CN114527076B - 生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，该方法包括以下步骤：针对温度诱导构象变化的生物大分子溶液，开展不同温度下生物大分子溶液的太赫兹光谱检测；对测得的太赫兹光谱数据，通过溶剂化模型分析，获得与生物分子构象变化紧密相关的溶剂化水的太赫兹吸收，根据溶剂化水的太赫兹吸收与温度的关系，确定构象转变点临界温度；然后通过范特霍夫方程和热力学关系式，推导生物大分子构象变化的焓变和熵变。本发明利用太赫兹光谱技术对生物大分子构象变化热力学参量进行测量，此方法具有快速、无标记、操作简单、适用范围广、重复性好、结果精确度高等优点。
Description
技术领域
本发明属于太赫兹生物检测技术、生物分子构象变化热力学测量技术领域，特别是涉及生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法。
背景技术
蛋白、DNA等生物分子由几十到上万个氨基酸或核苷酸组成，这些数目众多的氨基酸或碱基在空间的无规则排列导致生物分子构象数特别庞大。构象熵是一个用来描述生物分子无序状态的重要热力学参量，在数学上，可用S＝kBlnQ表示，其中kB是玻尔兹曼常数，Q是体系构象数。生物分子构象会随一些化学环境变量如温度、PH值、反离子浓度等影响而发生显著变化。例如，在温度或PH值的影响下，蛋白质会发生从线团到球状的coil-globule转变，DNA或RNA分子会发生双螺旋链到单螺旋链的转变，钙调蛋白在钙离子作用下会发生大尺度的结构域构象变化等。许多生物分子在实现其生物功能前都发生构象变化，构象变化对生物分子结构和功能有重要影响。比如，酶蛋白通过线团结构的摆动和二级结构单元的构象调整，实现对活性位点和底物分子的识别。血红蛋白发生从R构象到T构象变化，以此促进氧气分子的结合，增强血红蛋白的输氧能力。
从热力学角度来看,生物分子构象变化会改变在生物分子周围与生物分子发生亲水或疏水作用的溶剂分子的数目和结构，从而改变生物溶液体系的热容以及相应的熵和焓。不同生物分子构象变化引起的热力学参量的变化不同，同一生物分子的不同构象变化也会引起不同的热力学参量的变化。准确测定这些热力学参量的变化，不仅可以识别和鉴定生物分子种类，也可以预测生物分子的结构稳定性和活性。这对于药物设计、分子反应、酶催化等领域的研究具有重要的意义。量热仪是一种测量热力学参量变化的有效分析工具，在分子识别、化学反应、生物分子相互作用的探测方面具有显著优势和广泛应用前景。目前最常用的量热仪有差示扫描量热(DSC)和等温滴定量热(ITC)等方法。前者通过对试样和参比物各自独立加热，记录随时保持两者温度相同所需要的功率补偿，即相当于样品热量的变化。后者利用一种反应物滴定另一种反应物，随着加入滴定剂的数量的变化，测量反应体系温度的变化。DSC和ITC测定的都是热力学上的宏观统计信息，对生物体系构象转变的动力学和转变过程中的微细热力学变化的测定存在困难；同时，还存在响应速度慢(数秒到数十秒)、测量周期长(分钟到小时)、操作不简便(需要参照样品或参照池)等问题。因此，开发新的、快速的热力学测量工具及技术具有重要的理论和实践意义。
另一方面，从动力学角度来看,生物分子构象变化会带来组成生物分子的极性基团如肽键、磷酸基团位置发生变化，同时由于构象变化过程中有电荷转移发生，会产生诱导偶极，导致生个生物大分子的偶极矩发生显著改变；对处在生物分子周围并与生物分子紧密结合的水分子(溶剂化水，hydration/solvation water)来讲，其结构和动力学也都发生改变，而这些改变都会引起振动图谱的精细改变，从而可以通过光谱技术快速、准确捕捉到。
太赫兹波是一种介于红外与微波之间的电磁波，频率在0.1-10THz范围内。太赫兹光谱技术作为一种新兴的、极具潜力的生物医学诊疗技术具有独特的优点。太赫兹辐射的能级与生物分子低频运动如分子的振动、转动以及分子骨架扭动的能量有很大的交界，太赫兹技术可通过“指纹谱”识别实现生物分子表征；太赫兹光谱表征的是分子内、分子间的弱相互作用，主要包括氢键、范德华力以及非键作用(如亲疏水性等)，此特点可用于实现生物分子相互作用的动态探测；太赫兹波的光子能量相对较低，几乎不会对生物体系造成电离辐射的损伤，具有很好的生物安全性。传统的光谱技术如红外和拉曼光谱都可以通过特征原子集团的吸收峰强度或面积的变化来分析固体或溶液体系的热力学变化，太赫兹光谱作为一种新型的光谱技术应该也具备这种功能，特别是对存在构象变化的生物分子溶液体系。因为生物分子构象变化所需要的位垒能级以及生物溶液中亲水/疏水相互作用能级正好落在太赫兹能级范围，这是太赫兹光谱技术研究生物分子构象变化热力学所具有的独特优势。理论上，生物分子的太赫兹吸收强度可以通过偶极矩关联函数的傅立叶变换获得。因此，构象变化引起偶极矩的变化可以影响太赫兹光谱信号，这为通过太赫兹光谱技术研究生物分子构象熵变化提供理论依据。同时，太赫兹光谱作为一种基于短激光脉冲的光谱技术，探测的时间分辨率可以达到微秒甚至纳秒量级，这远比时间在秒级以上的传统量热法(数秒到数百秒)要灵敏得多。因此，开展基于太赫兹光谱技术的生物分子构象变化热力学研究具有显著的创新性和重大现实意义，将进一步拓展太赫兹光谱技术在生物分子识别、化学反应、分子相互作用以及相变等领域的潜在应用。
由于溶剂化水分子的太赫兹吸收比自由水和生物分子本身的太赫兹吸收都要大，当生物分子发生构象变化时，溶剂化水分子的太赫兹吸收变化最敏感。在生物分子溶液中，溶剂化水分子的太赫兹吸收是一个动力学问题，而构象熵是一个热力学问题，要发展太赫兹光谱技术成为一种有效的热力学参量探测技术，需要将以上动力学和热力学问题联系起来，建立二者之间的对应关系，为太赫兹量热技术提供理论依据。
另外，本发明拟要发展的太赫兹热力学测量方法是基于对生物溶液体系太赫兹光谱数据分析建立起来的，该方法的准确性和稳定性与太赫兹光谱测量数据的准确性紧密相关；然而，由于生物溶液体系存在大量的水，如何克服水分子对太赫兹波的强吸，从而实现生物大分子溶液太赫兹光谱的高灵敏检测，也是本发明需要解决的技术问题。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法。
本发明所采用的技术方案是：
生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，包括以下步骤：
步骤一：配置不同浓度的生物大分子溶液；
步骤二：将待测不同浓度生物大分子溶液样品置于温度控制样品池中，在一定温度范围内，选取不同温度点测量并获得不同浓度待测生物大分子溶液样品的太赫兹吸收光谱；
步骤三：根据溶液的三元太赫兹吸收模型，将整个生物分子溶液的太赫兹吸收表达成溶质、自由水和溶剂化水吸收；通过对三元太赫兹吸收模型方程的拟合，计算在不同温度、不同频率下溶剂化水的吸收αh(ω,T)；
步骤四：确定优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)；
步骤五：通过αh(ω*,T)对温度T作图，确定αh(ω*,T)的一级导数最大处所对应的温度即为构象转变温度Tc；
步骤六：对生物大分子构象变化平衡常数进行推导，根据范特霍夫方程，通过数据拟合，推导出生物分子构象变化过程中焓变和熵变热力学参量。
其中：步骤一中生物大分子溶液浓度范围为0.01mM变化到1mM，生物大分子溶液中添加缓冲溶液以维持生物溶液体系的酸碱度。
其中：步骤二中考虑到大多数蛋白分子的变性温度在70-80℃温度范围为20℃～80℃,温度控制精度为±0.2℃，温度升温速率控制在2℃/min，不同浓度下生物溶液样本太赫兹光谱变温测量数据每2℃～5℃记录一次。
其中：步骤二中获得不同浓度待测生物大分子溶液样品的太赫兹吸收光谱，包括以下步骤：将空的温度控制样品池和装有样品的温度控制样品池依次置于透射式太赫兹时域光谱装置中，分别获得空的温度控制样品池和装有样品的温度控制样品池的时域光谱信号；以前者信号作为参考信号，后者作为样品信号分别进行傅里叶变换得到相应的太赫兹频域波形、振幅等信息；生物大分子溶液样品的太赫兹吸收系数的计算是基于以上参考信号和样品信号的傅里叶变换得到的相应太赫兹频域波形、振幅等信息获得，生物大分子溶液样品折射率n(ω)计算公式如下：
其中，ω代表频率，
分别为样品信号Is和参考信号Iref进行傅里叶变换后获得的相位信息，c代表光速，d代表太赫兹穿透生物大分子溶液样品的厚度；
消光系数κ(ω)的计算公式如下：
其中在ρ(ω)是Is和Iref傅里叶变换的振幅比；
生物大分子溶液样品吸收系数α的计算公式如下：
其中：频率范围为0.1THz-2.0THz；样品吸收系数是通过输入时域光谱数据和样品的厚度根据计算公式计算得到。
其中：步骤三中根据溶液的三元太赫兹吸收模型，将整个生物分子溶液的太赫兹吸收表达成溶质、自由水和溶剂化水吸收，即
其中，αsolution(ω,T)，αs(ω,T)，αb(ω,T)，αh(ω,T)分别是在温度为T，频率为ω时溶液、溶质、自由水和溶剂化水的太赫兹吸收，V,Vs，Vh分别是体系总的体积和溶质、溶剂化水占有的体积；自由水吸收系数αb(ω,T)是一个已知量，溶质体积Vs正比于溶质浓度，以溶质浓度为自变量，溶液吸收系数为因变量，通过对上述方程的拟合，计算出在不同温度、不同频率下溶剂化水的吸收αh(ω,T)；由于生物大分子溶液太赫兹光谱普遍没有特征峰，这里的数据分析都是以太赫兹吸收强度来进行。
其中：步骤四中优化频率ω*是在0.5THz-1.5THz范围内的某个频点或者是在这一频率范围内某一小段频段的平均值；优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)是优化频率ω*下的吸收系数，或者是相对应的频率范围内的吸收系数αh(ω,T)的平均值。
其中：对温度诱导的生物大分子构象变化，在构象转变温度，体系达到平衡，即
其中G、C分别表示构象变化前后生物大分子的构象状态，n-q和n分别是构象变化前后溶剂化水分子的个数；根据吉布斯自由能公式，构象变化前后体系的自由能变化ΔG，焓变ΔH、熵变ΔS与体系平衡常数K关系描述为：
ΔG＝ΔH-TΔS＝-RT ln K (6)
R是气体热力学常数；
通常情况下，构象变化体系平衡常数K与体系观察量之间存在如下关系：
其中，Y表示体系变化过程中的任意观测量，Y1和Y2分别是当K为0和趋近于无穷大时的Y值；Y对应为优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)；根据方程(6)，将平衡常数K表达成熵变和焓变变量h和s的函数，即
观测量Y的一级导数为：
上述方程右边第二项是Van't Hoff方程，即
根据方程(7)，方程(9)右边第一项可表示为：
Y对T温度的一级导数可表示为：
Y对T温度的二级导数可推导为：
定义r(T)为Y二级导数与一级导数比值，得到：
将方程(8)代入方程(14)，r(T)包含两个变量h和s，以r(T)为因变量，T为自变量，进行数据拟合，推导出h和s，确定生物分子构象变化过程中焓变和熵变以及自由能变化。
本发明的优点如下：
本发明利用生物分子太赫兹光谱与构象变化熵之间关系，通过对生物分子构象变化过程中溶剂划水的太赫兹吸收吸收的精确测量，发展一种生物分子构象变化热力学探测新方法，该方法具有快速、无标记、操作简单、结果精确度高等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1中某个浓度下某种生物大分子溶液在不同温度下的太赫兹吸收光谱图；
图2是本发明实施例1中某个频率下某种生物大分子溶液太赫兹吸收系数随浓度变化关系；
图3是本发明实施例1中优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)(左侧)和其对温度的一级导数(右侧)随温度变化关系图；(图中虚线所标识的温度是αh(ω*,T)的一级导数绝对值最大处所对应的温度，即为生物大分子溶液构象转变温度)；
图4是本发明实施例1中优化频率ω*下溶剂化水吸收系数αh(ω*,T)对温度的二级导数与一级导数的比值随温度变化关系图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例1
本实施例提供生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其包括以下步骤：
步骤一：配置生物大分子水溶液：将生物大分子与去离子水按一定比例混合，充分搅拌后，确保生物大分子溶解充分，配置成已知浓度的生物大分子溶液；
步骤二：将配置好的不同浓度生物大分子溶液样品置于温度控制样品池中，在一定温度范围内，选取不同温度点测量并获得不同浓度待测生物大分子溶液样品的太赫兹吸收光谱，如图1所示；
步骤三：根据溶液的三元太赫兹吸收模型，将整个生物分子溶液的太赫兹吸收表达成溶质、自由水和溶剂化水吸收；根据三元太赫兹吸收模型方程公式
对如图2所示不同温度、不同频率下某种生物大分子溶液太赫兹吸收系数随浓度变化关系曲线进行数据拟合，计算在不同温度、不同频率下溶剂化水的吸收αh(ω,T)；
步骤四：在0.5THz-1.5THz范围内的选取某个频点或者在这一频率范围内选取某一小段频段的平均值作为优化频率ω*，计算相应的优化频率下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)；
步骤五：通过αh(ω*,T)对温度T作图，计算αh(ω*,T)对温度的一级导数，以αh(ω*,T)一级导数绝对值最大处所对应的温度为生物大分子溶液构象转变温度Tc，如图3所示；
步骤六：计算αh(ω*,T)对温度的二级导数，计算αh(ω*,T)对温度的二级导数与一级导数的比值r，用r对温度作图，如图4所示。根据范特霍夫方程，利用公式
对图4中曲线进行数据拟合，再根据公式
其中，h＝ΔH/R,s＝ΔS/R，推导出生物大分子溶液构象转变过程中焓变和熵变热力学参量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：配置不同浓度的生物大分子溶液；
步骤二：将待测不同浓度生物大分子溶液样品置于温度控制样品池中，在一定温度范围内，选取不同温度点测量并获得不同浓度待测生物大分子溶液样品的太赫兹吸收光谱；
步骤三：根据溶液的三元太赫兹吸收模型，将整个生物分子溶液的太赫兹吸收表达成溶质、自由水和溶剂化水吸收；通过对三元太赫兹吸收模型方程的拟合，计算在不同温度、不同频率下溶剂化水的吸收αh(ω,T)；
根据溶液的三元太赫兹吸收模型，将整个生物分子溶液的太赫兹吸收表达成溶质、自由水和溶剂化水吸收，即
其中，αsolution(ω,T)，αs(ω,T)，αb(ω,T)，αh(ω,T)分别是在温度为T，频率为ω时溶液、溶质、自由水和溶剂化水的太赫兹吸收，V,Vs，Vh分别是体系总的体积和溶质、溶剂化水占有的体积；自由水吸收系数αb(ω,T)是一个已知量，溶质体积Vs正比于溶质浓度，以溶质浓度为自变量，溶液吸收系数为因变量，通过对上述方程的拟合，计算出在不同温度、不同频率下溶剂化水的吸收αh(ω,T)；由于生物大分子溶液太赫兹光谱普遍没有特征峰，这里的数据分析都是以太赫兹吸收强度来进行；
步骤四：确定优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)；
步骤五：通过αh(ω*,T)对温度T作图，确定αh(ω*,T)的一级导数最大处所对应的温度即为构象转变温度Tc；
步骤六：对生物大分子构象变化平衡常数进行推导，根据范特霍夫方程，通过数据拟合，推导出生物分子构象变化过程中焓变和熵变热力学参量。
2.根据权利要求1所述的生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：所述的步骤一中生物大分子溶液浓度范围为0.01mM变化到1mM，生物大分子溶液中添加缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：所述的步骤二中温度范围为20℃～80℃,温度控制精度为±0.2℃，温度升温速率控制在2℃/min，不同浓度下生物溶液样本太赫兹光谱变温测量数据每2℃～5℃记录一次。
4.根据权利要求1所述的生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：所述的步骤二中获得不同浓度待测生物大分子溶液样品的太赫兹吸收光谱，包括以下步骤：将空的温度控制样品池和装有样品的温度控制样品池依次置于透射式太赫兹时域光谱装置中，分别获得空的温度控制样品池和装有样品的温度控制样品池的时域光谱信号；以前者信号作为参考信号，后者作为样品信号分别进行傅里叶变换得到相应的太赫兹频域波形、振幅信息；生物大分子溶液样品的太赫兹吸收系数的计算是基于以上参考信号和样品信号的傅里叶变换得到的相应太赫兹频域波形、振幅信息获得，生物大分子溶液样品折射率n(ω)计算公式如下：
其中，ω代表频率，
分别为样品信号Is和参考信号Iref进行傅里叶变换后获得的相位信息，c代表光速，d代表太赫兹穿透生物大分子溶液样品的厚度；
消光系数κ(ω)的计算公式如下：
其中在ρ(ω)是Is和Iref傅里叶变换的振幅比；
生物大分子溶液样品吸收系数α的计算公式如下：
5.根据权利要求4所述的生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：所述的频率范围为0.1THz-2.0THz；样品吸收系数是通过输入时域光谱数据和样品的厚度根据计算公式计算得到。
6.根据权利要求1所述的生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：所述的步骤四中优化频率ω*是在0.5THz-1.5THz范围内的某个频点或者是在这一频率范围内某一小段频段的平均值；优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)是优化频率ω*下的吸收系数，或者是相对应的频率范围内的吸收系数αh(ω,T)的平均值。
7.根据权利要求1所述的生物大分子构象变化热力学的太赫兹光谱测量方法，其特征在于：所述的对温度诱导的生物大分子构象变化，在构象转变温度，体系达到平衡，即
其中G、C分别表示构象变化前后生物大分子的构象状态，n-q和n分别是构象变化前后溶剂化水分子的个数，q表示构象变化引起的水分子的变化数目；根据吉布斯自由能公式，构象变化前后体系的自由能变化ΔG0，焓变ΔH0、熵变ΔS0与体系平衡常数K关系描述为：
ΔG0＝ΔH0-TΔS0＝-RTlnK (6)
R是气体热力学常数；
构象变化体系平衡常数K与体系观察量之间存在如下关系：
其中，Y表示体系变化过程中的任意观测量，Y1和Y2分别是当K为0和趋近于无穷大时的Y值；Y对应为优化频率ω*下溶剂化水的吸收系数αh(ω*,T)；根据方程(6)，将平衡常数K表达成熵变和焓变变量h和s的函数，即
观测量Y的一级导数为：
上述方程右边第二项是Van't Hoff方程，即
根据方程(7)，方程(9)右边第一项可表示为：
Y对T温度的一级导数可表示为：
Y对T温度的二级导数可推导为：
定义r(T)为Y二级导数与一级导数比值，得到：
将方程(8)代入方程(14)，r(T)包含两个变量h和s，以r(T)为因变量，T为自变量，进行数据拟合，推导出h和s，确定生物分子构象变化过程中焓变和熵变以及自由能变化。
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