CN114574588A - 基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法，其特征是，包括如下步骤，S1、DNA五角星纳米材料合成，S2、荧光检测MMP mRNA的含量，S3、荧光检测FN mRNA的含量；S4、细胞成像。本案使用荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA，具有检测灵敏度高、检测选择性高和直观性强的优点，能更加准确的检测出乳腺癌细胞中的肿瘤标志物mRNA，为肿瘤病人病灶的早期诊断提供帮助。
Description
技术领域
本发明涉及临床诊断癌症的肿瘤标志物的检测方法领域，具体涉及一种基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法。
背景技术
基质金属蛋白酶信使RNA(MMP mRNA)和纤维连接蛋白信使RNA(FN mRNA)作为临床诊断癌症的肿瘤标志物，与乳腺恶性肿瘤密切相关。确定其在细胞中的含量，对恶性肿瘤的早期直观性诊断、疗效评价有着非常重要的意义。
目前，临床普遍使用聚合酶链式反应(PCR)和多重实时荧光定量聚合酶链式反应(MRT-PCR)检测细胞内的mRNA含量。其中PCR临床检测mRNA的操作过程复杂、手段繁琐，并且存在检测限较高的缺点，不利于癌症的早期诊断的准确性。MRT-PCR法临床检测mRNA提高了检测灵敏度，但是，仍然存在构建时间长、稳定性差及前处理麻烦等问题。另外，目前临床使用的方法大多数采用荧光标记技术，其构造花费较多，保存条件要求苛刻且保存时间短，极大提高了使用成本。并且现有的实时荧光检测技术，停留在小分子荧光检测和单一靶标检测范畴。而在活体细胞中，干扰物质较多，导致检测体系对目标物的识别性较差，从而降低了检测方法的选择性。如何使得检测过程操作简便，使得检测方法具有直观性、普适性，是要解决的问题。
多功能荧光纳米材料用于细胞内的肿瘤标志物检测前景良好，其中人工合成核酸序列杂交组合构建的DNA三维、四维纳米材料不仅具有传统核酸纳米材料的优点，同时还避免了传统核酸纳米材料带来的局限性。荧光检测相对于电致化学发光检测法和电化学检测法稳定性较好，但检测不够直观，无法快速观测到细胞内标志物表达情况。适体是一种具有特异性识别性能的核酸序列，在一定条件下与靶标特异性结合形成稳定的结构，不受其他分子的干扰。相比其他的生物靶向识别分子，例如，抗原-抗体、多肽等，适体具有易合成、易储存、成本低等优点。适体技术提高了检测过程中目标物的选择性。
本发明利用核酸的固有分子识别和可编程特性、适体高特异性识别机制以及荧光成像技术的直观性检测特点，构建了一种新型的、尺寸粒径可控的DNA五角星荧光纳米材料，它兼并了核酸适体技术和荧光成像技术的优点，通过荧光成像特异性识别靶细胞内MMPmRNA和FN mRNA，直观性的给出胞内靶标物质的表达及分布情况。实际操作简单，不需要任何前处理过程。相较于传统检测方法，极大提高了检测方法的观测直观性，降低了材料构建时间及成本。
发明内容
鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法。
根据本申请实施例提供的技术方案，基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法，包括如下步骤，
S1、DNA五角星纳米材料合成，分别将含有MMP mRNA的互补序列H3、含有FN mRNA的互补序列H5和含有MUC-1蛋白的适体序列H2的五条DNA链自组装成DNA五角星纳米材料；DNA五角星纳米材料上的MUC-1适体能够特异性识别在乳腺癌细胞(MCF-7)中高表达的MUC-1蛋白。MUC-1适体与乳腺癌细胞表面的MUC-1蛋白结合后，使DNA五角星纳米材料能够克服负电性DNA与负电性细胞表面产生的静电斥力，顺利进入细胞内部。DNA五角星纳米材料包括五条不同序列的核酸链分别为H1、H2、H3、H4和H5，H3和MMP mRNA为互补序列，H5和FN mRNA为互补序列，H2为MUC-1蛋白的适体序列；H1和H3核酸链的末端分别连接有的荧光素Cy5和Cy3，H4和H5核酸链末端的分别连接有荧光猝灭剂BHQ-1和BHQ-3。H1、H2、H3、H4和H5的核酸序列如下：
H1：5’-TTTTTTTCTTGTCCTATAGGACAAGA-3’，5′端修饰Cy5；
H2：5’-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAAGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTCGACAGGAGGCTCACAACAGGCGAGAGAAGAGCTCTTCTCTC-3’；
H3：5’-CGCTCAGATCCGTGGTGAGATTTTTTT-3’,3′端修饰Cy3；
H4：5’-TTTTTTATCTCACCACCATTCGG CGG-3’,5′端修饰BHQ-1；
H5：5’-CCGCCGAATGTAGGACAAGATTTTTT-3’,3′端修饰BHQ-3。
其中，
H1为辅助1核酸序列，是用于支撑五角星形状的核酸序列；
H2为MUC-1蛋白的适体序列；
H3为MMP mRNA的互补序列；
H4为辅助2核酸序列，是用于支撑五角星形状的核酸序列；
H5为FN mRNA的互补序列，
H1和H3核酸链的末端分别连接有的荧光素Cy3和Cy5，
H4和H5核酸链末端的分别连接有荧光猝灭剂BHQ-1和BHQ-3。
S2、荧光检测MMP mRNA的含量，步骤S1中的所述DNA五角星纳米材料进入到细胞中并通过其特异性识别MMP mRNA和FN mRNA，通过竞争杂交互补反应，核酸链H3和核酸链H1末端的荧光素Cy3和荧光素Cy5会远离核酸链H4和核酸链H5末端的荧光猝灭剂BHQ-1和BHQ-3，从而使得Cy3和Cy5的荧光恢复，
S3、荧光检测FN mRNA的含量；通过步骤S2荧光恢复的程度及荧光素Cy3和荧光素Cy5所在的位置，从而确定MMP mRNA和FN mRNA含量和在细胞中的位置；
S4、细胞成像，将步骤S3中得到的细胞在激光共聚焦显微镜下观察细胞内Cy3和Cy5的荧光，分别以520nm为激发光源，采集560nm的发射光，以570nm为激发光源，采集660nm的发射光。
上述步骤相对于其他检测mRNA的方法，具有高的检测灵敏度和直观性，可视化直观的观测手段使其具有较好的普适性，为临床诊断癌细胞中的mRNA提供了新的方法。
综上所述，本申请的有益效果如下：
1、利用核酸适体技术，创造了一种新的识别靶标的手段，使其的生物安全性高，特异性识别强，实用范围广。核酸适体具有合成时间短，合成成本低、储存运输方便等优点，改善了传统抗原-抗体识别技术构造时间长、构造成本高、储存困难的缺陷，更加利于商业化推广。
2、成功实现了DNA五角星纳米结构在生化分析领域的应用，通过精密的结构设计，结合透射电子显微镜的验证，确保其有良好的粒径分布，有利于进一步实现工业化大规模生产。
3、针对金属纳米材料具有较强的生物毒性，利用纯核酸作为生命构造主要生物大分子的优势，构建的核酸五角星纳米颗粒极大的降低了生物毒性和降低了靶细胞的排异性。
4、利用生物内源性分子DNA，可以实现具有良好生物相容性和生物降解性的荧光探针。该纳米材料应用于复杂样品中的靶标物质检测，更加贴合实际临床肿瘤诊断中的无损检测需要。
5、相对于其他的复杂检测手段，本案中构建的DNA五角星纳米材料所需反应条件简便，构造时间短，对设备要求低，有利于实际生产。
6、相对于目前临床上通用的检测方法，本案使用荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA，具有检测灵敏度高、检测选择性高和直观性强的优点，能更加准确的检测出乳腺癌细胞中的肿瘤标志物mRNA，为肿瘤病人病灶的早期诊断提供帮助。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA示意图；
图2为DNA五角星纳米材料的电镜(TEM)图；
图3为DNA五角星纳米材料电泳表征图；
图4为DNA五角星纳米材料检测FN mRNA图；
图5为DNA五角星纳米材料检测MMP mRNA图；
图6为激光共聚焦图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。具体实施方式为：
(一)DNA五角星纳米材料合成
将5条核酸链(H1～H5)分别用用含有150mM NaCl，40mM Tris，40mM C4H6O4、Mg2+和1mM EDTA的缓冲液(pH 8.0)中稀释到1×10-5M。分别取等量的核酸链(H1～H5)混合均匀加热至90℃，20min后停止加热，5h内将样品冷却至室温实现退火。退火后，将DNA纳米星溶液储存在4℃中，并在10天内使用完毕。
图1为DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA示意图，其中所示的DNA五角星由五条不同颜色的曲线组成，五条颜色不同的曲线分别是五条不同序列的核酸链(H1～H5)。橘色线为H1核酸链，它末端的绿点是修饰的花菁素5(Cy5)荧光基团；蓝色线为H2核酸链；蓝紫色线为H3核酸链，它末端的紫点是修饰的花菁素3(Cy3)荧光基团；绿色线为H4核酸链，它末端绿点是修饰的BHQ-1荧光猝灭基团；紫色线为H5核酸链，它末端蓝点是修饰的BHQ-3荧光猝灭基团。灰色双层曲线为MCF-7细胞膜，橘色为细胞膜上的MUC-1蛋白，深蓝色曲线为细胞内FN mRNA，灰色曲线为细胞内MMP mRNA，红色星状物为正在发荧光的Cy5基团，黄色星状物为正在发荧光的Cy3基团。
图2为DNA五角星纳米材料电镜(TEM)图，其中图a是DNA五角星纳米材料结构图；图b为DNA五角星纳米材料结构放大图，粒径大约为100nm左右。这说明纳米凝胶结构具有均匀的粒径，便于顺利进入细胞内部，准确定量的测定靶标mRNA。
图3为电泳表征图，其中图三中泳道1～5为组成DNA五角星纳米材料的核酸链H1～H5，泳道6为核酸链H1和H2杂交后的复合物，泳道7为核酸链H1、H2和H3杂交后的复合物，泳道8为核酸链H1、H2、H3和H4杂交后的复合物，泳道9为DNA核酸链H1、H2、H3、H4和H5杂交后的复合物。从图上看，发生了核酸杂交互补的反应，确保实验结果与方案构想相一致，证明DNA五角星纳米材料成功构建。
(二)荧光检测MMP mRNA的含量
1、取步骤(一)生成的DNA五角星纳米材料，加入不同浓度的MMP mRNA，放入摇床反应2-3h。
2、用分子荧光仪测定其荧光强度。
图4为DNA五角星纳米材料检测MMP mRNA图，图中A为荧光动力学曲线图，B为检测MMP mRNA的线性图，由图可见在565nm处，荧光强度随着MMP mRNA的浓度增加而增加，线性范围是1nM～140nM，检测限为0.776nM，线性方程为F＝2.317CMMP mRNA+134.226(R2＝0.9954)，证明线性测定效果良好。
(三)荧光检测FN mRNA的含量
1、取步骤(一)生成的DNA五角星纳米材料，加入不同浓度的FN mRNA，放入摇床反应2-3h。
2、用分子荧光仪测定其荧光强度。
图5为DNA五角星纳米材料检测FN mRNA图，图中A为荧光动力学曲线图，B为检测FNmRNA的线性图，由图可见在660nm处，荧光强度随着FN mRNA的浓度增加而增加，线性范围是1nM～120nM，检测限为0.483nM，线性方程为F＝3.722CFN mRNA+33.625(R2＝0.9960)，证明线性测定效果良好。
(四)细胞成像
1、将MCF-7细胞分散在一次性培养皿中，并在5％的CO2培养箱中于37℃孵育36h。然后除去原始培养基，并将MCF-7细胞与含有100nM DNA五角星纳米材料的培养基孵育24h。
2、在激光共聚焦显微镜下观察细胞内Cy3和Cy5的荧光，分别以520nm为激发光源，采集560nm的发射光，以570nm为激发光源，采集660nm的发射光。
图6为激光共聚焦图，图中乳腺癌(MCF-7)细胞在565nm和660nm发射波长下的激光共聚焦图。将细胞与10mM DNA五角星纳米材料孵育24h后，观察到Cy3及Cy5两个通道都出现荧光，说明由于细胞对DNA五角星纳米材料的吸收。随着孵育时间的增加，MCF-7细胞观察到Cy3的黄色荧光信号和Cy5的红色荧光信号都逐渐增强。温育5h后，Cy3的黄色荧光信号和Cy5的红色荧光信号都达到最大值。说明DNA五角星纳米材料能够同时对MCF-7细胞内的MMPmRNA和FN mRNA产生响应，可持续性监测两种mRNA。
以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理等方案的说明。同时，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。
序列表
<110> 青岛科技大学
<120> 基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 核酸适体(aptamer)
<400> 1
tttttttctt gtcctatagg acaaga 26
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> 核酸适体(aptamer)
<400> 2
gggagacaag aataaacgct caagcagttg atcctttgga taccctggtt cgacaggagg 60
ctcacaacag gcgagagaag agctcttctc tc 92
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 核酸适体(aptamer)
<400> 3
cgctcagatc cgtggtgaga ttttttt 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 核酸适体(aptamer)
<400> 4
ttttttatct caccaccatt cggcgg 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 核酸适体(aptamer)
<400> 5
ccgccgaatg taggacaaga tttttt 26
Claims (3)
1.基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法，其特征是，包括如下步骤，
S1、DNA五角星纳米材料合成，分别将含有荧光素Cy3的核酸序列和MMP mRNA的互补序列H3、含有荧光猝灭剂BHQ-3和FN mRNA的互补序列H5、含有MUC-1蛋白的适体序列H2、含有荧光素Cy5的核酸序列H1和含有荧光猝灭剂BHQ-1的核酸序列H4的五条DNA链自组装成DNA五角星纳米材料；
S2、荧光检测MMP mRNA和FN mRNA的含量，步骤S1中的所述DNA五角星纳米材料进入到细胞中并通过其特异性识别MMP mRNA和FN mRNA，通过竞争杂交互补反应，核酸链H3和核酸链H1末端的荧光素Cy3和荧光素Cy5会远离核酸链H4和核酸链H5末端的荧光猝灭剂BHQ-1和BHQ-3，从而使得Cy3和Cy5的荧光恢复，荧光恢复的程度及荧光素Cy3和荧光素Cy5所在的位置，从而确定MMP mRNA和FN mRNA含量和在细胞中的位置；
S3、细胞成像，将步骤S3中得到的细胞在激光共聚焦显微镜下观察细胞内Cy3和Cy5的荧光，分别以520nm为激发光源，采集560nm的发射光，以570nm为激发光源，采集660nm的发射光。
2.根据权利要求1所述的基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法，其特征是，所述DNA五角星纳米材料包括五条不同序列的核酸链分别为H1、H2、H3、H4和H5，
其中，
H1为辅助1核酸序列；
H2为MUC-1蛋白的适体序列；
H3为MMP mRNA的互补序列；
H4为辅助2核酸序列；
H5为FN mRNA的互补序列，
H1和H3核酸链的末端分别连接有的荧光素Cy3和Cy5，
H4和H5核酸链末端的分别连接有荧光猝灭剂BHQ-1和BHQ-3。
3.根据权利要求2所述的基于DNA五角星纳米材料荧光成像监测乳腺癌细胞中mRNA的方法，其特征是，所述五条不同序列的核酸链的序列分别为：
H1：5’-TTTTTTTCTTGTCCTATAGGACAAGA-3’，5′端修饰Cy5；
H2：5’-GGGAGACAAGAATAAACGCTCAAGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGGTTCGACAGGAGGCTCACAACAGGCGAGAGAAGAGCTCTTCTCTC-3’；
H3：5’-CGCTCAGATCCGTGGTGAGATTTTTTT-3’,3′端修饰Cy3；
H4：5’-TTTTTTATCTCACCACCATTCGG CGG-3’,5′端修饰BHQ-1；
H5：5’-CCGCCGAATGTAGGACAAGATTTTTT-3’,3′端修饰BHQ-3。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| CONG ZHU等: "Triplex-Functionalized DNA Tetrahedral Nanoprobe for Imaging of Intracellular pH and Tumor-Related Messenger RNA", 《ANAL CHEM》 * |
| 吕思雪等: "DNA纳米五角星探针的构建及其在细胞内荧光成像检测mRNA的应用", 《山东化工》 * |
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| CN114574588B (zh) | 2023-08-22 |
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