CN114560899A - 一种车前宁的制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种车前宁的制备方法及其用途，属于生物医药技术领域。该方法以灯盏花乙素为原料，通过羧基酯化以及酯基还原两步反应，可以高效地制备车前宁。本发明的反应步骤短、收率高、反应条件温和、易于操作，具有较好的应用开发前景，为车前宁生物活性的进一步研究提供了必要的物质基础。本发明同时揭示了车前宁具有抑制新型冠状病毒蛋白酶的作用，具有开发成抗新冠病毒药物的潜力。

Description

一种车前宁的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种车前宁的制备新方法及其在制备预防和/ 或治疗新型冠状病毒3C样蛋白酶抑制剂药物中的应用。
背景技术
病毒是一种具有高度传染性的病原体，严重危害人类健康。据不完全统计，约75％流行 性传染病是由病毒感染引起的。目前抗病毒药物种类有限且有一定毒副作用，随着新型变 异毒株及耐药毒株的出现，高效低毒、抗耐性的抗病毒药物的研究迫在眉睫。
中药和天然药物具有多组分、多途径、多靶点作用的特点，在抗病毒方面具有独特优 势，不易产生耐药性。黄酮是多种中药和天然药物的活性成分之一，具有抗炎、抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节等多种活性。目前已有大量研究表明，黄酮类 化合物具有抗多种病毒的作用，包括流感病毒、乙肝病毒、柯萨奇病毒等，并且效果显著。
车前宁(plantaginin)是从车前子等中药中分离出的活性单体成分，具有镇咳,祛痰,平 喘,促进子宫运动等生物活性。目前，车前宁的获取主要来源于天然植物的提取分离，提取 分离获得的目标化合物量较少。关于车前宁的化学合成文献报道较少：Li等采用灯盏花乙 素为原料，经6步反应以1.5％的总收率制备得到车前宁(Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 2013,23,102–106)；颜世强等曾报道过车前宁的化学合成：同样以灯盏花乙素为 起始物料，经4步反应以50.8％的总收率制备得到车前宁(Tetrahedron 2020,76,130950)。
现有技术中还没有将车前宁用于抗新型冠状病毒的报道。现有技术中车前宁的获取目 前为止主要来源于天然植物的提取分离，提取分离所需要的植物资源有限，提取分离获得 的目标化合物量较少。现有技术中车前宁的化学合成反应步骤较长，收率较低。
多聚蛋白(polyproteins，PP)pp1a和pp1b对于维持冠状病毒RNA的合成至关重要，而多聚蛋白的成熟需要经历一系列裂解过程，才能生成多亚基蛋白质复合物(被称为“病毒复制转录酶”)。多亚基蛋白质复合物的主要蛋白酶(main protease，Mpro)为3C样蛋 白酶(3C-like protease，3CLP)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(papain-like cysteineprotease，PLP)，3CLP和PLP高度协调催化多聚蛋白的裂解，3CLP和PLP活性缺失会导致 冠状病毒生命周期停止。
新型冠状病毒进入细胞依靠刺突蛋白spike识别受体ACE2，两种参与新型冠状病毒蛋 白酶解过程的关键蛋白酶分别为3C样蛋白酶和木瓜样蛋白酶。因此针对3C样蛋白酶为靶 点的小分子抑制剂可应用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种车前宁的制备新方法及其在制备预防和/或治疗新型冠状 病毒药物中的应用，车前宁能够有效抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶(3C-likeprotease， 3CLP)的活性，能够用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物。
本发明的目的之一是为了提供一种车前宁的制备新方法。本发明以灯盏花乙素为起始 原料来半合成制备车前宁，合成步骤短，成本低，收率高，产品纯度高。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的制备方法为如下反应式：
Figure RE-GDA0003626290510000021
本发明提供了一种车前宁的制备新方法，具体包含以下步骤：
a:以灯盏花乙素(化合物1)为起始原料，在反应溶剂中和酸催化下将羧基甲酯化，得 到灯盏花乙素甲酯(化合物2)；
b:将上述生成的灯盏乙素甲酯(化合物2)在反应溶剂和还原剂存在的条件下发生酯基 还原反应，得到车前宁(化合物3)。
上述反应a步骤采用的反应溶剂为甲醇。
上述反应a步骤采用的酸性催化剂为氯化亚砜、高氯酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸、盐酸中的一种或多种的混合物，优选氯化亚砜或浓硫酸。
上述反应a步骤中灯盏花乙素在反应溶剂中的浓度优选10～100mg mL-1；更为优选地， 浓度为20～30mg mL-1。
上述反应b步骤采用的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠、四氢铝锂中的一种或多种 的混合物；优选硼氢化钠。
上述反应b步骤采用的反应溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或多种的混合 物，优选甲醇。
本发明的目的之二在于提供一种车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的 新用途。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的应用。
进一步地，本发明提供了车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒的酶抑制剂中的应 用。
更进一步地，本发明提供了车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒的3C样蛋白酶 抑制剂中的应用。
根据上述应用，车前宁作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物 中的应用；或者车前宁与其他抗病毒药物的组合物作为活性成分在制备预防和/或治疗新型 冠状病毒感染药物中的应用。
本发明另一个方面提供了一种预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，所述药 物组合物中包含车前宁。
在本发明的技术方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明的技术方案中，所述药物组合物的剂型为口服制剂、肺部吸入制剂、黏膜给 药制剂或注射剂；优选地，其剂型为口服制剂；更为优选地，口服制剂选自颗粒剂、粉末剂、丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。
本发明和现有技术相比具有以下优点：
本发明提供了一种车前宁的化学合成新方法，以商业可得的灯盏花乙素为起始原料， 以2步反应完成车前宁的制备；反应试剂廉价易得，反应步骤短，反应条件温和，产品收率高，可大量制备。
本发明经实验证明，车前宁在酶水平能够明显抑制新型冠状病毒的3C样蛋白酶活性， 从而抑制病毒复制，进而达到预防和/或治疗新型冠状病毒感染的作用。
在本发明中，所述车前宁能够抑制新型冠状病毒的3CLP活性，从而抑制新型冠状病毒 的活性和增殖，缓解感染的宿主细胞内免疫失衡。在本发明中，对3CLP发挥抑制的活性的 车前宁依赖于其黄酮母核。
附图说明
图1实施例1制备的车前宁1H-NMR谱图；
图2实施例1制备的车前宁13C-NMR谱图；
图3实施例1制备的车前宁ESI-HRMS谱图；
图4实施例1制备的车前宁对新型冠状病毒3CLPro的IC50值拟合图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例 范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品 说明书选择。
实施例1-3车前宁的合成
实施例1
500mL圆底烧瓶中加入200mL无水甲醇,冰浴下缓慢滴加SOCl2(7.25mL,100mmol)，滴加完毕撤去冰浴，室温继续搅拌1h。然后加入灯盏花乙素1(4.62g,10mmol)，室温 搅拌9h后，TLC(V乙酸乙酯:V异丙醇:V水＝4:2:1)检测反应完全。直接过滤得灯盏花乙素 甲酯2(化合物2，4.67g,98％)；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.85(s,1H,5-OH), 10.39(s,1H,4’-OH),7.93(d,J＝9.0Hz,2H,H-2’,H-6’),7.00(s,1H,H-8), 6.94(d,J＝9.0Hz,2H,H-3’,H-5’),6.81(s,1H,H-3),5.28(d,J＝7.0Hz, 1H,H-1”),4.20(d,J＝6.0Hz,1H,H-2”),3.70-3.90(3H,m,other sugar protons), 3.68(3H,s,-OCH3)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6):δ182.8,169.7,164.5,161.6,151.3, 149.4,147.3,130.8,128.9,121.7,116.4,106.3,102.9,100.2,93.9,75.7,75.4, 73.1,71.8,52.4(-OCH3)。
将化合物2(1.43g,3.0mmol)悬浮于甲醇60mL中,室温剧烈搅拌下少量多次加入硼氢化钠(1.14g,30.0mmol)。1h后TLC(V二氯甲烷∶V甲醇＝10：1)检测显示反应 完全。向反应体系中加入30mL10％乙酸溶液,乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相减压浓缩 得粗品,将所得粗品悬浮于20mL乙酸乙酯,加热回流30分钟后,自然冷却,过滤,滤饼用乙 酸乙酯洗涤,真空干燥得淡黄色固体车前宁31.08g,收率79％。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6) δ12.71(s,1H,5-OH),10.42(s,1H,4’-OH),8.56(s,1H,6-OH),7.93(d,J＝ 8.7Hz,2H,H-2′,H-6′),7.00(s,1H,H-8),6.93(d,J＝8.6Hz,2H,H-3′,H-5′), 6.81(s,1H,H-3),5.45(br,1H,2”-OH),5.14(br,2H,3”-OH,4”-OH),4.99(d, J＝7.0Hz,1H,H-1”),4.70(br,1H,6”-OH),3.75(d,J＝10.0Hz,1H),3.53– 3.29(m,4H),3.20(t,J＝8.2Hz,1H)；13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ182.44,164.11, 161.27,151.39,149.08,146.62,130.49,128.50,121.33,116.03,105.88,102.52, 101.03,94.15,77.36,75.91,73.22,69.73,60.69；ESI-HRMS m/z[M+H]+calcd for C21H21O11449.1078,found 449.1078。
实施例2
500mL圆底烧瓶中将灯盏花乙素1(4.62g,10mmol)悬浮于300mL无水甲醇,室温 下缓慢滴加浓硫酸(0.03mL)。滴加完毕，加热回流3h后，TLC(V乙酸乙酯:V异丙醇:V水＝4: 2:1)检测反应完全。自然冷却至室温后减压浓缩得灯盏花乙素甲酯2(化合物2，4.72g, 98％)。
将化合物2(1.47g,3.0mmol)悬浮于60mL甲醇中,室温剧烈搅拌下少量多次加入硼氢化钠(1.71g,45.0mmol)。1h后TLC(V二氯甲烷∶V甲醇＝10：1)检测显示反应 完全。向反应体系中加入30mL10％乙酸溶液,乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相减压浓缩 得粗品,将所得粗品悬浮于20mL乙酸乙酯,加热回流30分钟后,自然冷却,过滤,滤饼用乙 酸乙酯洗涤,真空干燥得淡黄色固体车前宁31.14g,收率84％。
实施例3
500mL圆底烧瓶中将灯盏花乙素1(4.62g,10mmol)悬浮于200mL无水甲醇,室温 下缓慢滴加70％高氯酸(0.03mL)。滴加完毕，加热回流3h后，TLC(V乙酸乙酯:V异丙醇:V水 ＝4:2:1)检测反应完全。自然冷却至室温后减压浓缩得灯盏花乙素甲酯2(4.72g,98％)。
将化合物2(1.43g,3.0mmol)悬浮于60mL无水乙醇中,室温剧烈搅拌下少量多次加入硼氢化钠(1.14g,30.0mmol)。1h后TLC(V二氯甲烷∶V甲醇＝10：1)检测显示 反应完全。向反应体系中加入30mL 10％乙酸溶液,乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机相减压 浓缩得粗品,将所得粗品悬浮于20mL乙酸乙酯,加热回流30分钟后,自然冷却,过滤,滤饼 用乙酸乙酯洗涤,真空干燥得淡黄色固体车前宁31.05g,收率77％。
实施例4新型冠状病毒3CLPro蛋白的表达与纯化
4.1引物设计
根据新型冠状病毒3CLPro的基因(ORF1ab的蛋白残基3264-3569，GenBank检索号：MN908947.3)为模板设计基因特异性引物(3CL-F： gtgccgcgcggcagccatatgtcggcagtgctgcaaagcggtttccgtaagatg，SEQ ID NO：1；3CL-R： gtggtggtggtggtgctcgaggggcccttgaaaggtcacaccgctgc，SEQ ID NO：2)，其中3CLPro-F 引物序列带有NdeI酶切位点，3CLPro-R引物序列带有XhoI酶切位点。在蛋白N端加入SAVLQ 5个氨基酸，构建3CLPro自身酶切位点；在蛋白C端的VTFQ氨基酸后加入GP两个氨基酸， 构建Precission蛋白酶酶切位点，促进目的基因与His标签融合表达。
4.2新型冠状病毒3CLPro基因扩增
首先由通用生物合成具有大肠杆菌密码子偏爱性的新型冠状病毒3CLPro基因。以合成 的新型冠状病毒3CLPro的基因作为模板，扩增总体系为100μL。PCR反应体系包括：cDNA 模板1μL、3CL-R 4μL、3CL-F 4μL、2×Phanta Master Mix 50μL和ddH2O 41μ L。反应程序具体为：94℃3min的预变性，30次扩增反应(94℃15s，65℃30s，72℃30 s)及72℃充分延伸5min。PCR产物取9μL，加入1μL 6×Gel Loading Dye Purple混 合均匀后上样，其中第一个胶孔中加入2μL DNA Marker，以供样品分离出的条带进行对照 (电压150V，40min)。在紫外灯下观察PCR结果，并用切胶刀从凝胶上切下PCR正确片 段的条带，放入1.5mL EP管中，称重并记录。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收 PCR产物，使用Nano Drop测定回收的目的基因浓度与纯度。
4.3新型冠状病毒3CLPro表达载体的构建
使用NdeI和XhoI限制性内切酶对pET28a(+)进行酶切，然后胶回收目的质粒片段用 于重组连接。具体连接体系包括：pET28a(+)质粒片段20μg、3CLPro目的基因40μg、 5×CEⅡBuffer 5μL、ExnaseⅡ2μL，并用水补足50μL。
4.4新型冠状病毒3CLPro的诱导表达
将转化成功的大肠杆菌菌种在37℃下按1％(v/v)接种量接种于25mL含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB液体培养基中预培养过夜，然后将培养物按1％(v/v)接种量接种于1L含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养。当OD600达到0.8时，添加0.5mM 异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在25℃下诱导12h，使3CLPro蛋白表达。
4.5新型冠状病毒3CLPro的纯化
1)取1L菌液在5000×g条件下离心10min，弃去上清液。
2)将沉淀重悬于40mL Lysis Buffer中(所有缓冲液的pH在4℃下调节)，然后通过高压均质仪裂解3～5min。
3)使用冷冻低温离心机将裂解液在4℃下超速离心(15000×g)30min，取上清再次超速离心(15000×g)30min。
4)使用Ni-NTA柱进行蛋白纯化前，先用Lysis Buffer平衡Ni-NTA柱。
5)将已离心2～3次的裂解液上清分批次加入至Ni-NTA柱流穿，流穿结束后，为除去 非特异性结合蛋白，加入100mL左右的Lysis Buffer洗涤Ni-NTA柱，洗涤结束后使用25mL Wash Buffer及35mL Elution Buffer洗脱收集3CLPro。
6)将裂解液、流穿液、洗涤液、Wash Buffer及Elution Buffer各收集20μL。
7)每个样品加入5μL 5×SDS-PAGE Protein Loading Buffer吹打混匀，在95℃条件 下加热10min使蛋白样品变性，每管样品取10μL进行SDS-PAGE电泳，其中第一个胶孔 中加入2μL Prestained Protein Ladder，以供样品分离出的条带进行对照(电压220V，45min)。
8)根据SDS-PAGE电泳结果浓缩洗脱液至2mL，使用替换液A(20mM HEPES，400mMNaCl，pH 7.5)替换洗脱液3次，最终得到4mL 3CLPro浓缩液，使用Nano Drop测定蛋 白浓度。在浓缩液中加入13mg/mL Precission蛋白酶(PPE)100μL酶切过夜。
9)使用GFC Buffer(100mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.5)平衡凝胶过滤分子筛层析柱(HiLoad 16/600Superdex 200pg)。
10)将4mL酶切处理后的3CLPro浓缩液均分至3个1.5mL EP管中，4℃下超速离心12000×g，10min。
11)去除沉淀后，使用螺旋注射器将蛋白样品推入5mL上样环中，通过AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化。
12)浓缩从凝胶过滤分子筛层析柱洗脱下来的含有高纯度3CLPro部分，浓缩液依次使 用替换液B(20mM HEPES，200mM NaCl，pH 7.5)和替换液C(20mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.5)替换3次，使用Nano Drop测定蛋白浓度。将3CLPro蛋白按50μL/管进行分装， 液氮速冻后放入-80℃保存。
实施例5取实施例1合成的车前宁进行活性测试
1)通过荧光共振能量转移技术(FRET)测定新型冠状病毒3CLPro活性及化合物对新 型冠状病毒3CLPro的抑制活性。测定试验中使用带有新型冠状病毒3CLPro切割位点(箭头所示)的荧光底物(Dabcyl-KTSAVLQ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2)和Tris-HCl缓冲液(50 mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 7.3)。
2)化合物由100％DMSO溶解。取上述10μL化合物分别与40μL新型冠状病毒3CLPro(终浓度0.1μM)在Tris-HCl缓冲液中孵育1h，通过添加50μL荧光底物(Dabcyl-KTSAVLQ ↓SGFRKM-E(Edans)-NH2、终浓度为20μM)引发反应。使用放射共振能量转移荧光分光 光度计检测由于3CLPro催化的底物裂解而产生的Dabcyl荧光信号(340nm(激发)/490nm (发射))，通过3min内荧光信号的变化，从而判定化合物是否具有抑制活性。
3)新型冠状病毒3CLPro动力学常数通过将数据拟合到MichaelisMenten方程中得出。
4)使用Tris-HCl缓冲液将化合物稀释至梯度浓度(1.5625-100μM和0.15625-10μM)， 并使用上述相同终浓度的新型冠状病毒3CLPro和荧光底物体系进行测定。化合物的IC50值 由GraphPad Prism 8.0软件计算。每次实验三个平行，最终结果用平均值±标准差(SD) 表示。测定结果为车前宁对新型冠状病毒3CLPro的IC50值为14.31μM，显示出对新型冠状病毒3CLPro的良好抑制活性(图4)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种车前宁的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：
a:以灯盏花乙素为起始原料，在反应溶剂中和酸催化下将羧基甲酯化，得到灯盏花乙素甲酯；
b:将步骤a中生成的灯盏花乙素甲酯在反应溶剂和还原剂存在的条件下发生酯基还原反应，得到车前宁。
2.如权利要求1所述的制备方法，反应a步骤采用的反应溶剂为甲醇；反应a步骤中，灯盏花乙素在反应溶剂中的浓度为10～100mg mL-1，优选20～30mg mL-1；反应a步骤中酸性催化剂选自氯化亚砜、高氯酸、硫酸、硝酸、盐酸、三氟乙酸中的一种或多种的混合物；优选氯化亚砜或浓硫酸。
3.如权利要求1所述的制备方法，反应b步骤采用的还原剂选自硼氢化钠、氰基硼氢化钠、四氢铝锂中的一种或多种混合物；优选硼氢化钠；反应b步骤采用的反应溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种或多种的混合物；优选甲醇。
4.车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒药物中的应用。
5.车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒的酶抑制剂中的应用。
6.车前宁在制备预防和/或治疗新型冠状病毒的3C样蛋白酶抑制剂中的应用。
7.根据权利要求4-6任一所述的应用，车前宁作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用；或者车前宁与其他抗病毒药物的组合物作为活性成分在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染药物中的应用。
8.一种预防和/或治疗新型冠状病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含车前宁。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其剂型为口服制剂、肺部吸入制剂、黏膜给药制剂或注射剂；优选地，其剂型为口服制剂；更为优选地，口服制剂选自颗粒剂、粉末剂、丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。
CN202111583953.1A 2021-12-22 2021-12-22 一种车前宁的制备方法及其用途 Active CN114560899B (zh)

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