CN114515280B - 一种药物组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种药物组合物及其应用。所述药物组合物包括：组分A：大麻二酚和/或大麻二酚可药用盐；组分B：长效β2受体激动剂。所述药物组合物中的组分A和组分B可起到协同增效的作用，具有良好的抗炎和抗平滑肌收缩作用，可减少用药量，同时，用大麻二酚替代现有技术中的糖皮质激素，能够有效避免因应用糖皮质激素产生的诸多不良反应。

Description

一种药物组合物及其应用

技术领域

本申请涉及一种药物组合物及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

支气管哮喘，在工业化国家中影响多达10％的个体，其特征在于支气管收缩，慢性支气管炎，气道反应过度，和粘膜水肿。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种常见的以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，气流受限进行性发展，与气道和肺脏对有毒颗粒或气体的慢性炎性反应增强有关。该疾病具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿症状，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上人群发病率高达9％～10％。

关于二者的发病机理较为复杂，患者存在气道炎症是诱发哮喘的主要原因，目前随着研究的深入，COPD也被认为是一种炎性疾病。其炎症反应以T淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞增生最常见。激活的炎症细胞过度释放多种细胞介质，包括白三烯B4(Leukotriene B4，LTB4)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、白细胞介素8(interleukin8，IL-8)、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)等。细胞因子异常表达、持续炎症细胞浸润、渗出、激活及其相互作用是发生、发展的重要因素。肺结缔组织存在着蛋白酶与抗蛋白酶系统，炎症反应可进一步导致蛋白酶与抗蛋白酶失衡，破坏肺弹力纤维，进一步造成肺实质破坏。

药物治疗仍是治疗哮喘的主要手段。缓解COPD导致的呼吸困难从而改善患者症状、提高患者生活质量是临床治疗的首要目标，COPD治疗指南中指出具有支气管舒张剂作用的长效β2受体激动剂可作为缓解患者症状的临床一线用药。但尚未解决COPD的抗炎治疗。为此，过去二十多年来开发出了多种长效β2受体激动剂和糖皮质激素组成的复方吸入剂，并且临床实践证明这些药物对于哮喘控制却有益处。但是，作为慢性疾病，哮喘和COPD患者需要长期服用药物。然而长期应用糖皮质激素会引起很多不良反应，比如声音嘶哑或发音困难、口咽真菌感染、反射性咳嗽、口周皮炎、口干和舌体肥厚，严重的甚至可以导致青光眼、视敏度改变、骨质疏松或骨折等病理状态和危害。常常因为这些不良反应导致患者治疗的依从性变差。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包括大麻二酚和/或大麻二酚可药盐；和长效β2受体激动剂，将这两种药物联合应用，可起到协同增效的作用，具有良好的抗炎和抗平滑肌收缩作用，可减少用药量，同时，用大麻二酚替代现有技术中的糖皮质激素，能够有效避免因应用糖皮质激素产生的诸多不良反应。

一种药物组合物，所述药物组合物包括：

组分A：大麻二酚和/或大麻二酚可药用盐；

组分B：长效β2受体激动剂。

大麻二酚(CBD)是大麻的主要非精神科成分，具有多种药理作用，包括抗焦虑、抗精神病、止吐、抗炎和抗氧化的特性。炎症发病机制是复杂的，炎症是通过各种胞间介质引起和维持的。其中肿瘤坏死因子(TNF)也参与了炎症形成的过程,并起着特别重要的作用。抗氧化介质(ROI)的抗菌和抗肿瘤活性对于保护机体起着关键的作用。一氧化氮(NO)则是具有多种生物功能的内源调节器,同样表现出具有抗菌和抗肿瘤活性,并且影响着发炎叠层的各个方面。当机体内TNF、ROI和NO水平较高将会引起炎症，并且损害机体的细胞和组织，并引起败血症。因此,使用药物作用于免疫系统来抑制TNF、ROI和NO是治疗炎症的主要目标。体外实验显示，CBD可以显著降低腹膜巨噬细胞产生的TNF和NO。

β2受体主要分布于支气管平滑肌、血管平滑肌等，其效应是抑制性的，激动后可介导支气管平滑肌、血管的舒张。慢阻肺患者最常用的β2受体支气管舒张剂分为短效和长效两类。长效β2受体激动剂不仅可以舒张支气管，而且可以抑制气道平滑肌细胞增殖和炎症因子的释放，刺激纤毛的运输，保护气道黏膜细胞，减轻中性粒细胞的聚集及活化。β2受体激动剂还可减轻有机粉尘导致的肺部炎症反应。

大麻二酚和长效β2受体激动剂均具有一定的抗炎和扩张支气管的作用，本申请意外发现，两个联合应用在抗炎、扩张支气管平滑肌等方面具有协同增效的作用，可用于治疗哮喘、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病。β-受体激动剂大剂量使用后掩盖哮喘患者的气道炎症症状，长期应用会诱发严重哮喘，增加患者的死亡率，本申请所得到的药物组合物大大减少了β-受体激动剂的使用剂量，有效避免了上述不良反应的发生。同时避免了目前β2肾上腺素受体激动剂类药物与糖皮质激素组合长期使用后由激素引起的副作用的风险，具有更好的治疗依从性，对于哮喘、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的治疗具有重要的临床意义。

可选地，所述长效β2受体激动剂选自茚达特罗、茚达特罗可药用盐、福莫特罗、福莫特罗可药用盐、维兰特罗、维兰特罗可药用盐、沙美特罗、沙美特罗可药用盐、奥达特罗、奥达特罗可药用盐中的至少一种。

可选地，所述茚达特罗可药用盐选自马来酸茚达特罗；

所述福莫特罗可药用盐选自富马酸福莫特罗；

所述维兰特罗可药用盐选自三苯乙酸维兰特罗；

所述沙美特罗可药用盐选自昔萘酸沙美特罗；

所述奥达特罗可药用盐选自盐酸奥达特罗。

可选地，所述组分A和组分B的质量比为0.5～2500：1。

可选地，所述组分A和组分B的质量比上限选自0.65：1、0.76：1、0.80：1、0.81：1、0.91：1、1.67：1、25.11：1、25.72：1、38.83：1、64.65：1、75.67：1、80.12：1、81.37：1、91.31：1、110.13：1、1828.15：1、2222.22：1、2500：1；下限选自0.5：1、0.65：1、0.76：1、0.80：1、0.81：1、0.91：1、1.67：1、25.11：1、25.72：1、38.83：1、64.65：1、75.67：1、80.12：1、81.37：1、91.31：1、110.13：1、1828.15：1、2222.22：1。

可选地，所述组分A和组分B的质量比为25～2000：1。

可选地，所述组分A和组分B的质量比为0.6～110：1。

根据本申请的另一个方面，提供一种药物制剂，所述药物制剂包括上述任一项所述的药物组合物和药学上可接受的赋形剂。

可选地，所述药物制剂的剂型选自经胃肠道给药的剂型或经呼吸道给药的剂型中的任一种。

可选地，所述经胃肠道给药的剂型选自片剂、胶囊剂、滴丸中的任一种；所述经呼吸道给药的剂型选自吸入剂、气雾剂中的任一种。

可选地，所述片剂选自缓释片、分散片、口含片中任一种；

所述胶囊剂选自缓释胶囊剂、软胶囊剂中的任一种；

所述吸入剂选自干粉吸入剂、吸入气雾剂、吸入喷雾剂中的任一种。

可选地，所述药物制剂的剂型为干粉吸入剂，所述药学上可接受的赋形剂选自糖类或糖醇中的至少一种；

所述糖类或糖醇的粒径为0.02～200μm。

可选地，所述自糖类或糖醇的粒径为1～100μm

可选地，所述组分A的粒径D₅₀≤7μm；所述组分B的粒径D₅₀≤7μm。

可选地，所述组分A的粒径D₅₀≤5μm；所述组分B的粒径D₅₀≤5μm。

可选地，所述组分A的粒径D₅₀≤3μm；所述组分B的粒径D₅₀≤4μm。

可选地，所述糖类选自单水乳糖和/或无水乳糖，所述糖醇选自甘露醇。

可选地，所述药物制剂中，所述药物组合物和所述药学上可接受的赋形剂的质量比为2～101：100～350。

可选地，所述药物制剂中，所述药物组合物和所述药学上可接受的赋形剂的质量比为10～101：150～350。

可选地，所述药物制剂的活性成分的单位用药量如下：

大麻二酚 0.2mg～10mg；

长效β2受体激动剂 4.5μg～120μg。

根据本申请的另一个方面，提供一种上述任一项所述的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：

(I)取所述组分B3～20倍量的药学上可接受的赋形剂与所述组分B进行混合I，获得混合物I，

(II)将剩余的药学上可接受的赋形剂、混合物I、所述组分A进行混合II，获得所述的药物制剂。

可选地，所述混合II的步骤包括：

(a)在高速搅拌机中混合1～5min，搅拌桨线速度15～50m/s。

可选地，所述混合II的步骤还包括：

(b)在三维混合机中混合5～20min。

根据本申请的另一个方面，提供一种如上述任一项所述的药物组合物、上述任一项所述的药物制剂、根据上述任一项所述的制备方法制备得到的药物制剂作为抗炎、扩张支气管平滑肌和/或抗平滑肌收缩药物的应用。

根据本申请的另一个方面，提供一种如上述任一项所述的药物组合物、上述任一项所述的药物制剂、根据上述任一项所述的制备方法制备得到的药物制剂作为治疗哮喘、慢性支气管炎和/或慢性阻塞性肺病药物的应用。

本申请中，英文缩写说明如下：

BEAS-2B：人支气管上皮细胞；

NF-kB：核因子激活的B细胞的κ-轻链增强。

本申请可产生的有益效果包括：

(1)本申请所提供的药用组合物中的大麻二酚和长效β2受体激动剂在抗炎、扩张支气管平滑肌等方面具有协同增效的作用，可用于治疗哮喘、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病。

(2)本申请通过调节大麻二酚和长效β2受体激动剂的用量比例，不仅可以提高药效，而且可以大大减少了β-受体激动剂的使用剂量，有效避免了因其过度使用所带来的不良反应的发生。同时避免了目前β2肾上腺素受体激动剂类药物与糖皮质激素组合长期使用后由激素引起的副作用的风险，具有更好的治疗依从性，对于哮喘、慢性支气管炎或慢性阻塞性肺病等呼吸系统疾病的治疗具有重要的临床意义。

(3)本申请所提供的干粉吸入剂，通过选用合适的载体，将活性成分或含活性成分的复合物结合于载体表面，在吸入给药过程中在气流的作用下活性成分或其含活性成分的复合物可以从载体表面解离抵达肺部，从而发挥治疗作用。且通过吸入给药，大麻二酚能直达病灶，避免了大麻二酚口服吸收差及首过效应，与此同时用大麻二酚替代糖皮质激素，能够有效避免因应用糖皮质激素产生的诸多不良反应。

附图说明

图1为本申请具体实施例6中所测定的大麻二酚和长效β2受体激动剂单独和联合使用对NF-kB的抑制效果。

图2为本申请具体实施例7中所测定的大麻二酚和长效β2受体激动剂单独和联合使用对豚鼠离体平滑肌的收缩的影响。

具体实施方式

下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。

如无特别说明，本申请的实施例中的试剂盒材料均通过商业途径购买，其中：

人支气管上皮细胞BEAS-2B：购自美国典型培养物保藏中心；

DMEM/F12培养基：购自美国Gibco公司；

胰蛋白酶：购自美国Gibco公司；

Hanks溶液：购自美国Gibco公司；

胎牛血清：购自美国Gibco公司；

双抗(氨苄青霉、链霉素100×)：购自美国Gibco公司；

转染试剂PEI：购自美国Invitrogen公司；

质粒pGL4.32：购自美国Promega公司；

质粒Renilla：购自美国Promega公司；

双荧光素酶报告基因试剂盒：购自美国Promega公司；

磷酸盐缓冲液(PBS)：购自美国赛默飞世尔公司。

作为一种实施例，本申请提供一种含大麻二酚和长效β2受体激动剂的药物组合物，所述长效β2受体激动剂为茚达特罗及其可药用盐、福莫特罗及其可药用盐、维兰特罗及其可药用盐、沙美特罗及其可药用盐、奥达特罗及其可药用盐。

上述组合物中大麻二酚包括其可药用盐。

在本申请的具体实施例中，通过选用合适的药用辅料，可将大麻二酚和长效β2受体激动剂两者开发成为复方制剂，例如，气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、胶囊、缓释胶囊、软胶囊、普通片、缓释片、分散片、口含片、滴丸等制剂形式，这既有利于药物疗效的迅速发挥，又适合药物各自的特点，方便病人服用。

可先地，本申请大麻二酚和长效β2受体激动剂组合物以吸入剂型存在，包括但不仅限于干粉吸入剂、吸入气雾剂、吸入喷雾剂。

一种干粉吸入剂，其活性成分的单位用药量如下：

大麻二酚0.2mg-10mg(单位剂量)

长效β2受体激动剂4.5μg-120μg(单位剂量)

所述的大麻二酚的粒径D50不大于7μm，优选地不大于5μm。所述的长效β2受体激动剂的粒径D50不大于7μm，优选地不大于5μm。所述干粉吸入剂药用载体选自糖类、糖醇中的一种或多种，优选为单水乳糖、无水乳糖或其混合物。他们都需要进行微粉化处理，粒径分布范围在0.02～200微米之间，优选为1～100微米之间。

在本申请中，所述干粉吸入剂中药用载体系指在制剂中充当填充剂的成分。制剂制备过程中活性成分或含活性成分的复合物可以结合于载体表面，以满足分散、混合以及定量装填等工序的加工要求。

在吸入给药过程中在气流的作用下活性成分或其含活性成分的复合物可以从载体表面解离抵达肺部，从而发挥治疗作用。

另一方面，本发明还提供一种制备上述干粉吸入剂的方法，该方法包括如下步骤：

a)先将β2受体激动剂与部分药用载体进行预混合得到预混合物；

b)将步骤a)中形成的预混合物与大麻二酚、剩余的药用载体进行高速搅拌混合即得。

所述预混合方法包括采用过筛、湿法制粒机或者三维混合机的方法进行混合。

所述高速搅拌混合是指物料群体中的粒子受到来自切刀、搅拌桨或是筛网等外力作用，粉体内部因流动产生搅拌效果，引起物料混合。搅拌混合的设备包括高速搅拌机、高速混合机等，除了流动之外还可以通过切刀或者搅拌桨的高速旋转将疏松的活性成分或活性成分与稳定剂形成的松散团块打散成较小的团块，并使其均匀分散结合于载体之上，这些设备的混合强度一般低于共研磨设备，为了不对基本粒子产生粉碎效果且不破坏稳定剂与活性成分的结合，搅拌桨(或切刀)的线速度为1～100m/s，优选10～60m/s。适合的混合设备包括V型混合机、三维混合机、湿法混合制粒机、万向混合机等。

制成的干粉吸入剂可以预先定量地装填于单剂量或多剂量容器中，可通过适当的包装以提供化学和物理保护，通过主动或被动式吸入装置给药，所述容器可为胶囊或泡罩，优选胶囊。

实施例1以单水乳糖为载体，用于大麻二酚马来酸茚达特罗干粉吸入剂的制备

分别将大麻二酚、马来酸茚达特罗、单水乳糖在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.6Mpa，所得的微粉化大麻二酚粒径D50＝2.95μm、微粉化马来酸茚达特罗粒径D50＝2.72μm，微粉化单水乳糖D50＝22μm。按照处方一称取微粉化的大麻二酚、马来酸茚达特罗和单水乳糖。取处方量马来酸茚达特罗3倍量的单水乳糖与处方量的马来酸茚达特罗过筛进行预混合得到预混合物，再将处方量的大麻二酚和剩余量处方量的单水乳糖加入上述预混合物中，在高速搅拌机中混合2min，搅拌桨线速度50m/s，获得大麻二酚马来酸茚达特罗干粉吸入剂。

处方一

实施例2以单水乳糖为载体，用于大麻二酚富马酸福莫特罗干粉吸入剂的制备

将大麻二酚在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.6Mpa，所得的微粉化大麻二酚粒径D50＝2.95μm；将富马酸福莫特罗、单水乳糖在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.4Mpa，所得的微粉化富马酸福莫特罗粒径D50＝3.12μm，微粉化单水乳糖D50＝37μm。按照处方二称取微粉化的大麻二酚、富马酸福莫特罗和单水乳糖。取处方量富马酸福莫特罗20倍量的单水乳糖与处方量的富马酸福莫特罗过筛进行预混合得到预混合物，再将处方量的大麻二酚和剩余处方量的单水乳糖加入上述预混合物中，在高速搅拌机中混合2min，搅拌桨线速度10m/s。最后再于三维混合机中混合20min，得到大麻二酚富马酸福莫特罗干粉吸入剂。

处方二

实施例3以单水乳糖为载体，用于大麻二酚三苯乙酸维兰特罗干粉吸入剂的制备

将大麻二酚在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.6Mpa，所得的大麻二酚粒径D50＝2.95μm；将三苯乙酸维兰特罗、单水乳糖在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.7Mpa，所得的微粉化三苯乙酸维兰特罗粒径D50＝2.67μm，微粉化单水乳糖D50＝15μm。按照处方三称取微粉化的大麻二酚、三苯乙酸维兰特罗和单水乳糖。分别取处方量三苯乙酸维兰特罗5倍量的单水乳糖与处方量的三苯乙酸维兰特罗过筛进行预混合得到预混合物，再将处方量的大麻二酚和剩余处方量的单水乳糖加入上述预混合物中，在高速搅拌机中混合2min，搅拌桨线速度20m/s。最后再于三维混合机中混合10min，得到大麻二酚三苯乙酸维兰特罗干粉吸入剂。

处方三

实施例4以甘露醇为载体，用于大麻二酚昔萘酸沙美特罗干粉吸入剂的制备

将大麻二酚在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.6Mpa，所得的大麻二酚粒径D50＝2.95μm；将昔萘酸沙美特罗、甘露醇在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.5Mpa，所得的微粉化昔萘酸沙美特罗粒径D50＝2.87μm，微粉化甘露醇D50＝41μm。按照处方四称取微粉化的大麻二酚、昔萘酸沙美特罗和甘露醇。取处方量昔萘酸沙美特罗8倍量的甘露醇与处方量的昔萘酸沙美特罗过筛进行预混合，再称取处方量的大麻二酚和剩余量处方量的甘露醇加入上述预混合物中，在高速搅拌机中混合2min，搅拌桨线速度15m/s。最后再于三维混合机中混合15min，得到大麻二酚昔萘酸沙美特罗干粉吸入剂。

处方四

实施例5以单水乳糖和无水乳糖为载体，用于大麻二酚盐酸奥达特罗干粉吸入剂的制备

将大麻二酚在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.6Mpa，所得的大麻二酚粒径D50＝2.95μm；将盐酸奥达特罗、无水乳糖、单水乳糖在气流粉碎机中进行微粉化，粉碎压力为0.6Mpa，所得的微粉化盐酸奥达特罗粒径D50＝2.95μm，微粉化无水乳糖D50＝17μm，微粉化单水乳糖D50＝29μm。按照处方五称取微粉化的大麻二酚、盐酸奥达特罗、无水乳糖和单水乳糖。将处方量盐酸奥达特罗15倍量的单水乳糖与处方量的盐酸奥达特罗过筛进行预混合得到预混合物，再称取处方量的微粉化的大麻二酚、处方量的无水乳糖、剩余处方量的单水乳糖加入上述预混合物中，在高速搅拌机中混合3min，搅拌桨线速度25m/s。最后再于三维混合机中混合20min，得到大麻二酚盐酸奥达特罗干粉吸入剂。

处方五

实施例6大麻二酚联合长效β2受体激动剂协同抗炎作用

A.细胞培养

选用人支气管上皮细胞BEAS-2B(美国典型培养物保藏中心)，置于37℃、5％CO₂的CO₂培养箱中用DMEM/F12(美国Gibco)完全培养基(含有10％胎牛血清和1％双抗)培养。几种试液配制方法如下：

胰酶消化液：含0.25％胰蛋白酶的Hanks溶液(美国Gibco)，-20℃保存。

DMEM/F12基础培养液：DMEM培养基：F12培养基＝1:1(体积比)。

DMEM/F12完全培养液：DMEM/F12基础培养基，加入10％胎牛血清(美国Gibco)及1％双抗(美国Gibco)，4℃保存。

具体培养方法如下：

1.复苏：从液氮中取出细胞，迅速移至37℃水浴锅中，摇晃至其溶解。1000rpm离心3min，弃去上清。加入少量培养基混匀沉淀，再次离心，弃去上清。加入适量培养基溶解沉淀，转移至培养瓶中，“十字”法拍打震荡混匀，放入5％CO₂培养箱中，37℃培养过夜。

2.换液、培养：第二天观察细胞贴壁生长情况，弃去旧培养液后再加入新鲜的培养基以去除死的细胞，放入5％CO₂的培养箱中，37℃继续培养，根据细胞生长情况确定换液频率，一般一至两天换液一次，待细胞密度达80～90％时，进行以下消化传代步骤。

3.消化传代：预先将冷冻保存的配制好的胰酶溶化。将步骤2培养细胞弃去旧的培养液，加入胰酶预洗，弃去。加入6滴胰酶，37℃反应1min。加入等体积的含10％血清的培养基终止消化反应。1000rpm离心3min，弃去上清，收集BEAS-2B细胞用于B步骤。

B.双荧光素酶报告基因质粒瞬时共转染

将步骤A中所得的BEAS-2B细胞培养于96孔板，待细胞融合至50％-70％时，用转染试剂PEI将NF-kB(核因子激活的B细胞的κ-轻链增强)荧光素酶报告基因质粒pGL4.32和内参荧光素酶报告基因质粒Renilla共转染入细胞内，分别加入pGL4.32 100ng/孔和Renilla9.6ng/孔，转染试剂PEI(1mg/Ml)与pGL4.32的比例为8:1，转染24h后，以无血清培养液继续培养12h同步化细胞，获得细胞培养液，待用。

C.细胞实验分组及给药

细胞炎症模型选用人支气管上皮细胞BEAS-2B釆用TNF-α刺激细胞产生炎症。

空白组：步骤B中获得的细胞培养液(未经TNF-α刺激，同时未添加药物)。

模型组：在步骤B中获得的细胞培养液中加入TNF-α10ng/mL造模6h，收集细胞裂解液用于NF-kB荧光活性的检测；

给药组：将大麻二酚(CBD)、茚达特罗(Ind)、福莫特罗(For)、沙美特罗(Sal)、维兰特罗(Vil)和奥达特罗(Olo)单独使用时，在细胞培养液中的终浓度均为20μmol/L，大麻二酚和长效β2受体激动剂联合使用时，在细胞培养液中各个单体剂量的终浓度分别为10μmol/L。各给药组药物预孵育细胞2h，加入TNF-α10ng/mL造模6h，收集细胞裂解液用于NF-kB荧光活性的检测。

D.NF-kB荧光活性检测

给药结束后，各组弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，裂解细胞用于NF-kB检测，具体操作步骤如下：

1.根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega，含有萤火虫荧光素酶和内参Renilla荧光素酶)说明书配制萤火虫荧光素酶检测试剂及内参检测试剂，其中萤火虫荧光素酶检测试剂缓冲液预先与底物混合，-20℃冻存备用，内参检测试剂的缓冲液与底物现用现配。

2.向96孔细胞培养板的每孔中加入20μL被动细胞裂解液，振荡30min，裂解细胞。

3.取20μL细胞裂解液，加入100μL配制好的萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻混匀后，用Modulus荧光检测仪(美国Turner Biosystems)检测并记录NF-kB荧光值。

4.再加入100μL内参荧光素酶检测试剂，轻轻混匀，用Modulus荧光检测仪检测并记录Renilla荧光值。

5.计算荧光素酶报告基因活性，即用萤火虫荧光素酶活性除以内参Renilla荧光素酶活性，以相对比值表示。相对荧光比率＝NF-kB荧光值/内参Renilla荧光值。

E.实验结果

如图1所示，利用TNF-α(10ng/mL)刺激人支气管上皮细胞BEAS-2B炎症模型证实，与模型组相比，单独给药时虽然也能降低TNF-α诱导的NF-kB激活(p<0.05)，但将大麻二酚和长效β2受体激动剂联合使用时具有更好的NF-kB抑制效果(p<0.05)。结果表明，大麻二酚联合长效β2受体激动剂可以显著地增强抗炎活性。

实施例7豚鼠离体平滑肌的协同平喘实验

取Hartley豚鼠，体重约250～300g，雌雄各半(购自于北京军事医学科学院实验动物中心，动物饲养于23～26℃且12h自动循环熄灯的标准动物房中，自由饮水和饮食)。麻醉后剥离气管，将气管剪成条段(5mm*10mm)，并固定于Krebs-Henseleit缓冲液中(130mmol/LNaCl，1.27mmol/L MgSO₄,5mmol/L KCl，2.3mmol/L CaCl₂，25mmol/LNaHCO₃，0.8mmol/LNaH₂PO₄，10mmol/L葡萄糖)，37℃，保持通入5％CO₂-95％O₂混合气体，加载1g负荷，每隔30min更换新鲜的Krebs-Henseleit缓冲液。待平滑肌稳定后，累积加入10倍梯度稀释的乙酰胆碱(Ach)10^-10～10^-2mol/L，记录各浓度的收缩效应值，以最大收缩值为100％作为空白对照。经Krebs-Henseleit缓冲液反复冲洗，待肌张力恢复至基线后，再分别加入1×10^{- 4}mol/L大麻二酚(CBD)、1×10^-8mol/L茚达特罗(Ind)、1×10^-8mol/L福莫特罗(For)、1×10^{- 8}mol/L沙美特罗(Sal)、1×10^-8mol/L维兰特罗(Vil)和1×10^-8mol/L奥达特罗(Olo)，以及大麻二酚和长效β2受体激动剂联合使用(大麻二酚0.5×10^-6mol/L，长效β2受体激动剂0.5×10^-8mol/L)，预孵育10min后，再次累积加入10倍梯度稀释的乙酰胆碱(Ach)10^-10～10^-2mol/L，记录各浓度收缩效应值，并计算平滑肌收缩曲线，以空白组乙酰胆碱刺激平滑肌收缩曲线的最大收缩为100％计算，分别用EC50来表示收缩效果。

如图2所示，单独或联合应用大麻二酚和长效β2受体激动剂时，均可以明显抑制乙酰胆碱引起的豚鼠气管平滑肌的收缩，而当上述相同剂量的大麻二酚和长效β2受体激动剂联合应用时，抗平滑肌收缩的效果显著提高。综合实施例6和7的试验结果可知，单独应用大麻二酚和长效β2受体激动剂都具有一定的抗炎和抗平滑肌收缩的效果，当二者联合应用时，抗炎和抗平滑肌收缩的效果显著提高，具有明显的协同增效的作用。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (8)

1.一种药物制剂在制备治疗哮喘、慢性支气管炎的药物中的应用，其特征在于，所述药物制剂由一种药物组合物和药学上可接受的赋形剂组成；

所述药物组合物由组分A和组分B组成：

组分A：大麻二酚和/或大麻二酚可药用盐；

组分B选自茚达特罗、茚达特罗可药用盐、福莫特罗、福莫特罗可药用盐、维兰特罗、维兰特罗可药用盐、沙美特罗、沙美特罗可药用盐、奥达特罗、奥达特罗可药用盐中的一种；

所述组分A和组分B的质量比为0.6~110：1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型选自经胃肠道给药的剂型或经呼吸道给药的剂型中的任一种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述经胃肠道给药的剂型选自片剂、胶囊剂、滴丸中的任一种；所述经呼吸道给药的剂型选自吸入剂、气雾剂中的任一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型为干粉吸入剂，所述药学上可接受的赋形剂选自单水乳糖和/或无水乳糖；

所述单水乳糖和/或无水乳糖的粒径为0.02~200μm。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型为干粉吸入剂，所述药学上可接受的赋形剂选自甘露醇；

所述甘露醇的粒径为0.02~200μm。

6.根据权利要求4或5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物制剂中，所述组分A的粒径D₅₀≤7μm；所述组分B的粒径D₅₀≤7μm。

7.根据权利要求4或5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物和所述药学上可接受的赋形剂的质量比为2~101：100~350。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制剂的制备方法包括以下步骤：

（I）取所述组分B 3~20倍量的药学上可接受的赋形剂与所述组分B进行混合I，获得混合物I，

（II）将剩余的药学上可接受的赋形剂、混合物I、所述组分A进行混合II，获得所述的药物制剂。