CN114592041A - 电化学检测外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
一种电化学检测外泌体的方法，包括CRISPR‑Cas12促进的级联信号放大反应和引物置换反应，对间充质干细胞外泌体实施电化学检测。本发明的方法，将CRISPR‑Cas12a系统引入外泌体的检测分析，结合引物置换反应建立了一种经济有效且具有高灵敏度外泌体定量分析新方法。引物置换反应与基于Cas12a蛋白反式切割活性的反应相结合，有效地提高了该方法的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞来源物质的检测方法方法，特别涉及一种电化学方法，对来自于如：干细胞的生物物质实施定性和定量的检测。
背景技术
间充质干细胞通过旁分泌机制分泌的30～150nm的微囊泡，能够借助所携带的蛋白质，microRNAs等生物活性物质拥有介导间充质干细胞的治疗效力，在多种疾病的治疗中发挥作用。外泌体分离后进行有效鉴定是开展后续的研究或临床应用的前提与基础。相关研究表明，间充质干细胞可以用于在神经系统损伤疾病的治疗，其次，外泌体可被修饰来加载分子药物，且具有较少不良反应和免疫原性，并能在长久的储存过程中维持活性。然而，间充质干细胞源性外泌体治疗在临床应用过程中依然面临着许多挑战。因此，建立一种高效灵敏的间充质干细胞外泌体的检测定量方法显得尤为重要。
目前已有的检测方法为蛋白免疫印迹，纳米粒子追踪分析以及酶联免疫吸附试验等，这些方法过程较为繁琐复杂，纳米粒子追踪分析需要以不同稀释度对样品进行多次测量且不能检测生物化学成分，酶联免疫吸附试验只能分析个别水平的外泌体，而不能进行大量分析。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，简化检测过程。
本发明的另一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，利于对间充质干细胞外泌体实施高通量检测，提高外泌体的分析量。
本发明的再一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，提高间充质干细胞外泌体的检测灵敏度。
本发明的又一个目的在于提供一种电化学检测外泌体的方法，实现间充质干细胞外泌体的定量检测。
规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)和其相关的Cas蛋白构成一个整合的CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统利用特定的RNA激活Cas蛋白并启动外源核酸的选择性切割，目前已被广泛用于基因编辑和分子诊断。其中，Cas12a蛋白不仅能切割双链DNA，而且还能够不加选择地切割单链DNA，且具有极高的酶转换率，在分子诊断中具有出色的灵敏度和特异性。
一种电化学检测间充质干细胞的方法，包括CRISPR-Cas12促进的级联信号放大反应和引物置换反应，对外泌体实施电化学检测。
另一种电化学检测外泌体的方法，包括两条DNA链，即P链和H链，其中P链是一条能够发生延伸反应的短引物链，H链是引物置换反应的模板发夹链；P链能够以H链为模板在聚合酶的作用下发生延伸。
P链的核酸序列为：5'-TTATACCGAGTA-3'；
H链的核酸序列为：5'-TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA-3'，在其3’末端进行胆固醇修饰。
另一种电化学检测间充质干细胞的方法，包括crRNA和5’末端由亚甲基蓝标记的DNA，以实施CRISPR-Cas12a辅助的信号放大。
crRNA的核酸序列为：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC-3'。
5’末端由亚甲基蓝标记的DNA的核酸序列为：5'-TACCGAATTCCCCTACCTACCCTGCGCACTTCC-3'。
为了实施本发明电化学检测外泌体的方法，采用CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极为工作电极，铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极进行电化学检测，电化学扫描范围为
振幅为25mV，频率为15Hz。
为了实施本发明电化学检测外泌体的方法，还包括采用免疫磁珠捕获外泌体，比如：采用CD63抗体功能化的免疫磁珠，通过氨基-羧基反应制备得到CD63抗体功能化的免疫磁珠。
经验证，本发明的方法在外泌体浓度范围为103颗粒/mL至1010颗粒/mL与得到的电化学信号呈线性相关，能在此浓度范围内实现定量化的电化学检测。检测外泌体的检测限为708颗粒/mL，显著优于现有的绝大多数外泌体检测方法。
本发明技术方案实现的有益效果：
本发明将CRISPR-Cas12a系统引入外泌体的检测分析，结合引物置换反应建立了一种经济有效且具有高灵敏度外泌体定量分析新方法。引物置换反应与基于Cas12a蛋白反式切割活性的反应相结合，有效地提高了该方法的检测灵敏度。
本发明通过级联信号放大策略的信号放大具有效率高，速度快的特点，因而实施本发明提供的方法能显著提高检测速度、提高样本的检测数量、以及检测范围广等优势。
附图说明
图1为检测外泌体技术方案的路线图；
图2为捕获外泌体结果图；
图3为加入不同DNA的核酸反应的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图；
图4为外泌体的电化学响应对比图；
图5为不同浓度外泌体的电化学信号响应结果线性拟合图。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
图1为检测外泌体技术方案的路线图。具体方法包括：
(1)设计两条DNA链，即DNA链P和DNA链H，其中DNA链P是一条能够发生延伸反应的短引物链，DNA链H是引物置换反应的模板发夹链；DNA链P能够以DNA链H为模板在聚合酶的作用下发生延伸。
(2)工作电极采用葫芦[7]脲(CB[7])、金纳米颗粒(AuNPs)和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)逐层功能化的石墨电极。电极经过砂纸打磨和铝粉抛光后先后在水和乙醇中超声波洗涤。为了在电极表面上形成带正电荷的PDDA膜，将电极浸入PDDA溶液中，随后，AuNPs通过与PDDA膜的静电相互作用吸附到电极表面。最后，将电极与CB[7]在室温下孵育并用蒸馏水彻底洗涤，得到CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极。
(3)当检测体系中存在间充质干细胞外泌体时，外泌体能够被CD63抗体修饰的免疫磁珠捕获，胆固醇修饰的H链可以通过胆固醇和外泌体膜磷脂之间的疏水作用插入外泌体膜，磁性分离后，未插入外泌体膜的核酸探针被除去，此时，若向溶液中加入引物P链和引物置换反应所需要的原料和酶，引物置换反应得以发生。
(4)当检测体系中不存在间充质干细胞外泌体时，磁性分离后，胆固醇修饰的H链未被保留在免疫磁珠表面，此时，若向磁珠中加入引物P链和引物置换反应所需要的原料和酶，引物置换反应不能发生，因此也不能激活cas12a蛋白的反式切割活性；最终，溶液中的亚甲基蓝修饰的信号链不能被切碎，长链的亚甲基蓝信号链不能够被功能化的石墨电极捕获，几乎检测不到亚甲基蓝的电化学信号。
(5)通过测定功能化石墨电极表面的亚甲基蓝信号，可以实现间充质干细胞外泌体的定量检测。
本发明如下实施例采用的方案主要包括以下步骤：
(a)CD63抗体功能化的免疫磁珠的配置，通过氨基-羧基反应制备得到CD63抗体功能化的免疫磁珠。
(b)间充质干细胞外泌体的捕获和引物置换反应的发生，具体过程包括：短引物P链自发结合H链的3'末端，并通过Bst DNA聚合酶延伸。由于缺乏dGTP，延伸反应在富含C的序列处停止。之后，延伸产物B链内的复制结构域与H链中的模板结构域之间的竞争促进了延伸产物B链的脱落，进而使得另一个游离引物P链与H链结合并引发了新一轮延伸反应。最终，溶液中产生大量的延伸产物B链，延伸产物B链能够与cas12a的crRNA识别结合并激活cas12a蛋白的反式切割活性，使得溶液中的亚甲基蓝修饰的信号链(MB-S)能够被切碎，切碎的亚甲基蓝信号链能够被功能化的石墨电极捕获，电化学检测中能够得到很高的亚甲基蓝信号。
(c)CRISPR-Cas12a辅助的信号放大过程，具体过程为：向上述溶液中加入200nM～300nM crRNA，600nM～700nM亚甲基蓝标记的DNA(MB-S)和200nM～300nM Cas12a，加入经焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的超纯水(DEPC水)使最终体积为100μL～150μL。最后，Cas12a切割亚甲基蓝标记信号链的反应条件为30℃～37℃下反应10分钟～15分钟，并在65℃～70℃下加热10分钟～15分钟以使酶失活。
(d)CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极的制备，具体过程为：电极经过砂纸打磨和铝粉抛光后按顺序在水和乙醇中超声波洗涤。随后将电极浸入含有3.5～4mg mL-1PDDA和0.05M NaCl的溶液中，进而在电极表面形成带正电荷的PDDA膜，用蒸馏水洗涤之后，柠檬酸钠还原法制备的AuNPs与电极室温孵育1小时，AuNPs通过与PDDA膜的静电相互作用吸附到电极表面上。最后，将电极与1～1.5mM CB[7]再室温孵育1～1.5小时，并用双蒸水彻底洗涤，得到CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极。
(e)电化学检测，通过在CHI-660C电化学工作站上使用三电极系统进行电化学测量。辅助电极为铂丝，参比电极为饱和甘汞电极，工作电极为CB[7]/AuNP/PDDA功能化电极。通过高纯度氮气将溶液彻底脱氧，并在整个实验过程中使用氮气流保持溶液厌氧。方波伏安法(SWV)的参数如下：电化学扫描范围为
振幅为25mV，频率为15Hz。
其中：
步骤(b)中所使用的P链的序列为：5'-TTATACCGAGTA-3'，所使用的H链的序列为：5'-TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA-胆固醇-3'。
步骤(c)中所使用的crRNA链的序列为：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC-3'，MB-S链的序列为：5'-亚甲基蓝-TACCGAATTCCCCTACCTACCCTGCGCACTTCC-3'。
实施例1捕获外泌体
(a)首先取100μL～150μL羧基功能化磁珠并用pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤三次，磁吸分离后重悬于PBS中，随后向溶液中加入500μL～600μL 0.22～0.23M 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液，室温下孵育30分钟～40分钟，以激活磁珠表面的羧基；
(b)进一步使用PBS洗涤并磁吸分离后，向磁珠溶液中加入10μL～15μL CD63抗体，室温下反应1.5小时～2小时，从而通过氨基-羧基反应制备得到CD63抗体功能化的免疫磁珠，最后，磁吸分离后除去没有结合到磁珠上的抗体，重悬于PBS溶液中备用；
(c)取步骤(b)中CD63抗体功能化的免疫磁珠(100μL～150μL)与外泌体在室温下孵育1.5小时～2小时，并用PBS洗涤两次，去除没有与免疫磁珠结合的外泌体。
用膜亲和染料DiO(20～30μM)对免疫磁珠捕获的外泌体膜于30℃～37℃金属浴中染色15分钟～30分钟，用PBS洗涤两次重悬于PBS缓冲液中，之后，取10μL～20μL制备玻片，避光放置以进行荧光显微镜分析。
结果如图2所示。其中图2a为CD63抗体功能化的免疫磁珠和间充质干细胞外泌体，在捕获表达PD-L1的外泌体后，与裸CD63抗体功能化免疫磁珠相比，在免疫磁珠周围观察到明亮的绿色荧光。图2b中为裸CD63抗体功能化免疫磁珠，即没有加入外泌体，从图中可以看出，在免疫磁珠周围几乎观察不到绿色荧光。荧光显微镜观察证实CD63在间充质干细胞外泌体中的阳性表达，并且证明使用CD63抗体功能化免疫磁珠可以捕获表达CD63的间充质干细胞外泌体。
实施例2CRISPR-Cas12a辅助的信号放大
(a)引物置换反应在50～60μL反应缓冲液(1.5～2mM Tris-HCl，1～1.5mM(NH4)2SO4,1mM KCl，1.2～1.5mM MgSO4和0.01％TritonX-100)中于30～37℃进行1.5～2小时。其含有所需的插入外泌体膜的H链，10～15μM引物P链，0.8～1单位μL-1Bst DNA聚合酶和100～150μM dNTPs(dCTP，dTTP和dATP)。
(b)向上述溶液中加入200～300nM crRNA，600～800nM亚甲基蓝标记的DNA(MB-S)和200～300nM Cas12a，加入DEPC水使最终体积为100～150μL。最后，Cas12a催化降解为在30～37℃下反应10～15分钟，并在65～70℃下加热10～15分钟以使酶失活。
(c)各样品与1～2μL的6x上样缓冲液混合并上样到15％非变性聚丙烯酰胺凝胶上。在1×Tris-borate-EDTA缓冲液中以120V电泳70～80分钟后，用GelDoc XR+System凝胶成像仪对凝胶进行拍照成像。
相关寡核苷酸DNA链序列如下：
P链：5'-TTATACCGAGTA-3'。
H链：5'-TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA-3'。
S链：5'-TACCGAATTCCCCTACCTACCCTGCGCACTTCC-3'
crRNA链：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC-3'
图3显示了不同DNA输入的核酸反应的聚丙烯酰胺凝胶电泳图像。泳道1至3分别代表信号探针(S)、催化发夹探针(H)和延伸产物(B)的条带。泳道4显示了一条与延伸产物B相对应的条带，由此证明引物置换反应的发生。泳道5为在Cas12a蛋白存在的情况下所显示的DNA条带。泳道5中S条带的消失表明，在经过引物置换反应产生延伸产物后，可以激活CRISPR-Cas12a中Cas12a蛋白的反式切割活性。
实施例3外泌体电化学检测
(a)CD63抗体功能化的免疫磁珠(100～150μL)与间充质干细胞外泌体在室温下孵育1.5～2小时，并用PBS洗涤两次除去没有结合到磁珠上的外泌体。然后，捕获的外泌体与胆固醇标记的催化发夹DNA(胆固醇-H)在室温温育45～50分钟，并用PBS洗涤两次除去没有插到外泌体膜上的H链。
(b)引物置换反应在50～60μL反应缓冲液(1.5～2mM Tris-HCl，1～1.5mM(NH4)2SO4,1mM KCl，1.2～1.5mM MgSO4和0.01％TritonX-100)中于30～37℃进行1.5～2小时。其含有所需的插有胆固醇-H链的外泌体，10～15μM引物P链，0.8～1单位μL-1Bst DNA聚合酶和100～150μM dNTPs(dCTP，dTTP和dATP)。
(c)向上述溶液中加入200～300nM crRNA，600～800nM亚甲基蓝标记的DNA(MB-S)和200～300nM Cas12a，加入DEPC水使最终体积为100～150μL。最后，Cas12a催化降解为在30～37℃下反应10～15分钟，并在65～70℃下加热10～15分钟以使酶失活。
(d)通过在CHI-660C电化学工作站上使用三电极系统进行电化学测量。辅助电极为铂丝，参比电极为饱和甘汞电极，工作电极为CB[7]/AuNP/PDDA功能化电极。通过高纯度氮气将溶液彻底脱氧，并在整个实验过程中使用氮气流保持溶液厌氧。方波伏安法(SWV)的参数如下：电化学扫描范围为
振幅为25mV；频率为15Hz。
相关寡核苷酸DNA链序列如下：
P链：5'-TTATACCGAGTA-3'。
H链：5'-TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA-3'。
MB-S链：5'-亚甲基蓝-TACCGAATTCCCCTACCTACCCTGCGCACTTCC-3'
crRNA链：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC-3'
图4显示了在有或没有间充质干细胞外泌体情况下的电化学响应。结果显示仅在Cas12a蛋白激活的反式切割活性导致MB-S切碎后并在存在外泌体时观察到高电化学响应(曲线b)。相比之下，在没有外泌体的情况下观察到相当低的电化学响应(曲线a)。H链与富集外泌体的免疫磁珠促进引物置换反应，随后激活Cas12a蛋白的反式切割活性。功能化石墨电极通过CB[7]的主客体相互作用捕获由Cas12a触发的DNA降解产生的具有短DNA片段的亚甲基蓝分子，因此亚甲基蓝电化学信号与外泌体的量呈正相关。相反，当没有外泌体时，CB[7]和长DNA链之间的强静电排斥导致产生的电化学信号很低。
实施例4外泌体的定量检测
按实施例3相同的检测方法，在不同浓度下检测，以实施间充质干细胞外泌体的定量检测。
图5显示了检测不同浓度间充质干细胞外泌体时得到的电化学信号。如图所示，随着外泌体浓度的增加，检测到的亚甲基蓝的电化学信号也逐渐增强。这是合理的，因为越多的外泌体会使得越来越多的H链结合在磁珠表面，因而可以更加高效地触发引物置换反应，导致更多的延伸产物B链的生成。从图中还可以看出，亚甲基蓝的电化学信号与外泌体浓度的对数值(lgCexosome)在103颗粒/mL至1010颗粒/mL范围呈线性相关，线性方程是I(μA)＝0.193×LogCexosomes(颗粒/mL-1)–0.079(R2＝0.990)。根据线性方程，可以计算得到本实施例的方法用于检测外泌体的检测限为708颗粒/mL，优于现有的绝大多数外泌体检测方法。
序列表
<110> 章毅
中国干细胞集团上海生物科技有限公司
中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司
重庆市干细胞技术有限公司
上海市干细胞技术有限公司
陕西省干细胞技术有限公司
苏州市干细胞技术有限公司
三亚市干细胞技术有限公司
<120> 电化学检测外泌体的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttataccgag ta 12
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctccacatc atagggtttt ccctatgatg tggagatact cggtataa 48
<210> 3
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uuaugaugug gagauacucc 40
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taccgaattc ccctacctac cctgcgcact tcc 33
Claims (10)
1.一种电化学检测外泌体的方法，其特征在于包括CRISPR-Cas12促进的级联信号放大反应和引物置换反应，对间充质干细胞外泌体实施电化学检测。
2.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于包括两条DNA链，即P链和H链；
所述P的核酸序列为：5'-TTATACCGAGTA-3'；
所述H链的核酸序列为：5'-TCTCCACATCATAGGGTTTTCCCTATGATGTGGAGATACTCGGTATAA-3'，在其3’末端具有胆固醇修饰。
3.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于以crRNA和5’末端由亚甲基蓝标记的DNA实施CRISPR-Cas12促进的级联信号放大反应；
所述crRNA的核酸序列为：5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGAUGUGGAGAUACUCCC-3'；
所述5’末端由亚甲基蓝标记的DNA的核酸序列为：5'-TACCGAATTCCCCTACCTACCCTGCGCACTTCC-3'。
4.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于采用CB[7]/AuNP/PDDA功能化的石墨电极为工作电极。
5.根据权利要求4所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于以铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极。
6.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于电化学扫描范围为
振幅为25mV，频率为15Hz。
7.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于还包括采用免疫磁珠捕获外泌体。
8.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于还包括采用CD63抗体功能化的免疫磁珠捕获外泌体。
9.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于对所述的外泌体实施定量检测。
10.根据权利要求1所述的电化学检测外泌体的方法，其特征在于所述的外泌体浓度范围为103颗粒/mL至1010颗粒/mL与得到的电化学信号呈线性相关。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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