CN114560965A - 一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法及应用，包括以下步骤：将基础单体苯乙烯、功能性阳离子交联剂、功能性阳离子单体一、功能单体二、阳离子乳化剂和引发剂混合搅拌，聚合得到乳胶微球；将乳胶微球清洗、分散，向分散液中加入浓硫酸和琼斯试剂。本发明获得的阳离子羧基微球均一度好，使得羧基阴离子和阳离子在聚苯乙烯微球共存，且羧基含量高。采用阿尔兹海默症磷酸化Tau蛋白抗体验证抗体偶联效果，通过两步法EDC/NHS先将微球羧基反应使得微球表面仅含阳离子，再通过阳离子吸引抗体C端，提高C端偶联到微球表面的效率，极大地提高抗体的偶联率及磷酸化Tau蛋白的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料和体外检测领域，具体涉及一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法及应用。
背景技术
阳离子型微球是采用阳离子乳化剂或带正电荷的单体均聚或共聚而成的聚合物乳液。其基本特征是：乳胶粒表面或聚合物本身带正电荷，对正负电荷具有良好的平衡性；同时还具有杀菌、滑爽等作用；在很多方面具有阴离子型或非离子型乳液所不可比拟的功能。阳离子型羧基乳胶微球由于同时具有羧基和阳离子基团可以极大地提高抗体偶联效率。但是阳离子和羧基阴离子的静电作用导致无法制备纳米级阳离子羧基微球。
阿尔茨海默症是影响中老年人常见的精神疾病，现有辅助诊断标志物有β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)、总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白。研究发现，在阿尔茨海默症发病早期，患者的Tau蛋白会出现异常磷酸化并堆积，且患者脑中Tau蛋白总量会明显增多。过度的磷酸化Tau的生成，极大干扰了微管系统的运行，使得正常轴突转运受损，引起突触丢失以及神经元损伤，导致脑神经退行性病变。因此，检测Tau及P-tau的含量有助于阿尔茨海默症的早期诊断，帮助降低人们的患病风险。因此，制备微球标记磷酸化Tau抗体用于早期筛查阿尔茨海默症是及其重要的。
羧基微球表面通常采用一步法或两步法偶联抗体，但是无论羧基含量多少，抗体的偶联效率都极为低下，究其原因是抗体偶联无序导致抗体随机偶联在微球上，致使多数偶联的抗体失去结合目标抗原作用。而阳离子可以吸引抗体C端固定抗体偶联方式，可以极大地提高抗体偶联效率。因此，需要制备一种阳离子羧基微球来提高抗体的有序偶联，提高抗体偶联的作用效率。
发明内容
为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法及应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，包括以下步骤：
(1)将基础单体苯乙烯、功能性阳离子交联剂、功能性阳离子单体一、功能单体二、阳离子乳化剂和引发剂混合搅拌，聚合得到乳胶微球；
(2)将乳胶微球清洗、分散，向分散液中加入浓硫酸和琼斯试剂，回流搅拌、清洗得到阳离子羧基乳胶微球。
作为本发明的一种优选技术方案，所述功能性阳离子交联剂为二甲基二烯丙基氯化铵阳离子交联剂。所述功能性阳离子交联剂目的为提高微球的聚合度和产率。
作为本发明的一种优选技术方案，所述功能性阳离子单体一为烯丙基三甲基氯化铵、(3-丙稀酰胺丙基)三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中一种或多种单体。所述功能性阳离子单体一作为反应性乳化剂，使得粒子表面带正电荷，促进粒子减小的作用。
作为本发明的一种优选技术方案，所述功能单体二为3-丁烯-1-醇、3,4-环氧-1-丁烯、5-己烯-1-醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或多种单体。所述功能单体二目的为保护羧基不与乳化剂和阳离子单体产生静电作用。所述功能单体二在强酸条件下氧化获得羧基的单体。
作为本发明的一种优选技术方案，所述阳离子乳化剂为十八烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、双十六烷基二甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中一种或多种。所述阳离子乳化剂的作用为乳化阳离子微球，减小微球粒径的作用。
作为本发明的一种优选技术方案，所述的引发剂为阳离子引发剂或阴离子引发剂。
作为本发明的一种优选技术方案，各组分按照重量份为：所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，各组分按照重量份为：基础单体苯乙烯为80-100份，功能性阳离子单体一为5-10份、功能单体二10-20份，功能性阳离子交联剂为1-3份，阳离子乳化剂为1-2份，引发剂为0.5-1份。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤(2)采用浓硫酸和琼斯试剂氧化得到羧基，防止羧基和阳离子之间发生静电作用。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明还提供一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法的应用，采用阿尔兹海默症磷酸化Tau蛋白抗体偶联采用纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法制备而成的微球，验证微球的抗体偶联效率。
本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：
1.本发明创新采用保护羧基法制备阴阳离子共存的阳离子羧基乳胶微球，有效防止阴阳离子静电作用导致的粒径增大；
2.本发明通过氧化法有效抑制羧基电离，防止阴阳离子相互作用，保持粒径均一；
3.本发明采用的乳液聚合法可以制备尺寸均一的纳米级阳离子羧基乳胶微球；
4.本发明采用的乳液聚合法可以通过调整基础单体苯乙烯、功能性阳离子交联剂、功能性阳离子单体一、功能单体二、阳离子乳化剂比例来调整粒径；
5.本发明采用的乳液聚合法可以通过调整温度、转速、引发剂比例等反应条件来改变粒径大小；
6.本发明中纳米级阳离子羧基乳胶微球通过阳离子的静电作用吸附C端，提高抗体的有序结合能力；
7.本发明中纳米级阳离子羧基乳胶微球通过两步法偶联阿尔兹海默症相关抗体，可以有效地提高微球标记抗体的偶联效率。
附图说明
图1为90nm阳离子羧基乳胶微球扫描电镜图；
图2为不同条件下纳米微球粒径变化趋势图；
图3为纳米级阳离子羧基乳胶微球偶联阿尔兹海默症相关磷酸化Tau蛋白抗体效率图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：90nm阳离子羧基乳胶微球制备。
在质量分数0.5％的十二烷基溴化铵溶液中，加入10g苯乙烯，2g甲基丙烯酸甲酯，1.2g烯丙基三甲基氯化铵，0.1g过硫酸钾，70℃下搅拌7h(300rpm)，乳液聚合制备得到乳胶微球。向离心清洗后得到的乳胶微球分散液中加入浓硫酸溶液和适当的琼斯试剂，继续搅拌反应3h，多次用去离子水离心处理得到纳米级阳离子羧基乳胶微球，其扫描电镜见图1。
实施例2：100nm阳离子羧基乳胶微球的制备。
在质量分数0.5％的十二烷基溴化铵溶液中，加入10g苯乙烯，2g甲基丙烯酸甲酯，0.8g烯丙基三甲基氯化铵，0.1g过硫酸钾，70℃下搅拌7h(300rpm)，乳液聚合制备得到乳胶微球。向离心清洗后得到的乳胶微球分散液中加入浓硫酸溶液和适当的琼斯试剂，继续搅拌反应3h，多次用去离子水离心处理得到100nm阳离子羧基乳胶微球。
实施例3：120nm阳离子羧基乳胶微球的制备。
在质量分数0.5％的十二烷基溴化铵溶液中，加入10g苯乙烯，2g甲基丙烯酸甲酯，0.4g烯丙基三甲基氯化铵，0.1g过硫酸钾，70℃下搅拌7h(300rpm)，乳液聚合制备得到乳胶微球。向离心清洗后得到的乳胶微球分散液中加入浓硫酸溶液和适当的琼斯试剂，继续搅拌反应3h，多次用去离子水离心处理得到120nm阳离子羧基乳胶微球，以上三个实例的粒径变化趋势图见图2。
实施例4：阿尔兹海默症相关零酸化Tau蛋白抗体偶联。
分别取100nm阳离子羧基微球和对应比例制备的羧基乳胶微球0.08g分散于PH为6的MES缓冲液(0.05M)中，加入EDC/NHS，充分混匀后，于37℃下孵育2h，离心清洗3次后重，放于MES缓冲液(0.05M,pH 6)，加入阿尔兹海默症相关磷酸化Tau抗体，充分混匀后，于37℃下孵育2h，之后加入氨基乙醇封闭，继续37℃下孵育30min，PBS缓冲液(0.1M,pH 7.4)清洗得到表面偶联阿尔兹海默症磷酸化Tau蛋白抗体的乳胶微球。
将上述偶联好的微球通过乳胶增强比浊法进行验证，结果如图3，可以看到同样的粒径条件下，阳离子乳胶微球偶联抗体的效率大大高于常规非阳离子乳胶微球。
本发明的获得的阳离子羧基微球均一度好，同时使得羧基阴离子和阳离子在聚苯乙烯微球共存，且羧基含量高。采用阿尔兹海默症磷酸化Tau蛋白抗体验证抗体偶联效果，通过两步法EDC/NHS，先将微球羧基反应使得微球表面仅含阳离子，通过阳离子吸引抗体C端，提高C端偶联到微球表面的效率，极大地提高了抗体的偶联率及磷酸化Tau蛋白的检测灵敏度。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基础单体苯乙烯、功能性阳离子交联剂、功能性阳离子单体一、功能单体二、阳离子乳化剂和引发剂混合搅拌，聚合得到乳胶微球；
(2)将乳胶微球清洗、分散，向分散液中加入浓硫酸和琼斯试剂，回流搅拌、清洗得到阳离子羧基乳胶微球。
2.根据权利要求1所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，所述功能性阳离子交联剂为二甲基二烯丙基氯化铵阳离子交联剂。
3.根据权利要求1所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，所述功能性阳离子单体一为烯丙基三甲基氯化铵、(3-丙稀酰胺丙基)三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵中一种或多种单体。
4.根据权利要求1所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，所述功能单体二为3-丁烯-1-醇、3,4-环氧-1-丁烯、5-己烯-1-醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯中的一种或多种单体。
5.根据权利要求1所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，所述阳离子乳化剂为十八烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、双十八烷基二甲基溴化铵、双十六烷基二甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、十六烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵中一种或多种。
6.根据权利要求1所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，所述的引发剂为阳离子引发剂或阴离子引发剂。
7.根据权利要求1所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法，其特征在于，各组分按照重量份为：基础单体苯乙烯为80-100份，功能性阳离子单体一为5-10份、功能单体二10-20份，功能性阳离子交联剂为1-3份，阳离子乳化剂为1-2份，引发剂为0.5-1份。
8.一种如权利要求1-7任一所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法的应用，其特征在于，采用阿尔兹海默症磷酸化Tau蛋白抗体偶联采用权利要求1-7任一所述的纳米级阳离子羧基乳胶微球的制备方法制备而成的微球，验证微球的抗体偶联效率。
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