CN114539341B - 检测药物的稀土络合物掺杂dna晶体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体及其制备方法和应用，包括以下步骤：(1)用不同的DNA链自组装得到DNA大晶体，并进行DNA链间交联，获得了稳定的交联后的DNA大晶体；(2)交联后的DNA大晶体分步加载镧系离子络合物：用晶体捞针捞取交联后形貌良好的DNA大晶体，将大晶体移入缓冲液中洗涤后，移入1～100mM镧系离子溶液中，10～60分钟后捞出晶体洗涤，移入1～100mM配体溶液中，3～15分钟后，把晶体转移到缓冲液中保持形貌，得到稀土络合物杂化发光DNA晶体。利用制备的发光DNA晶体这种特殊的材料，在药物环境下有不同的荧光性能，使得药物的释放和药物的分布都可以被监控。
Description
技术领域
本发明涉及纳米功能材料领域，尤其涉及的是一种检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体及其制备方法和应用。
背景技术
DNA是一个非常有用的分子程序自组装三维纳米尺度结构，它具有典型的沃森克里克碱基配对的高编程能力，并可以通过固定的霍利迪连结体和粘性端黏聚促进了晶体在三维空间的组装。DNA自组装纳米结构具有模块化、结构可编程性、空间寻址性和高阶自组装能力等特点，是组织纳米粒子的合适支架，例如，其可编程性质(如连接位点、孔隙率、晶格几何形状)的优势可以设计成符合目标物的形状、体积和表面特征，用于催化、生物免疫分析、光活性等各个研究领域。
近年来，在设计精确的DNA组装上出现了许多引人注目的里程碑。通过碱基配对对寡核苷酸组装的二级结构进行精确编程的能力导致了非凡的器件和材料的产生。这项研究将开发一种新的可编程物质形式的活性晶体材料。
利用稀土杂化发光的DNA晶体检测药物的研究还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体及其制备方法和应用。
本发明的技术方案如下：
一种检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体的制备方法，包括以下步骤：（1）用不同的DNA链自组装得到DNA大晶体，并进行DNA链间交联，获得了稳定的交联后的DNA大晶体；（2）交联后的DNA大晶体分步加载镧系离子络合物：用晶体捞针捞取交联后形貌良好的DNA大晶体，将大晶体移入缓冲液中洗涤后，移入1~100 mM 镧系离子溶液中，10~60分钟后捞出晶体洗涤，移入1~100 mM配体溶液中，3~15分钟后，把晶体转移到缓冲液中保持形貌，得到稀土络合物杂化发光DNA晶体。
所述的制备方法，步骤（2）中，镧系离子溶液为：EuCl3 乙醇溶液或TbCl3乙醇溶液；配体溶液为：2-噻吩甲酰三氟丙酮（TTA）、邻菲罗啉（phen）、乙酰丙酮（acac）、苯甲酸（Bens）、2，6二苯甲酰基吡啶、二苯甲酰甲烷（DBM）中的两种配体用超纯水稀释的乙醇溶液。
所述的制备方法，步骤（1）所述的DNA链为特定序列且5端带有末端磷酸基团的，从5端到3端的序列为：SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:7。
所述的制备方法，步骤（1）中：DNA离心后用超纯水溶解，用生长盘作为晶体生长的容器，晶体通过蒸汽扩散生长；DNA的离心管转速调为4000 rpm离心，用超纯水溶解避免小分子杂质的存在；用购买自汉普顿研究公司Cryschem 24井生长盘作为晶体生长的容器。
所述的制备方法，步骤（1）具体方法为：加DNA溶液于井中，缓冲液为0.1~0.5 M的二甲胂酸钠、MgCl2、NaCl、HEPES，pH=6，加入缓冲液于井中，在井的周围注入1M NaCl溶液，获得了最佳的晶体生长； DNA溶液A~G：缓冲液=7：1~28：1；形成晶体是通过90℃缓慢降温到22℃来退火瓦片，在22℃的培养箱中孵育三天获得生长完全的晶体。
所述的制备方法，步骤（1）中，交联剂为：超纯水配制0.1~1 M，pH=6的吗啉乙磺酸（MES），并以此为溶剂，溶解EDC，配置10~50 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）溶液，缓冲液与新鲜EDC溶液按比例混合得到交联剂。
所述的制备方法，交联过程中每24小时更换新配制的交联剂。
所述的制备方法，交联剂还可以为：甲醛、乙醛、顺铂、戊二醛、氮芥。
根据任一所述的制备方法获得的检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体。
所述检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体的在药物浓度检测中的应用，用药物对稀土络合物溶液和DNA晶体中的稀土络合物进行淬灭，药物为大黄素、姜黄素、盐酸强力霉素、柔红霉素、阿霉素、土霉素、环磷酰胺。
本发明的有益效果是：DNA晶体可以作为有良好生物相容性的载体，通过加载稀土络合物，得到杂化发光晶体，杂化发光晶体可以有效检测药物，随着药物载入量的增加荧光减弱。目前的工作可能为开发一种用于癌症治疗的药物检测系统提供新的机会。
附图说明
图1 具有稀土络合物掺杂DNA晶体材料的制备方法与应用的流程图。
图2 (a) (b) (c)不同浓度DNA溶液形成晶体的光学显微镜图像。
图3 DNA晶体分别掺杂(a) Eu(TTA)3phen与(c) Tb(acac)3phen的显微微区光谱，DNA晶体分别掺杂(b) Eu(TTA)3phen与(d) Tb(acac)3phen的显微微区图像。
图4 (a) Eu(TTA)3phen稀土络合物掺杂大黄素的荧光图谱, (b) Tb(acac)3phen稀土络合物掺杂大黄素的荧光图谱。
图5 (a) Eu(TTA)3phen杂化发光晶体掺杂大黄素的显微微区图谱, (b) Tb(acac)3phen杂化发光晶体掺杂大黄素的显微微区图谱。
实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
DNA链为特定序列且5端带有末端磷酸基团的，从5端到3端的序列为：
A：ATAATGGCCGGACGGTTCCGTGCATGTGGCCGATCAGAACCG
B：TATCGGTTCTGATCGCCTTGGTGC
C：TAAGCACCAAGGGCTACAATCCTCGCGTCGGCTCCACGAGGC
D：TTAGCCTCGTGGAGCGCTCTGTTG
E：TTCCAACAGAGCCCGACCTCAGGGTTCTGCGGTCAGACGAAC
F：GAAGTTCGTCTGACCTCCGGCCAT
G：GCAGAACCCTGAGGTCGGCGACGCGAGGATTGTAGCGCCACATGCACGGAACCG
H：GAGCAGCCTGTACGGACATCA
I：TCTGATGTGGCTGC
J：ACACCGTACACCGTACACCGT
实施例
DNA离心后用超纯水溶解，用生长盘作为晶体生长的容器，晶体通过蒸汽扩散生长。
将三条小晶体DNA链H~J以3：3：1比例混合，取 DNA溶液于井中，加入缓冲液（二甲胂酸钠、MgCl2、NaCl、HEPES，pH=6），DNA溶液：缓冲液=1：1，在井的周围注入1 M NaCl溶液，获得了最佳的晶体生长。每口井用透明胶带密封，油浴加热后从60℃慢慢降低到22℃来退火瓦片，并在培养箱中孵育一天，得到小晶体。
将七条大晶体DNA链A~G以相同比例混合，取DNA溶液于井中，加入缓冲液，DNA溶液：缓冲液=7：1，DNA浓度较小时，晶体较大，数量较少，如图2a，所以可以通过控制DNA溶液浓度的大小调节晶体大小，而晶体内部孔隙不变，从而使DNA晶体具有更广泛的应用。在井的周围注入NaCl溶液，透明胶带密封，加热后从90℃慢慢降低到22℃来退火瓦片，并在培养箱中孵育三天，得到大晶体。
超纯水配制0.5 M，pH=6的吗啉乙磺酸（MES），并以此为溶剂，溶解EDC，配制40 mg/mL新鲜EDC溶液，缓冲液与新鲜EDC溶液按1：1比例混合得到交联剂，两种晶体洗涤后分别转移到注入交联剂的井中，每24小时更换新配制的交联剂，得到交联后的小晶体和大晶体。
实施例
DNA离心后用超纯水溶解，用生长盘作为晶体生长的容器，晶体通过蒸汽扩散生长。将三条小晶体DNA链H~J以3：3：1比例混合，取 DNA溶液于井中，加入缓冲液（二甲胂酸钠、MgCl2、NaCl、HEPES，pH=6），DNA溶液：缓冲液=1：1，在井的周围注入1 M NaCl溶液，获得了最佳的晶体生长。每口井用透明胶带密封，油浴加热后从60℃慢慢降低到22℃来退火瓦片，并在培养箱中孵育一天，得到小晶体。
将七条大晶体DNA链A~G以相同比例混合，取DNA溶液于井中，加入缓冲液，DNA溶液：缓冲液=28：1，DNA溶液浓度过大时，晶体成核过快，晶体来不及生长完全，得到的晶体较小，数量较多，如图2c。在井的周围注入NaCl溶液，透明胶带密封，加热后从90℃慢慢降低到22℃来退火瓦片，并在培养箱中孵育三天，得到大晶体。
超纯水配制0.5 M ，pH=6的吗啉乙磺酸（MES），并以此为溶剂，溶解EDC，配制40mg/mL新鲜EDC溶液，缓冲液与新鲜EDC溶液按1：1比例混合得到交联剂，两种晶体洗涤后分别转移到注入交联剂的井中，每24小时更换新配制的交联剂，得到交联后的小晶体和大晶体。
实施例
DNA离心后用超纯水溶解，用生长盘作为晶体生长的容器，晶体通过蒸汽扩散生长。
步骤（1），将三条小晶体DNA链H~J以3：3：1比例混合，取 DNA溶液于井中，加入缓冲液（二甲胂酸钠、MgCl2、NaCl、HEPES，pH=6），DNA溶液：缓冲液=1：1，在井的周围注入1 MNaCl溶液，获得了最佳的晶体生长。每口井用透明胶带密封，油浴加热后从60℃慢慢降低到22℃来退火瓦片，并在培养箱中孵育一天，得到小晶体。
步骤（2），将七条大晶体DNA链（A~G）以相同比例混合，取DNA溶液于井中，加入缓冲液，DNA溶液：缓冲液=14：1，在井的周围注入NaCl溶液，透明胶带密封，加热后从90℃慢慢降低到22℃来退火瓦片，并在培养箱中孵育三天，得到大晶体，如图2b。
步骤（3），超纯水配制0.5 M，pH=6的吗啉乙磺酸（MES），并以此为溶剂，溶解EDC，配制40 mg/mL新鲜EDC溶液，缓冲液与新鲜EDC溶液按1：1比例混合得到交联剂，两种晶体洗涤后分别转移到注入交联剂的井中，每24小时更换新配制的交联剂，得到交联后的小晶体和大晶体。
步骤（4），交联后的小晶体分别加入mNoenGreen、mCherry、mOrange、YFP等荧光标签溶液24小时后，晶体并不发光。而交联后的大晶体有较大的溶剂通道，在分别加入mNoenGreen、mCherry、mOrange、YFP等荧光标签溶液24小时后，获得了加载不同的荧光蛋白的发光DNA大晶体。
步骤（5），采用步骤（3）交联后的大晶体分步加载铕络合物：用晶体捞针取交联后形貌良好的DNA大晶体，将晶体移入缓冲液中洗涤后，移入10 mM Eu3+溶液（超纯水稀释的EuCl3乙醇溶液）中，60分钟后捞出晶体洗涤，移入10 mM 2-噻吩甲酰三氟丙酮（TTA）和邻菲罗啉（phen）配体溶液（超纯水稀释的配体乙醇溶液）中，5分钟后，把晶体转移到缓冲液中保持形貌。
采用步骤（3）交联后的大晶体分步加载铽络合物：捞针取形貌良好的DNA大晶体移入缓冲液中洗涤，移入10 mM Tb3+溶液（超纯水稀释的TbCl3乙醇溶液）中，60分钟后，洗涤并将晶体移入10 mM 乙酰丙酮（acac）和phen配体溶液（超纯水稀释的配体乙醇溶液）中，5分钟后，把晶体转移到缓冲液中保持形貌。
图3为DNA晶体分别掺杂Eu(TTA)3phen与Tb(acac)3phen的显微微区光谱及图像，掺杂Eu(TTA)3phen的晶体在紫外光的照射下发红光，掺杂Tb(acac)3phen的晶体在紫外光的照射下发绿光。配制10 mM 的Eu(TTA)3phen与Tb(acac)3phen 稀土络合物溶液，用药物对稀土络合物溶液和杂化发光晶体进行淬灭，以无水乙醇为溶剂，配制0~10 mM 的大黄素。将大黄素分别加入到两种稀土络合物溶液中，60 分钟后检测荧光强度与荧光寿命。
如图4为药物大黄素分别对Eu(TTA)3phen与Tb(acac)3phen稀土络合物液体进行淬灭的荧光图谱，可以看到随着药物浓度的增加，稀土络合物的荧光强度逐渐降低，说明药物大黄素对稀土络合物有良好的淬灭效果。将大黄素由低浓度到高浓度（0.01 mM~10 mM）加入到加载荧光标签的DNA大晶体中，每滴加一个浓度的药物，对同一位置进行显微镜观察及显微微区荧光强度进行检测，如图5为杂化发光晶体掺杂药物大黄素的显微微区图谱，可以看到药物大黄素同样对杂化发光DNA晶体有良好的淬灭效果。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 青岛大学
<120> 检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体及其制备方法和应用
<130> 111
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataatggccg gacggttccg tgcatgtggc cgatcagaac cg 42
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcggttct gatcgccttg gtgc 24
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taagcaccaa gggctacaat cctcgcgtcg gctccacgag gc 42
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttagcctcgt ggagcgctct gttg 24
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttccaacaga gcccgacctc agggttctgc ggtcagacga ac 42
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagttcgtc tgacctccgg ccat 24
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagaaccct gaggtcggcg acgcgaggat tgtagcgcca catgcacgga accg 54
Claims (4)
1.一种检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用不同的DNA链自组装得到DNA大晶体，并进行DNA链间交联，获得了稳定的交联后的DNA大晶体；所述的DNA链为特定序列且5端带有末端磷酸基团的DNA链，从5端到3端的序列为：SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:7；DNA离心后用超纯水溶解，用生长盘作为晶体生长的容器，晶体通过蒸汽扩散生长；DNA的离心管转速调为4000 rpm离心，用超纯水溶解避免小分子杂质的存在；用购买自汉普顿研究公司Cryschem 24井生长盘作为晶体生长的容器；具体方法为：加DNA溶液于井中，缓冲液为0.1~0.5 M的二甲胂酸钠、MgCl2、NaCl、HEPES，pH=6，加入缓冲液于井中，在井的周围注入1M NaCl溶液； SEQ ID NO:1- SEQ ID NO:7所示的DNA溶液A~G：缓冲液=7：1~28：1；形成晶体是通过90℃缓慢降温到22℃来退火瓦片，在22℃的培养箱中孵育三天获得生长完全的晶体；交联剂为：超纯水配制0.1~1 M ，pH=6的吗啉乙磺酸（MES），并以此为溶剂，溶解EDC，配置10~50 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）溶液，缓冲液与新鲜EDC溶液按比例混合得到交联剂；交联过程中每24小时更换新配制的交联剂；（2）交联后的DNA大晶体分步加载镧系离子络合物：用晶体捞针捞取交联后形貌良好的DNA大晶体，将大晶体移入缓冲液中洗涤后，移入1~100 mM 镧系离子溶液中，10~60分钟后捞出晶体洗涤，移入1~100 mM配体溶液中，3~15分钟后，把晶体转移到缓冲液中保持形貌，得到稀土络合物杂化发光DNA晶体；镧系离子溶液为：EuCl3 乙醇溶液或TbCl3乙醇溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，配体溶液为：2-噻吩甲酰三氟丙酮（TTA）、邻菲罗啉（phen）、乙酰丙酮（acac）、苯甲酸（Bens）、2，6二苯甲酰基吡啶、二苯甲酰甲烷（DBM）中的两种配体用超纯水稀释的乙醇溶液。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法获得的检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体。
4.根据权利要求3所述检测药物的稀土络合物掺杂DNA晶体的在药物浓度检测中的应用，用药物对稀土络合物溶液和DNA晶体中的稀土络合物进行淬灭，药物为大黄素。
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