CN114573605A - Dna依赖蛋白激酶抑制剂及其应用 - Google Patents

Dna依赖蛋白激酶抑制剂及其应用 Download PDF

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CN114573605A CN202011387740.7A CN202011387740A CN114573605A CN 114573605 A CN114573605 A CN 114573605A CN 202011387740 A CN202011387740 A CN 202011387740A CN 114573605 A CN114573605 A CN 114573605A
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戚祖德
黄阳滨
伍世平
袁胜峰
胡文兵
李聪
袁文祥
李平
董思琪
岑玉杰
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Wuhan Guanggu Asia Pacific Medical Research Institute Co ltd
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Wuhan Guanggu Asia Pacific Medical Research Institute Co ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07D473/26—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with an oxygen, sulphur, or nitrogen atom directly attached in position 2 or 6, but not in both
    • C07D473/32—Nitrogen atom

Abstract

本发明涉及可用作DNA依赖蛋白激酶(DNA‑dependent protein kinase,DNA‑PK)抑制剂的化合物及其药学上可接受的盐，具体地，本发明化合物具有式I所示结构，其可用于治疗或者预防DNA‑PK介导的疾病(包括癌症)，并且可协同增强化疗和放疗效果，有效抑制肿瘤生长，同时可有效降低对正常细胞的损伤，减少副作用。

Description

DNA依赖蛋白激酶抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体地，本发明涉及DNA依赖蛋白激酶抑制剂及其应用。
背景技术
DNA损伤受到自然环境的因素比较多，比如，紫外线、电离辐射、药物诱导等因素。其中，电离辐射(IR)可以诱导多种DNA损伤，其中，双链断裂(DSB)是最具有细胞毒性的。如果DNA未快速和完全修复，这些DSB可经由凋亡和/或有丝分裂灾难而导致细胞死亡。除了IR以外，某些化学治疗剂(包括拓扑异构酶II抑制剂、博来霉素和阿霉素)也会引起DSB。这些双链DNA的损伤通过DNA损伤响应网络出发一系列复杂的信号，这些信号发挥作用而修复受伤的DNA并维持细胞活力和基因组稳定性。
在哺乳动物细胞中，DSB的主要修复途径是非同源末端接连途径(NHEJ)。无论处于细胞周期的哪个期，NHEJ途径均发挥作用，并且不需要模板来重新链接断裂的 DNA末端。NHEJ需要许多蛋白质和信号传导途径的协作。核心NHEJ机制由Ku70/80 异二聚体和DNA依赖蛋白激酶的催化亚基(DNA-PKc)组成，这二者一起构成活性的 DNA-PK酶复合物。
DNA-PKc是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族的成员，该家族还包括共济失调毛细管扩张突变激酶(ATM)、共济失调毛细管扩张和 Rad3相关激酶(ATR)、mTOR和四种PI3K同种型。然而，虽然DNA-PKc属于与 ATM和ATR相同的蛋白激酶家族，但后两种激酶通过同源重组(HR)途径发挥作用来修复DNA损伤并且局限于细胞周期的S期和G2期。虽然ATM也被募集到DSB的位点，但ATR被募集到单链DNA断裂的位点。
NHEJ被认为通过三个关键的步骤开展：识别DSB；进行DNA加工以移除端点处的不可链接末端或其他形式损伤；以及最后连接DNA末端。识别DSB通过这样来进行；Ku异二聚体结合至不完全的(ragged)DNA末端，然后募集两分子的DNA-PKc至 DSB的相邻侧；这用于保护断裂端点直至募集额外的加工酶。
最近的数据支持这样的假说：DNA-PKc使加工酶Artemis以及其自身磷酸化以使DNA末端准备进行另外的加工。在某些情况下，在连接步骤之前可能需要DNA聚合酶来合成新的末端。DNA-PKc的自磷酸化作用据信可诱导构象改变，该构象改变使中心的 DNA结合空穴打开，从DNA释放DNA-PKc，并帮助DNA末端的最终重新连接。
DNA-PK+/-小鼠对IR的效应高度敏感并且DNA-PKc的一些非选择性小分子抑制剂可使广泛的一组遗传背景的多种肿瘤细胞类型放射致敏。
由于肿瘤细胞具有较高基础水平的内源复制压力和DNA损伤(癌基因诱导的复制压力)并且在肿瘤细胞中DNA修复机制效率较低，因此肿瘤细胞对DNA-PK的敏感性更高。最近的研究发现DNA-PK抑制剂与精确递送聚焦IR(包括图像引导的RT (IGRT)和强度调整RT(IMRT))相组合将会改善治疗窗口，更好地免除对正常组织的影响。
目前，开发选择性好、毒性低、生物利用度高的DNA-PK抑制剂具有重要的临床意义，其可协同增强化疗和放疗效果，有效抑制肿瘤生长，同时可有效降低对正常细胞的损伤，减少副作用。
发明内容
本发明目的是提供一种DNA-PK抑制剂，其可有效抑制肿瘤生长，同时可有效降低对正常细胞的损伤，并且具有选择性好、毒性低、生物利用度高、清除率高、副作用小的优点。
本发明的第一方面，提供一种式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，
Figure BDA0002810193090000021
其中：
W独立选自：
Figure BDA0002810193090000022
其中，X1独立地为N或CRa，X2为N或CRb，X3独立地为N或CRc；Y1独立为N或CRd；
其中，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地选自：氢、卤素、羟基、氰基、氨基、C1-6烷基或卤代C1-6烷基；R1选自：氢、卤素、羟基、氨基、C1-3烷基、卤代C1-3烷基、C3-6环烷基或C3-6环氧烷基；
U独立选自取代或未取代的下组基团：C5-12饱和或不饱和桥环碳环基、C5-12饱和或不饱和螺环碳环基、C5-12饱和或不饱和稠合碳环基、5-12元桥环杂环基、5-12元杂环基和5-12元稠合杂环基；
其中，所述取代基团是指选自下组的一个或多个基团：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000031
Figure BDA0002810193090000032
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、 C3-6环烷基、C3-6环氧烷基、3-6元杂环基，其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、3-6元杂环基；
Z独立选自：H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、3-6元杂环基；
其中，所述的C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基、3-6元杂环基可任选地被选自下组的一个或多个基团取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基、3-6元杂环基。
在另一优选例中，U选自：
Figure BDA0002810193090000033
Figure BDA0002810193090000034
式中，E1、E2、E3、E4各自独立地为C3-6环烷基、3-6元杂环基；
各A独立地选自：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(NRf)-、-N(Rf)-、-C(Ri)(Rj)-；
M独立地选自：N或C(Ri)；
各Rm独立地选自：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000035
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、 -COORe、
Figure BDA0002810193090000036
Figure BDA0002810193090000037
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
q为0、1、2、3、4、5或6；
n为1、2、3、4、5或6。
在另一优选例中，所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，U选自：
Figure BDA0002810193090000041
Figure BDA0002810193090000042
其中，各A独立地选自：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(NRf)-、-N(Rf)-、-C(Ri)(Rj)-；
M独立地选自：N或C(Ri)；
各Rm独立地选自：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000043
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000051
Figure BDA0002810193090000052
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
q为0、1、2、3、4、5或6；
n为1、2、3、4、5或6。
在另一优选例中，U选自：
Figure BDA0002810193090000053
Figure BDA0002810193090000054
其中，A、M、Rh的定义如上所述。
在另一优选例中，所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，U选自：
Figure BDA0002810193090000055
Figure BDA0002810193090000056
Figure BDA0002810193090000061
其中，Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000062
Figure BDA0002810193090000063
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、 C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
n为1、2、3、4、5或6。
在另一优选例中，Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、卤代甲基(如CH2Cl、CHCl2、CCl3、 CH2F、CHF2、CF3)、卤代乙基(如CH2CH2Cl、CH2CHCl2、CH2CCl3、CH2CH2F、CH2CHF2、 CH2CF3)、卤代异丙基(如CH3CHCH2 Cl、CH3CHCH2Cl2、CH3CHCCl3、CH3CHCH2F、 CH3CHCHF2、CH3CHCF3)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、卤代甲氧基(如OCF3)、卤代乙氧基(如OCH2CF3)、卤代异丙氧基(如OCH(CH3)(CF3))、环丙基、环丁基、环戊基、环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基、
Figure BDA0002810193090000064
羟基、氨基、氰基、-C(O)Me、-C(O)Et、-C(O)OMe、-C(O)OEt、-S(O)2Me、-S(O)2Et。
在另一优选例中，各Rm独立地选自：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、卤代甲基(如CH2Cl、CHCl2、CCl3、CH2F、CHF2、CF3)、卤代乙基(如CH2CH2Cl、CH2CHCl2、CH2CCl3、CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3)、卤代异丙基(如CH3CHCH2 Cl、 CH3CHCH2Cl2、CH3CHCCl3、CH3CHCH2F、CH3CHCHF2、CH3CHCF3)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、卤代甲氧基(如OCF3)、卤代乙氧基(如OCH2CF3)、卤代异丙氧基(如 OCH(CH3)(CF3))、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基、
Figure BDA0002810193090000071
羟基、氨基、氰基、-C(O)Me、-C(O)Et、- C(O)OMe、-C(O)OEt、-S(O)2Me、-S(O)2Et。
在另一优选例中，所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，U选自：
Figure BDA0002810193090000072
Figure BDA0002810193090000073
Figure BDA0002810193090000081
在另一优选例中，所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，W选自：
Figure BDA0002810193090000082
Figure BDA0002810193090000083
在另一优选例中，W选自：
Figure BDA0002810193090000084
Figure BDA0002810193090000085
在另一优选例中，所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，Z选自：甲基、乙基、环丙基。
在另一优选例中，W、U和Z为实施例中各具体化合物所对应基团。
在另一优选例中，所述的式I化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前药、溶剂合物，所述化合物选自下组：
Figure BDA0002810193090000086
Figure BDA0002810193090000091
在另一优选例中，所述化合物为实施例中所示化合物。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，包含第一方面所所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物；和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物还包括选自下组一种或多种其他抗癌剂：有丝分裂抑制剂(如阿霉素、羟喜树碱)、烷化剂(如环磷酰胺)、抗代谢物(如甲氨蝶呤、 5-氟-2'-脱氧脲核苷、吉西他滨、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、氟达拉滨、长春瑞滨等)、 DNA嵌合剂(如米托蒽醌)、抗肿瘤抗生素(如多柔比星)、生长因子抑制剂、信号传导抑制剂、细胞周期抑制剂、酶抑制剂、类维生素A受体调控剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂、激素类药物、血管再生抑制剂、细胞生长抑制剂、靶向抗体、HMG-CoA还原酶抑制剂和异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂。
在另一优选例中，所述的其他治疗剂可以是减轻或降低本发明化合物在用于治疗受试者疾病时所产生的一种或多种副作用的药物，也可以是增强本发明化合物药效的药物。
在另一优选例中，提供一种药物组合物的制备方法，包括步骤：将药学上可接受的载体与本发明所述第一方面所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物进行混合，从而形成药物组合物。
在另一优选例中，本发明化合物可以制备成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等。
本发明第三方面，提供一种第一方面所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物或第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备治疗或预防与DNA依赖蛋白激酶的活性或表达量相关的疾病的药物或药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为癌症。
本发明第四方面，提供一种第一方面所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物或第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备使癌细胞对于抗癌剂和/或电离辐射敏感的药物。
在另一优选例中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠直肠癌、胃-食道癌、纤维肉瘤、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、头颈鳞状上皮细胞癌、黑素瘤、肺癌、胰腺癌和前列腺癌
另一方面，本发明提供一种治疗与DNA-PK过度活化相关的疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的前述式I所示的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物或包含其的药物组合物；所述与DNA-PK过度活化相关的疾病为肿瘤或癌症。
另一方面，本发明提供一种增强患者对于抗癌剂或放疗敏感性的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的前述式I所示的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物或包含其的药物组合物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现一种新的DNA-PK抑制剂，其具有很好的生物活性，如选择性好、毒性低、生物利用度高、清除率高、副作用小等。具体地，本发明化合物对DNA-PKc蛋白的抑制活性可以低至0.16nM，对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ的选择性分别达到了500、2700、1700倍。同时，对本发明化合物的PK 和小鼠耐受量的测试发现，本发明化合物具有优异的生物利用度，达到192％，并且可快速被清除出体内；此外，在对裸鼠进行7天连续给药200mg/kg观察发现，化合物未显示出毒性问题，动物各项指标都表现正常。因此，本发明化合物作为DNA-PK抑制剂，相关的副作用显著下降，从而使得安全性显著提高。在此基础上，完成了本发明。
术语
术语“卤素”、“卤代”是指氟、氯、溴或碘。
术语“C1-4烷基”是指具有1、2、3、4个碳原子的直链或支链的饱和单价烃基团，术语“C1-6烷基”是指具有1、2、3、4、5、6个碳原子的直链或支链的饱和单价烃基团。上述C1-4烷基和C1-6烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基-正丁基、2-甲基-正丁基、3-甲基-正丁基、1,1-二甲基-正丙基、1,2-二甲基-正丙基、2,2-二甲基-正丙基、1-乙基-正丙基、正己基、1-甲基-正戊基、2-甲基-正戊基、3-甲基-正戊基、4-甲基-正戊基、1,1-二甲基-正丁基、1,2-二甲基-正丁基、1,3-二甲基-正丁基、2,2-二甲基-正丁基、2,3-二甲基-正丁基、 3,3-二甲基-正丁基、1-乙基-正丁基、2-乙基-正丁基、1,1,2-三甲基-正丙基、1,2,2-三甲基 -正丙基、1-乙基-1-甲基-正丙基、1-乙基-2-甲基-正丙基等。
术语“C1-6卤代烷基”是指直链或支链的饱和单价烃基团，其中，术语“C1-6卤代烷基”中的烷基如上文C1-6烷基所定义，其中，一个或多个氢原子被相同或不同的卤素原子替换，即一个卤素原子独立于另一个卤素原子。优选所述卤素原子是F。例如，- CF3、-CHF2、-CH2F、-CF2CF3或-CH2CF3。
术语“C1-6杂烷基”应理解为是指由一定数目碳原子和至少一个杂原子或杂原子组成的，稳定的直链或支链的烷基原子团或其组合物。优选地，杂原子选自B、O、N、和 S，其中，氮和硫原子任选地被氧化，氮杂原子任选地被季铵化。优选地，杂原子团选自：-C(＝O)O-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)N(H)-、-N(H)-、-S(＝O)2 N(H)-、-S(＝O)2N(H)-。
术语“C1-6烷氧基”应理解为是指式-O-烷基的直链或支链的饱和单价烃基团，其中，术语“烷基”如上文C1-6烷基所定义，例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、1-甲基-正丁氧基、2-甲基- 正丁氧基、3-甲基-正丁氧基、1,1-二甲基-正丙氧基、1,2-二甲基-正丙氧基、2,2-二甲基- 正丙氧基、1-乙基-正丙氧基、正己氧基、1-甲基-正戊氧基、2-甲基-正戊氧基、3-甲基- 正戊氧基、4-甲基-正戊氧基、1,1-二甲基-正丁氧基、1,2-二甲基-正丁氧基、1,3-二甲基- 正丁氧基、2,2-二甲基-正丁氧基、2,3-二甲基-正丁氧基、3,3-二甲基-正丁氧基、1-乙基- 正丁氧基、2-乙基-正丁氧基、1,1,2-三甲基-正丙氧基、1,2,2-三甲基-正丙氧基、1-乙基-1- 甲基-正丙氧基、1-乙基-2-甲基-正丙氧基等，或其异构体。
术语“环烷基”是指包含特定数目的C原子的环状烷基，其可以是单环(如C3-6环烷基)，也可以是双环或三环形式，例如桥环、稠环或螺环(如C5-C12桥环烷基、C5- C12稠环烷基、C5-C12螺环烷基)形式。其中，“C3-6环烷基”是指具有3、4、5、6 个碳原子的环状饱和单价烃基团，C3-6环烷基的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、 1-甲基-环丙基、2-甲基-环丙基、环戊基、1-甲基-环丁基、2-甲基-环丁基、3-甲基-环丁基、1,2-二甲基-环丙基、2,3-二甲基-环丙基、1-乙基-环丙基、2-乙基-环丙基、环己基、 1-甲基-环戊基、2-甲基-环戊基、3-甲基-环戊基、1-乙基-环丁基、2-乙基-环丁基、3-乙基-环丁基、1,2-二甲基-环丁基、1,3-二甲基-环丁基、2,2-二甲基-环丁基、2,3-二甲基-环丁基、2,4-二甲基-环丁基、3,3-二甲基-环丁基、1-正丙基-环丙基、2-正丙基-环丙基、1- 异丙基-环丙基、2-异丙基-环丙基、1,2,2-三甲基-环丙基、1,2,3-三甲基-环丙基、2,2,3- 三甲基-环丙基、1-乙基-2-甲基-环丙基、2-乙基-1-甲基-环丙基、2-乙基-2-甲基-环丙基、 2-乙基-3-甲基-环丙基等；其中，桥环、稠环或螺环烷基可由如下环烷基去掉一个H原子得到：
Figure BDA0002810193090000121
Figure BDA0002810193090000122
术语“环烯基”是指包含一个或多个双键和特定数目C原子的环状烷基，其可以是单环(如C3-6环烯基)，也可以是双环或多环(如三环)形式，例如桥环、稠环或螺环 (如C6-C12桥环烯基、C6-C12稠环烯基、C6-C12螺环烯基)形式。其中，桥环、稠环或螺环烷基可由如下环烷基去掉一个H原子得到：
Figure BDA0002810193090000123
术语“3-至7-元杂环烷基”是指饱和的单价的单-或双环烃环，其含有2、3、4、5、 6、7个碳原子，以及一个或多个选自C(＝O)、O、S、S(＝O)、S(O)2、NRx的含有杂原子的基团，其中，Rx代表氢原子或C1-6-烷基或者C1-6-卤代烷基；所述杂环烷基可以通过任何一个碳原子，或，如果存在的话，氮原子，与分子的其余部分相连接。
尤其是，所述3-至7-元杂环烷基可以含有2、3、4或5个碳原子，以及一个或多个上述含有杂原子的基团。例如可以是，氧杂环丙烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、氮杂环丁烷基、吗啉基、二氢-2H-吡喃基、四氢吡啶基、四氢呋喃基等。
术语“杂环基”是指具有选自N、S和O的杂原子的饱和或部分饱和的环状基团，其可以是单环(如3-6元杂环烷基)，也可以是双环或多环(如三环)形式，例如桥环或螺环(如5-12元桥杂环基、5-12元稠合杂环基、5-12元螺杂环基)形式。单环杂环基实例包括但不限于：氧杂环丁烷、氮杂环丁烷、四氢-2H-吡喃基、哌啶基、哌嗪基、四氢呋喃基、吗啉基和吡咯烷基等；双环或多环杂环基的实例包括但不限于
Figure BDA0002810193090000124
Figure BDA0002810193090000131
Figure BDA0002810193090000132
等类似基团，本发明中，所述的杂环基还意在包含取代杂环基。
术语“碳环基”是指如上所述的环烷基或环烯基。
术语“杂芳基”是指单价的单环或双环的芳香环系统，其具有5、6、7、8、9、 10、11或12个环原子，尤其是5或6个环原子，并且含有至少一个可以相同或不同的杂原子，所述杂原子选自：氧、氮或硫。此外，杂芳基可以是苯并稠合的。杂芳基的例子包括但不限于：2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噁唑基、4-噁唑基、5- 噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、3-异噻唑基、4-异噻唑基、5-异噻唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基等。
术语“芳基”是指环上不含杂原子的芳香族环基，“C6-C12芳基”是指在环上不含杂原子的具有6至12个碳原子的芳香族环基，所述芳基可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环。如苯基(即六元芳环)、萘基等，其中六元芳基还意在包含六元芳基并5-6元环烷基和六元芳基并5-6元杂环烷基。C6-C12 芳基优选C6-C10芳基。芳基可以是任选取代的或未取代的。
“稠合环”是指共享两个相邻环原子的双环。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或状况可能但不是必须出现的，并且该描述包括其中所描述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
在本发明中，术语“取代”指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。特定的取代基为在前文中相应描述的取代基，或各实施例中所出现的取代基。除非特别说明，某个取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的。本领域技术人员应理解，本发明所预期的取代基的组合是那些稳定的或化学上可实现的组合。
术语“任选取代的”是指被具体基团、原子团或部分任选取代。环系取代是指与芳香族或非芳香族环体系链接的取代基，例如替换环体系上的可得氢。
本文使用的术语“一个或多个”，例如，在本发明的通式的化合物的取代基的定义中，是指“一个、两个、三个、四个或五个，尤其是一个、两个、三个或四个，更尤其是一个、两个或三个，更加尤其是一个或两个”。
术语“药学上可接受的载体”是指与配制品的其他成分相容的载体，例如稀释剂或赋形剂。赋形剂表示不具有治疗活性且无毒的任何成分，例如配制药品的崩解剂、粘合剂、填充剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、润滑剂等。
术语“增殖性疾病”包括恶性疾病，例如癌症，以及非恶性疾病，例如炎性疾病、阻塞性气道疾病、免疫疾病或心血管疾病。
除非特别说明，本发明所描述的结构式意在包括所有的同分异构形式(如对映异构，非对映异构和几何异构体(或构象异构体))：例如含有不对称中心的R、S构型，双键的(Z)、(E)异构体等。因此，本发明化合物的单个立体化学异构体或其对映异构体、非对映异构体或几何异构体(或构象异构体)的混合物都属于本发明的范围。
如本文所用，术语“互变异构体”表示具有不同能量的结构同分异构体可以超过低能垒，从而互相转化。比如，质子互变异构体(即质子移变)包括通过质子迁移进行互变，如1H-吲唑与2H-吲唑。化合价互变异构体包括通过一些成键电子重组而进行互变。
如本文所用，术语“溶剂合物”是指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定比例的配合物。
活性成分
如本文所用，“本发明化合物”指式I所示的化合物，并且还包括及式I化合物的立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物。
所述式I化合物具有如下结构：
Figure BDA0002810193090000151
其中，W、U和Z的定义如上所述。
优选地，式I中，U选自：
Figure BDA0002810193090000152
Figure BDA0002810193090000153
式中，E1、E2、E3、E4各自独立地为C3-6环烷基、3-6元杂环基(优选地为3-6元杂环烷基)；
各A独立地选自：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(NRf)-、-N(Rf)-、-C(Ri)(Rj)-；
M独立地选自：N或C(Ri)；
各Rm独立地选自：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000154
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、 -COORe、
Figure BDA0002810193090000155
Figure BDA0002810193090000156
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
q为0、1、2、3、4、5或6；
n为1、2、3、4、5或6。
优选地，式I中，U选自：
Figure BDA0002810193090000161
Figure BDA0002810193090000162
其中，各A独立地选自：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(NRf)-、-N(Rf)-、-C(Ri)(Rj)-；
M独立地选自：N或C(Ri)；
各Rm独立地选自：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000163
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；更优选地，Rm独立地选自：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、卤代甲基(如 CH2Cl、CHCl2、CCl3、CH2F、CHF2、CF3)、卤代乙基(如CH2CH2Cl、CH2CHCl2、CH2CCl3、CH2CH2F、CH2CHF2、CH2CF3)、卤代异丙基(如CH3CHCH2 Cl、CH3CHCH2Cl2、CH3CHCCl3、 CH3CHCH2F、CH3CHCHF2、CH3CHCF3)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、卤代甲氧基(如 OCF3)、卤代乙氧基(如OCH2CF3)、卤代异丙氧基(如OCH(CH3)(CF3))、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基、
Figure BDA0002810193090000164
Figure BDA0002810193090000171
羟基、氨基、氰基、-C(O)Me、-C(O)Et、-C(O)OMe、-C(O)OEt、-S(O)2Me、-S(O)2Et；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；n为1、2、3、4、5或6；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure BDA0002810193090000172
Figure BDA0002810193090000173
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、 C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基；q为1、2、 3、4、5或6；
更优选地，Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、卤代甲基(如CH2Cl、CHCl2、CCl3、 CH2F、CHF2、CF3)、卤代乙基(如CH2CH2Cl、CH2CHCl2、CH2CCl3、CH2CH2F、CH2CHF2、 CH2CF3)、卤代异丙基(如CH3CHCH2Cl、CH3CHCH2Cl2、CH3CHCCl3、CH3CHCH2F、 CH3CHCHF2、CH3CHCF3)、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、卤代甲氧基(如OCF3)、卤代乙氧基(如OCH2CF3)、卤代异丙氧基(如OCH(CH3)(CF3))、环丙基、环丁基、环戊基、环丙基氧基、环丁基氧基、环戊基氧基、环己基氧基、
Figure BDA0002810193090000174
羟基、氨基、氰基、-C(O)Me、-C(O)Et、-C(O)OMe、-C(O)OEt、-S(O)2Me、-S(O)2Et；
W选自：
Figure BDA0002810193090000175
Figure BDA0002810193090000176
Z选自：H、甲基、氘代甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、二氟甲基。
优选地，式I中，U选自：
Figure BDA0002810193090000177
Figure BDA0002810193090000178
Figure BDA0002810193090000181
W选自：
Figure BDA0002810193090000182
Z选自：H、甲基、氘代甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、二氟甲基。
本发明中的化合物可能形成的盐也是属于本发明的范围。除非另有说明，本发明中的化合物被理解为包括其盐类。在此使用的术语“盐”，指用无机或有机酸和碱形成酸式或碱式的盐。此外，当本发明中的化合物含一个碱性片段时，它包括但不限于吡啶或咪唑，含一个酸性片段时，包括但不限于羧酸，可能形成的两性离子(“内盐”)包含在术语“盐”的范围内。药学上可接受的(即无毒，生理可接受的)盐是首选，虽然其他盐类也有用，例如可以用在制备过程中的分离或纯化步骤。本发明的化合物可能形成盐，例如，化合物I与一定量如等当量的酸或碱反应，在介质中盐析出来，或在水溶液中冷冻干燥得来。
本发明中的化合物含有的碱性片段，包括但不限于胺或吡啶或咪唑环，可能会和有机或无机酸形成盐。可以成盐的典型的酸包括醋酸盐(如用醋酸或三卤代醋酸，如三氟乙酸)、己二酸盐、藻朊酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二甘醇酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、羟基乙磺酸盐(如，2-羟基乙磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐(如，2-萘磺酸盐)、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐(如3-苯丙酸盐)、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐，水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐(如与硫酸形成的)、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐如对甲苯磺酸盐、十二烷酸盐等等。
本发明的某些化合物可能含有的酸性片段，包括但不限于羧酸，可能会和各种有机或无机碱形成盐。典型的碱形成的盐包括铵盐、碱金属盐如钠、锂、钾盐，碱土金属盐如钙、镁盐和有机碱形成的盐(如有机胺)，如苄星、二环已基胺、海巴胺(与N,N-二(去氢枞基)乙二胺形成的盐)、N-甲基-D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖酰胺、叔丁基胺，以及和氨基酸如精氨酸、赖氨酸等等形成的盐。碱性含氮基团可以与卤化物季铵盐，如小分子烷基卤化物(如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物及碘化物)，二烷基硫酸盐(如，硫酸二甲酯、二乙酯，二丁酯和二戊酯)，长链卤化物(如癸基、十二烷基、十四烷基和十四烷基的氯化物、溴化物及碘化物)，芳烷基卤化物(如苄基和苯基溴化物)等等。
本发明中化合物的前药及溶剂合物也在涵盖的范围之内。此处术语“前药”是指一种化合物，在治疗相关疾病时，经过代谢或化学过程的化学转化而产生本发明中的化合物、盐、或溶剂合物。本发明的化合物包括溶剂合物，如水合物。
本发明中的化合物、盐或溶剂合物，可能存在的互变异构形式(例如酰胺和亚胺醚)。所有这些互变异构体都是本发明的一部分。
所有化合物的立体异构体(例如，那些由于对各种取代可能存在的不对称碳原子)，包括其对映体形式和非对映形式，都属于本发明的设想范围。本发明中的化合物独立的立体异构体可能不与其他异构体同时存在(例如，作为一个纯的或者实质上是纯的光学异构体具有特殊的活性)，或者也可能是混合物，如消旋体，或与所有其他立体异构体或其中的一部分形成的混合物。本发明的手性中心有S或R两种构型，由理论与应用化学国际联合会(IUPAC)1974年建议定义。外消旋形式可通过物理方法解决，例如分步结晶，或通过衍生为非对映异构体分离结晶，或通过手性柱色谱法分离。单个的光学异构体可通过合适的方法由外消旋体得到，包括但不限于传统的方法，例如与光学活性酸成盐后再结晶。
本发明中的化合物，依次通过制备、分离纯化获得的该化合物其重量含量等于或大于90％，例如，等于或大于95％，等于或大于99％(“非常纯”的化合物)，在正文描述列出。此处这种“非常纯”本发明的化合物也作为本发明的一部分。
本发明的化合物所有的构型异构体都在涵盖的范围之内，无论是混合物、纯的或非常纯的形式。在本发明化合物的定义包含顺式(Z)和返式(E)两种烯烃异构体，以及碳环和杂环的顺式和反式异构体。
在整个说明书中，基团和取代基可以被选择以提供稳定的片段和化合物。
特定官能团和化学术语定义都详细介绍如下。对本发明来说，化学元素与Periodic Table of the Elements，CAS version，Handbook of Chemistry and Physics，75th Ed.中定义的一致。特定官能团的定义也在其中描述。此外，有机化学的基本原则以及特定官能团和反应性在“Organic Chemistry”，Thomas Sorrell，University ScienceBooks，Sausalito: 1999，也有说明，其全部内容纳入参考文献之列。
本发明的某些化合物可能存在于特定的几何或立体异构体形式。本发明涵盖所有的化合物，包括其顺式和反式异构体、R和S对映异构体、非对映体、(D)型异构体、(L) 型异构体、外消旋混合物和其它混合物。另外不对称碳原子可表示取代基，如烷基。所有异构体以及它们的混合物，都包涵在本发明中。
按照本发明，同分异构体的混合物含有异构体的比率可以是多样的。例如，在只有两个异构体的混合物可以有以下组合：50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，95:5， 96:4，97:3，98:2，99:1，或100:0，异构体的所有比率都在本发明范围之内。本专业内一般技术人员容易理解的类似的比率，及为更复杂的异构体的混合物的比率也在本发明范围之内。
本发明还包括同位素标记的化合物，等同于原始化合物在此公开。不过实际上对一个或更多的原子被与其原子量或质量序数不同的原子取代通常会出现。可以列为本发明的化合物同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯同位素，分别如2H、3H、13C、11C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。本发明中的化合物，或对映体，非对映体，异构体，或药学上可接受的盐或溶剂化物，其中含有上述化合物的同位素或其他同位素原子都在本发明的范围之内。本发明中某些同位素标记化合物，例如3H 和14C的放射性同位素也在其中，在药物和底物的组织分布实验中是有用的。氚，即3H 和碳-14，即14C，它们的制备和检测比较容易。是同位素中的首选。此外，较重同位素取代如氘，即2H，由于其很好的代谢稳定性在某些疗法中有优势，例如在体内增加半衰期或减少用量，因此，在某些情况下可以优先考虑。同位素标记的化合物可以用一般的方法，通过用易得的同位素标记试剂替换为非同位素的试剂，用批露在示例中的方案可以制备。
如果要设计一个本发明的化合物特定的对映体的合成，它可以不对称合成制备，或用手性辅剂衍生化，将所产生的非对映混合物分离，再除去手性辅剂而得到纯的对映体。另外，如果分子中含有一个碱性官能团，如氨基酸，或酸性官能团，如羧基，可以用合适的光学活性的酸或碱的与之形成非对映异构体盐，再通过分离结晶或色谱等常规手段分离，然后就得到了纯的对映体。
如本文所述，本发明中的化合物可与任何数量取代基或官能团取而扩大其包涵范围。通常，术语“取代”不论在术语“可选”前面或后面出现，在本发明配方中包括取代基的通式，是指用指定结构取代基，代替氢自由基。当特定结构中的多个在位置被多个特定的取代基取代时，取代基每一个位置可以是相同或不同。本文中所使用的术语“取代”包括所有允许有机化合物取代。从广义上讲，允许的取代基包括非环状的、环状的、支链的非支链的、碳环的和杂环的，芳环的和非芳环的有机化合物。在本发明中，如杂原子氮可以有氢取代基或任何允许的上文所述的有机化合物来补充其价态。此外，本发明是无意以任何方式限制允许取代有机化合物。本发明认为取代基和可变基团的组合在以稳定化合物形式在疾病的治疗上是很好的。此处术语“稳定”是指具有稳定的化合物，在足够长的时间内检测足以维持化合物结构的完整性，最好是在足够长的时间内都在效，本文在此用于上述目的。
本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的代谢产物，以及可以在体内转变为本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的结构的前药，也包含在本申请的权利要求中。
制备方法
以下方案和实例中描述了制备式I的化合物的方法。原料和中间体从商业来源购买，由已知步骤制备，或以其他方式说明。在某些情况下，可以改变执行反应方案的步骤的顺序，以促进反应或避免不需要的副反应产物。
下面更具体地描述本发明式(I)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
通常，在制备流程中，各反应通常惰性气体保护下，适当溶剂中，在0到90℃下进行，反应时间通常为2-24小时。
方法一：
Figure BDA0002810193090000211
s1)在惰性溶剂(乙腈、四氢呋喃或者二氧六环等)中，碱(三乙胺、碳酸钠、碳酸铯或者N,N-二异丙基乙胺等)存在下，化合物1a-1与化合物H2N-U反应，然后经过水解得到化合物1a-2；
s2)在惰性溶剂(四氢呋喃或者二甲基乙酰胺)中，催化剂(叠氮磷酸二苯酯)存在下，化合物1a-2得到氨基的中间体，与碘甲烷和无机碱在四氢呋喃的溶剂中反应得到化合物1a-3；
s3)在惰性溶剂(四氢呋喃、乙腈、或者二氧六环)中，催化剂(钯催化和磷配体) 存在下，化合物1a-3与化合物
Figure BDA0002810193090000221
反应，得到化合物1a-4；
方法二：
Figure BDA0002810193090000222
s1')在惰性溶剂(乙腈、四氢呋喃或者二氧六环等)中，碱(三乙胺、碳酸钠、碳酸铯或者N,N-二异丙基乙胺等)存在下，化合物1b-1与化合物H2N-U反应，得到化合物 1b-2；
s2')在惰性溶剂(甲醇、乙醇或者四氢呋喃)中，催化剂(钯炭和氢气)存在下，化合物1b-2转化成氨基化合物中间体，该中间体按照顺序与CDI和碘甲烷进行反应，得到化合物1b-3；
s3')在惰性溶剂(四氢呋喃、乙腈、或者二氧六环等)中，催化剂(钯催化和磷配体)存在下，化合物1b-3与化合物
Figure BDA0002810193090000223
反应，得到化合物1b-4；
方法三：
Figure BDA0002810193090000224
s1”)在惰性溶剂(乙腈、四氢呋喃或者二氧六环等)中，碱(三乙胺、碳酸钠、碳酸铯或者N,N-二异丙基乙胺等)存在下，化合物1c-1与化合物H2N-U反应，得到化合物1c-2；
s2”)在惰性溶剂(四氢呋喃或者二甲基乙酰胺)中，催化剂(叠氮磷酸二苯酯)存在下，化合物1c-2在该条件生成得到氨基的中间体，与碘甲烷和无机碱在四氢呋喃的溶剂中反应得到化合物1c-3；
s3”)在惰性溶剂(二氯甲烷、四氢呋喃等)中，氧化剂(间氯过氧苯甲酸)存在下，化合物1c-3发生反应，得到化合物1c-4；
s4”)在惰性溶剂(四氢呋喃、乙腈、或者二氧六环等)中，碱(钯催化和磷配体)
存在下，化合物1c-4与化合物
Figure BDA0002810193090000225
反应，得到化合物1c-5；
上述各式中，G选自：甲基、乙基；
W、U、Z的定义如上所述。
本发明化合物合成方法中所用起始原料和试剂均可商业购买或通过文献报道的方法合成。
除上述的路线外，也可根据有机合成领域技术人员的公知常识，采用其他路线合成目标化合物。因此，在如上所示方案中所示的转化次序并非意图为限制的，并可结合来自不同方案的适当合成步骤以形成另外的合成顺序。此外，可在所示例的转化之前和/或之后完成取代基W，Z，U中任一个的修饰。这些修饰可为保护基的引入、保护基的裂解、官能团的还原或氧化、卤化、金属化、金属催化偶联反应、取代或本领域技术人员已知的其它反应。这些转化包括引入可使取代基进一步互变的官能团的转化。合适的保护基及其引入或裂解为本领域技术人员所公知(参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts， Protective Groups inOrganic Synthesis，第四版，Wily 2006)。具体的实施例描述于后续段落中。此外，如本领域技术人员所公知，有可能可以进行两个以上的连续步骤而不在所述步骤之间进行后处理，例如“一锅”反应。
药物组合物和施用方法
本发明所述的药物组合物用于预防和/或治疗以下疾病：炎症、癌症、心血管疾病、感染、免疫性疾病、代谢性疾病。
通式(I)所述化合物可以与已知的治疗或改进相似病状的其他药物联用。联合给药时，原来药物的给药方式和剂量可以保持不变，而同时或随后服用式I的化合物。当式I化合物与其它一种或几种药物同时服用时，可以优选使用同时含有一种或几种已知药物和式I化合物的药用组合物。药物联用也包括在重叠的时间段服用式I化合物与其它一种或几种已知药物。当式I化合物与其它一种或几种药物进行药物联用时，式I化合物或已知药物的剂量可能比它们单独用药的剂量低。
可以与通式(I)所述化合物进行药物联用的药物或活性成分包括但不局限为：有丝分裂抑制剂(如阿霉素、羟喜树碱)、烷化剂(如环磷酰胺)、抗代谢物(如甲氨蝶呤、5-氟-2'-脱氧脲核苷、吉西他滨、去氧氟尿苷、阿糖胞苷、氟达拉滨、长春瑞滨等)、DNA嵌合剂(如米托蒽醌)、抗肿瘤抗生素(如多柔比星)、生长因子抑制剂、信号传导抑制剂、细胞周期抑制剂、酶抑制剂、类维生素A受体调控剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、生物应答调节剂、激素类药物、血管再生抑制剂、细胞生长抑制剂、靶向抗体、HMG-CoA还原酶抑制剂和异戊二烯基蛋白质转移酶抑制剂。
本发明药物组合物的剂型包括(但并不限于)：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用擦剂、控释型或缓释型或纳米制剂。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂
Figure BDA0002810193090000241
润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明治疗方法可以单独施用，或者与其它治疗手段或者治疗药物联用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选50～1000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供了一种药物组合物的制备方法，包括步骤：将药学上可接受的载体与本发明所述通式(I)化合物或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物进行混合，从而形成药物组合物。
本发明还提供了一种治疗方法，它包括步骤：给需要治疗的对象施用本发明中所述通式(I)化合物，或其晶型、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，或施用本发明所述的药物组合物，用于选择性地抑制DNA-PK。
本发明具有以下主要优点：
(1)本发明化合物对DNA-PK激酶具有优良的抑制能力，以及对DNA-PK激酶具有优良选择性；
(2)本发明化合物具有更低的毒副作用。
(3)本发明化合物更好的药效学、药代动力学性能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
中间体的合成
中间体12的合成：
Figure BDA0002810193090000261
步骤1：化合物12b的合成
在25℃温度条件下，将化合物12a(5.0g，32.60mmol)滴加到含有N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(DMF-DMA)(13.0mL)的甲苯(50.0mL)溶液中，110℃温度条件下反应2小时。2小时后，将反应液直接旋干，得到粗品(6.50g),粗品直接用于下一步反应。
步骤2：化合物12c的合成
在100mL单口瓶中，将上述粗品(6.50g)用MeOH(50mL)溶解后滴加到 NH2OH.HCl(4.5g,65.6mmol)中，75℃温度条件下反应1小时。TLC(PE:EA＝3:1,碘显)显示原料反应完全，而且有一个新点生成，将反应液先旋干，然后向其中加入EA (25.0mL)和水(25.0mL)萃取,所得有机相干燥，过滤，旋干后，得到目标物质的质量为6.0g,两步收率为93.60％。
步骤3：化合物12d的合成
在100mL三口瓶中，0℃条件下将化合物12c(6.0g,30.59mmol)溶解于 THF(60.0mL)中，随后向反应液中缓慢滴加TFAA(4.9mL)，25℃温度条件下反应 12hrs。LCMS显示原料反应完全，有产物Ms生成，向反应液中加入EA(30.0mL)和水(30.0mL)萃取,所得有机相干燥，过滤，旋干后，拌样过柱纯化，得到目标产物 4.50g，收率为82.57％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝0.581min,(M+H)＝179.10。
步骤4：化合物12的合成
在100mL单口瓶中，25℃条件下将化合物12d(4.5g,25.26mmol)溶解于 EtOH(45.0mL)中，随后在N2氛围下，向反应液中加入Pd/C(450.00mg)，H2氛围下置换3次后，在H2下反应12小时。LCMS显示原料反应完全，有产物Ms生成，向反应液过滤，母液旋干后，拌样过柱纯化，得到墨绿色的固体物质2.70g，收率为 72.22％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝0.468min,(M+H)＝149.02。
分析方法：
仪器：Agilent LCMS(G6125C)
色谱柱：Agilent Eclipse pLus C18(100*4.6mm*3.5um)
进样量：2uL，柱温：35℃，流速：1.5mL/min
检测波长：254\220\365nm
流动相A：0.02％甲酸水溶液
流动相B：0.02％甲酸乙腈溶液
洗脱梯度：
T/min A％ B％
0 95 5
12 5 95
实施例I.化合物101的合成
Figure BDA0002810193090000271
步骤1：化合物3的合成
在25℃温度下，将溶于500mL DCM的1(25.9g，0.227mol)溶液逐滴加入到含有 2(159g，2.27mol)和醋酸铑二聚体(1.0g，2.2mmol)的DCM溶液中，室温反应18h。该反应完成后，反应液旋蒸拌样，过硅胶柱纯化，得15.0g无色油状粗产物粗品3，直接用于下一步反应。
步骤2：化合物4的合成
在25℃温度下，将LiOH.H2O加入到含有3(15g，粗品)的THF/H2O(2:1，60mL) 溶液中，25℃反应2h。该反应液用乙酸乙酯萃取多次后，母液用2N盐酸溶液调pH至 1-2，再用乙酸乙酯萃取，干燥，过滤，旋干，得2.2g淡黄色固体产物4，两步收率7％。
步骤3：化合物5的合成
在25℃温度下，将DPPA(4.29g，15.6mmol)逐滴加入到含有4(2.0g，15.6mmol)、TEA(1.58g，15.6mmol)和苯甲醇(3.4g，31.4mmol)的DMAc(20mL)溶液中，在氮气的保护下，在25℃温度下反应1h后，体系加热到100℃反应12h。反应完毕后，向反应液加入到一定量的水，用乙酸乙酯萃取多次后，饱和食盐水洗涤多次，干燥，过滤，硅胶拌样，过硅胶柱纯化，得2.2g淡黄色固体产物5，收率61％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝1.210min,(M+H)＝234.20，(M-44+H)＝190.19。
1H NMR：(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.43(d,J＝31.0Hz,1H),7.38–7.26(m,5H),5.01(d,J＝4.1Hz,2H),3.78(d,J＝8.4Hz,2H),3.58(dt,J＝8.4,1.6Hz,2H),2.25(q,J＝2.7 Hz,1H),1.74(d,J＝2.1Hz,2H).
步骤4：化合物6的合成
在25℃温度下，将Pd/C(100mg，10％)加入到含有5(2.0g，7.3mmol)的乙醇溶液中，在氢气的保护下，25℃反应12h后，过滤，室温旋干，得到化合物6的淡黄色油状粗产物800mg，收率100％。
步骤5：化合物8的合成
在25℃温度下，将6(800mg，8mmol)加入到含有7(1.78g，8mmol)的DMF(20mL) 溶液中，反应4h后，再加入K2CO3(2.2g，16mmol)，室温反应12h，LCMS显示原料反应完全。向该反应液中加入20mL水淬灭反应，用乙酸乙酯多次萃取后，饱和食盐水洗涤，干燥，过滤，有机相旋干拌样，过硅胶柱纯化，得1.4g白色固体产物8，收率62％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝1.331min,(M+H)＝284.11。
步骤6：化合物9的合成
在25℃温度下，将LiOH/H2O加入到含有8(1.0g，3.5mmol)的THF/H2O(3:1， 24mL)中，25℃反应2h。LCMS中间监控显示原料反应完全，向该反应液先用乙酸乙酯萃取，然后用2N HCl调pH至3左右，再用乙酸乙酯萃取，干燥，过滤，旋干后，得 800mg白色固体产物9，收率90％。
步骤7：化合物10的合成
在25℃温度下，将DPPA(858mg，3.12mmol)逐滴加入到含有9(800mg，3.1mmol) 和TEA(315mg，3.1mmol)的DMAc(20mL)中，在氮气的保护下，先25℃温度下反应1h后，体系温度升至100℃反应12h。LCMS显示原料反应完全，向该反应液用乙酸乙酯萃取多次，饱和食盐水洗涤有机相，干燥过滤，旋干拌样，过硅胶柱纯化后，得700 mg白色固体产物10，产率89％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝0.883min,(M+H)＝253.10。
步骤8：化合物11的合成
在25℃温度下，将碘甲烷(1.97g，13.8mmol)加入到含有10(700mg，2.78mmol) 和NaOH(552mg，13.8mmol)的THF/H2O(3:1，50mL)中，室温下反应2小时。TLC 显示原料反应完全，反应液旋干拌样，过硅胶柱纯化后，得450mg浅白色固体产物11，产率60％。
LCMS(MS-ESI,m/z):T＝0.965min,(M+H)＝267.06。
步骤9：化合物101的合成
于室温下，将Brettyphos percat G3([(2-二环己基膦基-2′,6′-双(N,N-二甲基氨)- 1,1′-联苯)-2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]甲磺酸钯(II))(154mg，0.17mmol)加入到含有11 (450mg，1.71mmol)、12(250mg，1.69mmol)和Cs2CO3(1.1g，3.38mmol)的二氧六环(20mL)中，在氮气的保护下，100℃反应12小时。LCMS显示原料反应完全，反应液旋干拌样，过硅胶柱纯化后，用色谱级乙腈重结晶，得340mg灰黄色固体产物 101，产率53％。
LCMS(MS-ESI,m/z):T＝5.653min,(M+H)＝379.30。
1H NMR：(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.34(s,1H),8.59(s,1H),8.35(s,1H),8.08(s,1H),7.70–7.65(m,1H),3.99(s,1H),3.97(s,1H),3.71(t,J＝1.4Hz,1H),3.69(dd,J＝2.0,1.0Hz,1H),3.26(s,3H),2.63(t,J＝2.3Hz,1H),2.41(d,J＝1.0Hz,3H),2.37–2.34(m,2H)。
实施例II.化合物102的合成
Figure BDA0002810193090000291
步骤1：化合物22的合成
向反应瓶中加入化合物21(500mg，3.96mmol)、甲酸铵(2.5g，39.6mmol)和甲醇(10mL)，搅拌至澄清，加入Pd/C(100mg，10％含量)，氢气置换三次，30℃常压反应12小时，TLC显示少量化合物21剩余(PE:EA＝5:1，2,4-二硝基苯肼显色)，将反应液过滤，滤饼用甲醇淋洗三次，滤液旋干，得无色油状22(450mg，粗品)。
步骤2：化合物24的合成
向反应瓶中加入化合物7(1.0g，4.52mmol)、化合物22(442mg，3.48mmol)、碳酸钾(961mg，6.96mmol)和乙腈(10mL)，氮气置换，30℃反应4小时，LCMS显示少量化合物7剩余，产物为主峰，将反应液加入饱和氯化铵(30mL)，乙酸乙酯(30 mL)萃取两次，有机相干燥，浓缩，过柱纯化，得白色固体24(290mg)，产率26.8％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝1.437min,(M+H)＝312.27。
步骤3：向反应瓶中加入化合物24(290mg，0.930mmol)、一水合氢氧化锂(78 mg，1.86mmol)、四氢呋喃(10mL)和水(2mL)，30℃反应3小时，LCMS显示原料反应完全，产物为主峰，将反应液用2M盐酸水溶液调酸至pH 4，乙酸乙酯(40mL)萃取两次，有机相干燥浓缩，得白色固体25(240mg)，收率90.9％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝1.135min,(M+H)＝284.01。
步骤4：向反应瓶中加入化合物25(240mg，0.845mmol)、三乙胺(94.16mg，0.930mmol)和N,N-二甲基乙酰胺(10mL)，氮气置换，冷却到0℃，滴加叠氮磷酸二苯酯(244mg，0.888mmol)，加完自然升温至30℃反应2小时，升温到110℃反应2小时， LCMS显示原料反应完全，有产物MS,将反应液冷却到0℃，加水(20mL)直接用于下一步。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝1.145min,(M+H)＝281.17。
步骤5：向上述反应液中加入四氢呋喃(5mL)、氢氧化钠(170mg，4.27mmol，理论)，滴加碘甲烷(606mg，4.27mmol)，加完30℃反应4小时，LCMS显示原料反应完全，有产物MS,将反应液加水(40mL)，乙酸乙酯(40mL)萃取两次，有机相干燥、浓缩、过柱纯化，得白色固体27(170mg)，收率68.2％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝1.211min,(M+H)＝295.33。
步骤6：向反应瓶中加入化合物27(80mg，0.271mmol)、化合物12(44mg，0.298mmol)、碳酸铯(176mg，0.542mmol)、Bretty phos G3([(2-二环己基膦基-2′,6′-双 (N,N-二甲基氨)-1,1′-联苯)-2-(2′-氨基-1,1′-联苯)]甲磺酸钯(II))(24.5mg，0.027 mmol)和二氧六环(5mL)，氮气置换，100℃反应12小时，TLC显示原料反应完全(PE: EA＝1:1，紫外)，将反应液过柱，再制备得102(55mg，纯度100％)，收率49.8％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：T＝5.364min，(M+H)＝407.11。
1H NMR：(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.56(s,1H),8.26(s,1H),7.88(s,1H),7.58(s,1H),6.65(s,1H),4.74(tt,J＝11.8,7.6Hz,1H),4.55–4.45(m,2H),3.39(s,3H),2.49(s,3H), 2.33(dt,J＝12.8,8.4Hz,2H),2.20–2.10(m,2H),2.02–1.93(m,2H),1.82–1.76(m,2H).
实施例III.化合物301的合成
Figure BDA0002810193090000301
步骤1：化合物32的合成
向反应瓶中加入化合物31(0.99g，5.92mmol)、化合物7(1.32g，5.92mmol)和乙腈(20ml)，搅拌至澄清，加入碳酸钾(1.65g，11.84mmol)，室温反应1小时，TLC显示原料反应完全，有一个新的主点生成(PE:EA＝2:1，Rf＝0.3，254nm显色)，将反应液过滤，滤饼用乙腈淋洗三次，滤液旋干后，通过过柱纯化，得白色固体32(1.80g)，收率 86.5％。
步骤2：化合物33的合成
向反应瓶中加入化合物32(1.8g，5.12mmol)、一水合氢氧化锂(428mg，10.23mmol)、四氢呋喃(20ml)和水(10ml)，室温反应1小时，TLC显示原料反应完全，有一个新点生成(PE:EA＝1:1，Rf＝0.01，254nm显色)，将反应液用2M盐酸水溶液调酸至 pH 4，有白色固体析出，过滤，减压旋干，得白色固体33(1.66g)，收率100％。
步骤3：化合物34的合成
向反应瓶中加入化合物33(1.66g，5.13mmol)、三乙胺(519mg，5.13mmol)和 N,N-二甲基乙酰胺(20mL)，氮气置换，冷却到0℃，滴加叠氮磷酸二苯酯(1.41g， 5.13mmol)，加完自然升室温反应2小时，升温到120℃反应1小时，LCMS显示原料反应完全，有产物MS,反应液(20ml)直接用于下一步。
LCMS(MS-ESI,m/z)：321.11(M+H+),RT＝1.140min。
步骤4：化合物35的合成
向上述反应液中加入四氢呋喃(5ml)、碳酸钾(3.23g，23.38mmol，理论)，滴加碘甲烷(3.32g，23.38mmol)，加完室温反应3小时，LCMS显示原料反应完全，有产物 MS,向反应液加水(40ml)，乙酸乙酯(40ml)萃取两次，有机相干燥，浓缩，过柱纯化，得白色固体35(300mg)，两步收率为17.4％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：335.20(M+H+),RT＝1.209min。
步骤5：化合物301的合成
向反应瓶中加入化合物35(300mg，0.896mmol)，化合物12(132mg，0.896 mmol)，碳酸铯(584mg，1.79mmol)，Bretty phos G3(80mg，0.090mmol)和二氧六环 (4ml)，氮气置换，100℃微波反应1.5小时，LCMS显示原料反应完全，有产物MS，将反应液减压旋干，通过过柱纯化，得淡黄色固体301(270mg，纯度96.70％)，收率 67.5％。
LCMS(MS-ESI,m/z)：447.35(M+H+),RT＝5.435min。
1H NMR：(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ8.98(s,1H),8.98(s,1H),8.54(s,1H),8.36(s,1H),8.08(s,1H),7.67(s,1H),4.44(s,1H),4.18(s,1H),3.26(s,3H),2.89(s,2H),2.34(d,J＝ 0.6Hz,3H),2.01(d,J＝12.7Hz,2H),1.80(s,1H),1.70(d,J＝11.6Hz,2H),1.59(d,J＝12.6 Hz,2H),1.53(s,1H),1.26–1.16(m,2H).
参照实施例I-III的实验步骤制备，以不同起始原料，得到实施例IV-XII，如下表1所示。
表1
Figure BDA0002810193090000311
Figure BDA0002810193090000321
Figure BDA0002810193090000331
参见实施例I-XII，可以得到如下化合物XIII-XXX，见表1-1。
表1-1
Figure BDA0002810193090000332
Figure BDA0002810193090000341
Figure BDA0002810193090000351
Figure BDA0002810193090000361
实施例31.体外检测DNA-PK抑制剂的酶活性测定
1.将DNA-依赖性蛋白激酶、DNA-依赖性蛋白激酶肽底物(10mg/mL)、ATP(包含在ADP-Glo Kinase Assay试剂盒中)在冰上融化，并且在实验过程中以上试剂需要一直置于冰上，未使用完的原液需要分装保存，避免反复冻融；
2.取1μl/孔化合物工作液加入到微孔板中，阳性对照加入1μl/孔1X assaybuffer含有5％DMSO,空白对照加入1μl/孔1X缓冲液(assay buffer)；
3.DNA-依赖性蛋白激酶完全溶解后，用1X缓冲液将酶稀释到2.5unit/μl后，取2μl/孔酶溶液加入到微孔板中，空白对照孔加入2μl/孔1X缓冲液，微孔板1000转离心1 分钟。
4.底物与ATP的混合溶液配制：使用1X缓冲液对DNA-依赖性蛋白激酶肽底物(10mg/mL)进行稀释并加入ATP，使ATP的浓度为125μM，DNA-依赖性蛋白激酶肽底物浓度为0.5μg/μl，底物与ATP的混合溶液置于冰上备用；
5.取2μl/孔底物与ATP的混合溶液到微孔板中，微孔板1000转离心1分钟，此时DNA-依赖性蛋白激酶肽底物浓度为0.2μg/μl，ATP浓度为50μM，DMSO浓度为1％；
微孔板封膜，置于25℃孵育60min；
6.ADP-GloTM试剂和Kinase Detection在使用前需要平衡到室温；
结束孵育后，取5μl/孔ADP-GloTM试剂加入到微孔板中，微孔板1000转离心1分钟，微孔板封膜后置于25℃，孵育40分钟；
7.结束孵育后，取10μl/孔Kinase Detection加入到微孔板中，微孔板1000转离心1 分钟，微孔板封膜后，置于25℃，孵育30分钟；
结束孵育后，使用Nivo进行Luminescence检测，读取发光值(RLU)；
8.酶活率计算：
酶活％＝(RLU(样品)-RLU(空白))/(RLU(1％DMSO)-RLU(空白)))x100％
注意事项：
1.DNA-依赖性蛋白激酶、DNA-依赖性蛋白激酶肽底物(10mg/mL)、DTT均需要进行小体积分装，避免反复冻融；
2.DNA-依赖性蛋白激酶、DNA-依赖性蛋白激酶肽底物(10mg/mL)需要在-80℃保存，其他试剂可在-20℃保存，所有试剂在操作过程中均放置在冰上。1DNA-PK抑制剂与蛋白之间结合力实验结果见表2
表2
实施例 IC50(nM)
I 1.95
II 0.367
III 0.38
IV 0.16
V 0.45
VI 0.53
VII 0.58
阳性对照(AZD7648) 0.58
AZD7648的结构为
Figure BDA0002810193090000371
结果表明，相较于阳性对照，本发明化合物具有相当甚至更好的抑制DNA激酶活性。
实施例32.DNA-PK抑制剂与辐照联合对癌细胞A549的影响
由于DNA-PK抑制剂与辐照进行联合使用是潜在抑制DNA损伤修复过程，因此，辐照与DNA-PK抑制剂进行搭配是非常合理的。因为DNA受到辐照后，在DNA损伤信号通路上非常多的损伤位点上能够引起磷酸化和形成由DNA损伤引起的细胞核聚集点。比如，γH2AX，53BP1和ATM蛋白靶点在丝氨酸1981上的磷酸化都是细胞对辐照做出的应急反应。为了验证DNA-PK抑制剂对辐照的增敏作用，我们利用非小细胞肺癌A549细胞株与辐照进行联用，在体外考察DNA-PK抑制剂的活性。
实验方法及步骤
细胞培养
将细胞系A549培养条件在37℃，5％CO2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。细胞铺板和化合物储备液按照一般基本操作程序进行，待完成加药程序后，将96孔细胞板放置于培养箱，1小时后置于RadSource 2000X-ray仪器，进行辐照，辐照强度为2.4Gy，辐照结束将96孔细胞板放回培养箱中培养9天。采用CellTiter-Glo发光法细胞活性检测，用下列公式来计算检测化合物的抑制率(Inhibition rate，IR)：IR(％)＝(1–(RLU化合物–RLU空白对照)/(RLU溶媒对照–RLU空白对照))*100％得到化合物的抑制率IC50，结果如表3所示。
表3.DNA-PK抑制剂与辐照联合使用的情况下，对A549细胞生长的抑制活性
实施例 IC50(μM)
I 0.37
II 0.09
III 0.083
IV 0.047
V <0.5
VI <0.5
VII <0.5
阳性对照(AZD7648) 0.170
实验结果表明该系列化合物与辐照对癌细胞有较强的抑制作用，对辐照有非常好的协同效应。
实施例33.实施例对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ酶的抑制活性测试
实验方法操作步骤：
1)在稀释板中用DMSO对化合物进行4倍稀释，化合物起始浓度为2mM。
2)将化合物50倍稀释到1X激酶(PI3Kα，PI3Kβ或者PI3Kγ)反应缓冲液中，在振荡器上震荡20分钟。
3)用1X的酶反应缓冲液配制准备2X激酶。
4)向反应板中每孔加入2μl激酶(步骤3中配制)。
5)向每孔加入1μl在缓冲液中稀释好的化合物，用封板膜封住板子1000g离心30秒，室温放置10分钟。
6)用1X的酶反应缓冲液配制4xATP/底物混合液，向反应板中加入1μl 4x ATP混合液。
7)用封板膜封住板子1000g离心30秒，室温反应60分钟。
8)转移4μL ADP-Glo到384反应板中1000rpm/min,离心1min，25℃孵育40min。
9)转移8μL Detection溶液到384反应板中1000rpm/min,离心1min，25℃孵育40min。
10)使用Biotek多功能读板机读取RLU(Relative luminescence unit)信号。信号强度 11)抑制率计算如下:化合物抑制率(％inh)＝100％-(化合物-阳性对照)/(阴性对照-阳性对照)*100％，并利用一下公式进行计算IC50，
Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*Hill Slope))
X:化合物浓度log值Y:抑制率(％inhibition)
实验结果如表4所示。
表4DNA-PK抑制剂对PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kδ酶的抑制活性
Figure BDA0002810193090000391
实施例34.体内药代动力学性质研究
供试样品：在上述实验基础上，选择一下活性好的、具有代表性结构的化合物进一步开展实验。
实验方法：该研究的目的是为了测定该化合物药代动力学参数，并计算其在SD大鼠中的口服生物利用度。该项目使用六只SD大鼠，三只大鼠进行静脉注射给药，给药剂量为1mg/kg(组分为，生理盐水90-95％，吐温-80 0.1-5％，羟丙基甲基纤维素0.1-5％)，收集0h(给药前)和给药后xx，0.25，0.5，1，2，3，6，8，24h的血浆样品，另外三只小鼠口服灌胃给药，给药剂量为5mg/kg，收集0h(给药前)和给药后0.5，1，2,3,4,6,8,24 h的血浆样品，然后对收集的样品进行LC/MS/MS分析并采集数据，采集的分析数据用 Phoenix WinNonlin 6.2.1软件计算相关药代动力学参数，实验结果如表5所示。
表5.化合物实施例I在SD大鼠的静脉和口服给药动力学参数
Figure BDA0002810193090000392
Figure BDA0002810193090000401
实验结果表明：本发明化合物的生物利用度可达192％，并且可快速被清除出体内。
实施例35.初步连续给药的毒性反应
初步观察多次给予受试物后出现的毒性反应，摸索出现毒性反应剂量和死亡剂量范围，为剂量设计提供依据。
实验方法：5只昆明小鼠给溶媒灌胃给药，5只小鼠化合物灌胃给药，剂量：200mg/kg，给药体积：10ml/kg，给药浓度：20mg/mL，连续灌胃给药7天观察7天。
观察项目：
1).外观观察：外观体征、行为活动、皮毛、粪便性状、腺体分泌、呼吸、给药局部反应以及其它表现。发现死亡或濒死动物，及时尸检。
2).眼科检查：外眼检查(眼睑、结膜、角膜、巩膜、瞳孔和对光反射)。
3).进食量和体重称量每周2-3次。
4).解剖脏器做大体观察。
实验结果如表6所示。
表6.化合物实施例I在小鼠体重给药7天的体重变化
Figure BDA0002810193090000402
(g，n＝5)
Figure BDA0002810193090000403
该实验表明，化合物101在每天给予昆明小鼠200mg/kg的剂量情况下，动物体重没有发生任何变化，给药载体组也没有出现体重减轻的情况。因此，该实验表明化合物的毒性较低，小鼠有很好的耐受，同时也表明同类化合物的治疗窗口非常大。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，
Figure FDA0002810193080000011
其中：
W独立选自：
Figure FDA0002810193080000012
其中，X1独立地为N或CRa，X2为N或CRb，X3独立地为N或CRc；Y1独立为N或CRd；
其中，Ra、Rb、Rc和Rd各自独立地选自：氢、卤素、羟基、氰基、氨基、C1-6烷基或卤代C1-6烷基；R1选自：氢、卤素、羟基、氨基、C1-3烷基、卤代C1-3烷基、C3-6环烷基或C3-6环氧烷基；
U独立选自取代或未取代的下组基团：C5-12饱和或不饱和桥环碳环基、C5-12饱和或不饱和螺环碳环基、C5-12饱和或不饱和稠合碳环基、5-12元桥环杂环基、5-12元杂环基和5-12元稠合杂环基；
其中，所述取代基团是指选自下组的一个或多个基团：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure FDA0002810193080000013
Figure FDA0002810193080000014
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基、3-6元杂环基，其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、3-6元杂环基；
Z独立选自：H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、3-6元杂环基；
其中，所述的C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基、3-6元杂环基可任选地被选自下组的一个或多个基团取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基、3-6元杂环基。
2.如权利要求1所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其特征在于，U选自：
Figure FDA0002810193080000021
Figure FDA0002810193080000022
其中，各A独立地选自：-O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)(NRf)-、-N(Rf)-、-C(Ri)(Rj)-；
M独立地选自：N或C(Ri)；
各Rm独立地选自：羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure FDA0002810193080000023
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure FDA0002810193080000024
Figure FDA0002810193080000025
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
q为0、1、2、3、4、5或6；
n为1、2、3、4、5或6。
3.如权利要求1所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其特征在于，U选自：
Figure FDA0002810193080000031
Figure FDA0002810193080000032
其中，Rh、Ri和Rj各自独立地选自：H、羟基、卤素、氰基、氨基、-O-Re、-O-(CH2)nRp、ReCOO-、-COORe、
Figure FDA0002810193080000033
Figure FDA0002810193080000034
C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基，
其中，Re、Rf各自独立地选自：C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基；
Rp选自：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
(CH2)n中的H原子可任选地被选自下组的取代基取代：羟基、卤素、氰基、氨基、C1-6烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-6环烷基、C3-6环氧烷基；
n为1、2、3、4、5或6。
4.如权利要求1所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其特征在于，U选自：
Figure FDA0002810193080000041
Figure FDA0002810193080000042
5.如权利要求1所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其特征在于，W选自：
Figure FDA0002810193080000043
Figure FDA0002810193080000044
6.如权利要求1所述的式I化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂合物，其特征在于，Z选自：甲基、乙基、环丙基。
7.如权利要求1所述的式I化合物或其立体异构体、药学上可接受的盐、前药、溶剂合物，其特征在于，所述化合物选自下组：
Figure FDA0002810193080000051
Figure FDA0002810193080000061
8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物；和药学上可接受的载体。
9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物或权利要求8所述的药物组合物的用途，用于制备治疗或预防与DNA依赖蛋白激酶的活性或表达量相关的疾病的药物或药物组合物。
10.如权利要求1-7中任一项所述的化合物或其立体异构体或光学异构体、药学上可接受的盐、前药或溶剂化物或权利要求8所述的药物组合物的用途，用于制备使癌细胞对于抗癌剂和/或电离辐射敏感的药物。
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