CN114573706A - 一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体的研制及其应用方法。采用纳米沉淀、乳液聚合的方法，以生物相容性较好的聚乙二醇及聚(乳酸‑羟基乙酸)为原料制备转运载体，将交联剂包裹于其中，通过信号肽作用将交联剂靶向递送至植物细胞中的叶绿体内并释放，提取相互作用的蛋白质复合物，再经点击化学及富集，结合质谱技术，实现细胞器内蛋白质复合物的原位交联。该种材料解决了交联剂跨植物细胞膜实现原位交联的障碍,为后期光合作用相关蛋白质复合物的原位分析奠定了基础。

Description

一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体和应用

技术领域

本发明涉及一种用于靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体的研制及其应用方法，属于生物分析技术领域。

背景技术

载体转运是药物转运的一种特殊形似，化学物质与生物膜一侧的载体分子结合可由一侧移向另一侧。转运能力受结合的饱和度或多种物质竞争性抑制作用的影响。可分为：(1)主动转运，即逆浓度(或电化学)梯度转运，需消耗一定能量。(2)易化扩散，即顺浓度梯度转运，不消耗能量。聚(乳酸-羟基乙酸)以其生物相容性和极低的毒性而闻名。聚(乳酸-羟基乙酸)经过降解会产生乳酸和乙醇酸副产物，它们可以进入细胞代谢途径，因此它是最有前途的可生物降解聚合物的载体材料之一，且能够获得监管机构的认可并进入市场(Journal of Controlled Release，2018，289:10-13.)。

叶绿体是植物生物工程的关键细胞器，是植物唯一能够进行光合作用的细胞器，并且对于改善作物生长、开发合成生物学等至关重要。蛋白质N末端含有一个信号序列，称之为转运肽。目前已经运用了多种不同方法研究靶向肽序列，具有如下性质：含有大量的羟基化氨基酸和丙氨酸、缺少酸性氨基酸、存在短序列基元、疏水环境中易形成α螺旋结构。叶绿体缺乏基因沉默途径，并且已被证明具有高而稳定的转基因表达。由于叶绿体在大多数植物物种中都是母系遗传的，因此它们在转化的农作物中提供了遗传抑制作用。尽管生物技术取得了数十年的进步，但许多植物物种及其质体仍然难以进行遗传转化。目前，几乎没有能够将生物分子转移到植物细胞及其亚细胞器区室中的传递工具，每个传递工具都有局限性(Molecular Plant,2019,12(8):1037-1040.)。用于植物传递的另一种常用工具是生物弹颗粒递送，可以将生物分子传递到更广泛的植物物种和质体组织中，但面临着低水平以及植物组织在高轰炸压力下受到损害的局限性，并且该种方法需要专门的设备及昂贵的材料。缺乏可以穿过刚性和多层细胞壁以及细胞器的双层脂质、将生物分子传递到植物细胞中的工具，这是纳米技术无法促进植物工程发展的重大瓶颈。

近年来，化学交联的蛋白质复合物并通过交联残基的质谱鉴定已成为结构生物学的重要技术之一，化学交联剂是交联质谱的核心(Dissertations&Theses-Gradworks，2014，53(30):4924-2930.)。光合作用通过一系列蛋白质复合物运行，这些蛋白质复合物收集阳光并将其转化为化学能，大型组织及其之间的相互作用尚不清楚。目前，对于光合作用相关蛋白质复合物的研究都是将相关蛋白提取纯化，这种方法虽然能解析部分相互作用蛋白，但是提取纯化的过程无法实现原位分析，造成一定交联信息的损失。

在本专利中，针对现有交联剂无法跨植物细胞进行原位交联，以及载体无法更精准地靶向递送的困难问题，发展了种用于靶向叶绿体的交联剂转运载体的研制及其应用方法，以实现载体转运交联剂跨植物细胞膜实现原位交联,为后期光合作用相关蛋白质复合物的原位分析奠定了基础。

发明内容

本发明涉及一种用于靶向叶绿体的交联剂转运载体的研制及其应用方法，以实现载体跨膜转运交联剂获取原位交联信息。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1.采用乳液聚合法制备转运载体，其步骤包括：将聚(乳酸-羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和双十二烷基二甲基溴化铵以一定的比例溶于油相中，该油相不与水互溶且易挥发；将油相分散于水相中，并借助超声均匀分散，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒；将初次分散的水相二次固化，通过机械搅拌，液滴固化稳定，形成载体；将液滴均匀分散的悬浊液通过离心作用去除多余的水分及分散剂，沉淀经冷冻干燥，得到载体颗粒。

2.采用纳米沉淀法制备转运载体，其步骤包括：将聚(乳酸-羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和双十二烷基二甲基溴化铵以一定的比例溶于油相中，该油相可溶于水且易挥发；将油相逐滴加入水相，再经机械搅拌，固化一段时间；通过旋蒸快速去除油相；通过离心去除多余水相，最后冷冻干燥得到载体颗粒。

3.载体表面修饰信号肽，信号肽应具有靶向的序列。信号肽的筛选主要应用噬菌体表面展示技术，从随机的多肽库中筛选与特异配体或植物细胞结合的环形多肽。根据叶绿体的输入机制，所选信号肽一端用于叶绿体外膜导入机制的识别位点，另一段与载体表面键合。所选信号肽序列为植物细胞中高度保守的序列，并包含功能性生物识别基序，允许跨过叶绿体双膜。

4.靶向转运载体所包裹的交联剂结构为：其两侧为可与蛋白中的氨基反应的琥珀酰亚胺基团，琥珀酰亚胺酯具有胺类反应活性和强交联能力，可与伯氨或仲氨反应产生稳定的酰胺或亚酰胺键。

5.靶向叶绿体的特定位置包括叶绿体内膜、叶绿体外膜、类囊体、基质。

6.转运载体与植物细胞在26℃下，共同孵育2-4h，并收集细胞，也可以进一步收集细胞内特定部位。植物细胞为无壁的原生质体；特定部位为叶绿体。

7.将获得的细胞或叶绿体中加入离子液体并通过超声提取出蛋白质。取适量的蛋白加入二硫苏糖醇，56℃或95℃高温变性，将样品转移至滤膜上。再经吲哚-3-乙酸室温避光孵育烷基化，后加入适量胰蛋白酶，37℃酶解过夜。离心收集样品。

8.获得的肽段需经过高精度及高分辨的质谱仪器进行分析，需采用plink进行对质谱数据进行解析，筛选出可信度较高的相互作用蛋白，获得叶绿体内的原位交联信息。

叶绿体的输入机制是通过叶绿体外膜上的转运蛋白TOC和位于内膜上的转运蛋白TIC协同调控的，信号肽经TOC/TIC特异性识别后，引导载体穿过叶绿体双层膜进入特定生长时期的叶绿体。特定的叶绿体信号肽与叶绿体输入机制密切相关，其蛋白来源为CrPDAT、GAP3，其CTPs类型为CTP1。

当载体进入细胞中，经靶向肽的趋动以及材料表面的静电作用，实现特定位置递送。基于载体递送交联剂至叶绿体内，提取蛋白质及其复合物的原位信息，并利用高分辨质谱对蛋白质及其复合物进行解析。该种材料解决了交联剂跨植物细胞膜实现原位交联的障碍,为后期光合作用相关蛋白质复合物的原位分析奠定了基础。

本发明具有如下优点：

(1)本发明通过载体转运交联剂，保护交联剂，防止其在跨植物细胞膜时被多糖消耗。

(2)本发明通过修饰信号肽，使得转运载体能够特定地进入叶绿体，交联剂原位释放，提高了交联信息的可用性。

(3)本发明通过载体的手段，实现植物细胞中原位交联，从而获得了更多与光合作用相关蛋白质复合物的交联信息。

附图说明

图1叶绿体靶向交联剂转运载体与植物细胞共孵育4h，载体进入植物细胞内的荧光照片(载体为绿色，叶绿体为红色)。

具体实施方式

实施例一

采用纳米沉淀法制备转运载体，聚(乳酸-羟基乙酸)80mg(分子量9000，乳酸-羟基乙酸摩尔比50：50)，聚乙二醇20mg(分子量3350)，交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺40mg，双十二烷基二甲基溴化铵14mg，油相为乙腈20ml，水的体积200ml。将双十二烷基二甲基溴化铵、聚(乳酸-羟基乙酸)和聚乙二醇溶于乙腈中；将乙腈逐滴加入50ml水中，室温搅拌15min，30℃蒸发5im去除油相；通过离心16000g/min 30min，去除多余水，最后干燥得到载体颗粒；在载体表面偶联信号肽，信号肽来源于CrPDAT，其氨基酸序列为MTTPTKGNSNARQRKKGGTSAEASAATPSKAKPGRDHNVHATPSHSHSHSHSQSQQHRQGPHAAQPKSERRLVLWLAAAGVVLLPLVLLPPAL；将1mg信号肽和20mg载体溶于1ml二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24小时，12000转每分钟，离心30分钟，得到载体颗粒，用水清洗两遍，12000转每分钟离心30分钟，取得沉淀后冻干得到载体颗粒。合成载体颗粒的粒径为210.2±5.9nm，分散系数为0.11±0.13，表面电荷为+27.07±0.75mV，包载交联剂的量为原投入量的71.72±7.3％，交联剂占载体的质量——载药率为14.94±5.73％。

将载体颗粒投入莱茵衣藻培养体系内，25℃共孵育4小时，收集细胞。经细胞破碎、梯度离心，收集5ml叶绿体及其他组织。加入3ml 8M尿素，通过超声提取蛋白质样品，加入二硫苏糖醇，95℃高温变性5min，将样品转移至滤膜上。再加入吲哚-3-乙酸室温避光孵育30min烷基化，后加入适量胰蛋白酶，37℃酶解过夜。离心收集样品。获得的肽段需经过高精度及高分辨的质谱仪器进行分析，需采用plink进行对质谱数据进行解析，筛选出可信度较高的相互作用蛋白，获得叶绿体内的原位交联信息。最终获得88条交联信息，其中有60条是与叶绿体光合作用相关的蛋白质复合物的相互作用信息。

实例二

采用乳液聚合法制备转运载体，聚(乳酸-羟基乙酸)(分子量8000，乳酸-羟基乙酸摩尔比50：50)90mg，聚乙二醇(分子量4000)10mg，交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺40mg，双十二烷基二甲基溴化铵12mg。将聚(乳酸-羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵溶于10ml二氯甲烷中；将油相分散于100ml水中，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒，搅拌1h，形成载体悬浊液；将悬浊液通过离心作用16000g/min，10min，去除水及二氯甲烷，沉淀经干燥，得到载体颗粒：在载体表面偶联信号肽，信号肽来源于GAP3，其氨基酸序列为MAAMMQKSAFTGSAVSSKSGVRAKA；将信号肽2mg和载体25mg溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24小时，16000g/min，离心30分钟，得到载体颗粒，用水清洗两遍，12000转每分钟离心30分钟，取得沉淀后冻干得到载体颗粒。合成载体颗粒的粒径为298.2±7.6nm，分散系数为0.11±0.09，表面电荷为+30.57±0.75mV，包埋率为57.69±5.77％，载药率为11.44±2.03％。

将载体颗粒投入莱茵衣藻培养体系内，25℃共孵育4小时，收集细胞。经细胞破碎器、梯度离心，收集6ml叶绿体及其他组织。加入5ml 4％十二烷基硫酸钠超声提取蛋白质，取适量的蛋白样品加入二硫苏糖醇，56℃高温变性15min，将样品转移至滤膜上。再经吲哚-3-乙酸室温避光孵育烷基化30min，后加入适量胰蛋白酶，37℃酶解过夜。离心收集样品。获得的肽段需经过高精度及高分辨的质谱仪器进行分析，需采用plink进行对质谱数据进行解析，筛选出可信度较高的相互作用蛋白，获得叶绿体内的原位交联信息。最终获得135条交联信息，其中有87条是与叶绿体光合作用相关的蛋白质复合物的相互作用信息。

实例三

采用乳液聚合法制备转运载体，聚(乳酸-羟基乙酸)(分子量8500，乳酸-羟基乙酸摩尔比50：50)80mg，聚乙二醇(分子量4200)20mg，交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺30mg，双十二烷基二甲基溴化铵15mg。将聚(乳酸-羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵溶于20ml二氯甲烷中；将油相分散于100ml水中，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒；将在水相中自组装形成乳胶粒，搅拌30min，形成载体悬浊液；将悬浊液通过离心作用16000g/min 30min，去除水及二氯甲烷，沉淀经干燥，得到载体颗粒：在载体表面偶联信号肽，信号肽来源于GAP3，其氨基酸序列为MAAMMQKAAFTGSA；将信号肽1mg和载体10mg溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24小时，18000g/min，离心30分钟，得到载体颗粒，用水清洗两遍，18000g/min，离心30分钟，取得沉淀后冻干得到载体颗粒。合成载体颗粒的粒径为298.2±7.6nm，分散系数为0.11±0.09，表面电荷为+28.57±0.75mV，包载交联剂的量为原投入量的57.69±5.77％，交联剂占载体的质量——载药率为11.44±2.03％。

将载体颗粒投入莱茵衣藻培养体系内，25℃共孵育4小时，收集细胞。经细胞破碎器、梯度离心，收集5ml叶绿体及其他组织。加入6ml 4％十二烷基硫酸钠超声提取蛋白质，取适量的蛋白样品加入二硫苏糖醇，56℃变性15min，将样品转移至滤膜上。再经吲哚-3-乙酸室温避光孵育30min烷基化，后加入适量胰蛋白酶，37℃酶解过夜。离心收集样品。获得的肽段需经过高精度及高分辨的质谱仪器进行分析，需采用plink进行对质谱数据进行解析，筛选出可信度较高的相互作用蛋白，获得叶绿体内的原位交联信息。最终获得73条交联信息，其中有43条是与叶绿体光合作用相关的蛋白质复合物的相互作用信息。

实例四

采用纳米沉淀法制备转运载体，聚(乳酸-羟基乙酸)85g(分子量9000，乳酸-羟基乙酸摩尔比50：50)，聚乙二醇15mg(分子量3350)，交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺18mg，双十二烷基二甲基溴化铵8mg，油相为乙腈，5ml。将双十二烷基二甲基溴化铵、聚(乳酸-羟基乙酸)和聚乙二醇溶于乙腈中；将乙腈逐滴加入10ml水中，搅拌25min，30℃蒸发5min去除油相；通过离心20000g/min 30min，去除多余水，最后干燥得到载体颗粒；在载体表面偶联信号肽，信号肽来源于CrPDAT，其氨基酸序列为MTTPTKGNSNARQRKKGGTSAEASAATPSKAKPGRDHNVHATPSLLPPAL；将0.5mg信号肽和10mg载体溶于2ml二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应36小时，20000g/min离心30分钟，得到载体颗粒，用水清洗两遍，20000g/min离心30分钟，取得沉淀后冻干得到载体颗粒。合成载体颗粒的粒径为256.3±4.6nm，分散系数为0.09±0.07，表面电荷为+37.3±0.17mV，包载交联剂的量为原投入量的39.80±5.3％，交联剂占载体的质量——载药率为22.49±3.25％。

将载体颗粒投入莱茵衣藻培养体系内，25℃共孵育4小时，收集细胞。经细胞破碎、梯度离心，收集4ml叶绿体及其他组织。加入5ml 8M尿素超声提取蛋白质，取蛋白样品加入二硫苏糖醇，56℃变性15min，将样品转移至滤膜上。再经吲哚-3-乙酸室温避光孵育30min烷基化，后加入适量胰蛋白酶，37℃酶解过夜。离心收集样品。获得的肽段需经过高精度及高分辨的质谱仪器进行分析，需采用plink进行对质谱数据进行解析，筛选出可信度较高的相互作用蛋白，获得叶绿体内的原位交联信息。最终获得147条交联信息，其中有107条是与叶绿体光合作用相关的蛋白质复合物的相互作用信息。

Claims (10)

1.一种靶向叶绿体的包裹有交联剂的转运载体，其特征在于：以聚(乳酸-羟基乙酸)和聚乙二醇为载体材料，以双十二烷基二甲基溴化铵使载体外表呈正电，并将交联剂包裹于其中；再经叶绿体信号肽修饰获得。

2.如权利要求1所述的转运载体，其特征在于：包裹有交联剂的转运载体的制备过程为，

A、通过乳液聚合法制备包裹有交联剂的转运载体，其步骤包括：(1)将聚(乳酸-羟基乙酸)、聚乙二醇、交联剂和带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵溶于油相中；(2)将油相分散于水中，油相与水的体积比范围为1:5-1:10，载体材料在水相中自组装形成乳胶粒；(3)将在水相中自组装形成乳胶粒,搅拌15min-1h，液滴固化稳定，形成载体悬浊液；(4)将悬浊液通过离心作用16000-20000g/min，15-40min去除水及油相，沉淀经干燥，得到载体颗粒；(5)：在载体表面偶联信号肽，将信号肽和载体溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24-48小时，16000-20000g/min，离心30-40分钟，得到载体颗粒，用水清洗1-3遍，16000-20000g/min，离心30-40分钟，取得沉淀后干燥得到载体颗粒；

或B、通过纳米沉淀法制备交联转运载体，其步骤包括：(1)将带正电作用的双十二烷基二甲基溴化铵、交联剂、聚(乳酸-羟基乙酸)和聚乙二醇溶于油相中；(2)将油相逐滴加入水中，油相与水的体积比范围为1:5-1:10，搅拌15min-1h，固化；(3)30℃蒸发5-15min，去除油相；(4)通过离心12000-20000g/min，15-40min去除多余水，最后干燥得到载体颗粒；(5)在载体表面偶联信号肽，将信号肽和载体溶于二甲基甲酰胺中，避光室温摇床反应24-48小时，12000-20000g/min，离心30-40分钟，得到载体颗粒，用水清洗1-3遍，12000-20000g/min，离心30-40分钟，取得沉淀后干燥得到载体颗粒。

3.如权利要求1或2所述的转运载体，其特征在于：

所包裹的交联剂包括：其两侧中的一侧或二侧为具有可与蛋白中的氨基反应的琥珀酰亚胺基团的化合物，琥珀酰亚胺酯具有胺类反应活性和强交联能力；或两侧中的一侧或二侧为具有可与伯氨和/或仲氨反应产生稳定的酰胺和/或亚酰胺基团的化合物。

4.如权利要求3所述的靶向载体，其特征在于：连接两侧基团的中部链为C7-C15碳链的烷基，信号肽与载体颗粒的的质量比范围为1:20-1:40。

5.如权利要求2所述的转运载体，其特征在于：聚乙二醇的分子量为5000-10000，聚(乳酸-羟基乙酸)的分子量为2000-5000(乳酸-羟基乙酸摩尔比50/50)；聚(乳酸-羟基乙酸)和聚乙二醇的质量比为4:1-9:1，油相为二氯甲烷和/或乙腈；聚(乳酸-羟基乙酸)于油相中质量浓度3-15mg/ml，双十二烷基二甲基溴化铵于油相中质量浓度0.7-1.8mg/ml；交联剂于油相中质量浓度1.5-5mg/ml。

6.如权利要求1或2所述的转运载体，其特征在于：信号肽来源于叶绿体蛋白CrPDAT或GAP3，信号肽与载体颗粒的的质量比范围为1:10-1:20。

7.一种权利要求1-6任一所述靶向载体的应用，其特征在于：靶向载体可用于将靶向载体内包裹的交联剂递送至植物细胞内信号肽所靶向的叶绿体处。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：

利用包裹交联剂靶向叶绿体的转运载体与植物细胞共孵育，经过细胞内吞，载体依靠静电和信号肽的作用将交联剂运送至细胞内叶绿体的所在位置，并且释放交联剂，从而使交联剂原位交联叶绿体和/或除叶绿体之外所途径亚细胞器层面的蛋白质复合物；所述的线粒体以及到达线粒体之前所途径细胞内亚细胞器为：叶绿体内膜、叶绿体外膜、叶绿体类囊体、叶绿体基质中的一种或两种以上。

9.如权利要求7或8所述靶向载体的应用，其可用于植物细胞内蛋白质和/或植物细胞内蛋白质复合物的原位分析过程；蛋白质和/或蛋白质复合物的分析方法包括：(1)在收集的交联后的植物细胞叶绿体(体积为3-6ml)中加入3-9ml 8M尿素或4％十二烷基硫酸钠超声提取蛋白质和/或其复合物，然后加入二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦，并进行高温变性，所述高温变性的温度及时间为56℃15min或95℃5min；(2)将高温变性后的样品转移至滤膜上，利用碘代乙酰胺或N乙基马来酰亚胺进行烷基化，室温避光孵育30min；(3)利用胰酶对蛋白质及其复合物进行膜上酶切，并利用离心收集肽段和/或其交联肽段样品；(4)通过高分辨率质谱解析蛋白质和/或蛋白质复合物的交联信息。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于：利用高分辨质谱对蛋白质及其蛋白质复合物进行分析包括：蛋白质及其蛋白质复合物定性分析和/或定量分析过程采用液质联用，所述液质联用中的质谱为静电场轨道阱、飞行时间管和傅里叶变换质谱中的一种或二种以上，利用高分辨质谱对蛋白质及其蛋白质复合物进行分析时，采用的检索数据库包括：Mascot，pFind和pLink中的一种或二种以上；

所述的细胞内蛋白质复合物原位分析方法可应用于：细胞内原位蛋白复合体的规模化分析、细胞内亚细胞器蛋白质复合物规模化分析、细胞内原位目标蛋白质复合物分析、蛋白质的空间结构解析、蛋白质-蛋白质相互作用解析以及蛋白质时空动态变化分析中的一种或二种以上。

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