CN114515312A - 一种具有抗疲劳效果的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有抗疲劳效果的组合物及其制备方法和应用，其组合物，包括下列重量份的原料：松花粉3‑6份、人参提取物3‑6份、山楂1‑2份、枸杞2‑4份、大枣1‑2份和龙眼肉1‑2份。本发明从疲劳发生的现代发病机理出发，并针对中医对疲劳的辨证原则，运用网络药理学，借助系统生物学研究手段，对本发明提供组合物的抗疲劳作用机制进行多成分、多靶点的系统性研究，基于小鼠抗疲劳实验和网络药理学完成本发明提供组合物的功效评价和作用机制，增强了抗疲劳作用，且改善了口感，具有更好的商业价值。

Description

一种具有抗疲劳效果的组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于中医药技术领域，尤其涉及一种具有抗疲劳效果的组合物及其制备方法和应用。
背景技术
疲劳是指脑力或体力到达一定阶段时必然出现的一种生理现象。现代生理学研究表明，疲劳会导致身体发生一系列的生理变化，如睡眠障碍、内分泌紊乱、免疫功能障碍和代谢紊乱等。严重者会出现衰老、抑郁、癌症、多发性硬化症和帕金森等多种疾病。
现代医学理论认为，疲劳的生物学机制可能有以下几个方面：①活动所需能源物质耗竭：机体活动到疲劳时，能源物质(如糖原、三磷酸腺苷、磷酸肌酸等)含量下降而又得不到及时的补充，从而引发疲劳产生；②疲劳物质蓄积：肌肉或血液中乳酸及丙酮酸等酸性物质随疲劳程度的加深而增加；③内分泌调节紊乱：疲劳发生时，皮质醇分泌剧增，大量皮质醇可通过下丘脑-垂体-性腺轴来降低雄性激素的分泌，造成人体机能恢复能力锐减，进而加重疲劳症状；④机体内环境失调：机体进行各种活动产生的酸性代谢产物使机体体液酸度下降，降低到某一数值时，细胞内外的水分以及离子的浓度就会发生变化，人体机能就相应下降，工作效率降低；⑤免疫功能紊乱：由机体免疫系统的机能下降或紊乱造成的。
国珍牌松花参宝片是一款被证明具有抗疲劳作用的保健食品，其由松花粉和人参两味药物制成，其抗疲劳作用仍有待改进。
发明内容
本发明针对上述的现有技术存在的不足，提供一种具有抗疲劳效果的组合物。
本发明的再一的目的是，提供所述组合物的制备方法。
本发明的另一的目的是，提供所述组合物的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种具有抗疲劳作用的组合物，包括下列重量份的原料：松花粉3-6份、人参提取物3-6份、山楂1-2份、枸杞2-4份、大枣1-2份和龙眼肉1-2份。
优选地，一种具有抗疲劳作用的组合物，包括下列重量份的原料：松花粉4份、人参提取物4份、山楂1份、枸杞3份、大枣1份和龙眼肉1份。
进一步地，所述组合物还包括20-40wt％的可食用辅料。。
进一步地，所述辅料为异麦芽酮糖醇(粉末)和/或乳糖。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
按重量份将所述组合物中的原料磨制成粉状、混合均匀、制粒，进一步制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或合剂。
优选地，所述组合物被制成片剂。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的组合物在制备具有抗疲劳作用的药物、保健品或食品中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明从疲劳发生的现代发病机理出发，并针对中医对疲劳的辨证原则，结合松花粉的独特药理活性定位，辅以枸杞、大枣、人参和龙眼肉等补中益气之要药，符合中医抗疲劳气血双补的理念和君臣佐使的配方思路。其中人参，性温，味甘、微苦、微温，归脾，肺经，可补脾益肺、生津、安神；补脾还可清化痰湿，是为君药。松花粉，味甘、温，归肝、脾经，可润心肺之气，还可疏肝解郁，健脾祛湿，是为臣药。二药合用，共奏补气安神，疏肝健脾祛湿之功效。龙眼肉，味甘，温，归心、脾经，可补益心脾，养血安神；枸杞，味甘，平，归肝、肾经，可养肝滋肾，润肺，去虚劳；二药合用，可补益肝肾，养血安神，是为佐药。山楂，酸、甘，微温，归脾、胃、肝经，可消食健胃，行气散瘀，化浊降脂，是为使药。
本发明运用网络药理学，借助系统生物学研究手段，对本发明提供组合物的抗疲劳作用机制进行多成分、多靶点的系统性研究，基于小鼠抗疲劳实验和网络药理学完成本发明提供组合物的功效评价和作用机制，增强了抗疲劳作用，且改善了口感，具有更好的商业价值。
附图说明
图1为本发明松花参宝片产品组给药期间小鼠体重变化折线图；
图2为本发明松花参宝片升级产品组给药期间小鼠体重变化折线图；
图3为本发明给予受试物28d对小鼠爬杆时间的影响条形图；
图4为本发明给予受试物28d对小鼠力竭游泳时间的影响条形图；
图5为本发明给予受试物28d对小鼠血清乳酸含量的影响条形图；
图6为本发明给予受试物28d对小鼠血清尿素氮含量的影响条形图；
图7为本发明给予受试物28d对小鼠肝糖原含量的影响条形图；
图8为本发明给予受试物28d对小鼠肌糖原含量的影响条形图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施例：
一种具有抗疲劳作用的组合物，包括下列重量份的原料：松花粉4份、人参提取物4份、山楂1份、枸杞3份、大枣1份和龙眼肉1份，异麦芽酮糖醇粉末3份和乳糖2份。
上述具有抗疲劳作用的组合物的制备方法如下：
将上述组合物的原料磨制成粉状、混合均匀、制粒，进一步压片和包衣后制成片剂产品，以下统称为“松花参宝片升级产品”。
对比例：
国珍牌松花参宝片(烟台新时代健康产业有限公司，批号2106001S)。
1.实验内容：
仪器与材料
仪器：XPE105DR型电子分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)；高速冷冻离心机(ThermoFisher)；HH-6数显恒温水浴锅(常州德科仪器有限公司)。
材料：人参北芪胶囊(江西银涛药业有限公司，批号：2011005)；国珍牌松花参宝片(批号：2106001S)、本发明松花参宝片升级产品(批号：2107001S)；小鼠乳酸酶联免疫(ELISA)试剂盒(批号：20210803)、小鼠尿素氮酶(ELISA)试剂盒(批号：20210723)、小鼠肝/肌糖原酶联免疫(ELISA)试剂盒(批号：20210729)，均购自南京建成生物工程研究所；水合氯醛；0.9％生理盐水。
动物与分组：以昆明(KM)小鼠为实验对象，KM小鼠购自于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SCXK(鲁)20190003，雄性，SPF(Specific Pathogen Free)级，体重18-20g，适应性饲养7天后，随机分为8组，分别为空白组、阳药组、松花参宝片产品低剂量组、松花参宝片产品中剂量组、松花参宝片产品高剂量组、松花参宝片升级产品低剂量组、松花参宝片升级产品中剂量组和松花参宝片升级产品高剂量组。
给药剂量确定：按照体表面积系统折算方法，计算得出阳药组(人参北芪胶囊)的给药剂量为0.80g/kg；松花参宝片产品(2106001S)高剂量组为0.80g/kg，松花参宝片升级产品(2107001S)高剂量组为0.80g/kg，松花参宝片产品(2106001S)中剂量组为0.40g/kg，松花参宝片升级产品(2107001S)中剂量组为0.40g/kg，松花参宝片产品(2106001S)低剂量组为0.20g/kg，松花参宝片升级产品(2107001S)低剂量组为0.20g/kg。
2.实验方法
2.1基于KM小鼠力竭游泳实验的抗疲劳作用评价：
将分组好的小鼠饲养至SPF级动物房内，除空白组给予去离子水外，其他各组小鼠于每天上午10：00经口服灌胃给予规定量的药物，每日1次，灌胃液体积为0.1-0.2mL/10g，连续给药28天。在末次给药30min后，在小鼠尾根部捆绑10％小鼠体重的重物，放入规定体积的游泳箱中(水温：25.0±1.0℃，水深：40cm)，每次5只，用秒表记录自游泳开始至力竭(小鼠头部没入水中后10s仍不能返回水面)的时间作为小鼠力竭游泳时间。
2.2基于KM小鼠爬杆实验的抗疲劳作用评价：
将分组好的小鼠饲养至SPF级动物房内，除空白组给予纯水外，其他各组小鼠于每天上午10：00经口服灌胃给予上述样品，每日1次，灌胃液体积为0.1～0.2mL/10g，连续给药28天。在末次给药30min后，将小鼠置于垂直固定的光滑有机玻璃棒(长30cm、直径10mm)上端1/5处，使其肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠从固定至跌落的时间。反复3次，记录每次时间，累计作为小鼠爬杆实验结果。
2.3爬杆实验KM小鼠的血清样品获取：
经爬杆试验后的小鼠，静息24h后进行自由游泳试验30min(水温：25.0±1.0℃、水深40cm)，结束后休息10min。然后，采用10％水合氯醛经腹腔注射给予小鼠进行麻醉。最后于小鼠腹主动脉取血1.0mL，离心10min(4℃，3000r/min)。取上层血清，置于-80℃下保存。
3.疲劳相关指标测定
3.1乳酸检测(LD)
试剂一：酶稀释液60mL×1瓶。
试剂二：酶贮备液0.6mL×1支。
酶工作液配制：临用前将试剂二(酶贮备液)和试剂一(酶稀释液)按照1：100的体积比进行混合，现用现配。
试剂三：黄色透明液体6mL×2瓶。
试剂四：粉剂×2支。
显色剂的配制：使用前取试剂四粉剂1支倒入1瓶试剂三液体中，待粉剂全部溶解后，用微量移液器取少量液体打入小离心管内，反复颠倒离心管，再用微量移液器将离心管中的液体转移到瓶中，如此反复2～3次，使二者充分混合，配成显色剂，4℃避光保存两周内有效。
试剂五：终止液，60mL×2瓶。
试剂六：3mmol/L标准品。
实验操作：依据试剂盒操作说明，并按照表1中的溶剂比例进行实验，所有样品溶液均先在37℃水浴精准反应10分钟，后加终止液2mL混匀，以蒸馏水为基准，在530nm测量各样品溶液的OD值。同时按照“公式一”计算各组小鼠血清内乳酸的含量。
公式一：
Figure BDA0003555932850000061
注：C标准：标准品浓度，3mmol/L；
N：样本测试前稀释倍数。
表1血清乳酸试剂盒溶液配比
Figure BDA0003555932850000062
3.2血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)检测
试剂一：1g/L的肟溶液100mL×1瓶。
试剂二：酸溶液40mL×1瓶，用时加双蒸水80mL配成应用液。
试剂三：10mmol/L尿素氮标准品×1瓶。
实验操作：依据试剂盒操作说明，并按照表2中的溶剂比例进行实验，混匀，置沸水中准确水浴15分钟，立即用自来水冷却，以蒸馏水为基准，在530nm测量各样品溶液的OD值。同时按照“公式二”计算各组小鼠血清内尿素氮的含量。
公式二：
Figure BDA0003555932850000071
注：C标准：标准品浓度，10mmol/L；
N：样本测试前稀释倍数。
表2血清尿素氮试剂盒溶液配比
Figure BDA0003555932850000072
4.肝/肌肉糖原的变化测定
4.1生物样本获取
将采血后的KM小鼠脱颈处死，立即分离脾脏、肝脏和后腿部肌肉，用生理盐水将其漂洗干净，吸水纸洗净多余的液体，分别获得脾脏、肝脏和肌肉组织。
4.2脾脏指数测定
将各组小鼠的脾脏采用万分之一天平进行称重，记录脾脏重量，并依据“公式三”计算各组小鼠的脾脏指数。
公式三：
Figure BDA0003555932850000081
4.3糖原(Glycogen)检测
采用标准试剂盒对各组小鼠肝和肌肉中的糖原进行精细检测，所需试剂如下：
试剂一：碱溶液，40mL×1瓶。
试剂二：1mg/mL葡萄糖标准贮备液，1mL×1支。
0.01mg/mL葡萄糖标准应用液的制备：1mg/mL葡萄糖标准贮备液：双蒸水＝1：99，现用现配。
试剂三：显色剂，粉剂×6支，室温或2～8℃保存6个月。用时每支加浓硫酸(分析纯)25mL，混匀。
肝糖原检测：
取肝脏样本100mg，精密称定，用生理盐水漂洗，滤纸吸干。按肝脏样本重量(mg)：碱液体积(μL)＝1：3，加入试管，沸水浴加热水解20min，流水冷却。肝糖原检测液为1％，加入双蒸水量为：肝脏重量×100-肝脏重量×4＝肝脏重量×96。
实验操作：依据试剂盒操作说明，并按照表3中的溶剂比例进行实验，充分混匀后置沸水浴中加热5min，冷却后，以蒸馏水为基准，于620nm测量各样品溶液的OD值。同时按照“公式四”计算各组小鼠肝糖原的含量。
公式四：
Figure BDA0003555932850000082
注：n：标准管糖原含量，0.01mg；
N：样本测试前稀释倍数；
10：测试过程中稀释倍数；
1.11：此法测得的葡萄糖含量换算成糖原含量系数。
表3肝糖原试剂盒溶液配比
Figure BDA0003555932850000091
肌糖原检测：
取肌肉样本60mg，用生理盐水漂洗，滤纸吸干。按肌肉样本重量(mg)：碱液体积(μL)＝1：3，加入试管，沸水浴加热水解20min，流水冷却。肌糖原检测液为5％，加入双蒸水量为：肌肉重量×20-肌肉重量×4＝肌肉重量×16。
实验操作：依据试剂盒操作说明，并按照表4中的溶剂比例进行实验，充分混匀后置沸水浴中加热5min，冷却后，以蒸馏水为基准，于620nm测量各样品溶液的OD值。同时按照“公式五”计算各组小鼠肌糖原的含量。
公式五：
Figure BDA0003555932850000092
注：n：标准管糖原含量，0.01mg；
N：样本测试前稀释倍数；
10：测试过程中稀释倍数；
1.11：此法测得的葡萄糖含量换算成糖原含量系数。
表4肌糖原试剂盒溶液配比
Figure BDA0003555932850000093
5.统计学处理
试验结果“均值±标准差”(x±s)的形式表示，并采用SPSS17.0和Graphpad软件进行计算和统计。多组间数据比较依据各组正态及方差齐与否选择单因素方差分析或Kruskal-Wallis轶和检验，组间两两比较根据方差齐与否选择采用Dunnett-t检验或Dunnett’sT3检验。当P<0.05时，认为差异具有统计学显著性。
6.实验结果
6.1小鼠体重动态时序变化结果
在给药期间，平均每7天测定不同组小鼠体重，实验结果见表5、图1和图2。实验结果表明，在给药剂量0.2～0.8g/kg的范围内，各给药组小鼠体重呈现上升趋势，但并未出现明确差异性。同时，各组小鼠毛色正常，无倦怠和异常死亡情况出现，说明松花参宝片产品和松花参宝片升级产品在0.2～0.8g/kg的范围内对小鼠无毒副作用。由此，确定本研究的给药剂量为0.2～0.8g/kg。
表5给予受试物28d对小鼠体重的影响
Figure BDA0003555932850000101
6.2小鼠爬杆实验结果
在给予受试物第28天，对小鼠进行爬杆实验，结果显示，松花参宝片产品组、松花参宝片升级产品组及阳药组的小鼠爬杆时间均高于空白组，且与空白组对比，阳药组及松花参宝片升级前后产品的高、中剂量组均有显著差异(p<0.05)，表明松花参宝片升级前后的产品可增加小鼠爬杆时间，且其在实验所设剂量范围内，随剂量增加作用增强。同时根据实验结果表明，在同等给药剂量的情况下，升级后产品的爬杆时间明显优于升级前产品。实验结果见表6和图3。
表6给予受试物28d对小鼠爬杆时间的影响
Figure BDA0003555932850000111
注：与空白组比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
6.3小鼠力竭游泳实验结果
在给予松花参宝片第28天后，对各组小鼠进行力竭游泳实验。结果显示：升级前后的松花参宝片组及阳药组的小鼠力竭游泳时间均优于空白组；且与空白组相较，阳药组及升级前后的松花参宝片的高剂量组均有显著差异(P<0.05)，而升级前后的松花参宝片中剂量组及低剂量组均无显著差异。其中，松花参宝片升级后的产品效果要明显优于松花参宝片升级前的产品及阳药的效果，表明本发明的松花参宝片能有效提高小鼠游泳时间，且升级后的产品效果最好。实验结果见表7和图4。
表7给予受试物28d对小鼠力竭游泳时间的影响
Figure BDA0003555932850000112
Figure BDA0003555932850000121
注：与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
6.4小鼠血清乳酸检测结果
在给予松花参宝片第28天后取小鼠血清，测定其血清中的乳酸含量。结果显示：与空白组相比，其余各组小鼠的血清乳酸含量均成下降趋势，且升级前后的松花参宝片组及阳药组均有显著差异(p<0.05)，以上结果说明松花参宝片升级前后的产品均可有效降低小鼠血清乳酸含量，且同样给药剂量下升级后的产品效果比升级前好。实验结果见表8和图5。
表8给予受试物28d对小鼠血清乳酸含量的影响
Figure BDA0003555932850000122
注：与空白组比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
6.5小鼠血清尿素氮检测结果
在给予松花参宝片样品第28天后，取小鼠血清，测定其中的血清尿素氮含量。结果显示，升级前后的松花参宝片组及阳药组的小鼠血清尿素氮含量均低于空白组；且升级前后的松花参宝片组及阳药组均有显著差异(p<0.05)，说明松花参宝片及升级后产品均可有效降低小鼠血清尿素氮含量。实验结果见表9和图6。
表9给予受试物28d对小鼠血清尿素氮含量的影响
Figure BDA0003555932850000131
注：与空白组比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
6.6小鼠肝糖原检测结果
在给予松花参宝片第28天后，取各组小鼠肝脏并测定其中的肝糖原含量。结果显示，升级前后的松花参宝片组及阳药组的小鼠肝糖原含量均高于空白组。与空白组相比，阳药组及松花参宝片升级后产品(2107001S)高、中剂量组均可明显升高小鼠肝糖原含量，且呈现显著差异(p<0.05)，而升级前产品(2106001S)的高、中、低组与空白组之间并无显著差异。上述结果说明，松花参宝片升级前后的产品均可促进小鼠肝糖原积累，且升级后产品(2107001S)的效果更优，且在实验所设剂量范围内，随剂量增加效果逐步增强。实验结果见表10和图7。
表10给予受试物28d对小鼠肝糖原含量的影响
Figure BDA0003555932850000132
注：与空白组比较：*p＜0.05，**p＜0.01。
6.7小鼠肌糖原检测结果
在给药第28天后，取小鼠肌肉组织测定其肌糖原含量。结果显示：与空白组相比，松花参宝片升级前产品组、松花参宝片升级后产品组及阳药组的小鼠肌糖原含量呈现升高趋势。松花参宝片升级后产品(2107001S)高、中、低剂量组，松花参宝片升级前产品(2106001S)的高、中剂量组均具有显著性差异(p<0.05)。实验结果表明：松花参宝片升级前后产品产品可促进小鼠肌糖原积累，且升级后产品(2107001S)的效果更优。实验结果见表11和图8。
表11给予受试物28d对小鼠肌糖原含量的影响
Figure BDA0003555932850000141
注：与空白组比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001
综合以上研究结果可见，爬杆实验和力竭游泳结果表明松花参宝片升级后产品(2107001S)小鼠较松花参宝片升级前产品小鼠(2106001S)爬杆时间及力竭游泳时间明显延长；说明升级后的产品抗疲劳效果更明显。其次，小鼠血清乳酸及尿素氮含量测定结果表明松花参宝片升级后产品(2107001S)可明显降低小鼠血清乳酸及尿素氮含量；小鼠肝/肌糖原含量测定结果揭示松花参宝片升级后产品(2107001S)更有利于小鼠肝/肌糖原积累，较升级前产品具有更好的抗疲劳效果。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (7)

1.一种具有抗疲劳效果的组合物，其特征在于，包括下列重量份的原料：松花粉3-6份、人参提取物3-6份、山楂1-2份、枸杞2-4份、大枣1-2份和龙眼肉1-2份。
2.根据权利要求1所述的具有抗疲劳效果的组合物，其特征在于，包括下列重量份的原料：松花粉4份、人参提取物4份、山楂1份、枸杞3份、大枣1份和龙眼肉1份。
3.根据权利要求1或2所述的具有抗疲劳效果的组合物，其特征在于，还包括20-40wt％的可食用辅料。
4.根据权利要求3所述的具有抗疲劳效果的组合物，其特征在于，所述辅料为异麦芽酮糖醇(粉末)和乳糖。
5.权利要求1-4任一项所述的具有抗疲劳效果的组合物的制备方法，其特征在于，按重量份将所述组合物中的原料磨制成粉状、混合均匀、制粒，进一步制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或合剂。
6.根据权利要求5所述的具有抗疲劳效果的组合物的制备方法，其特征在于，所述组合物被制成片剂。
7.权利要求1-4任一所述的组合物在制备具有抗疲劳效果的药物、保健品或食品中的应用。
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