CN114569539A

CN114569539A - 一种新型抗菌素释缓系统、制备方法及其应用

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Publication number: CN114569539A
Application number: CN202210079855.2A
Authority: CN
Inventors: 赵振群; 龚瑜林; 白锐; 赵爱青; 王文选; 王勇; 孟晨阳; 姜博雍
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2022-06-03

Abstract

一种新型抗菌素释缓制备方法及其应用，包括固态万古霉素纳米微球PLGA‑PTMC缓释系统和液态BMSCs‑PLGA‑PTMAC支架。治疗感染性骨缺损时与万古霉素CPC缓释系统植入组相比，植入含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统组的抗感染能力更强。治疗感染性骨缺损时，与万古霉素CPC缓释系统植入组相比，植入含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统组的成骨能力更强。在感染性骨缺损治疗中，含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统可吸收性良好。含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系的局部应用对于治疗感染性骨缺损效果是良好的。

Description

一种新型抗菌素释缓系统、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及领域，尤其涉及一种新型抗菌素释缓系统、制备方法及其应用。

背景技术

交通事故等高能量损伤所致感染性骨缺损发病率极高，治疗十分棘手。Gafur的一份早前研究显示，由于大量的机动车交通事故、骨科手术及一些枪弹伤，骨与软组织感染性疾病的发病率明显增加，1982年至2002年期间骨髓炎发病率增加了2.8倍。Johnson的一项回顾性研究发现，所有开放性的III型战伤骨折都有感染，37％的患者骨折延迟愈合或骨缺损，在延迟愈合的患者中14％最后面临截肢。感染性骨缺损的修复仍然是目前研究的重点和难点。单纯的植骨术很可能因感染未控制而失败，因此患者往往不能进行一期植骨，而须彻底清创，待感染因素消除、伤口愈合、血运重建后再进行二期植骨修复骨缺损。此种治疗方法需多次手术，增加患者的痛苦，延长治疗时间，耗费较多的医疗资源及社会财力。

由于存在感染和骨缺损双重病变，感染性骨缺损治疗棘手,已成为困扰骨科医师的难题之一。其特点为软组织缺损、肌肉萎缩、多处窦道、骨缺损、骨外露、邻近关节僵硬、多重耐药菌感染、肢体不等长、复杂畸形等，从而导致肢体功能受到严重影响。传统治疗方法是经反复手术清创,待感染控制后二期手术植骨治疗骨不连或骨缺损,其临床治疗周期长、肢体功能障碍重、再次骨不连及感染发生率高。同时对于本病来说，治疗骨缺损的植骨时机，其把握度亦十分困难。近年来随着外固定技术、显微外科技术、生物材料技术及骨组织工程技术等的发展,感染性骨缺损的治疗取得明显进步,但是仍有其不足之处。如何寻求一种同时兼备缓释抗炎、成骨活性、骨传导作用、可降解吸收的一期治疗手段，是目前临床亟需解决的难题和挑战。

发明内容

为了解决上述相关领域中的不足，本发明提供一种新型抗菌素释缓系统、制备方法及其应用。

本发明的一种新型抗菌素释缓系统、制备方法及其应用是通过以下技术方案实现的：

一种新型抗菌素释缓系统，包括万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统和BMSCs-PLGA-PTMAC支架。

进一步地，所述万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统包括盐酸万古霉素、蒸馏水、PLGA二氯甲烷溶液、2.5％PVA溶液、多孔块状PTMC。

10.进一步地，所述BMSCs-PLGA-PTMAC支架包括盐酸万古霉素、蒸馏水、PLGA二氯甲烷溶液、2.5％PVA溶液、多孔块状PTMC、第3代MSCs、DMEM-F12培养液。

一种新型抗菌素释缓系统的制备方法，包括：

步骤1，制备PLGA-PTMAC多孔支架；

步骤2，制备万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统；

步骤3，培养BMSCs；

步骤4，制备BMSCs-PLGA-PTMAC支架；

步骤5，混合所得到的万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统和BMSCs-PLGA-PTMAC支架，即得到所述新型抗菌素释缓系统。

进一步地，所述PLGA-PTMAC多孔支架是通过以下步骤得到的：

取PLGA颗粒(丙交酯∶乙交酯＝75∶25，相对分子质量30×104)、PTMC颗粒(PLGA∶PTM C＝7∶3)溶于氯仿中，配成10％的溶液，待聚合物完全溶解后，加入直径200-300μm的氯化钠颗粒，充分搅拌混匀后，超声脱泡，浇注于调平的聚四氟模具中，浇注后静置24-48h，脱模后再静置24-48h，然后在真空干燥箱中真空干燥24h，最后将材料置于去离子水中浸泡并不时搅动，每4-6h换1次水，连续48h，取出后漓干水，空气干燥48h，真空干燥48h。

进一步地，所述万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统是通过以下方法得到的：

取一定量的盐酸万古霉素，用蒸馏水溶解作为内水相，与PLGA二氯甲烷溶液混合，超声乳化制成初乳；

将初乳快速均匀地滴加到浓度为2.5％PVA溶液20mL中，高速搅拌2min得复乳，并将其用100mL蒸馏水稀释，低速搅拌(400rpm)6h，离心水洗3次，预冻24小时，冷冻干燥24小时即可；

将多孔块状PTMC加工成直径10mm、厚3mm的圆盘状，电子分析天平称重，60钴辐照消毒备用；

按10∶1的质量比向PTMC中加入万古霉素PLGA纳米微球混悬液，真空吸附后，用冻干机进行材料的冻干，制成万古霉素纳米微球PLGA-PTMC材料，每块材料约含万古霉素0.1g，备用。

进一步地，所述BMSCs-PLGA-PTMAC支架是通过以下方法得到的：

将PLGA-PTMC多孔支架切成5mm×5mm×3mm大小的片状，浸泡于体积分数为75％的乙醇中24h，以D-hank's液反复清洗去除乙醇；将培养至第3代MSCs消化、重悬后调整浓度为5×108/L；每支架接种100μL细胞悬液，分别放置于6孔培养板中；4h后加入DMEM-F12培养液8mL，于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，每3d更换培养液1次，共培养2周，备用。

进一步地，所述BMSCs是通过以下方法进行培养的：

取3月龄新西兰大耳白兔10只(体重约1.5-2.0kg)，徒手侧身固定于桌面，于一侧坐骨结节处新洁尔灭(1：15)消毒，戴无菌手套，铺无菌洞巾，2％利多卡因由表皮至骨膜浸润麻醉，12号骨穿针刺破骨皮质有一明显突破感，用内含2ml PBS与3000u肝素的20ml注射器抽取骨髓2-10mL，于超净工作台内将骨髓轻轻加于与骨髓稀释液等体积的percoll(密度为1.073g/ml)细胞分离液面上，水平离心机2500r/min离心20min，用吸管小心吸取血清与分离液之间交界面的云雾状单核细胞层，加入PBS漂洗，800r/min离心5min，共三次，弃上清，最后加入DMEM/F12(1:1)完全培养基3ml吹打重悬细胞，接种于25cm2培养瓶中，5％CO2、37℃、饱和湿度孵箱培养，48小时后更换培养基，弃除未贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。倒置显微镜下观察，当培养瓶中的细胞融合到80％左右时进行传代。弃去培养瓶中的培养基，用37℃的PBS清洗3遍，加入预热至37℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶1ml，37℃消化2-5min，镜下见细胞形态明显变圆并有部分细胞脱壁时加入含有胎牛血清的培养基终止消化，并轻轻吹打瓶壁以吹掉尚未脱落的细胞，并将细胞悬液移入15ml无菌离心管，800rpm离心5min；用5ml培养基重新悬浮细胞，用镜下细胞计数的方法计算细胞总数，并稀释成4×104/ml的细胞悬液，按每个培养瓶内4ml细胞悬液，或96孔板每孔0.5ml接种细胞。取出接种到96孔板的第3代MSCs，PBS冲洗3次，5次/min；用预冷的甲醛丙酮混合液(V:V＝1:1)固定30min，PBS冲洗3次，5次/min；3％过氧化氢室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；每孔分别加50μl以1:100稀释的第一抗体(CD29、CD44、CD45、碱性磷酸酶)；对照组不加一抗，4℃过夜；PBS冲洗3次，每次5min；每孔加50μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗，室温下孵育30min；PBS冲洗3次，每次5min；每孔加50μl DAB染色液显色，显微镜下观察，出现棕黄色后每孔加入自来水终止反应；收集培养的第3代MSCs，调整浓度为1×106/ml，过细胞筛，PBS洗涤3次，每次5min，分别加入CD29和CD44单克隆抗体(1：100稀释)，PBS代替一抗作空白对照，4℃孵育30min；PBS洗涤3次，每次5min，加FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1：100稀释)，4℃孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min，流式细胞仪检测。

一种新型抗菌素释缓系统在制备治疗骨缺损、骨组织再生或创伤愈合的药物中的应用。

有益效果：

相对于现有技术，本发明一种新型抗菌素释缓制备方法及其应用

1.治疗感染性骨缺损时与万古霉素CPC缓释系统植入组相比，植入含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统组的抗感染能力更强。

2.治疗感染性骨缺损时，与万古霉素CPC缓释系统植入组相比，植入含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统组的成骨能力更强。

3.在感染性骨缺损治疗中，含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统可吸收性良好。

4.含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系的局部应用对于治疗感染性骨缺损效果是良好的，可视为一种可缓慢降解吸收、具有缓释药物作用、具有一定的骨生成作用的治疗方法。本发明为感染性骨缺损的治疗提供了新的思路，临床效果有待于进一步研究。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。

图1为处理后各时间段植骨区大体观；图1-A2为A组处理后2周，植骨区被纤维组织覆盖，剔除纤维组织可见骨缺损；图1-B2为B组处理后2周，植骨区被纤维组织覆盖，剔除纤维组织可见骨缺损；图1-A4为A组处理后4周，局部仍可见植入之颗粒骨被纤维组织覆盖；图1-B为B组处理后4周，骨缺损两端可见骨痂形成，针刺感较硬；图1-A8为A组处理后8周，骨痂形成基本填满骨缺损区；图1-B8为B组处理后8周，骨痂形成基本填满骨缺损区；图1-A12为A组处理后12周，骨缺损区基本完全愈合；图1-B12为B组处理后12周，骨缺损区完全愈合，骨折端连接良好；

图2为处理前后各组各时相点家兔CRP值变化趋势，其中A组在上，B组在下；

图3为处理前后各组各时相点家兔ESR值变化趋势图；其中A组在上，B组在下；

图4为处理后各时间段植骨区影像学X片；图4-A2为A组处理后2周，骨缺损区清晰可见；图4-B2为B组处理后2周，骨缺损区清晰可见；图4-A4为A组处理后4周，骨缺损区有少量云雾状骨痂形成，密度较低，仍可见植入之颗粒骨；图4-B4为B组处理后4周，骨缺损区有云雾状骨痂形成，密度较低，仍可见植入之颗粒骨；图4-A8为A组处理后8周，骨缺损区可见大量骨痂，髓腔未通；图4-B8为B组处理后8周，骨缺损区可见大量骨痂,髓腔未通；图4-A12为A组处理后12周，骨缺损区基本达骨性愈合，髓腔未通；图4-B12为B组处理后12周，骨缺损区基本达到骨性愈合和骨髓腔再通的标准；

图5为处理后各时间段植骨区取材病理HE染色切片；图5-A2为A组处理后2周(HE×100)，可见植入未完全吸收的松质骨颗粒和纤维组织；图5-B2为B组处理后2周(HE×100)，可见植入未完全吸收的松质骨颗粒和纤维组织；图5-A4为A组植骨处理后4周(HE×100)，可见类骨质和原始骨小梁；图5-B4为B组植骨处理后4周(HE×100)，可见类骨质和原始骨小梁；图5-A8为A组植骨处理后8周(HE×100)，可见类骨质和原始骨小梁较A4增多；图5-B8为B组植骨处理后8周(HE×100)，可见类骨质和原始骨小梁较B4增多；图5-A12为A组植骨处理后12周(HE×100)，可见骨板正在塑性,髓腔正在形成；图5-B12为B组植骨处理后12周(HE×100)，可见骨板正在塑性，髓腔正在形成。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明中未详细说明的结构或工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本技术领域的技术人员应当知晓。

请参阅图1-5。

实施例1

本实施例提供一种新型抗菌素释缓系统，包括万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统和BMSCs-PLGA-PTMAC支架。

进一步地，所述万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统包括盐酸万古霉素、蒸馏水、PLGA二氯甲烷溶液、2.5％PVA溶液、多孔块状PTMC。。

进一步地，所述BMSCs-PLGA-PTMAC支架包括盐酸万古霉素、蒸馏水、PLGA二氯甲烷溶液、2.5％PVA溶液、多孔块状PTMC、第3代MSCs、DMEM-F12培养液。

实施例2

本实施例提供一种新型抗菌素释缓系统的制备方法，包括：

步骤1，制备PLGA-PTMAC多孔支架；

步骤2，制备万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统；

步骤3，培养BMSCs；

步骤4，制备BMSCs-PLGA-PTMAC支架；

进一步地，所述PLGA-PTMAC多孔支架是通过以下步骤得到的：

将初乳快速均匀地滴加到浓度为2.5％PVA溶液20mL中，高速搅拌2min得复乳，并将其用100mL蒸馏水稀释，低速搅拌(4O0rpm)6h，离心水洗3次，预冻24小时，冷冻干燥24小时即可；

进一步地，所述BMSCs-PLGA-PTMAC支架是通过以下方法得到的：

进一步地，所述BMSCs是通过以下方法进行培养的：

取3月龄新西兰大耳白兔10只(体重约1.5-2.0kg)，徒手侧身固定于桌面，于一侧坐骨结节处新洁尔灭(1：15)消毒，戴无菌手套，铺无菌洞巾，2％利多卡因由表皮至骨膜浸润麻醉，12号骨穿针刺破骨皮质有一明显突破感，用内含2ml PBS与3000u肝素的20ml注射器抽取骨髓2-10mL，于超净工作台内将骨髓轻轻加于与骨髓稀释液等体积的percoll(密度为1.073g/ml)细胞分离液面上，水平离心机2500r/min离心20min，用吸管小心吸取血清与分离液之间交界面的云雾状单核细胞层，加入PBS漂洗，800r/min离心5min，共三次，弃上清，最后加入DMEM/F12(1:1)完全培养基3ml吹打重悬细胞，接种于25cm2培养瓶中，5％CO2、37℃、饱和湿度孵箱培养，48小时后更换培养基，弃除未贴壁细胞，以后每3-4天换液一次。倒置显微镜下观察，当培养瓶中的细胞融合到80％左右时进行传代。弃去培养瓶中的培养基，用37℃的PBS清洗3遍，加入预热至37℃、浓度为0.25％的胰蛋白酶1ml，37℃消化2-5min，镜下见细胞形态明显变圆并有部分细胞脱壁时加入含有胎牛血清的培养基终止消化，并轻轻吹打瓶壁以吹掉尚未脱落的细胞，并将细胞悬液移入15ml无菌离心管，800rpm离心5min；用5ml培养基重新悬浮细胞，用镜下细胞计数的方法计算细胞总数，并稀释成4×10⁴/ml的细胞悬液，按每个培养瓶内4ml细胞悬液，或96孔板每孔0.5ml接种细胞。取出接种到96孔板的第3代MSCs，PBS冲洗3次，5次/min；用预冷的甲醛丙酮混合液(V:V＝1:1)固定30min，PBS冲洗3次，5次/min；3％过氧化氢室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；每孔分别加50μl以1:100稀释的第一抗体(CD29、CD44、CD45、碱性磷酸酶)；对照组不加一抗，4℃过夜；PBS冲洗3次，每次5min；每孔加50μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗，室温下孵育30min；PBS冲洗3次，每次5min；每孔加50μl DAB染色液显色，显微镜下观察，出现棕黄色后每孔加入自来水终止反应；收集培养的第3代MSCs，调整浓度为1×106/ml，过细胞筛，PBS洗涤3次，每次5min，分别加入CD29和CD44单克隆抗体(1：100稀释)，PBS代替一抗作空白对照，4℃孵育30min；PBS洗涤3次，每次5min，加FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1：100稀释)，4℃孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min，流式细胞仪检测。

实施例3

本实施例提供一种新型抗菌素释缓系统在制备治疗骨缺损、骨组织再生或创伤愈合的药物中的应用。

实验部分

(一)实验材料

本实验所选用的实验动物为健康3～4月龄新西兰大白兔(内蒙古医科大学动物实验中心提供)，体重2.0～2.5kg，雌雄不限。

主要药品与试剂如表1所示。

表1主要药品与试剂

主要仪器

(二)实验方法

1.BMSCs的分离培养与鉴定：

取3月龄新西兰大白兔10只(体重约1.5-2.0kg)，徒手侧身固定于桌面，于一侧坐骨结节处新洁尔灭(1：15)消毒，戴无菌手套，铺无菌洞巾，2％利多卡因由表皮至骨膜浸润麻醉，12号骨穿针刺破骨皮质有一明显突破感，用内含2ml PBS与3000u肝素的20ml注射器抽取骨髓2-10mL，将骨髓加于ercoll(密度为1.073g/ml)细胞分离液面上，离心20min，提取血清与分离液之间单核细胞层，用PBS漂洗后离心5min，共三次，弃上清，然后加入DMEM/F12(1:1)培养基3ml，接种于培养瓶放于孵箱培养。当细胞融合达到80％左右时进行传代，800rpm离心5min。将细胞悬液稀释成4×104/ml，96孔培养基每孔0.5ml接种细胞。取出接种到96孔板的第3代MSCs，细胞仪检测,将培养至第3代BMSCs消化、重悬后调整浓度为5×108/L，于培养板中培养，每3d更换培养液1次，共培养2周，留置备用。

2.实验动物模型的制备

筛选60只健康新西兰大白兔(内蒙古医科大学动物实验中心供)，分两批实验。分笼饲养观察5天后，对每只兔按30mg/kg比例，耳缘静脉静脉注入5％戊巴比妥钠，将实验兔成功麻醉后，将兔子固定于操作台上，兔双侧后肢备皮，实验人员常规刷手，消毒，戴无菌手套，取双侧后肢内侧约2cm切口，显露胫骨中下段，用骨穿针钻孔至髓腔，经骨穿孔注入0.5ml3×10⁹/ml金黄色葡萄球菌悬液(内蒙古医科大学基础医学院微生物学教研室)，以无菌骨蜡将骨孔封闭，缝合皮肤，之后对实验兔进行4周的分笼饲养观察。

4周后对实验兔进行细菌培养、病理切片观察以及X射线检查，以下列标准判定实验兔是否受到骨感染(符合其中两项即确定感染)：①细菌培养标本，检测出金葡菌。②病理切片出现多核巨细胞浸润、骨髓破坏、坏死骨等现象。③x线检出软组织脓肿影、骨膜反应等。随机等分40只造模成功的实验兔，分为A、B组。

3.分组处理

将造模成功的动物按30mg/kg戊巴比妥钠(5％)耳缘静脉麻醉，原切口打开皮肤，清除所有的炎性坏死组织，形成胫骨中下段1.0cm～2.0cm长节段性骨缺损(根据具体感染性骨缺损情况，统一范围)。病灶用生理盐水、双氧水、0.05％碘伏反复冲洗干净后，A组植入万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统，万古霉素用量为100mg/kg；B组植入万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统结合BMSCs-PLGA-PTMC支架，万古霉素用量为100mg/kg,BMSCs用量为100μL/kg，逐层缝合切口。

处理后动物分笼饲养。各组再分为2、4、8、12周4个时间点，每组每时相观察点为6只(12条后肢)。各实验兔均分笼饲养以作观察。

4.检测指标

4.1一般情况观察

实验人员密切监测实验兔处理后的饮食、精神、及活动情况。切口是否红肿、溃烂以及分泌脓性物等变化。

4.2大体标本观察

分别于处理后2、4、8和12周随机取六只实验兔进行X线检查之后处死，取胫骨做大体观察，观察骨缺损处的软组织覆盖，骨缺损处的修复情况等。

4.3血清C反应蛋白(C reactive protein，CRP)和红细胞沉降率(Erythrocytesedimentation rate，ESR)的测定：

实验人员分别于术前1天、处理后第1、3天、以及处理后1、2和4周的兔子中抽取静脉血测定血清CRP和ESR。

4.4影响学X线观察及评分

分别于处理后2、4、8和12周每组中随机取6只兔子进行骨修复区X线检查。并按Lane-sandhu标准对X片观察结果进行打分如表2。

表2处理后Lane-sandhuX线评分标准

4.5光镜学观察及评分

4.5.1切片标本制备

处理后2、4、8和12周从每组中随机处死6只兔子，分离出胫骨并且采集骨缺损植骨区域骨组织作为研究标本，并对骨组织标本作如表3的操作，将按表3操作处理后的骨组织标本进行透明然后浸蜡和包埋。用切片机切片，将切片粘于载玻片上，烘烤12-24h。

表3主要操作程序

4.5.2病理切片HE染色程序

表4 HE染色主要操作程序

最后对标本进行封片。研究人员就可以在光镜下主要观察桡骨缺损移植处的骨细胞，骨小梁,纤维组织等结构，通过表5中评定的标准对骨组织病理切片标本进行评估。

表5处理后Lane-sandhu骨移植组织学评分标准

5.统计学方法

将C反应蛋白、血沉、X线、病理切片等实验数据以均数±标准差

表示，对实验数据的分析采用SPSS20.0软件。计量资料组间两组间比较采用t检验分析；P≤0.05有统计学意义。

(三)实验结果

1.一般情况观察

处理之后，将实验兔分笼喂养，重点观察处理后的恢一般情况以及处理后是否发生死亡等情况。处理后1～2d所有兔活动减少、精神差、饮食尚可,无发热。处理伤口无红肿、渗液等。3d后精神好转,饮食正常,活动增加。处理后约1～2周切口愈合。实验阶段共有48只造模成功，分为A、B组。

2.大体标本观察

严格按照规范的处理步骤进行处理操作，并且在处理之后对所有的实验兔进行观察，仔细检查其处理部位的软组织是否出现炎症。其中B组1只家兔术区出现皮肤溃烂，少许脓性分泌物渗出。在骨移植处理后2周，从每组实验兔中随机选择6只实验兔过量麻药处死，然后取出胫骨重点观察骨缺损处恢复情况。

A、B两组大体观下均可见到有纤维组织增生覆盖，骨折断端间没有连接，大体上观察两组无明显差异(图1-A2、图1-B2)；处理后4周从每组实验兔中随机选择6只实验兔过量麻药处死，然后取出胫骨重点观察骨缺损处骨移植的恢复情况。A组骨缺损处被纤维组织覆盖,B组骨折断端间为软骨痂所填充，类似软骨组织，针刺感较软(图1-A4、图1-B4)；处理后8周，每组实验兔随机挑选6只处死，并取出胫骨重点观察植骨部位，B组硬骨痂已取代软骨痂，针刺感较硬，胫骨骨缺损移植处的缺失部分已被基本填满，骨折基本愈合。A组恢复不如B组，硬骨痂量少(图1-A8、图1-B8)；处理后12周，每组家兔随机挑选6只处死，并取出胫骨重点观察植骨部位，A、B两组骨缺损段基本愈合完毕，B组硬骨痂表面变得光滑，剖面中心部位变疏松，有髓腔形成(图1-A12、图1-B12)。

3.C-反应蛋白(CRP)和红细胞沉降率(ESR)的测定

对实验兔进行处理前1天、处理后第1天和第3天、1周、2周和4周C反应蛋白进行检测，如表6所示，并且分别对A、B两组实验动物处理后第一天的CRP检测值与处理前第一天进行比较发现，处理后第一天两组的C反应蛋白检测值明显高与术前第一天；处理后3天各组的C反应蛋白检测值均达到最高水平，如图2所示。处理后第1周时CRP(血清C反应蛋白)检测值B组低于A组，差异有统计学意义(p＜0.05)，第4周时CRP(血清C反应蛋白)检测值A组仍处在较高的水平，B组基本达到正常水平。

对实验兔红细胞沉降率(ESR)的检测结果如表7所示和图3所示，处理后1天A、B两组的水平相比于术前1天有所增加，存在差异，具有统计学意义，处理后三天指标仍然呈现上升趋势，七天后指标达到最高水平，处理后第2周时ESR(血沉)检测值B组低于A组，差异有统计学意义(p＜0.05)，第4周时ESR(血沉)检测值A组仍处在较高的水平，B组基本达到正常水平。与万古霉素CPC缓释系统植入组实验动物的血清C反应蛋白及红细胞沉降率相比，含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统植入组实验动物的血清C反应蛋白和红细胞沉降率有较快的下降速度，说明了相比于万古霉素CPC缓释系统植入组而言，含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统植入组在抗菌能力方面效果更加突出。

表6处理前后各组各时相点家兔CRP测定结果(㎎/L)

表7处理前后各组各时相点家兔ESR测定结果(㎜/h)

4.影像学X线观察及评分

处理后2周，X线显示A、B两组骨缺损处开始出现骨化，无明显差异(图4-A2、图4-B2)。处理后4周，A组骨痂刚刚出现；B组骨缺损边缘已有新鲜骨痂形成，可见大片云雾影(图4-A4、图4-B4)。处理后8周，A组缺损部位骨痂成形较以前增多，B组可见有新生皮质骨结构，骨痂的密度增高，其密度B>A组(图4-A8、图4-B8)。处理后12周，A组骨缺损已达到骨性愈合,微微可以看到髓腔形成的痕迹，B组缺损处被骨皮质完全覆盖，髓腔充分形成(图4-A12、图4-B12)。

根据处理后Lane-Sandhu X线评分标准示：处理后2、4、8周，相比A组，B组存在明显成骨优于A组(P<0.05)，且具有统计学意义；处理后12周的X线显示检测结果两组无显著差别，不存在统计学意义，如表8所示。

表8处理后各组各时间段家兔骨缺损区的Lane-Sandhu X线评分值

^a表示与A组比较P<0.05。

5.光镜学观察及评分

处理后2周，A、B两组骨缺损出出现肉芽组织，其中B组存在少量的软骨细胞，具体结果如图5-A2、5-B2所示。处理后4周，A、B两组病变处生成骨样组织，B组已经可以看到软骨，并出现了基质溶解现象，同时伴随软骨细胞变形坏死状况，可能在这一部位出现了成骨样组织，出现少量骨小梁，且不规则(图5-A4、图5-B4)。处理后8周，A、B两组中都出现了软骨内成骨和纤维性成骨，而B组的骨小梁相互交联成为网状(图5-A8、图5-B8)。处理后12周，A、B两组中大部分的软骨组织和纤维组织都在网状骨小梁的作用下成为骨性骨痂，而A组的局部区域内存在着一定数量的软骨结构，B组的骨小梁之间出现了早期的骨髓腔，表明新生骨正在进行改造(图5-A12、图5-B12)。

根据Lane-Sandhu组织学评分示，如表9所示，处理后2、4、8、周，相比A组，B组成骨存在优势(P<0.05)；处理后12周A、B组相差无意义(P>0.05)。

表9处理后各组各时间段家兔骨缺损区的Lane-Sandhu组织学评分值

^a表示与A组比较P<0.05。

(四)总结

动物实验证实：

5.治疗兔感染性骨缺损时与万古霉素CPC缓释系统植入组相比，植入含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统组的抗感染能力更强。

6.治疗兔感染性骨缺损时，与万古霉素CPC缓释系统植入组相比，植入含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统组的成骨能力更强。

7.在兔感染性骨缺损治疗中，含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系统可吸收性良好。

8.含万古霉素和BMSCs的CPC缓释系的局部应用对于治疗感染性骨缺损效果是良好的，可视为一种可缓慢降解吸收、具有缓释药物作用、具有一定的骨生成作用的治疗方法。该发明为感染性骨缺损的治疗提供了新的思路，临床效果有待于进一步研究。

Claims

1.一种新型抗菌素释缓系统，其特征在于，包括固态万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统和液态BMSCs-PLGA-PTMAC支架。

2.如权利要求1所述的一种新型抗菌素释缓系统，其特征在于，所述万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统包括：盐酸万古霉素、蒸馏水、PLGA二氯甲烷溶液、2.5％PVA溶液、多孔块状PTMC。

3.如权利要求1所述的一种新型抗菌素释缓系统，其特征在于，所述BMSCs-PLGA-PTMAC支架包括：盐酸万古霉素、蒸馏水、PLGA二氯甲烷溶液、2.5％PVA溶液、多孔块状PTMC、第3代MSCs、DMEM-F12培养液；。

4.一种基于权利要求1-3任一项所述的新型抗菌素释缓系统的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1，制备PLGA-PTMAC多孔支架；

步骤2，制备万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统；

步骤3，培养BMSCs；

步骤4，利用步骤2、3所获得的产物，经处理后制备BMSCs-PLGA-PTMAC支架；

5.如权利要求4所述的一种新型抗菌素缓释系统的制备方法，其特征在于，所述PLGA-PTMAC多孔支架是通过以下步骤得到的：

取丙交酯∶乙交酯＝3∶1，相对分子质量30×10^4的PLGA颗粒、PTMC颗粒，其中二者质量比为PLGA∶PTM C＝7∶3；溶于氯仿中，配成10％的溶液，待聚合物完全溶解后，加入直径200-300μm的氯化钠颗粒，充分搅拌混匀后，超声脱泡，浇注于调平的聚四氟模具中，浇注后静置24-48h，脱模后再静置24-48h，从而得以达到充分获得产物的目的，然后在真空干燥箱中真空干燥24h，最后将材料置于去离子水中浸泡并不时搅动，每4-6h换1次水，连续48h，取出后漓干水，空气干燥48h，真空干燥48h，以上步骤能够最大化的减少杂质对于产物的影响。

6.如权利要求4所述的一种新型抗菌素缓释系统的制备方法，其特征在于，所述万古霉素纳米微球PLGA-PTMC缓释系统是通过以下方法得到的：

取一定量的盐酸万古霉素，用蒸馏水溶解作为内水相，与PLGA二氯甲烷溶液混合，超声乳化制成初乳；万古霉素用量为100mg/kg；

将初乳快速均匀地滴加到浓度为2.5％PVA溶液20mL中，高速搅拌2min得复乳，并将其用100mL蒸馏水稀释，400rpm低速搅拌6h，离心水洗3次，预冻24小时，冷冻干燥24小时，即可制得所需多孔块状PTMC；

将所得多孔块状PTMC加工成直径10mm、厚3mm的圆盘状，电子分析天平称重，60钴辐照消毒备用；

向PTMC中加入万古霉素PLGA纳米微球混悬液，其中PLGA纳米微球混悬液与PTMC的质量比10∶1的，真空吸附后，用冻干机进行材料的冻干，制成万古霉素纳米微球PLGA-PTMC材料，每块材料含万古霉素0.1g，备用。

7.如权利要求4所述的一种新型抗菌素缓释系统的制备方法，其特征在于，所述BMSCs-PLGA-PTMAC支架是通过以下方法得到的：

将不含有万古霉素的PLGA-PTMC多孔支架切成5mm×5mm×3mm大小的片状，将其浸泡于体积分数为75％的乙醇中24h进行溶解，以D-hank's液反复清洗去除乙醇；将培养至第3代MSCs消化、重悬后调整浓度为5×10⁸/L；每支架接种100μLMSCs细胞悬液，分别放置于6孔培养板中；4h后加入DMEM-F12培养液8mL，于37℃、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养，每3d更换培养液1次，每次仍为8mL，共培养2周，备用。

8.如权利要求4所述的一种新型抗菌素缓释系统的制备方法，其特征在于，所述BMSCs是通过以下方法进行培养的：

9.如权利要求1-3任一项所述的一种新型抗菌素释缓系统做为治疗感染性骨缺损、骨组织再生或创伤愈合的药物中的应用。