CN114561447A - 一种单细胞全基因组的扩增方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单细胞全基因组的扩增方法及其应用，所述单细胞全基因组的扩增方法包括以下步骤：(1)采用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增，得到单链DNA；(2)纯化步骤(1)所得的单链DNA，使用DNA聚合酶和随机引物扩增形成互补链。所述单细胞全基因组的扩增方法能够兼顾高保真性和均一性，且能同时满足SNP和CNV的分析需求。所述单细胞全基因组的扩增方法的酶切速率高，在切口的同时进行等温扩增，扩增效率高，扩增产物的产量大；扩增反应条件为恒温条件，对仪器的要求低，使用操作简单快捷，方法易于推广。
Description
技术领域
本发明属于单细胞测序领域，具体涉及一种单细胞全基因组的扩增方法及其应用。
背景技术
细胞是生命活动的基本单位，在单个细胞中含有以单一分子形式存在的携带遗传信息的DNA分子。在生物学和医学中，通常需要对单个细胞的基因组进行研究，有些细胞很珍贵，数量很少，例如，人类卵母细胞和循环肿瘤细胞等。单个细胞的基因组随时间发生随机变化，单个细胞在特定时间的基因组序列可以揭示其在时间上的变化过程。同一样本中单个细胞的基因组是异质的，因此，人们在研究这一类样本时往往需要了解样本中细胞的分布情况，而不是确定大量细胞集合的平均值。因此，针对单细胞水平的测序研究具有重要的临床和科研意义。
随着全基因组扩增技术(whole genome amplification，WGA)的诞生，针对单个细胞的基因组研究成为可能。WGA是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度地增加DNA的总量，满足下一代测序要求。
目前用于单细胞全基因组扩增的技术主要有PicoPLEXTM技术和多重置换扩增技术(multiple displacement amplification，MDA)。
PicoPLEXTM技术具有拟线性放大的特点，减少了因指数放大而加剧的序列依赖偏差。PicoPLEXTM的关键在于不复制副本，通过保护扩增产物的方式，仅复制原始基因组DNA。PicoPLEXTM的引物在低温下与单链DNA分子随机退火，并在高温下通过具有链置换活性的聚合酶进行延伸，产生半扩增子。在后续的温度循环中，在完整扩增子环化步骤之后，单链扩增子和基因组DNA被用作模板，分别产生完整扩增子和额外的半扩增子。对于完整的扩增子，其3’端与5’端的序列互补。两端杂交形成环状DNA，可以有效地防止完整的扩增子被用作模板，从而保证接近线性的扩增。在线性预扩增后，使用通用27核苷酸序列作为引物进行PCR扩增，只有完整的扩增子才能以指数方式扩增。PCR反应将产生微克级的DNA用于测序实验。但是，PicoPLEXTM技术使用的Bst DNA聚合酶的保真性不高，扩增过程中容易引入扩增错误，因此在SNV检测时会出现更多的假阳性。
MDA技术是等温的链置换扩增技术，在等温条件下，随机六聚体引物与模板随机退火，在Phi29 DNA聚合酶的作用下延伸并发生链置换反应，形成树枝状结构。置换后的单链又可与引物发生随机结合、延伸，最终形成多支化扩增结构。该方法以链置换为基础，对全基因组进行高保真的均匀扩增。具有高分辨率和高基因组覆盖度，而且具有更好的敏感性和特异性，因而是公认较好的单细胞基因组扩增技术。但是MDA技术扩增的随机性强，扩增偏好性大，均一性差，时常会导致整个基因组不同区域的扩增倍数相差好几个数量级，因此MDA法不太适合进行CNV分析。
因此，提供一种可以兼顾高保真性、均一性且能同时满足SNP和CNV分析需求的WGA技术对单个细胞的基因组研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单细胞全基因组的扩增方法及其应用。所述单细胞全基因组的扩增方法能够兼顾高保真性和均一性，且能同时满足SNP和CNV的分析需求。所述单细胞全基因组的扩增方法的酶切速率高，在切口的同时进行等温扩增，扩增效率高，扩增产物的产量大；扩增反应条件为恒温条件，对仪器的要求低，使用操作简单快捷，方法易于推广。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种单细胞全基因组的扩增方法，所述单细胞全基因组的扩增方法包括以下步骤：
(1)采用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增，得到单链DNA；
(2)纯化步骤(1)所得的单链DNA，使用DNA聚合酶和随机引物扩增形成互补链。
本发明基于核酸切刻内切酶和恒温扩增酶的特点，形成组合反应体系实现对单细胞的有效全基因组扩增。在核酸切刻内切酶的作用下，在基因组上特定酶切识别位点处产生切口，切口上游序列可发挥引物作用，然后在具有链置换活性的恒温扩增酶的作用下，沿着模板链生成互补链，并替换掉原来的序列；核酸切刻内切酶再对新生成的双链继续发挥作用，循环上述步骤，如此在核酸切刻内切酶和恒温扩增酶的共同介导下，短时间内产生大量模板序列。
优选地，步骤(1)中，所述核酸切刻内切酶包括Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.Bst9I或Nt.BstNBI中任意一种或至少两种的组合。
本发明中所述核酸切刻内切酶的识别序列如下所示：
注：N＝A或G或C或T。“↓”表示链切口。
本发明中，所述核酸切刻内切酶是限制性核酸内切酶的一种，它与一般的限制性核酸内切酶不同，核酸切刻内切酶是以DNA双链为识别序列，但只切割其中的一条单链，形成一个切口。从单细胞中裂解释放的双链基因组DNA模板，或微量双链基因组DNA模板，在核酸切刻内切酶作用下在酶切识别位点切割形成单一缺口，然后以上游片段作为引物，通过具有链置换活性的恒温扩增酶的作用，以dNTPs为原料从缺口处的3’端聚合延伸，置换出下游DNA链，由此又形成了新的完整的含有切口酶识别位点的双链DNA序列。这条双链DNA再次被切口酶识别并切割，进而开始“切割-聚合延伸”的不断循环，从而产生大量被置换下来的DNA单链。最后利用随机引物在DNA聚合酶作用下生成DNA单链的互补链，获得预期扩增产物。上述“切割-聚合延伸”反应同时发生在基因组上所有的切口酶识别位点。
优选地，所述核酸切刻内切酶包括Nt.AlwI、Nt.BstNBI或Nt.Bst9I中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所使用的核酸切刻内切酶，其酶切位点在基因组上分布均匀，酶切效率高；同时，本发明在扩增阶段的每个循环均是以原始模板进行高保真性链置换，从而实现对全基因组的高均一性、高覆盖率、高保真性的扩增放大。所述核酸切刻内切酶的酶切速率高，切口的同时进行等温扩增，使得扩增效率高、产量大。
优选地，所述恒温扩增酶包括Bst DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Sau DNA聚合酶或Bsu DNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合。
本发明中，使用保真性高的恒温扩增酶，所有扩增产物均以原始模板进行复制，进一步提升了扩增产物的均一性和保真性。
优选地，所述恒温扩增酶包括Bst DNA聚合酶和/或Phi29 DNA聚合酶。
优选地，步骤(1)中，所述恒温扩增的体系包括扩增模板、扩增缓冲液、核酸切刻内切酶、恒温扩增酶、dNTPs和单链结合蛋白。
本发明中，在扩增反应体系中加有热稳定性高的单链结合蛋白，阻止生成的单链片段间产生相互作用，以保证反应顺利完成。
优选地，所述扩增模板包括核酸和/或细胞。
优选地，所述恒温扩增的体系中扩增模板为5～100pg的部分或全部基因组DNA，模板浓度例如可以是5pg、8pg、10pg、20pg、50pg或100pg等。
优选地，所述恒温扩增的体系中的核酸切刻内切酶和恒温扩增酶的终浓度各自独立为0.05～0.5U/μL，例如可以是0.05U/μL、0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL或0.5U/μL等。
优选地，所述单链结合蛋白的终浓度为5～10ng/μL，例如可以是5ng/μL、6ng/μL、7ng/μL、8ng/μL、9ng/μL或10ng/μL等。
优选地，所述单链结合蛋白包括ET SSB。
优选地，步骤(1)中，所述恒温扩增的程序包括：
37～65℃孵育1～2h，孵育的温度例如可以是37℃、47℃、57℃或65℃等，孵育的时间例如可以是1h、1.2h、1.4h、1.5h、1.6h、1.8h或2h等；
65～80℃孵育20～30min，孵育的温度例如可以是65℃、70℃、75℃或80℃等，孵育的时间例如可以是20min、23min、25min、28min或30min等；
0～4℃保温，保温的温度例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃等。
本发明中，扩增的条件为恒温条件，对仪器的要求低，操作简单，易于推广使用。
优选地，步骤(2)中，所述纯化的方法包括使用磁珠进行纯化。
优选地，步骤(2)中，所述DNA聚合酶包括DNA聚合酶I、Klenow大片段酶、Bsu DNA聚合酶大片段或T4 DNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)中，所述DNA聚合酶包括Klenow大片段酶和/或T4 DNA聚合酶。
优选地，步骤(2)中，所述扩增的体系包括纯化后的单链DNA、随机引物、扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
本发明中的随机引物的碱基数为6～10bp，例如可以是6bp、7bp、8bp、9bp或10bp。
优选地，步骤(2)中，所述扩增的体系的配制过程包括以下步骤：
将纯化后的单链DNA与随机引物混合并高温孵育，再冰浴冷却，冰浴后加入扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
优选地，所述孵育的温度为92～98℃，例如可以是92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃等；所述孵育的时间为2～5min，例如可以是2min、3min、4min或5min等。
优选地，所述扩增的体系中的纯化后的单链DNA的终浓度为0.05～0.15μg/μL，例如可以是0.05μg/μL、0.07μg/μL、0.09μg/μL、0.1μg/μL、0.11μg/μL、0.13μg/μL或0.15μg/μL等。
优选地，所述扩增的体系中的随机引物的终浓度为0.1～2μM，例如可以是0.1μM、0.5μM、1μM、1.5μM或2μM等。
优选地，所述扩增的体系中的DNA聚合酶的终浓度为0.05～0.5U/μL，例如可以是0.05U/μL、0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL或0.5U/μL等。
优选地，步骤(2)中，所述扩增的程序包括：
20～25℃孵育1～1.5h，孵育的温度例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等，孵育的时间例如可以是1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h或1.5h等；
0～4℃保温，保温的温度例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃等。
优选地，步骤(2)中，所述扩增后还包括加入EDTA终止反应的步骤。
优选地，所述EDTA的pH为7.5～8.5，例如可以是7.5、7.8、8.0、8.2、8.3或8.5等。
优选地，所述EDTA的终浓度为0.08～0.12M，例如可以是0.08M、0.085M、0.09M、0.1M、0.11M或0.12M等。
作为本发明的优选技术方案，所述单细胞全基因组的扩增方法包括如下步骤：
(1)采用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增，得到单链DNA。
配制恒温扩增体系，所述恒温扩增体系中扩增模板为5～100pg的部分或全部基因组DNA，所述恒温扩增的体系中的核酸切刻内切酶、恒温扩增酶的终浓度各自独立为0.05～0.5U/μL，所述单链结合蛋白的终浓度为5～10ng/μL。
所述恒温扩增的程序包括：
37～65℃孵育1～2h；
65～80℃孵育20～30min；
0～4℃保温。
(2)纯化步骤(1)所得的单链DNA，使用DNA聚合酶和随机引物扩增形成互补链。
使用磁珠对扩增得到的单链DNA进行纯化；配制扩增体系，将纯化后的单链DNA与随机引物混合，在92～98℃孵育2～5min，再冰浴冷却，冰浴后加入扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
所述扩增体系中纯化后的单链DNA的终浓度为0.05～0.15μg/μL，随机引物的终浓度为0.1～2μM，DNA聚合酶的终浓度为0.05～0.5U/μL。
所述扩增的程序包括：
20～25℃孵育1～1.5h；
0～4℃保温。
扩增后加入终浓度为0.08～0.12M、pH为7.5～8.5的EDTA终止反应。
本发明中，所述单细胞全基因组的扩增方法可在恒温1～2h内，得到2～3μg的高覆盖率、均一的单细胞全基因组扩增产物。
第二方面，本发明提供了一种单细胞全基因组的扩增试剂盒，所述单细胞全基因组的扩增试剂盒包括恒温扩增试剂和互补扩增试剂；
所述恒温扩增试剂包括扩增缓冲液、核酸切刻内切酶、恒温扩增酶、dNTPs和单链结合蛋白；
所述互补扩增试剂包括纯化磁珠、随机引物、扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
第三方面，本发明提供一种单细胞全基因组的扩增装置，所述单细胞全基因组的扩增装置包括：
(1)单链DNA扩增模块：
配制扩增体系，使用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增；
(2)互补链合成模块：
纯化步骤(1)所得的扩增产物并以其为模板，使用DNA聚合酶和随机引物进行合成。
第四方面，本发明提供一种构建单细胞全基因组高通量测序文库的方法，采用第一方面所述的单细胞全基因组的扩增方法、第二方面所述的单细胞全基因组的扩增试剂盒或第三方面所述的单细胞全基因组的扩增装置进行扩增，并采用酶切法构建单细胞全基因组文库。
第五方面，本发明提供第一方面所述的单细胞全基因组的扩增方法、第二方面所述的单细胞全基因组的扩增试剂盒、第三方面所述的单细胞全基因组的扩增装置或第四方面所述的构建单细胞全基因组高通量测序文库的方法在单细胞全基因组测序中的应用。
需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语：
CNV：copy number variation，基因拷贝数变异；
SNV：single nucleotide variant，单核苷酸变异；
ADO：allele dropout，等位基因脱扣；
ET SSB：Extreme Thermostable Single-Stranded DNA Binding Protein，极高热稳定性单链结合蛋白。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所用的切口酶，其酶切位点在基因组上分布均匀，酶切效率高，同时，每个扩增循环中均以原始模板进行扩增，使得扩增产物均一性好，提升对CNV的检出精确度。
(2)本发明中的扩增反应在恒温条件下进行，无需对原始模板进行变性，降低了对模板DNA的损伤和碱基突变位点的产生。此外，高保真的恒温扩增酶使扩增产物保真性好，适用于SNV的检测。
(3)扩增效率高，需要的仪器设备简单，操作简便高效，适用于临床扩增DNA，易于推广使用。
附图说明
图1为实施例3中的扩增原理图。
图2为测试例1中的琼脂糖凝胶电泳结果图。泳道M代表DNA marker；泳道1代表MDA的单细胞基因组扩增产物；泳道2代表PicoPLEXTM的单细胞基因组扩增产物；泳道3代表实施例3的单细胞基因组扩增产物。
图3为测试例2中的二代测序的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未标明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或未标注生产厂商者，均为可通过正规渠道采购获得的常规产品。
以下具体实施方式中，所使用的材料来源如下所示：
基因组提取试剂盒：
Bst DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Nt.AlwI、Nt.BstNBI和ET SSB的厂家均为NEB；
AMPure XP磁珠：厂家贝克曼库尔特；
Taq 2×预混液：厂家TaKaRa；
细胞裂解液：QIAGEN。
实施例1
本实施例提供一种单细胞全基因组的扩增试剂盒，所述单细胞全基因组的扩增试剂盒包括恒温扩增试剂和互补扩增试剂。
所述恒温扩增试剂包括扩增缓冲液、核酸切刻内切酶、恒温扩增酶、dNTPs和单链结合蛋白。
其中，所述核酸切刻内切酶为：Nt.AlwI，所述Nt.AlwI的识别区域和剪切位点为-GGATCNNNN↓-，“↓”表示链切口；所述恒温扩增酶为：Bst DNA聚合酶；所述单链结合蛋白为：极高热稳定性单链结合蛋白(ET SSB)。
所述互补扩增试剂包括纯化磁珠、随机引物、扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
其中，所述纯化磁珠为：AMPure XP磁珠；所述DNA聚合酶为：Klenow大片段酶。
实施例2
本实施例提供一种单细胞全基因组的扩增试剂盒，所述单细胞全基因组的扩增试剂盒包括恒温扩增试剂和互补扩增试剂。
所述恒温扩增试剂包括扩增缓冲液、核酸切刻内切酶、恒温扩增酶、dNTPs和单链结合蛋白。
其中，所述核酸切刻内切酶为：Nt.BstNBI，所述Nt.BstNBI的识别区域和剪切位点为-GAGTCNNNN↓-，“↓”表示链切口；所述恒温扩增酶为：Phi29 DNA聚合酶；单链结合蛋白为：极高热稳定性单链结合蛋白。
所述互补扩增试剂包括纯化磁珠、随机引物、扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
其中，所述纯化磁珠为：AMPure XP磁珠；所述DNA聚合酶为：Klenow大片段酶。
实施例3
本实施例使用实施例1提供的单细胞全基因组的扩增试剂盒进行单细胞全基因组的扩增，所使用的细胞为GM10315(核型为47，XX，+22)，使用基因组提取试剂盒提取GM10315细胞的基因组。本实施例的扩增原理如图1所示。
(1)采用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增，得到单链DNA。
对微量核酸进行扩增时，配制单链DNA扩增体系，所述单链DNA扩增体系如下所示：
将上述单链DNA扩增体系充分震荡混匀并离心，然后进行扩增反应，所述扩增程序如下所示：
65℃孵育1h；80℃孵育20min；4℃保温。
(2)纯化步骤(1)所得的单链DNA，使用DNA聚合酶和随机引物扩增形成互补链。
运行结束后，加入AMPure XP磁珠30μL，混匀后室温放置5min，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用300μL的80％酒精洗涤两次，室温干燥后用22μL Low TE洗脱DNA。
使用随机引物生成互补链，配制扩增体系，将纯化后的单链DNA与随机引物混合并92℃孵育5min，再冰浴冷却，冰浴后加入扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs，所述随机引物的碱基数为6bp、7bp、8bp、9bp和10bp。
所述扩增体系如下所示：
将上述扩增体系充分震荡混匀并离心，然后进行扩增反应，所述扩增程序如下所示：
25℃孵育1h；4℃保温。
加入5μL 0.4M EDTA(pH 7.5)终止反应。运行结束后加入AMPure XP磁珠37.5μL，混匀后室温放置5min，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用300μL的80％酒精洗涤两次，室温干燥后用22μL Low TE洗脱DNA，Qubit测浓度。
实施例4
本实施例提供一种使用实施例2提供的单细胞全基因组的扩增试剂盒进行单细胞全基因组的扩增，所使用的细胞为GM10315(核型为47，XX，+22)。
(1)采用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增，得到单链DNA。
对单细胞进行扩增时，配制单链DNA扩增体系，所述单链DNA扩增体系如下所示：
将上述单链DNA扩增体系充分震荡混匀并离心，然后进行扩增反应，所述扩增程序如下所示：
37℃孵育2h；65℃孵育30min；4℃保温。
(2)纯化步骤(1)所得的单链DNA，使用DNA聚合酶和随机引物扩增形成互补链。
运行结束后，加入AMPure XP磁珠30μL，混匀后室温放置5min，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用300μL的80％酒精洗涤两次，室温干燥后用22μL Low TE洗脱DNA。
使用随机引物生成互补链，配制扩增体系，将纯化后的单链DNA与随机引物混合并98℃孵育2min，再冰浴冷却，冰浴后加入扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs，所述随机引物与实施例3相同。
所述扩增体系如下所示：
将上述扩增体系充分震荡混匀并离心，然后进行扩增反应，所述扩增程序如下所示：
20℃孵育1.5h；4℃孵育保温。
加入5μL 0.6M EDTA(pH8.5)终止反应。运行结束后加入AMPure XP磁珠37.5μL，混匀后室温放置5min，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用300μL的80％酒精洗涤两次，室温干燥后用22μL Low TE洗脱DNA，Qubit测浓度。
对比例1
本对比例使用多重置换扩增技术(multiple displacement amplification，MDA)扩增单细胞基因组，所使用的细胞为GM10315(核型为47，XX，+22)。
所述多重置换扩增技术扩增GM10315细胞的基因组的步骤包括：
(1)配置D2缓冲液(Buffer D2)：二硫苏糖醇(DTT)1M 3μL+DLB缓冲液(Reconstituted Buffer DLB)33μL。
(2)向含单细胞的扩增管中补充PBS缓冲液至液体的体积为4μL。
(3)在扩增管中加入3μL的Buffer D2；轻弹混匀后短暂离心。
(4)65℃孵育10min后加入3μL终止液(Stop Solution)，轻弹混匀后短暂离心；置于冰上暂存。
(5)在冰上配制反应Mix：
有多个扩增反应时可按比例放大各组分。
(6)将40μL的反应Mix加入步骤(4)得到的10μL变性DNA中。
(7)30℃孵育8h，65℃孵育3min。
运行结束后，得到扩增产物。
对比例2
本对比例使用PicoPLEXTM技术扩增单细胞基因组，所使用的细胞为GM10315(核型为47，XX，+22)。
所述PicoPLEXTM技术扩增GM10315细胞的基因组的步骤包括：
(1)细胞裂解：在装有单细胞样本的0.2mL PCR管中依次加入如下试剂，涡旋5s混匀后短暂离心。
75℃孵育10min；95℃孵育4min；25℃保持。
(2)预扩增：从PCR仪中取出反应结束的样本，室温放置，依次加入如下试剂，涡旋5s混匀后短暂离心。
设置PCR仪反应程序，按照如下条件进行孵育：
95℃孵育2min，1个循环；
95℃孵育15s，15℃孵育50s，25℃孵育40s，35℃孵育30s，65℃孵育40s，75℃孵育40s，12个循环；
4℃保温。
(3)指数扩增：从PCR仪中取出反应结束的样本，放置于冰上，依次加入如下试剂，涡旋5s混匀后短暂离心。
设置PCR仪反应程序，按照如下条件进行孵育：
95℃孵育2min，1个循环；
95℃孵育15s，65℃孵育1min，75℃孵育1min，14个循环；
4℃保温。
(4)扩增产物纯化：将扩增产物转移到1.5mL的EP管中，涡旋或颠倒混匀AMPure XP磁珠10次，向EP管中加入磁珠112μL。混匀后，室温反应5min。放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用300μL的70％酒精洗涤两次，室温干燥后用33μL Low TE洗脱DNA。
测试例1
分别对实施例3、对比例1和对比例2中的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，所述琼脂糖凝胶电泳的结果如图2所示。从图2中可以看出，对比例1中MDA方法扩增产物片段较长，平均产物长度>10kb，对比例2中PicoPLEXTM技术扩增产物片段较短，主要集中在400bp左右，实施例3中扩增产物片段主要集中在900bp左右。图2中泳道M代表DNA marker；泳道1代表MDA的单细胞基因组扩增产物；泳道2代表PicoPLEXTM的单细胞基因组扩增产物；泳道3代表实施例3的单细胞基因组扩增产物。
测试例2
分别对实施例3、对比例1和对比例2中的单细胞基因组扩增产物进行二代测序。将扩增产物使用酶切打断的方法构建基因组文库，进行低深度高通量测序。拷贝数变异系数(CV)值用于评价CNV的分散程度。
二代测序的结果图如图3所示，MDA的单细胞基因组扩增产物的CV值最大，实施例3与PicoPLEXTM的单细胞基因组扩增产物的CV值无明显差异，散点较为集中，说明两种单细胞基因组扩增的均一性较好。
测试例3
等位基因脱扣(ADO)是由于WGA不均匀扩增导致的，需要不断改进WGA技术，降低扩增时的等位基因脱扣。如果一个二倍体细胞有杂合突变，两个等位基因中的一个缺乏扩增，就会造成等位基因丢失。ADO是单核苷酸变异(SNV)测定假阴性的主要原因。ADO率是通过在单细胞基因组扩增产物中未检测到的与实际杂合子SNV的比率来衡量的，这里实际杂合子是指基因组DNA(gDNA)中的杂合子。随机挑选50个SNP位点并设计相应的引物，挑选的位点以及相应引物参见表1。
为了衡量给定位点的扩增效率和ADO率，将使用MDA、PicoPLEXTM和实施例3的单细胞基因组扩增产物以及人类表皮成纤维细胞(AFP)细胞gDNA，分别进行多重PCR。
表1
所述多重PCR的扩增体系如下所示：
所述多重PCR的扩增程序如下所示：
99℃孵育2min，1个循环；
99℃孵育15s，60℃孵育4min，15个循环；
10℃保温。
运行结束后，得到扩增产物，将所述扩增产物构建成基因组文库，使用DA8600测序仪测序。二代测序分析结果显示，以gDNA为起始材料的多重PCR产物中共检测到杂合位点32个，这32个杂合位点在MDA单细胞基因组扩增产物中检测到31个，其中有1个ADO；在PicoPLEXTM单细胞基因组扩增产物中检测到30个，其中有4个ADO；实施例3的单细胞基因组扩增产物检测到30个，其中有3个ADO。MDA单细胞基因组扩增产物ADO率最低，实施例3的单细胞基因组扩增产物ADO率比PicoPLEXTM单细胞基因组扩增产物ADO率低。说明实施例3的单细胞基因组扩增方法的保真性优于PicoPLEXTM技术，具有更好的SNV检测性能。具体数据见三种单细胞基因组扩增产物中杂合位点的ADO率比较表，如表2所示。
表2
| 杂合位点 | MDA | PicoPLEX<sup>TM</sup> | 实施例3 |
| 32(gDNA) | 1/31 | 4/30 | 3/30 |
| ADO率 | 3.23％ | 13.33％ | 10.00％ |
| 扩增效率 | 96.88％ | 93.75％ | 93.75％ |
综上，本发明提供的单细胞全基因组的扩增方法能够兼顾高保真性和均一性，且能同时满足SNP和CNV的分析需求。所述单细胞全基因组的扩增方法的酶切速率高，在切口的同时进行等温扩增，扩增效率高，扩增产物的产量大；扩增反应条件为恒温条件，对仪器的要求低，使用操作简单快捷，方法易于推广。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 苏州贝康医疗器械有限公司
<120> 一种单细胞全基因组的扩增方法及其应用
<130> 2022
<160> 100
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtagcagcga ccaccttgt 19
<210> 2
<211> 21
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<213> 人工序列
<400> 51
tccttattcc tgtcaatttg cagtacaa 28
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggttaaattt ccagtgccac atatttgt 28
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
gcatgctggg tatcttctgg tt 22
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
gacaaaaggg taggcggtag at 22
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
agcgatcaat gagtttaaga ggctt 25
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
attcagatgg atgttgtgag ttttgaaaaa 30
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
cttaatactg attttggcca tgaaaagaca 30
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
ggatctctct aggatataac tggttcctta 30
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
aaatgtggtg attcattctg ttcaaactg 29
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tacacacata cctatataca accacacaga 30
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ctgctaattg gtataagtaa cagaggcaa 29
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
gggctaaata ctattagcag ttccaga 27
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
cacatacctc aaaataataa aagctgccta 30
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
atattgcggg tgaagagaga tagtttg 27
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
gttagttcat gtctgtgtgt ggaca 25
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
aactgcacat taaaacaaga agataccaac 30
<210> 67
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
catcttttcc tcaatttctt cctaccctt 29
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
acatagtctg cacattaagg aactgag 27
<210> 69
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
ttgcatatca ctgggtcttg atgtac 26
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
tcatattgaa gatgaggagg tcaagaga 28
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
ggtcttcact gaaccttttc cca 23
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
tatgagccac aaagggttta tattgagg 28
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
tctaagacat aagacatgta tttgcatgga 30
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
ggtcatggat cgagttcaga gaaaaa 26
<210> 75
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
cttttctctg tctcttgaaa gagctct 27
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
cagtttctcc agtttccctt tttcctaata 30
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
gggtcctgac ttgatgtgtg at 22
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
aaactcatag gccatattga gagcttc 27
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
ccacagtgct aggtgttctg tg 22
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
tcgacagtag ggaaaccagt gta 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
cgagagaagc tggagaagag tga 23
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
tctgttttgg actcattctg cctatg 26
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
acctcgctta atgaactgca ga 22
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gggtgaccac agcatagaag ag 22
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
aggaggccct caaaatgaaa aca 23
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gtaccaccgt gctcaggtaa atta 24
<210> 87
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
gaaagtcaaa cttagtagct ttgtgagtc 29
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
ggaggcgtag agacaggttt ttg 23
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
ccaggctgga atgagtaagg tc 22
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
ctaaacggga ccaaaaaggg tcagt 25
<210> 91
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
gtgtgtatgt gatatgtgta tgtgcatc 28
<210> 92
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
gaggaaagaa ggcaaaaata aaagcattg 29
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
ttgattcagc aaaagtgcgt acatataaac 30
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
tggcttacta tgtgttgcaa aaatgc 26
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
tgacccagca tcaaagcaat ct 22
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
gggagtgagg cttgatcctt tc 22
<210> 97
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
gtggctgtag tagaaatacc aaaagact 28
<210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
tatgaaatcc ctatcaagaa ggctgaga 28
<210> 99
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
ctaccatctt ccagaatgtt cctctt 26
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
tacagttgaa gagaatgagg atagaagagt 30
Claims (10)
1.一种单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，所述单细胞全基因组的扩增方法包括以下步骤：
(1)采用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增，得到单链DNA；
(2)纯化步骤(1)所得的单链DNA，使用DNA聚合酶和随机引物扩增形成互补链。
2.根据权利要求1所述的单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，所述核酸切刻内切酶包括Nt.AlwI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.Bst9I或Nt.BstNBI中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述核酸切刻内切酶包括Nt.AlwI、Nt.BstNBI或Nt.Bst9I中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述恒温扩增酶包括Bst DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶、Sau DNA聚合酶或BsuDNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述恒温扩增酶包括Bst DNA聚合酶和/或Phi29 DNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，所述恒温扩增的体系包括扩增模板、扩增缓冲液、核酸切刻内切酶、恒温扩增酶、dNTPs和单链结合蛋白；
优选地，所述扩增模板包括核酸和/或细胞；
优选地，所述恒温扩增的体系中扩增模板为5～100pg的部分或全部基因组DNA；
优选地，所述恒温扩增的体系中的核酸切刻内切酶和恒温扩增酶的终浓度各自独立为0.05～0.5U/μL；
优选地，所述单链结合蛋白的终浓度为5～10ng/μL；
优选地，所述单链结合蛋白包括ET SSB。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，所述恒温扩增的程序包括：
37～65℃孵育1～2h；
65～80℃孵育20～30min；
0～4℃保温。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的单细胞全基因组扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纯化的方法包括使用磁珠进行纯化；
优选地，步骤(2)中，所述DNA聚合酶包括DNA聚合酶I、Klenow大片段酶、Bsu DNA聚合酶大片段或T4 DNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤(2)中，所述DNA聚合酶包括Klenow大片段酶和/或T4 DNA聚合酶；
优选地，步骤(2)中，所述扩增的体系包括纯化后的单链DNA、随机引物、扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs；
优选地，步骤(2)中，所述扩增的体系的配制过程包括以下步骤：
将纯化后的单链DNA与随机引物混合并高温孵育，再冰浴冷却，冰浴后加入扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs；
优选地，所述孵育的温度为92～98℃；所述孵育的时间为2～5min；
优选地，所述扩增的体系中的纯化后的单链DNA的终浓度为0.05～0.15μg/μL；
优选地，所述扩增的体系中的随机引物的终浓度为0.1～2μM；
优选地，所述扩增的体系中的DNA聚合酶的终浓度为0.05～0.5U/μL。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的单细胞全基因组的扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增的程序包括：
20～25℃孵育1～1.5h；
0～4℃保温；
优选地，步骤(2)中，所述扩增后还包括加入EDTA终止反应的步骤；
优选地，所述EDTA的pH为7.5～8.5；
优选地，所述EDTA的终浓度为0.08～0.12M。
7.一种单细胞全基因组的扩增试剂盒，其特征在于，所述单细胞全基因组的扩增试剂盒包括恒温扩增试剂和互补扩增试剂；
所述恒温扩增试剂包括扩增缓冲液、核酸切刻内切酶、恒温扩增酶、dNTPs和单链结合蛋白；
所述互补扩增试剂包括纯化磁珠、随机引物、扩增缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
8.一种单细胞全基因组的扩增装置，其特征在于，所述单细胞全基因组的扩增装置包括：
(1)单链DNA扩增模块：
配制扩增体系，使用核酸切刻内切酶处理扩增模板，使用恒温扩增酶进行恒温扩增；
(2)互补链合成模块：
纯化步骤(1)所得的扩增产物并以其为模板，使用DNA聚合酶和随机引物进行合成。
9.一种构建单细胞全基因组高通量测序文库的方法，其特征在于，采用权利要求1～6中任一项所述的单细胞全基因组的扩增方法、权利要求7所述的单细胞全基因组的扩增试剂盒或权利要求8所述的单细胞全基因组的扩增装置进行扩增，并采用酶切法构建单细胞全基因组文库。
10.权利要求1～6中任一项所述的单细胞全基因组的扩增方法、权利要求7所述的单细胞全基因组的扩增试剂盒、权利要求8所述的单细胞全基因组的扩增装置或权利要求9中所述的构建单细胞全基因组高通量测序文库的方法在单细胞全基因组测序中的应用。
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| CN104726549A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-06-24 | 青岛科技大学 | 一种基于切刻酶的双链核酸等温扩增检测新方法 |
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