CN114514320A - 杀昆虫蛋白 - Google Patents

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CN114514320A CN202080067951.4A CN202080067951A CN114514320A CN 114514320 A CN114514320 A CN 114514320A CN 202080067951 A CN202080067951 A CN 202080067951A CN 114514320 A CN114514320 A CN 114514320A
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Abstract

披露了用于控制昆虫有害生物的组合物和方法。特别是，提供了对至少鞘翅目昆虫有害生物具有毒性的新颖杀昆虫蛋白。还提供了编码所述新颖杀昆虫蛋白的核酸分子。还披露了制备所述杀昆虫蛋白的方法和使用所述杀昆虫蛋白以及编码本披露的杀昆虫蛋白的核酸的方法，例如，在转基因植物中以赋予免于昆虫损害的保护。

Description

杀昆虫蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月14日提交的美国临时申请号62/914,667的优先权，其内容通过引用以其全文并入本文。
序列表的引用
提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37 C.F.R.§1.821提交的，名称为“81942-WO-REG-ORG-P-1_ST25.txt”，大小为约113千字节，于2020年9月30日生成并经EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。
技术领域
本发明涉及蛋白工程、植物分子生物学以及有害生物控制的领域。更具体地，本发明涉及具有杀昆虫活性的新颖蛋白及其变体，核酸(其表达产生杀昆虫蛋白)，以及制造这些杀昆虫蛋白和相应的核酸的方法和使用这些杀昆虫蛋白和相应的核酸来控制昆虫的方法。
背景技术
昆虫有害生物是引起作物损失的一个主要原因。仅在美国，由于各个属的昆虫的侵染每年就损失数十亿美元。除了大田作物的损失之外，昆虫有害生物对于菜农和果农、对于观赏性花卉的生产商而言也是一种负担，并且对于园丁和房屋所有者而言是一种令人讨厌的东西。
玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。单在美国，三个物种，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫)、长角巴氏根萤叶甲(D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫)、以及黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫)，在美国玉米带中，每年对玉米造成的损失超过十亿美元。美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae))。在南美洲，南美叶甲(DiabroticaSpeciosa)被认为是玉米的重要有害生物。西方玉米根虫于1992年传播到欧洲，自2008年以来一直在整个主要玉米种植地区造成经济损失。玉米根虫幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成最为实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食还通过为导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了进入根部的途径，而对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，在此它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。
玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而具有活性。由此可以达到良好的玉米根虫控制，但这些化学品有时也能影响其他有益的生物。广泛使用化学杀有害生物剂引起的另一个问题是出现抗性昆虫群体。又另一个问题是由于下述事实：玉米根虫幼虫在地下摄食因此使得施用杀昆虫剂的救护处理变得困难。因此，大多数杀昆虫剂的施用是在种植时预防性地进行的。这种实践导致了巨大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需求。
生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ-内毒素(Δ-内毒素；也被称为结晶毒素或Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(Bt)菌株，也已经小规模施用至作物植物中，产生了针对某些昆虫有害生物的令人满意的结果。这些δ-内毒素是在结晶基质内所容纳的蛋白，已知它们当被某些昆虫摄取时拥有杀昆虫活性。来自苏云金芽孢杆菌的此类Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物。例如，起始于2003年，通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、或修饰的Cry3A(mCry3A)或eCry3.1Ab蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可商购的。
尽管已经显示使用表达Cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的Cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型且有效的有害生物控制蛋白，这些有害生物控制蛋白为农民提供经济益处并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(Diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白，与现有昆虫控制产品中的Cry蛋白相比这些蛋白具有不同的作用方式，以缓和抗性发展。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制蛋白是令人希望的。
发明内容
鉴于这些需要，在一些实施例中，本披露提供了特别来源于根瘤菌科细菌，但也可以来源于其他类型的细菌的杀昆虫蛋白。此类杀昆虫蛋白的实例在本文中举例说明并且此类杀昆虫蛋白，无论来源于根瘤菌科还是其他不同细菌，统称为根瘤菌科杀昆虫蛋白(RIP)。本披露还提供了RIP的变体，以及与RIP及其变体基本相同的蛋白。本披露的RIP的氨基酸序列的示例包括但不限于SEQ ID NO:1-21中的任一个。本披露的RIP对昆虫有害生物具有毒性。例如，本披露的蛋白可用于控制经济上重要的昆虫有害生物，包括鞘翅目昆虫，如西方玉米根虫(WCR；玉米根萤叶甲)、北方玉米根虫(NCR；长角巴氏根萤叶甲)、南方玉米根虫(SCR；黄瓜十一星叶甲食根亚种)和/或墨西哥玉米根虫(MCR；墨西哥玉米根萤叶甲)。
本披露还提供了核酸分子，所述核酸分子包含一个或多个编码RIP或变体RIP的核苷酸序列、它们的互补序列，或与RIP或RIP变体基本相同的核苷酸序列。编码本披露的RIP或变体RIP的核苷酸序列的实例包括但不限于SEQ ID NO:22-49中的任一个
本披露还提供了包含编码本披露的RIP和/或变体RIP的重组核酸的载体；包括和能够表达这样的核酸的植物或微生物；用这样的核酸转化的植物，例如转基因玉米植物；这样的植物的后代，其含有稳定地掺入和以孟德尔方式遗传的核酸，和/或这样的植物的种子和这样的后代。本披露还提供育种的方法，以将包含本披露的核酸分子的转基因引入子代植物和各种种质中。
本披露还提供了包含本披露的RIP和/或变体RIP的组合物和配制品，其能够抑制有害生物存活、生长和/或繁殖的能力，或限制与昆虫相关的对作物的损害或损失的能力，例如，将RIP或RIP变体作为组合物或配制品的一部分施用于受昆虫侵染的区域或植物，或预防性处理易受昆虫侵染的区域或植物以赋予对昆虫有害生物的保护。
本披露进一步提供制造RIP或其变体的方法，以及使用所述核酸的方法，例如，在微生物中控制昆虫或者在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护。这样的微生物可以是，例如，定殖玉蜀黍根并将本披露的RIP递送至玉蜀黍根际的内生物种，从而保护根免受玉米根虫摄食的损害。
本披露的RIP和/或变体RIP可以单独使用或与其他昆虫控制剂和策略组合使用，来以最小的环境影响赋予针对相同昆虫有害生物的增强的有害生物控制效率和/或增加靶昆虫的谱。
通过学习本发明的以下说明书和非限制性实例，本发明的其他方面和优点对于本领域的技术人员而言将变得清楚。
对序列表中的序列的简述
SEQ ID NO:1是Ensif_aridCRW(RIP1Aa)氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是Sinorhiz_GL28CRW(RIP2Aa)氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是Rhizo_bactCRW(RIP3Aa)氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是Rhiz_SPYCRW(RIP4Aa)氨基酸序列。
SEQ ID NO:5代表变体RIP3Aa氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是RIP3Aa-I50L氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是RIP3Aa-I53L氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是RIP3Aa-I56L氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是RIP3Aa-A62C氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是RIP3Aa-A62L氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是RIP3Aa-A64C氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是RIP3Aa-A64L氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是RIP3Aa-I81L氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是RIP3Aa-I126L氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是RIP3Aa-I153L氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是RIP3Aa-I169L氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是RIP3Aa-I185L氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是RIP3Aa-I207L氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是RIP3Aa-I219L氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是RIP3Aa-I275L氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是SUMO-RIP1Aa氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是Ensif_aridCRW(rip1Aa)核苷酸序列。
SEQ ID NO:23是Sinorhiz_GL28CRW(rip2Aa)核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是Rhizo_bactCRW(rip3Aa)核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是Rhiz_SPYCRW(rip4Aa)核苷酸序列。
SEQ ID NO:26是rip1Aa大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27是rip2Aa大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是rip3Aa大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29是rip4Aa大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是rip3Aa-I50L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是rip3Aa-I53L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是rip3Aa-I56L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33是rip3Aa-A62C大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是rip3Aa-A62L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35是rip3Aa-A64L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是rip3Aa-A64C大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37是rip3Aa-I81L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是rip3Aa-I126L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39是rip3Aa-I153L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:40是rip3Aa-I169L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41是rip3Aa-I185L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是rip3Aa-I207L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是rip3Aa-I219L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是rip3Aa-I275L大肠杆菌优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:45是SUMO-rip1Aa核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是rip1Aa玉蜀黍优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:47是rip2Aa玉蜀黍优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是rip3Aa玉蜀黍优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:49是rip4Aa玉蜀黍优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50包含RIP1Aa细胞毒素结构域。
SEQ ID NO:51包含RIP2Aa细胞毒素结构域。
SEQ ID NO:52包含RIP3Aa细胞毒素结构域。
SEQ ID NO:53包含RIP4Aa细胞毒素结构域。
具体实施方式
本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明预期了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，本文建议的不同实施例的众多变化以及增加物对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的发明的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
本文引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文并入。
本文提供的核苷酸序列以5'至3'方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸碱基的标准代码表示，如37C.F.R.§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述，例如：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。
氨基酸同样是使用WIPO标准ST.25来指示，例如：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。如本文所使用的，氨基酸序列中的“X”或“Xaa”表示该位置的氨基酸可以是20种已知氨基酸中的任何一种或可以是本文中列举的氨基酸中的任何一种。
除非上下文另外指示，明确地预期的是本文所述的本发明的不同特征可以按任何组合使用。而且，本发明还考虑到在本发明的一些实施例中，本文陈述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果本说明书陈述组合物包含组分A、B和C，明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
定义
如根据本披露使用的，除非另外指明，否则以下术语应当被理解为具有以下含义：
如本文和所附权利要求所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。
如本文所使用的，词语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
术语“约”在本文用于表示大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。
除非上下文另有说明，如本文所使用的，例如“在约X和Y之间”、“在约X和约Y之间”、“从X至Y”和“从约X至约Y”(以及类似短语)的短语应被解释为包括X和Y。
如本文所使用的，术语“扩增”意指使用至少一种核酸分子作为模板，构建核酸分子的多个拷贝或与该核酸分子互补的多个拷贝。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西索加的坎基尼公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)、以及链置换扩增(SDA)。参见，例如，Diagnostic Molecular Microbiology:Principles andApplications[诊断分子微生物学：原理与应用],PERSING等人编,American Society forMicrobiology[美国微生物学会],华盛顿(Washington,D.C.),(1993)。扩增的产物被称为“扩增子”。
本披露的杀昆虫蛋白的“活性”意指杀昆虫蛋白作为口服活性的昆虫控制剂发挥作用，具有毒性作用、和/或能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本披露的杀昆虫蛋白被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以该杀昆虫蛋白可被该昆虫可用的来源为食。“杀有害生物”被定义为有毒的生物活性，其能够控制有害生物(如昆虫、线虫、真菌、细菌或病毒)，优选地通过杀死或破坏它们来进行控制。“杀昆虫”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫，优选地通过杀死它们来进行控制。“杀有害生物剂”是具有杀有害生物活性的药剂。“杀昆虫剂”是具有杀昆虫活性的药剂。
如本文所使用的，术语“嵌合构建体”或“嵌合基因”或“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”(或类似术语)是指如下构建体或分子，该构建体或分子包含被组装进单个核酸分子中的不同来源的两个或更多个多核苷酸。术语“嵌合构建体”、“嵌合基因”、“嵌合多核苷酸”或“嵌合核酸”是指如下任何构建体或分子，该构建体或分子含有但不限于(1)多核苷酸(例如，DNA)，包括在自然界中没有被发现在一起的调节多核苷酸和编码多核苷酸(即，构建体中的至少一个多核苷酸相对于它的其他多核苷酸中的至少一个是异源的)，或(2)编码不是天然毗邻的蛋白部分的多核苷酸，或(3)不是天然毗邻的启动子部分。另外，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸可以包含衍生自不同来源的调节多核苷酸和编码多核苷酸，或包含衍生自相同来源、但以与在自然界中所发现的不同的方式进行布置的调节多核苷酸和编码多核苷酸。在本披露的一些实施例中，嵌合构建体、嵌合基因、嵌合多核苷酸或嵌合核酸包含表达盒，该表达盒包含在调节多核苷酸的控制下、特别地在植物或细菌中具有功能性的调节多核苷酸的控制下的本披露的多核苷酸。
“编码序列”是转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的核酸序列。优选地，RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白。
“控制”昆虫意指通过毒性作用抑制了昆虫有害生物存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，或限制与昆虫有关的损害或作物植物中的损失。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。
如本文所使用的，“密码子优化的”序列意指如下核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物体可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，该方式是为了保持由待优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，重组DNA构建体的DNA序列包括已经针对该构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、或真菌细胞)进行了密码子优化的序列。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014，通过引用并入本文。
术语“包含(comprises或comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、或其组的存在或添加。
如本文所使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求的范围有待被解读为涵盖权利要求中所列举的指定材料或步骤以及非实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。
在本披露的上下文中，“对应于(corresponding to或corresponds to)”意指当变体或同系物蛋白的氨基酸序列与彼此比对时，“对应于”在该变体或同系物蛋白中某些枚举的位置的氨基酸是与参考蛋白中的这些位置比对的那些，但在相对于本披露的特定参考氨基酸序列而言的这些精确的数字位置中是不必要的。例如，如果SEQ ID NO:1是参考序列并与SEQ ID NO:2比对，则SEQ ID NO:2的位置153(L153)处的氨基酸Leu(L)“对应于”SEQ IDNO:1的位置154(L154)处的Leu(L)，或例如，SEQ ID NO:2的位置2(N2)处的Asn(N)“对应于”SEQ ID NO:1的Ala(A)A2。
“递送”组合物或毒性蛋白意指该组合物或毒性蛋白与昆虫接触，这促进该组合物或毒性蛋白的经口摄取，产生对昆虫的毒性作用和控制。可以按照许多公认的方式，包括但不限于转基因植物表达、一种或多种配制的蛋白组合物、一种或多种可喷洒的蛋白组合物、饵基(bait matrix)、或任何其他的领域公认的蛋白递送系统来递送该组合物或毒性蛋白。
术语“结构域”是指沿着进化相关蛋白的序列的比对在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置上的氨基酸可在同系物之间有所不同，但是在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白的结构、稳定性或功能中很可能是必需的氨基酸。通过其在蛋白同系物家族的经比对序列中的高度保守性进行鉴别，其可用作鉴别物(identifier)，用来确定所讨论的任何多肽是否属于先前鉴别的多肽组。
“控昆虫有效量”意指杀昆虫蛋白的浓度，其通过毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“有效的昆虫控制量”可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。
如本文所使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导特定的核苷酸序列的表达的核酸序列，包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子，该目的核苷酸序列可操作地连接至终止信号。它还典型地包含适当翻译该核苷酸序列所需要的序列。包含该目的核苷酸序列的表达盒可能具有其组分中的至少一种，该组分相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。该表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，该表达盒相对于该宿主而言是异源的，即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中。在表达盒中核苷酸序列的表达可以是在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，该启动子只有当该宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才启动转录。在多细胞生物体(如植物)的情况下，该启动子对于特定组织、或器官、或者发育阶段也可以是特异的。
包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。表达盒还可以是包括驱动其天然基因的天然启动子，然而已经以对于异源表达有用的重组形式获得。表达盒的这种用途使它如此在其被引入的细胞中不是天然存在的。
表达盒还可以任选地包括在植物中发挥作用的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出目的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的核苷酸序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以是衍生自另一种来源(即，对于启动子、目的核苷酸序列、植物宿主、或其任何组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。任何已知在植物中发挥作用的可供使用的终止子均可以在本披露的上下文中使用。
当参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白的过程。基因表达可以在该过程的许多阶段进行调节。例如，在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，各自地表达可仅指该反义RNA或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白的产生。
“基因”是位于基因组内并且包含编码核酸序列的限定区域，并且典型地还包含其他负责控制该编码部分表达(也就是转录和翻译)的主要调节性核酸。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。另外的可能存在的元件是例如内含子。如在自然界中所发现，基因的调节核酸序列在正常情况下可能不与该相关联的核酸序列进行可操作地连接，并因此不会是嵌合基因。
“目的基因”是指当转移至生物体，例如细菌或植物时，在该细菌或植物上赋予所希望的性状(如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其他有害生物的抗性、除草剂耐受性、非生物胁迫耐受性、雄性不育、改性脂肪酸代谢、改性碳水化合物代谢、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力)的任何核酸分子。“目的基因”还可以是被转移至细菌或植物用于在该植物中产生商业上有价值的酶或代谢物的基因。
“异源”核酸序列或核酸分子是天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列或核酸分子，包括天然存在的核酸序列的非天然存在的多个拷贝。异源核酸序列或核酸分子可以包含嵌合序列，如嵌合表达盒，在该表达盒中，启动子和编码区源自多源生物体。启动子序列可以是组成型启动子序列、组织特异性启动子序列、化学诱导型启动子序列、伤口诱导型启动子序列、胁迫诱导型启动子序列、或发育阶段特异性启动子序列。
“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关联的核酸序列。
“同源重组”是在同源核酸分子之间的核酸片段的相互交换。
如本文所使用的，“假设蛋白”是指其存在已被预测但缺乏其在体内表达的实验证据的蛋白。对基因组或生物体(如细菌或植物)进行测序，通常会产生大量预测的开放阅读框，而这些阅读框的功能不易指定。这些蛋白，无论是孤立的还是保守的假设蛋白，占每个新测序基因组中编码的蛋白的约20％至约40％。即使有足够的证据表明基因的产物被表达，通过微阵列和质谱等技术，也很难为其指定功能，因为它与具有注释生化功能的蛋白序列缺乏同一性。通常，大多数蛋白序列是从基因组DNA序列的计算分析中推断出来的。假设蛋白通常是在基因组分析过程中由基因预测软件创建的。当用于基因鉴定的生物信息学工具在蛋白数据库中发现没有特征同源物的大型开放阅读框时，此类工具通常会返回名称“假设蛋白”作为注释。
术语“基序”或“共有序列”或“特征(signature)”是指进化相关蛋白的序列中的短保守区。基序常常是结构域的高度保守部分，但是也可只包括结构域的一部分，或位于保守结构域外部(如果基序的所有氨基酸位于所限定结构域的外部)。
在两个核酸或氨基酸序列的上下文中，术语“同一性”或“相同的”或“基本上相同的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少60％、优选至少80％、更优选90％、甚至更优选95％、并且最优选至少99％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列，如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。优选地，基本的同一性存在于整个具有长度为至少约50个残基或碱基的序列的区域中，更优选地在整个至少约100个残基或碱基的区域中，并且最优选地这些序列在至少约150个残基或碱基上是基本上相同的。在一个尤其优选的实施例中，这些序列在整个编码区域长度中是基本上相同的。此外，基本上相同的核酸或氨基酸序列基本上执行相同的功能。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算这个或这些测试序列相对于该参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包(Wisconsin GeneticsSoftware Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(GeneticsComputer Group)，科学街575号，麦迪逊，威斯康星州)，或通过目测检查(总体上参见Ausubel等人,下文)。
适用于确定序列同一性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于以下文献中：Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(the National Center forBiotechnology Information，美国国家医学图书馆(U.S.National Library ofMedicine)，美国洛克维尔大道8600号(8600 Rockville Pike)，贝塞斯达，马里兰州20894)可供公众使用的。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。
两个核酸序列基本上相同的另一个指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指分子在严格条件下仅与特定的核苷酸序列结合、双链化或杂交，这是在该序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时进行的。“基本上结合”是指在探针核酸与靶核酸之间的互补杂交，并且涵盖少量错配，这些错配可以通过降低杂交介质的严格来容纳，以实现靶核酸序列的所希望的检测。
在核酸杂交实验(如DNA杂交和RNA杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。对核酸杂交的一种广泛指导发现于Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes part I chapter 2"Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays"Elsevier,New York。通常，高严格杂交和洗涤条件在限定的离子强度和pH下被选定为比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。典型地，在“严格条件”下，探针将会与它的靶序列进行杂交，但不会与其他序列杂交。
Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针进行杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。非常严格条件被选定为等于特定探针的Tm。对于互补核酸(它们在DNA或RNA印迹中在滤器上具有超过100个互补的残基)的杂交的严格杂交条件的实例是在42℃下、具有1mg肝素的50％甲酰胺、将杂交进行过夜。高严格洗涤条件的实例是0.15M NaCl在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是0.2×SSC洗涤在65℃下持续15分钟(参见，Sambrook，下文，对于SSC缓冲液的说明)。通常，高严格洗涤之前会先进行低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的实例是1×SSC在45℃下持续15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的实例是4-6×SSC在40℃下持续15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件典型地涉及小于约1.0M的Na离子的盐浓度，典型地在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M的Na离子浓度(或其他盐类)，并且该温度典型地是至少约30℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。一般而言，相比于不相关的探针，在特定的杂交测定中观察到高出2倍(或更高)的信噪比就表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码子简并而创建核酸的拷贝时，则发生这种情况。
以下是可以用来克隆同源核苷酸序列(这些序列与本披露的参考核苷酸序列基本上相同)的杂交/洗涤条件的设置的实例：参考核苷酸序列在以下条件下优选地与该参考核苷酸序列杂交：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在2×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在1×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；仍更令人希望的是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.5×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.1×SSC、0.1％SDS中在50℃洗涤；更优选地在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃，并且在0.1×SSC、0.1％SDS中在65℃洗涤。
两个核酸序列或蛋白基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白与由第二核酸编码的蛋白进行免疫性交联反应或与其特异性结合。因此，蛋白典型地是与第二蛋白基本上相同的，例如其中这两种蛋白仅区别于保守性取代。
术语“分离的”核酸分子、多核苷酸或蛋白是不再存在于其天然环境中的核酸分子、多核苷酸或蛋白。本披露的分离的核酸分子、多核苷酸或蛋白可以按照纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，例如转基因细菌或转基因植物中。因此，如本文所列举的对“分离的”核酸分子的权利要求涵盖当核酸分子包含在转基因植物基因组内时的核酸分子。
“核酸分子”或“核酸序列”是可以从任何来源中分离的单链或双链DNA或RNA的区段。在本披露的上下文中，核酸分子典型地是DNA的区段。在一些实施例中，本披露的核酸分子是分离的核酸分子。
“可操作地连接”是指在单一核酸片段上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸或功能RNA的表达时(即，该编码多核苷酸或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与该编码多核苷酸或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码多核苷酸能够与调节多核苷酸可操作地连接。
如本文所使用的，“杀有害生物”、“杀昆虫”等是指本披露的RIP控制有害生物的能力或者可以控制如本文所定义的有害生物的RIP的量。因此，杀有害生物RIP可以杀死或抑制有害生物(例如，昆虫有害生物)存活、生长、摄食、或繁殖的能力。
术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在本文可以互换地使用。
“植物”是在发育的任何阶段的任何植物，特别是种子植物。示例性植物包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zea mays))、卡罗拉(canola)(欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁亚种(Brassica rapa ssp.))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago saliva))、稻(栽培稻(Oryzasativa)，包括但不限于籼稻和/或粳稻)、油菜(欧洲油菜)、黑麦(rye，Secale cereale)、高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor)、Sorghum vulgare)、向日葵(sunflower，Helianthusannus)、小麦(普通小麦(Triticum aestivum))、大豆(soybean，Glycine max)、烟草(普通烟草(Nicotiana tabacum))、马铃薯(洋芋(Solanum tuberosum))、花生(落花生(Arachishypogaea))、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(番薯(Ipomoea batatas))、木薯(树薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡属亚种(Cofea spp.))、椰子(可可椰子(Cocosnucifera))、菠萝(凤梨(Ananas comosus))、柑桔树(柑橘属物种(Citrus spp.))、可可(cocoa，Theobroma cacao)、茶(茶树(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉属物种(Musaspp.))、鳄梨(avocado，Persea americana)、无花果(fig，Ficus casica)、番石榴(guava，Psidium guajava)、芒果(杧果(Mangifera indica))、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、番木瓜(木瓜(Carica papaya))、腰果(cashew，Anacardium occidentale)、澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)、扁桃(巴旦杏(Prunus amygdalus))、糖用甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、苹果(apple，Malus pumila)、黑莓(悬钩子属(Rubus))、草莓(草莓属(Fragaria))、胡桃(普通胡桃(Juglans regia))、葡萄(酿酒葡萄(Vitis vinifera))、杏(apricot，Prunus armeniaca)、樱桃(李属(Prunus))、桃(碧桃(Prunus persica))、李(欧洲李(Prunus domestica))、梨(西洋梨(Pyrus communis))、西瓜(watermelon，Citrullusvulgaris)、浮萍(浮萍属(Lemna spp.))、燕麦(oats，Avena sativa)、大麦(barley，Hordium vulgare)、蔬菜、观赏植物、针叶树和草坪草(例如观赏性、娱乐或饲料用)、以及生物质禾草(例如柳枝稷和芒草)。
蔬菜包括但不限于茄属物种(例如西红柿、番茄(Lycopersicon esculentum))、莴苣(例如莴苣(Lactuea sativa))、胡萝卜(Caucus carota)、花椰菜(甘蓝(Brassicaoleracea))、芹菜(旱芹(Apium graveolens))、茄子(eggplant，Solanum melongena)、芦笋(石刁柏(Asparagus officinalis))、秋葵(黄秋葵(Abelmoschus esculentus))、四季豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、青豆(Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrusspp.))，南瓜属(Cucurbita)的成员如古巴瓜(C.hubbard)、冬南瓜(南瓜(C.moschata))、密生西葫芦(zucchini)(西葫芦(C.pepo))、曲颈南瓜(C.crookneck)、C.argyrosperma、C.argyrosperma ssp sororia、C.digitata、C.ecuadorensis、旱地油瓜(C.foetidissima)、C.lundelliana、以及C.martinezii，以及黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(cucumber，Cucumis sativus)、哈密瓜(C.cantalupensis)、以及甜瓜(香瓜(C.melo))。
观赏植物包括但不限于杜鹃花(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙花(水仙属(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、猩猩木(一品红(Euphorbia pulcherima))、以及菊花。
可以用于实践本披露的针叶树包括例如，松树如火炬松(loblolly pine，Pinustaeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、杰克松(西黄松(Pinus ponderosa))、黑松(小干松(Pinus contorta))以及蒙特利松树(辐射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；美国西部铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))；美国西加云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；冷杉如银杉(温哥华冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(加拿大胶杉(Abies balsamea))；以及雪松，如美国西部侧柏(北美香柏(Thuja plicata))以及阿拉斯加黄杉(Alaska yellow-cedar)(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。
草坪草包括但不限于结缕草、剪股颖、羊茅草、早熟禾、奥古斯丁草、百慕达草、野牛草(bufallograsses)、黑麦草、以及鸭茅。
还包括的是主要充当实验室模式的植物，例如拟南芥。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(例如像，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文所使用的，“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
“多核苷酸”是指由共价键合于链中的许多核苷酸单体构成的聚合物。此类“多核苷酸”包括DNA、RNA、经修饰的寡核苷酸(例如，包含对于生物RNA或DNA非典型的碱基的寡核苷酸，如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另有说明，否则除任何明确指示的多核苷酸之外，本披露的具体核酸或多核苷酸任选地还包含或编码互补多核苷酸。
“目的多核苷酸”是指任何多核苷酸，当将其转移至生物(例如，植物)中时赋予该生物体所希望的特征，如昆虫抗性、疾病抗性、除草剂耐受性、抗生素抗性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能、商业上有价值的酶或代谢物的产生、或者改变的繁殖能力。
“启动子”是编码区的不被翻译的DNA序列上游，其含有RNA聚合酶结合位点并且启动DNA的转录。启动子区还可以包括充当基因表达的调节物的其他元件。
如本文所使用的，术语“重组”是指核酸分子(例如，DNA或RNA)或蛋白或生物体的如下形式，该形式通常不会在自然界中发现并且正因为如此通过人类干预来产生。如本文所使用的，“重组核酸分子”是包含多核苷酸组合的核酸分子，这些多核苷酸不会天然地共同存在并且是人类干预的结果，例如，由至少两种彼此异源的多核苷酸的组合组成的核酸分子，或人工合成的(例如，使用组装的核苷酸序列合成的多核苷酸)并且包含不同于通常存在于自然界中的多核苷酸的多核苷酸的核酸分子，或包含人工掺入至宿主细胞的基因组DNA中和该宿主细胞基因组相关侧翼DNA中的转基因的核酸分子。重组核酸分子的另一个实例是由将转基因插入至植物的基因组DNA中产生的DNA分子，其可以最终导致该生物体中的重组RNA/或蛋白分子的表达。如本文所使用的，“重组植物”是通常不会在自然界中存在的植物，是人类干预的结果，并且含有掺入至其基因组中的转基因和/或异源核酸分子。由于此类基因组改变，重组植物明显不同于相关的野生型植物。
“调控元件”是指参与控制核苷酸序列的表达的序列。调控元件包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子以及终止信号。它们还典型地涵盖适当翻译该核苷酸序列所需的序列。
根瘤菌科杀昆虫蛋白(RIP)是由至少在根瘤菌科细菌基因组中发现的基因编码的蛋白，其包含细胞毒素结构域并且至少对根萤叶甲属中的昆虫有害生物有活性。“变体RIP”是通过取代和/或缺失在天然存在的RIP中发现的至少一个氨基酸和/或将氨基酸插入到RIP序列中而工程化的RIP。如本文所使用的，除非另有说明，否则当单独使用术语“根瘤菌科杀昆虫蛋白”或“RIP”时，它意味着包括天然存在的蛋白以及工程化的变体蛋白两者。
参考氨基酸或核苷酸序列在本文中使用术语“取代”、“插入”或“添加”和“缺失”。“取代”是指分别用不同的核苷酸或氨基酸替换一个或多个核苷酸或氨基酸。“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列中的变化，其与天然存在的序列相比，分别导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列中的变化，其中分别不存在一个或多个核苷酸或氨基酸残基。氨基酸取代典型地是单个残基取代；插入通常将在约1到20个氨基酸的数量级，尽管可以耐受显著更大的插入。缺失的范围是约1至约20个残基，尽管在一些情况下，缺失可以远远更大。取代、缺失、插入或其任何组合可用于获得最终变体多肽。通常，改变一些氨基酸以最小化分子的变化。然而，在某些情况下，可以耐受更大变化。在某些实施例中，氨基酸取代可以是用具有相似结构和/或化学特性的另一个氨基酸置换一个氨基酸的结果，例如用缬氨酸置换异亮氨酸，即保守氨基酸置换。插入或缺失可任选地在1至5个氨基酸的范围内。在实施例中，可以根据已知的“保守性取代”进行取代。“保守性取代”是指一类中的氨基酸被同一类中的氨基酸取代，其中类由常见的物理化学氨基酸侧链特性和自然界中发现的同源蛋白中的高取代频率来定义。相反，在某些实施例中，取代是非保守性的。“非保守性取代”是指用来自另一类的氨基酸取代一类中的氨基酸。
“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物体的方法。在特定实施例中，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物体的基因组(核或质体)中。
“转化的/转基因的/重组的”是指异源核酸分子已经引入其中的宿主生物如细菌或植物。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子还可以作为染色体外分子存在。这种染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含该异源的核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。
本披露提供了用于控制有害的昆虫有害生物的组合物以及方法。特别地，本披露涉及杀昆虫蛋白及其变体，在本文中称为根瘤菌科杀昆虫蛋白(RIP)，其至少对鞘翅目昆虫具有活性，例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(Diabrotica barber)(北方玉米根虫；NCR)和/或黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫；MCR)和南美根萤叶甲(葫芦甲虫)。本发明的发明人发现，在本领域中被描述为假设蛋白的某些蛋白令人惊讶地具有杀昆虫性，这些蛋白据称至少在根瘤菌目中的革兰氏阴性细菌的基因组中编码。更具体地说，这些假设蛋白的编码序列存在于根瘤菌科细菌的基因组中。根瘤菌科是变形菌门的科，包括与植物，特别是植物根相关的多个亚群。更具体地，发现具有杀昆虫作用的假设蛋白的编码序列存在于中华根瘤菌属、剑菌属、根瘤菌属和相关属的根瘤菌科细菌的基因组中。甚至更具体地，本文示例为杀昆虫蛋白的假设蛋白的编码序列包括但不限于阿里迪剑菌(Ensiferaridi)菌株(NCBI:txid1708715)、中华根瘤菌属物种GL28菌株(NCBI:txid1358418)、未分类的根瘤菌目细菌菌株(NCBI:txid1909294)和根瘤菌属物种SPY-1菌株(NCBI:txid2547961)的基因组中的那些序列。在合成编码上述蛋白的核酸分子并在转基因大肠杆菌细菌中表达该蛋白后，本发明人确定本领域中描述为假设蛋白的蛋白令人惊讶地具有杀昆虫活性，特别是针对根萤叶甲属昆虫有害生物。此类杀昆虫蛋白在本文中通常称为根瘤菌科杀昆虫蛋白(RIP)，并且在本文中特别举例说明的那些被指定为RIP1Aa(Enf_adiCRW；SEQ ID NO:1)、RIP2Aa(Sinorhiz_GL28CRW；SEQ ID NO:2)、RIP3Aa(Rhizo_bactCRW；SEQ IDNO:3)和RIP4Aa(Rhiz_SPCRW；SEQ ID NO:4)。本领域技术人员将认识到，使用本披露的教导，本领域技术人员可以鉴定以下但不限于以下中与上述那些相关的序列：细菌中、来自环境样品的核酸分子中和基因组数据库中，其中这样的序列可以是指定为假设的，或者它们可能具有一些其他已知的功能，等等。预期此类相关序列包含在本披露中。技术人员在阅读本披露后将理解术语“相关序列”的含义。如下文进一步详细描述的，本披露的RIP具有独特的细胞毒素结构域，其赋予对抗至少鞘翅目昆虫有害生物的活性。
本披露还涉及核酸(它们的表达产生了本披露的RIP)，以及涉及制造和使用这些RIP以控制昆虫有害生物的方法。在某些非限制性实施例中，这些核酸的表达产生杀昆虫蛋白，其可用于至少控制鞘翅目昆虫(如西方玉米根虫、北方玉米根虫和/或南方玉米根虫)，特别是当表达于转基因植物(如转基因玉米植物)中时。
在一些非限制性实施例中，本披露涵盖核酸分子，所述核酸分子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：编码对昆虫有害生物有毒的蛋白(即杀昆虫蛋白)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)编码包含氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性；(b)与SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性；或者(c)是(a)或(b)的合成序列，该合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。在其他实施例中，所述杀昆虫蛋白包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒性片段的氨基酸序列。在其他实施例中，所述核苷酸序列包含以下、基本由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段。
在一些非限制性实施例中，本披露涵盖嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作地连接到核酸分子的异源启动子，所述核酸分子包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：编码对昆虫有害生物有毒的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)编码包含氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性；(b)与SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性；或者(c)是(a)或(b)的合成序列，该合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。在其他实施例中，杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒性片段的氨基酸序列。在其他实施例中，核苷酸序列包含SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段。在这些实施例的一些方面中，嵌合基因是表达盒。
在其他非限制性实施例中，包含在本披露嵌合基因或表达盒中的启动子是植物可表达型启动子。在这些实施例的方面，所述植物可表达型启动子选自下组的启动子，该组由以下组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、稻肌动蛋白、稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
在一些非限制性实施例中，由本披露的核酸分子或本披露的嵌合基因或本披露的表达盒编码的杀昆虫蛋白对鞘翅目昆虫有害生物具有活性。在这些实施例的一些方面中，鞘翅目昆虫有害生物在根萤叶甲属中。在其他方面，根萤叶甲属昆虫有害生物是玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫；NCR)和/或黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫；MCR)。
在一些非限制性实施例中，本披露的嵌合基因或表达盒包括编码本披露的RIP的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列经密码子优化以用于在转基因生物中表达。在这些实施例的一些方面中，转基因生物是细菌或植物。
在其他非限制性实施例中，转基因细菌是以下属：芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属、鞘脂单胞菌属、伯克氏菌属、Candidatus Glomeribacter、戴氏菌属、草螺菌属、慢生根瘤菌属、葡萄球菌属、嗜甲基菌属、贪噬菌属、链球菌属、鞘氨醇杆菌科(Chitinophaga)或产碱杆菌属。在其他实施例中，转基因细菌是大肠杆菌。在其他实施例中，核苷酸序列包含以下、基本由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:26-45中的任一个。
在其他非限制性实施例中，转基因植物是单子叶植物或双子叶植物。在其他实施例中，双子叶植物选自由以下组成的组：大豆、向日葵、番茄、芸苔属作物、棉花、甜菜和烟草。在另外的方面中，所述单子叶植物选自由以下组成的组：大麦、玉蜀黍、燕麦、稻、高粱、甘蔗和小麦。在一些方面，转基因植物是玉蜀黍植物。在其他实施例中，核苷酸序列包含优化用于在玉蜀黍中表达的密码子。在仍其他实施例中，核苷酸序列包含以下、基本由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:46-49中的任一个。
在一些非限制性实施例中，本披露涵盖对昆虫有害生物有毒的蛋白，以及任选地分离的蛋白，即杀昆虫蛋白，其中所述蛋白或分离的蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性；(b)氨基酸序列，所述氨基酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段；(c)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性；(d)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段；或(e)(a)-(d)中任一项的氨基酸序列，其包含选自由以下组成的组的细胞毒素结构域：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:52和SEQ ID NO:53。本领域技术人员将认识到，可以对本披露所涵盖的示例性RIP进行修饰。此类修饰和基本上一致的核酸或氨基酸分子涵盖于本披露中。
本披露还包括工程化的根瘤菌科杀昆虫蛋白，其可被描述为本披露的突变RIP或变体RIP或经修饰的RIP。在一些实施例中，修饰可包括天然存在的RIP序列中一个或多个氨基酸的取代和/或缺失和/或将一个或多个另外氨基酸插入天然存在的RIP序列中。在其他实施例中，修饰可包括工程化的RIP中一个或多个氨基酸的取代和/或缺失和/或插入。取代和/或插入可以是用天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在一些非限制性实施例中，修饰包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：在RIP氨基酸序列的氨基酸位置处丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸中的一个或多个的取代和/或插入和/或缺失。这种取代和/或插入和/或缺失可以通过改变编码RIP的核苷酸序列中的密码子来实现，从而产生编码工程化的RIP(其是本披露的突变体RIP或变体RIP或经修饰的RIP)的经修饰的rip核苷酸序列。
在一些非限制性实施例中，通过以下的取代和/或插入来修饰RIP：(a)具有脂肪族疏水侧链的一个或多个氨基酸(例如丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和/或缬氨酸；在实施例中，氨基酸不是丙氨酸)；(b)具有芳香族疏水侧链的一个或多个氨基酸(例如，苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸)；(c)具有极性中性侧链的一个或多个氨基酸(例如，天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和/或苏氨酸)；(d)具有酸性侧链的一个或多个氨基酸(例如，天冬氨酸和/或谷氨酸)；具有碱性侧链的一个或多个氨基酸(例如，精氨酸、组氨酸和/或赖氨酸)；(e)一个或多个甘氨酸残基；(f)一个或多个脯氨酸残基；或(g)(a)至(f)的任何组合。
在其他实施例中，在本披露的RIP的任何氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1-4的任何氨基酸序列中氨基酸被取代和/或缺失和/或插入。在其他实施例中，在SEQ ID NO:3中氨基酸被取代。在其他实施例中，在SEQ ID NO:3中被取代的氨基酸位于位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219和/或275。在其他实施例中，位置50处的氨基酸被L取代，位置52处的氨基酸被L取代，位置56处的氨基酸被L取代，位置62处的氨基酸被C或L取代，位置64处的氨基酸被C或L取代，位置81处的氨基酸被L取代，位置126处的氨基酸被L取代，位置153处的氨基酸被L取代，位置169处的氨基酸被L取代，位置185处的氨基酸被L取代，位置207处的氨基酸被L取代，位置218处的氨基酸被L取代，或位置275处的氨基酸被L取代。
在另外的实施例中，本披露提供了一种嵌合RIP毒素，其包括与完整的RIP序列或RIP序列的一部分(例如细胞毒素结构域)连接的蛋白融合标签。蛋白融合标签可以连接在N末端(例如，在RIP序列的氨基酸1或2处)，或可替代地，蛋白融合标签可以连接在RIP序列的C末端。蛋白融合标签可以是聚组氨酸、聚精氨酸、卤代烷脱卤酶、链霉亲和素结合、谷胱甘肽s-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白、小泛素样修饰剂(SUMO)、N-利用物质A(NusA)、蛋白二硫键异构酶I(DsbA)、Mistic、酮类固醇异构酶(KSI)或TrpE、c-myc、血凝素抗原(HA)、FLAG、1D4、钙调蛋白结合肽、几丁质结合结构域、纤维素结合结构域、S-标签或Softag3蛋白融合标签。这些可用于生产、分离或纯化本披露的任何RIP毒素的方法中。本披露还提供了重组多核苷酸，例如构建体，其编码与本披露的RIP毒素连接的融合标签。在一些实施例中，将SUMO标签连接到RIP1Aa毒素的N末端以产生由SUMO-rip1Aa多核苷酸(SEQID NO:45)编码的SUMO-RIP1Aa毒素(SEQ ID NO:21)。
在一些非限制性实施例中，本披露涵盖变体RIP，其包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：氨基酸序列，所述氨基酸序列与a)SEQ ID NO:1具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且还在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1-345的位置处包含至少一个突变；或与b)SEQ ID NO:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且还在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置1-344的位置处包含至少一个突变；或与c)SEQ ID NO:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且还在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置1-351的位置处包含至少一个突变；或与d)SEQ ID NO:4具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性，并且还在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸位置1-347的位置处包含至少一个突变。在其他非限制性实施例中，所述突变位于与SEQ ID NO:3的氨基酸位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219或275或其任意组合对应的氨基酸位置处。在其他非限制性实施例中，突变位于SEQ ID NO:3的位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219或275处。在其他实施例中，位置50处的突变为I50L，位置52处的突变为I52L，位置56处的突变为I56L，位置62处的突变为A62C或A62L，位置64处的突变为A64C或A64L，位置81处的突变为I81L，位置126处的突变为I126L，位置153处的突变为I153L，位置169处的突变为I169L，位置185处的突变为I185L，位置207处的突变为I207L，位置2019处的突变为I219L，或位置275处的突变为I275L。在另外的其他实施例中，变体RIP包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、ID NO:19或SEQ IDNO:20。
在一些非限制性实施例中，当在相同条件(例如酶浓度、蛋白浓度、pH、温度和/或时间)下测试时，与合适的对照和/或不含本披露的修饰的亲本分子相比，本披露的变体RIP具有增强的被哺乳动物消化蛋白酶(例如，胃蛋白酶)的消化。用胃蛋白酶和其他消化蛋白酶评估蛋白消化的方法是本领域已知的。例如，使用胃蛋白酶的消化可以在以下条件进行：约37℃和约pH 1.2，任选地具有约10单位(U)胃蛋白酶/微克蛋白的酶浓度。
在一些实施例中，本披露的RIP，包括本披露的变体RIP，对鞘翅目昆虫有害生物具有活性。鞘翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何鞘翅目昆虫，包括原鞘亚目、粘食亚目、肉食亚目和多食亚目、及其任何组合中的那些。
在一些非限制性实施例中，本披露的RIP毒素和变体RIP毒素对根萤叶甲属物种具有活性。根萤叶甲属是鞘翅目的一种甲虫属，通常被称为“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”。示例性根萤叶甲属物种包括但不限于：巴氏长角根萤叶甲(Diabrotica longicornis barberi)(北方玉米根虫)、玉米根萤叶甲指名亚种(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(westernspotted cucumber beetle))、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spottedleaf beetle))、南美叶甲(D.speciosa)(菊花甲虫(chrysanthemum beetle))、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curvipustulata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusa)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.viridula)；及其任何组合。
根据本披露的鞘翅目昆虫有害生物的其他非限制性实例包括瘦跗叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)，如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)；叶甲虫属物种(Chrysomelaspp.)，如黑杨叶甲(C.scripta)(黑杨叶甲虫(cottonwood leaf beetle))；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹(H.hampei)(咖啡豆钻孔虫(coffee berry borer))；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais)(玉蜀黍象(maize weevil))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis)(烟草跳
Figure BDA0003567056520000331
(tobacco fleabeetle))和黄瓜跳甲(E.cucumeris)(马铃薯跳甲(potato flea beetle))：条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如十字花科跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲(cruciferflea beetle))和西方黑跳甲(P.pusilla)(西方黑色跳甲(western black fleabeetle))；花象属物种(Anthonomus spp.)，如胡椒花象(A.eugenii，pepper weevil)；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius)(铁线虫(wireworms))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如普通梳爪叩头甲(M.communis)(铁线虫(wireworms))；荚象甲属物种(Ceutorhychus spp.)，如甘蓝荚象甲(C.assimilis)(甘蓝心皮象鼻虫(cabbageseedpod weevil))；条跳甲属物种，如十字花科跳甲(十字花科植物跳甲)；Aeolus属物种(Aeolus spp.)，如A.mellillus(铁线虫)；Aeolus属物种，如A.mancus(小麦铁线虫(wheatwireworm))；砂铁线属物种(Horistonotus spp.)，如砂铁线虫(H.uhlerii)(沙子铁线虫(sand wireworm))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis)(玉蜀黍谷象(maize billbug))、梯牧草谷象(S.zeae)(梯牧草谷象虫(timothy billbug))、牧草长喙象(S.parvulus)(早熟禾谷象(bluegrass billbug))和南方玉米长喙象(S.callosus)(南方玉米谷象(southern corn billbug))；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米铜色跳甲(C.pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beetle))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)，如日本弧丽金龟(P.japonica)(日本金龟子(Japanese beetle))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如菜豆莹叶甲(C.trifurcate)(豆叶甲(Bean leaf beetle))；豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata)(斑蝥(listerbeetles))；以及前述的任何组合。
本披露的RIP也可以对鳞翅目昆虫有活性。这样的鳞翅目昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何被分类为鳞翅目昆虫的昆虫，包括在轭翅亚目、有喙亚目和异石蛾亚目及其任何组合内的那些昆虫物种。示例性鳞翅目昆虫包括但不限于：玉米螟属物种，如欧洲玉米螟(O.nubilalis，European corn borer)；菜蛾属物种，如小菜蛾(P.xylostella，diamondback moth)；灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)(秋夜蛾(fall armyworm))、黄条粘虫(S.ornithogalli，yellowstripedarmyworm)、西部黄条粘虫(S.praefica，western yellowstriped armyworm)、南部粘虫(S.eridania，southern armyworm)和甜菜夜蛾(S.exigua，beet armyworm)；地夜蛾属物种，如小地老虎(A.ipsilon)(黑色地老虎)、普通地老虎(A.segetum，common cutworm)、泥背地老虎(A.gladiaria，claybacked cutworm)和西部灰地老虎(A.orthogonia，palewestern cutworm)；切根虫属物种(Striacosta spp.)，如豆白缘切根虫(S.albicosta)(西部豆切根虫(western bean cutworm))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)，如玉米穗虫(H.zea)(玉米穗蛾(corn earworm))、茶色铃夜蛾(H.punctigera)(原生夜蛾(nativebudworm))、海灰翅夜蛾(S.littoralis)(埃及棉树叶虫(Egyptian cotton leafworm))和棉铃虫(H.armigera，cotton bollworm)；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)，如烟芽夜蛾(烟夜蛾)；杆草螟属物种(Diatraea spp.)，如西南玉米螟(D.grandiosella，southwesterncorn borer)和小蔗螟(D.saccharalis)(甘蔗蛀虫))；粉纹夜蛾属物种(Trichoplusiaspp.)，如粉纹夜蛾(T.ni，cabbage looper)；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)，如地中海玉米螟(S.nonagroides，Mediterranean corn borer)；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)，如棉红铃虫(P.gossypiella，pink bollworm)；纹卷蛾属物种(Cochylis spp.)，如向日葵细卷叶蛾(C.hospes，banded sunflower moth)；天蛾属物种(Manduca spp.)，如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)，如南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；尺夜蛾属物种(Pseudoplusia spp.)，如大豆尺蠖(P.includens)(大豆夜蛾)；干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)，如黎豆夜蛾(绒毛豆毛虫)；绿夜蛾属物种(Plathypena spp)，如苜蓿绿夜蛾(P.scabra，green cloverworm)；马醉木属物种(Pieris spp.)，如大菜粉蝶(P.brassicae)(纹白蝶(cabbage butterfly))；夜蛾属物种(Papaipema spp.)，如蛀茎夜蛾(P.nebris，stalk borer)；黏虫属物种(Pseudaletia spp.)，如一星黏虫(P.unipuncta)(普通黏虫)；疆夜蛾属物种(Peridromaspp.)，如杂色地老虎(P.saucia，variegated cutworm)；茄茎麦蛾属物种(Keiferiaspp.)，如番茄蠹蛾(K.lycopersicella，tomato pinworm)；菜粉蝶属物种(Artogeiaspp.)，如菜粉蝶(A.rapae，imported cabbageworm)；茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)，如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm)；透翅缓夜蛾属物种(Crymodes spp.)，如C.devastator，glassy cutworm；脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)，如脏切夜蛾(F.ducens，dingy cutworm)；以及前述的任何组合。
本披露的RIP还可以针对半翅类、双翅类、草盲蝽属物种和/或其他刺吸式昆虫(例如直翅目或缨翅目的刺吸式昆虫)具有活性。双翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何双翅目昆虫，包括但不限于斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)，如三叶斑潜蝇(L.trifolii)(潜叶虫(leafminer))和美洲斑潜蝇(L.sativae)(蔬菜潜叶虫(vegetableleafminer))；Scrobipalpula属物种，如番茄潜叶虫(S.absoluta，tomato leafminer)；地种蝇属物种(Delia spp.)，如玉米蝇蛆(D.platura)(玉米种蝇(seedcorn maggot))、甘蓝种蝇蛆(D.brassicae)(甘蓝种蝇(cabbage maggot))和甘蓝根花蝇(D.radicum，cabbageroot fly)；锈蝇属物种(Psilia spp.)，如胡萝卜锈蝇(P.rosae，carrot rust fly)；根斑蝇属物种(Tetanops spp.)，如甜菜根蛆(T.myopaeformis)(甜菜根斑蝇(sugarbeet rootmaggot))；以及前述的任何组合。
直翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何直翅目昆虫，包括但不限于黑蝗属物种(Melanoplus spp.)，如异黑蝗(M.differentialis)(长额负蝗(Differential grasshopper))、赤胫黑蝗(M.femurrubrum，Redlegged grasshopper))、双带黑蝗(M.bivittatus，Twostriped grasshopper))；及其任何组合。
缨翅目的昆虫包括但不限于目前已知的或之后鉴定的任何缨翅目昆虫，包括但不限于花蓟马属物种(Frankliniella spp.)，如西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower thrips))和烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))；和蓟马属物种(Thrips spp.)，如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips))、瓜蓟马(T.palmi，melon thrips)；以及前述的任何组合。
本披露的RIP还可以针对线虫具有活性。如本文所使用的术语“线虫”涵盖目前已知的或之后鉴定的任何被分类为动物界线虫门的生物，包括但不限于有腺纲(包括例如：嘴刺目、等咽目、单齿目、矛线目、毛首目、索虫目、姆斯帕目、薄咽目、色矛目、带线虫目、链环目和单宫目)和/或胞管肾纲(包括例如：小杆目、圆线虫目、蛔虫目、旋尾目、驼形目、双胃目、垫刃目和滑刃目)中的线虫。
线虫包括但不限于寄生线虫，如根结线虫、胞囊线虫和/或腐线虫。根据本披露的线虫的示例性属包括但不限于：根结线虫属(根结线虫)、异皮线虫属(胞囊线虫)、球异皮线虫属(Globodera)(胞囊线虫)、穿孔线虫属(穿孔线虫)、肾状线虫属(肾形肾状线虫)、短体线虫属(腐线虫)、滑刃线虫属(叶面线虫)、螺旋线虫属(螺旋线虫)、纽带线虫属(矛线虫)、拟毛刺属(短粗根线虫)、长针线虫属、珍珠线虫属(假根结线虫)、亚粒线虫属(Subanguina)、刺线虫属(刺线虫)、小环线虫属(小环线虫)、环线虫属(环线虫)、茎线虫属(茎线虫)、锥线虫属(锥线虫)、半轮线虫属(半轮线虫)、鞘线虫属(鞘线虫)、潜根线虫属(潜根线虫)、根结线虫属(Hypsoperine)、大茎线虫属(大茎线虫)、Melinius属、刻点胞囊属(Punctodera)、五沟线虫属(Quinisulcius)、盾线虫属(盾线虫)、剑线虫属(匕首线虫)、矮化线虫属(矮化线虫)、穿刺线虫属(穿刺线虫)、伞滑刃属(蛔虫)、及其任何组合。
根据本披露的示例性植物寄生线虫包括但不限于：细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus，pine wood nematode)、龙胆轮线虫属(Criconemoides ornata)、马玲薯腐烂线虫(Ditylenchus destructor，potato rot nematode)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchusdipsaci，stem and bulb nematode)、马铃薯胞囊线虫(Globodera pallida，potato cystnematode)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(金黄线虫(golden nematode))、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii，sugar beet cyst nematode)；玉米胞囊线虫(Heterodera zeae，corn cystnematode)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、Heterodera trifolii(三叶异皮线虫)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、Hoplolaimusmagnistylus、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、北方根节线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax)、异常珍珠线虫(Nacobbusaberrans)、Naccobus dorsalis、Paratrichodorus christiei、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、Pratylenchus hexincisus、落选短体线虫(Pratylenchusneglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、Pratylenchus projectus、斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)、Pratylenchus tenuicaudatus、Pratylenchusthornei、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、Punctodera chaccoensis、Quinisulciusacutus、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis)、顺逆矮化线虫(Tylenchorhynchus dubius)、柑桔半穿刺线虫(Tylenchulussemipenetrans)、美洲剑线虫(Siphinema americanum)、X.Mediterraneum、以及前述的任何组合。
本披露还涵盖重组载体和/或重组构建体，这些重组载体或构建体也可被称为载体或构建体，其包含本披露的表达盒和/或核酸分子。在此类载体中，这些核酸优选地处于表达盒中，这些表达盒包含用于在能够表达核苷酸分子的宿主细胞中表达核苷酸分子的调节元件。此类调节元件通常包含启动子和终止信号并且优选地还包含元件，这些元件允许由本披露的核酸所编码的多肽的有效的翻译。包含核酸的载体能够在特定的宿主细胞中复制(优选是作为染色体外分子)并因此可用来在这些宿主细胞中扩增本披露的核酸。
本披露还涵盖宿主细胞，所述宿主细胞包含本披露的重组载体、表达盒或核酸分子。在其他实施例中，此类载体是病毒载体并被用于在特定的宿主细胞(例如昆虫细胞或植物细胞)中复制核苷酸序列。重组载体也用于将本披露的核酸分子转化到宿主细胞中，由此这些核酸分子被稳定整合到转基因宿主的DNA中。在一些实施例中，宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。在这些实施例的一些方面中，细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属、鞘脂单胞菌属、伯克氏菌属、Candidatus Glomeribacter、戴氏菌属、草螺菌属、慢生根瘤菌属、葡萄球菌属、嗜甲基菌属、贪噬菌属、链球菌属、鞘氨醇杆菌科或产碱杆菌属中。在这些实施例的其他方面，用于此类重组载体的宿主细胞是内生菌或附生菌。在这些实施例的一些其他方面，宿主细胞是植物细胞，例如双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。在其他方面，双子叶植物细胞选自下组，该组由以下组成：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、甜菜细胞以及烟草细胞。在仍其他方面，单子叶植物细胞选自由以下组成的组：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。
在本披露的一些非限制性实施例中，将本披露的核酸分子中的至少一个插入到适当的表达盒(包含启动子以及终止信号)中。核酸的表达可以是组成型的，或者可以使用响应于各种类型的刺激以起始转录的诱导型启动子。在另一个实施例中，其中表达了本披露的杀昆虫蛋白的细胞是微生物，如病毒、细菌或真菌。在又另一个实施例中，病毒(如杆状病毒)在其基因组中含有本披露的核酸并且在感染了适当的真核细胞(适合于病毒复制以及该核酸的表达)之后表达了大量相应的杀昆虫蛋白。将由此产生的杀昆虫蛋白用作杀昆虫剂。可替代地，被工程化以包括该核酸的杆状病毒被用来体内感染昆虫并通过该杀昆虫毒素的表达或通过病毒感染与该杀昆虫毒素的表达的组合而将其杀死。在一个另外的实施例中，本披露还涵盖了用于产生具有杀昆虫活性的多肽的方法，该方法包括在编码该多肽的核酸分子被表达的条件下培养宿主细胞。
细菌细胞也是用于表达本披露的核酸的宿主。在一个实施例中，使用了能够在植物组织内生活并复制的非致病的共生细菌(所谓的内生菌)，或能够定居在叶际或根际的非致病的共生细菌(所谓的附生菌)。此类细菌包括以下属的细菌：农杆菌属、产碱杆菌属、固氮螺菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、沙雷氏菌属、链霉菌属、鞘脂单胞菌属、伯克氏菌属、Candidatus Glomeribacter、戴氏菌属、草螺菌属、慢生根瘤菌属、葡萄球菌属、嗜甲基菌属、贪噬菌属、链球菌属、鞘氨醇杆菌科和黄单胞菌属。共生的真菌(如木霉属以及胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的核酸的可能的宿主。
这些基因操作技术对于不同的可供使用的宿主而言是特异性的并且在本领域中是已知的。例如，表达载体pKK223-3以及pKK223-2可以用来在大肠杆菌中(在转录或翻译融合中)在tac或trc启动子之后表达异源基因。为了表达编码多个ORF的操纵子，最简单的方法是在转录融合中将该操纵子插入载体(如pKK223-3)中，允许对该异源基因的同源核糖体结合位点进行利用。在革兰氏阳性物种(如芽孢杆菌属)中的过表达技术在本领域中也是已知的，并且可在本披露的上下文中使用(Quax等人,在:Industrial Microorganisms:Basicand Applied Molecular Genetics[工业微生物：基础和应用分子遗传学]中，编辑Baltz等人,American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿(1993))。用于过表达的替代性系统依赖于例如酵母载体，并包括毕赤酵母属、酵母属、以及克鲁维酵母属的使用(Sreekrishna,在:Industrial microorganisms:basic and applied moleculargenetics[工业微生物：基础和应用分子遗传学]中,Baltz,Hegeman,和Skatrud编辑,American Society for Microbiology[美国微生物学会],华盛顿(1993)；Dequin和Barre,Biotechnology[生物科技]L2:173-177(1994)；van den Berg等人,Biotechnology[生物科技]8:135-139(1990))。
在又其他实施例中，本披露涵盖了控制昆虫有害生物的方法，该方法包括将本披露的控昆虫有效量的杀昆虫蛋白递送至昆虫有害生物。在这些实施例的一些方面中，所述杀昆虫蛋白通过转基因植物或通过局部施用包含所述杀昆虫蛋白的杀昆虫组合物递送。在其他方面，所述转基因植物或所述杀昆虫组合物包含不同于本披露的RIP的第二杀昆虫剂。在仍其他方面中，第二杀昆虫剂是蛋白、dsRNA或化学品。在仍其他方面，蛋白选自由以下组成的组：Cry蛋白、VIP毒素、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；或者化学品是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或者化学品包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
在本披露的一些实施例中，本披露的RIP毒素中的至少一种在高等生物例如植物中表达。表达控昆虫有效量的杀昆虫蛋白的转基因植物保护其本身免受昆虫有害生物损害。在昆虫有害生物开始以这种转基因植物为食时，它也摄取了这种已表达的杀昆虫蛋白。这可以阻止昆虫进一步咬食植物组织和/或甚至可以伤害或杀死昆虫。将本披露的核酸分子插入到表达盒中，然后该核酸可被稳定地整合到该植物的基因组中。在其他实施例中，核酸分子包括在非致病的自我复制的病毒中。根据本披露所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于：玉米、小麦、燕麦、草坪草、牧场草、亚麻、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、小南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、大麻、绿皮西葫芦、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属物种，以及木本植物，如针叶树以及落叶树。
在一些实施例中，本披露涵盖生产对昆虫有害生物有毒的蛋白，即杀昆虫蛋白的方法，所述方法包括：(a)获得包含基因的宿主细胞，该基因自身包含本披露的表达盒和/或核酸分子；和(b)在所述转基因宿主细胞产生所述对昆虫有害生物有毒的蛋白的条件下使所述宿主细胞或包含所述宿主细胞的转基因宿主生长。
在其他实施例中，本披露涵盖产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括：(a)将包含编码本披露的杀昆虫蛋白的核酸分子的嵌合基因或表达盒或载体引入植物或植物部分，其中所述杀昆虫蛋白在所述植物或植物部分中表达，从而产生具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。在其他实施例中，嵌合基因、表达盒或载体可编码本披露的RIP毒素，所述RIP毒素包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:1-21中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少由91％组成、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同或相似的氨基酸序列。“增强的”昆虫抗性可以用转基因植物对以转基因植物为食的昆虫有害生物的任何毒性作用来衡量。增强的昆虫抗性与不表达所述杀昆虫蛋白的对照植物相比可高出0％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、或至少1000％的杀昆虫活性。可通过植物转化、植物组织培养或育种的方法产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。可通过有性或无性繁殖的方法来产生植物或植物部分。可以使用任何合适的对照植物或植物部分，例如在相同环境下生长的、具有相同或相似遗传背景的植物。在实施例中，对照植物或植物部分与所描述的植物具有相同的遗传背景并在相同的环境中生长，但其不包含本披露的分子，而所描述的植物包含本披露的核酸分子。
在其他实施例中，本披露涵盖了使植物或植物部分的昆虫抗性与对照植物或植物部分相比增强的方法，该方法包括在该植物或植物部分中表达本披露的核酸分子或表达盒，其中该表达盒的异源核酸的表达导致植物或植物部分与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性。在一些实施例中，表达盒或核酸分子包含可操作地连接至包含核苷酸序列的异源核酸分子的启动子，所述核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)SEQ ID NO:22-49中的任一个的核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:22-49中的任一个的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的核苷酸序列；(c)编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白的氨基酸序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQID NO:1-21中的任一个；(d)编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO:1-21中的任一个的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同；(e)上述(a)至(d)中任一个的核苷酸序列，其经密码子优化以在转基因宿主生物中表达；或(f)与上述(a)至(e)中的任一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。可将核酸分子或表达盒引入植物。在一些实施例中，可将核酸分子或表达盒引入植物部分中，并且可从该植物部分产生包含核酸分子或表达盒的植物。
在一些实施例中，本披露涵盖了产生与对照植物相比具有增强的昆虫抗性的植物的方法，该方法包括在植物部分中检测包含本披露的核酸分子或表达盒的异源核酸，以及从该植物部分产生植物，从而产生与对照植物相比具有增强的昆虫抗性的植物。在一个另外的实施例中，本披露涵盖了鉴定与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分的方法，该方法包括在该植物或植物部分中检测本披露的核酸分子或表达盒，从而鉴定具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。在一个另外的实施例中，将该表达盒或其诊断片段在来自该植物或植物部分的核酸样品中的扩增产物中进行检测。诊断片段可以是至少10个连续核苷酸长的核酸分子，其对于本披露的表达盒是独特的。
在其他实施例中，本披露涵盖了产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的植物的方法，该方法包括将第一亲本植物与第二亲本植物进行杂交，其中至少该第一亲本植物在其基因组中包含含有本披露的核酸分子或表达盒的异源核酸；以及产生子代后代，其中该子代后代包含至少一种在其基因组中具有所述异源核酸并且与对照植物相比展现出增强的昆虫抗性的植物。
在上述实施例的一些方面中，本披露的方法赋予植物或植物部分针对鞘翅目昆虫有害生物的增强的昆虫抗性。在实例中证明了对鞘翅目昆虫有害生物的昆虫控制。在另外的方面中，本披露的方法赋予植物或植物部分针对根萤叶甲属物种(包括玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种、墨西哥玉米根萤叶甲和/或南美叶甲(Diabroticaspeciosa))和/或相关物种的增强的昆虫抗性。在另外的实施例中，本披露的方法赋予植物或植物部分针对西方玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲和/或黄瓜十一星叶甲食根亚种的增强的昆虫抗性。
在一些实施例中，本披露涵盖了转基因植物，所述转基因植物包含本披露的异源核酸分子或表达盒，所述异源核酸分子或表达盒在被转录或被翻译时向所述转基因植物赋予增强的昆虫抗性。在这些实施例的一些方面中，异源核酸分子或表达盒包含与SEQ IDNO:21-49中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％至少99％或100％相同的核苷酸序列。在其他实施例中，转基因植物是双子叶植物或单子叶植物。在另外的方面中，转基因植物是苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西蓝花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽、柑橘、克莱门氏小柑橘、咖啡豆、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、苦苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、葡萄柚、白兰瓜、豆薯、奇异果、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、秋葵、洋葱、橙子、观赏植物、木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、李、石榴、杨树、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、小萝卜、覆盆子、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、小南瓜、草莓、甜菜、向日葵、甘薯、枫香、柑桔、茶、烟草、番茄、草皮、藤、西瓜、洋芋或绿皮西葫芦。在仍其他方面，转基因植物是粟、柳枝稷、玉蜀黍、高粱、小麦、燕麦、草坪草、牧场草、亚麻、稻、甘蔗、油菜或大麦。在其他实施例中，转基因植物是转基因玉蜀黍(玉米)植物，其包含rip编码序列(其中密码子优化用于在玉蜀黍中表达)，例如SEQ ID NO:46-49中的任何一个。
在一些实施例中，本披露涵盖编码本披露的杀昆虫蛋白的核酸分子，所述杀昆虫蛋白经修饰和优化以在转基因植物中表达。尽管在许多情况中来自微生物有机体的基因可以在没有修饰的情况下在植物中以高水平表达，但在转基因植物中的低表达可能是由于具有在植物中不优选的密码子的微生物核酸所造成的。在本领域中已知的是，所有生物针对密码子使用具有特定偏好，并且可以对本披露中所描述的核酸的密码子进行改变以符合植物的偏好，同时保持由此所编码的氨基酸，或对编码的杀昆虫蛋白进行某些氨基酸改变。此外，在植物中高表达最好是由以下编码序列实现的，这些编码序列具有至少约35％、优选大于约45％、更优选大于约50％、并且最优选大于约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核酸可能在植物中表达欠佳，这是由于存在可使信息不稳定的ATTTA基序，以及可能引起不适当的聚腺苷酸化作用的AATAAA基序。在实施例中，可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(Murray等人Nucl.Acids Res.[核酸研究]17:477-498(1989))。此外，针对可能引起信息缩短的不合理剪接位点的存在对这些核酸筛选。可以使用熟知的位点定向诱变、PCR、以及合成基因的构建的技术，例如，使用公开的专利申请EP 0 385 962、EP 0 359 472、以及WO93/07278中所述的方法，对在这些核酸之内所有需要做出的变化(如以上所描述的那些变化)进行改变。
在本披露的一些实施例中，根据美国专利5,625,136(通过引用并入本文)中所披露的程序来制造本披露的杀昆虫蛋白的编码序列。在这个程序中，使用了玉蜀黍优选的密码子，即最频繁地编码玉蜀黍中的氨基酸的单个密码子。针对特定的氨基酸的玉蜀黍优选的密码子可例如源自玉蜀黍的已知基因序列。针对来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用发现于Murray等人,Nucleic Acids Research[核酸序列]17:477-498(1989)中，其披露内容通过引用并入本文。以这种方式，这些核苷酸序列可以进行优化用于在任何植物中表达。认识到的是该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用合成的或部分优化的序列。
为了更加有效的翻译起始，可修饰与起始甲硫氨酸相邻的序列。例如，它们可以通过包含已知在植物中有效的序列而被修饰。Joshi已经提出了针对植物的适当的共有序列(NAR 15:6643-6653(1987))，并且Clontech提出了另一种共有翻译起始子(1993/1994目录，第210页)。这些共有序列适合与本披露的核酸一起使用。在实施例中，将这些序列掺入包含核酸的构建体中，达到并且包括ATG(而未对第二个氨基酸进行修饰)，或者可替代地达到并且包括在ATG后的GTC(具有修饰该转基因的第二氨基酸的可能性)。
在转基因植物中这些核酸的表达是由在植物中发挥作用的启动子所驱动的。启动子的选择将根据表达的时间和空间需要而变化，并且还根据靶物种而变化。因此，本披露的核酸在叶、柄(stalk)或茎(stem)、穗、花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等等)、根、和/或籽苗中的表达是优选的。然而在许多情况下，寻求针对多于一种类型昆虫有害生物的保护，并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但理想的是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中表达。不过，对于所选的启动子的起源没有限制；只要它们可有效驱动核酸在所希望的细胞中表达就足够了。
在一些实施例中，使用了以组成型表达的启动子，包括肌动蛋白或泛素或cmp启动子，或CaMV35S和19S启动子。本披露的核酸也可以在用化学方法进行调节的启动子的调节下表达。用于基因表达的化学诱导的优选的技术详述于公开申请EP 0 332 104(汽巴-嘉基公司(Ciba-Geigy))以及美国专利5,614,395中。用于化学诱导的优选的启动子是烟草PR-1a启动子。
在其他实施例中，可使用一类伤口诱导型启动子。已经描述了数量众多的在创伤部位并且还在植物病原菌感染的部位表达的启动子。理想的是，这种启动子应该仅在感染的部位有局部活性，并且以这种方式，本披露的杀昆虫蛋白仅在需要合成这些蛋白的细胞中累积以杀死入侵的昆虫有害生物。这类优选的启动子包括由以下文献所描述的那些：Stanford等人Mol.Gen.Genet.[分子遗传学]215:200-208(1989)，Xu等人PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)，Logemann等人Plant Cell[植物细胞]1:151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)，Firek等人Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)，以及Warner等人Plant J.[植物杂志]3:191-201(1993)。
用于在植物(特别是玉米)中表达对本披露的杀昆虫蛋白进行编码的基因的组织特异性的或组织优选的启动子是那些直接在根、髓、叶或花粉(特别是根)中表达的启动子。此类启动子，例如从PEPC或trpA中分离的那些披露于美国专利号5,625,136中，或从MTL中分离的那些披露于美国专利号5,466,785中。这两篇美国专利以其全文通过引用并入本文。
此外，可以使用在质体中发挥作用的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。适用于本披露的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
在本披露的一些实施例中，可以使用诱导型启动子。因此，例如，可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节物来调节本披露的核苷酸序列的表达。本披露的核苷酸序列的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得本披露的多肽仅当用诱导的化学物处理作物植物时能被合成。取决于目的，在应用化学品诱导本披露的核苷酸序列的表达时，该启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品抑制本披露的核苷酸序列表达时该启动子可以是化学阻抑型启动子。
化学诱导型启动子在本领域是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR-1a启动子(其由水杨酸激活)(例如，PR1a系统)、类固醇反应性启动子(参见例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]USA 88,10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.[植物杂志]14,247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型启动子和四环素-阻抑型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学]227,229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)、Lac阻遏物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(Aoyama等人(1997)Plant J.[植物杂志]11:605-612)以及蜕皮激素诱导型系统启动子。
诱导型启动子的其他非限制性实例包括ABA诱导型和细胞膨胀诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因启动子(Schwob等人(1993)Plant J.[植物杂志]4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston等人(1988)Genetics[遗传]119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等人(1994)Plant J.[植物杂志]6:141-150)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Kohler等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29:1293-1298；Martinez等人(1989)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]208:551-565；和Quigley等人(1989)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和乙醇诱导型(国际专利申请公开号WO 97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于以下文献中的诱导型启动子中的任一种：Gatz(1996)Current Opinion Biotechnol.[生物技术新见]7:168-172和Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.[植物生理学与植物分子生物学年度综述]48:89-108。适用于指导本披露的核苷酸序列在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中，该专利通过引用以其全文并入本文。基因表达的化学诱导还详述于公开申请EP 0 332 104(授予汽巴-嘉基公司)和美国专利5,614,395中。在一些实施例中，用于化学诱导的启动子可以是烟草PR-1a启动子。
在进一步的实施例中，本披露的核苷酸序列可以与启动子可操作地相关联，该启动子是创伤诱导型或由有害生物或病原体侵染(例如，昆虫或线虫植物有害生物)进行的诱导型。已经描述了在创伤部位和/或在有害生物攻击(例如，昆虫/线虫摄食)或植物病原菌侵染的部位处表达的数量众多的启动子。理想的是，这种启动子应仅在攻击部位处或邻近该部位具有局部活性，并且以这种方式，本披露的核苷酸序列的表达将集中在所侵入或摄食的细胞中。此类启动子包括但不限于由以下描述的那些启动子：Stanford等人,Mol.Gen.Genet.[分子与普通遗传学]215:200-208(1989)；Xu等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)；Logemann等人,Plant Cell[植物细胞]1:151-158(1989)；Rohrmeier和Lehle，Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)；Firek等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)；Warner等人,PlantJ.[植物杂志]3:191-201(1993)；美国专利号5,750,386；美国专利号5,955,646；美国专利号6,262,344；美国专利号6,395,963；美国专利号6,703,541；美国专利号7,078,589；美国专利号7,196,247；美国专利号7,223,901；以及美国专利申请公开2010043102。
在本披露的一些实施例中，使用“最小启动子”或“基本启动子”。最小启动子能够募集并结合RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白，以允许转录起始和延伸。在一些实施例中，最小启动子被构建成仅包含来自转录因子的结合和目的核苷酸序列的转录所必需的选定启动子的核苷酸/核苷酸序列的启动子，这一目的核苷酸序列可操作地与包括但不限于TATA盒序列的最小启动子相关联。在其他实施例中，最小启动子缺少募集并结合转录因子的cis序列，这些转录因子调节(例如，增强、阻抑、赋予组织特异性，赋予诱导性或阻抑性)转录。最小启动子通常被放置在待表达的核苷酸序列的上游(即，5’)。因此，可以选择来自与本披露一起可用的任何启动子的核苷酸/核苷酸序列用作最小启动子。
可以将数量众多的其他序列掺入本披露所描述的表达盒中。这些序列包括已经显示出增强表达的序列，如内含子序列(例如，来自Adhl和bronzel)以及病毒的前导序列(例如，来自TMV、MCMV、和AMV)。
本披露的核酸在植物中针对不同的细胞定位的靶向表达可能是更优选的。在一些情况下，在胞质溶胶中的定位可能是令人希望的，而在其他情况下，在某个亚细胞器中的定位可能是优选的。使用本领域内熟知的技术进行编码酶类的转基因的亚细胞定位。典型地，对编码来自已知细胞器靶向的基因产物的靶肽的DNA进行操作并将其融合在该核酸的上游。针对叶绿体的许多此类靶序列是已知的并且已经证明了它们在异源构建体中的功能。还将本披露的核酸的表达靶向至宿主细胞的内质网或液泡。实现其的技术在本领域中是熟知的。
适合于植物转化的载体描述于在本说明书的其他地方。对于农杆菌介导的转化，二元载体或携带至少一种T-DNA边界序列的载体是合适的，而对于直接基因转移，任何载体都是合适的，并且仅含有目的构建体的线性DNA也许是优选的。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(Schocher等人,Biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转化这两者，转化通常(但不是必需的)用选择性标记进行，这种选择性标记可以提供针对抗生素(卡那霉素、潮霉素、或甲氨蝶呤)或除草剂(basta)的抗性。包含本披露的核酸分子的植物转化载体还可包含以下基因(例如磷酸甘露糖异构酶；PMI)，这些基因提供转基因植物的阳性选择，如美国专利5,767,378和5,994,629(通过引用并入本文)中所披露的。然而，选择性标记的选择对于本披露并不是至关重要的。
在一些实施例中，核酸可以转化到核基因组中。在另一个实施例中，本披露的核酸被直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点在于质体通常能够表达细菌基因而无需实质性的密码子优化，而且质体能够在单一启动子的控制下表达多个开放阅读框。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在McBride等人,(1994),Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及例如使用生物射弹(biolistic)或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)，将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA区连同目的基因一起引入合适的靶组织中。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序列)促进了与质体基因组的同源重组，并且因而允许置换或修饰原质体(plastome)的特定区域。最初，将叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变(赋予对壮观霉素和/或链霉素抗性)用作用于转化的选择性标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,和Maliga,P.(1990)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87,8526-8530；Staub,J.M.,和Maliga,P.(1992)Plant Cell[植物细胞]4,39-45)。这以大约每100次靶叶轰击大约1个的频率产生稳定的同质转化株。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的引入(Staub,J.M.和Maliga,P.(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12,601-606)。转化频率的实质性增加是通过用显性选择性标记(细菌aadA基因，其编码了壮观霉素-解毒酶氨基糖苷-3'-腺苷酰转移酶)置换隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因来获得的(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90,913-917)。先前，这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)这种绿藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)Nucl.Acids Res.[核酸研究]19:4083-4089)。有用于质体转化的其他选择性标记在本领域是已知的，并且被包括在本披露的范围之内。典型地，转化之后需要大约15-20个细胞分裂循环以便达到同质状态。质体表达(其中基因通过同源重组被插入到在每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的庞大的拷贝数目的优点，以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10％的表达水平。在一个优选的实施例中，将本披露的核酸插入到质体靶向的载体中并且转化到所希望的植物宿主的质体基因组中。获得了对于包含本披露的核酸的质体基因组同型的植物，并且这些植物能够优先地高表达该核酸。
在又其他实施例中，本披露的转基因植物可包含异源核酸分子，该异源核酸分子编码至少一种另外的所希望的性状。另外的性状可以在与本披露的核酸分子相同的异源核酸分子上编码，或者可以在第二异源核酸分子上编码。另外的所希望的性状可赋予对第二昆虫有害生物的昆虫抗性、对相同昆虫有害生物的昆虫抗性、非生物胁迫耐受性、雄性不育、除草剂抗性、细菌疾病抗性、真菌疾病抗性、病毒疾病抗性、线虫抗性、改性脂肪酸代谢、改性碳水化合物代谢、改善的营养价值、工业过程中改善的性能或改变的繁殖能力。另外的所希望的性状还可诱导商业上有价值的酶或代谢物在植物内产生。
在一些实施例中，所希望的另外的性状是第二杀有害生物剂。第二杀有害生物剂可对任何植物有害生物(包括昆虫、线虫、真菌、病毒或细菌)具有活性。昆虫植物有害生物的实例包括但不限于：褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)(例如褐飞虱(N.lugens)(褐色飞虱(brown planthopper)))；灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)(例如灰飞虱(L.striatellus)(褐色小飞虱(small brown planthopper)))；黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)(例如二点黑尾叶蝉(N.virescens)或黑尾叶蝉(N.cincticeps)(青叶蝉(green leafhopper))，或二条黑尾叶蝉(N.nigropictus)(稻叶蝉(riceleafhopper)))；白背飞虱属物种(Sogatella spp.)(例如白背飞虱(S.furcifera，white-backed planthopper))；土长蝽属物种(Blissus spp.)(例如麦长蝽(B.leucopterus)(麦小蝽(chinch bug)))；黑蝽属物种(Scotinophora spp.)(例如稻黑蝽(S.vermidulate，rice blackbug))；拟缘蝽属物种(Acrosternum spp.)(例如拟绿蝽(A.hilare)(绿椿象(green stink bug)))；稻弄蝶属物种(Parnara spp.)(例如直纹稻弄蝶(P.guttata，riceskipper))；禾草螟属物种(Chilo spp.)(例如二化螟(C.suppressalis)(水稻二化螟(ricestriped stem borer))、台湾稻螟(C.auricilius)(金线二化螟(gold-fringed stemborer))、或稻多丽螟(C.polychrysus)(黑头茎螟(dark-headed stem borer)))；稻螟属物种(Chilotraea spp.)(例如稻多丽螟(C.polychrysa)(稻茎螟(rice stalk borer)))；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)(例如大螟(S.inferens)(粉红色稻螟(pink riceborer)))；蛀禾螟属物种(Tryporyza spp.)(例如稻白螟(T.innotata)(白稻螟(whiterice borer))、或三化螟(T.incertulas)(黄稻螟(yellow rice borer)))；稻纵卷叶螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)(例如稻纵卷叶螟(C.medinalis，rice leafroller))；潜蝇属物种(Agromyza spp.)(例如日本稻潜蝇(A.oryzae)(潜叶虫(leafminer)、或美洲黍潜叶蝇(A.parvicornis)(玉米污点斑潜蝇(corn blot leafminer)))；杆草螟属物种(例如小蔗螟(甘蔗蛀虫)、或西南玉米螟(D.grandiosella，southwestern corn borer)；Narnaga属物种(例如稻螟蛉(N.aenescens，green rice caterpillar))；黄夜蛾属物种(Xanthodes spp.)(例如犁纹黄夜蛾(X.transversa，green caterpillar))；灰翅夜蛾属物种(例如草地贪夜蛾(S.frugiperda)(秋夜蛾(fall armyworm))、甜菜夜蛾(S.exigua，beet armyworm)、海灰翅夜蛾(S.littoralis，climbing cutworm)或西部黄条粘虫(S.praefica，westernyellowstriped armyworm))；光腹夜蛾属物种(Mythimna spp.)(例如粘虫(Mythmnaseperata，Pseudaletia seperata))；铃夜蛾属物种(例如玉米穗虫(玉米穗蛾))；Colaspis属物种(例如葡萄肖叶甲(C.brunnea，grape colaspis))；稻水象属物种(Lissorhoptrusspp.)(例如稻水象虫(L.oryzophilus)(稻水象鼻虫(rice water weevil))；稻象甲属物种(Echinocnemus spp.)(例如稻鳞象虫(E.squamos)(稻象鼻虫(rice plant weevil)))；稻铁甲属物种(Diclodispa spp.)(例如水稻铁甲(D.armigera，rice hispa))；负泥虫属物种(Oulema spp.)(例如水稻负泥虫(O.oryzae(稻叶泥虫(leaf beetle)))；米象属物种(Sitophilus spp.)(例如米象(S.oryzae，rice weevil))；稻瘿蚊属物种(Pachydiplosisspp.)(例如稻瘿蚊(P.oryzae，rice gall midge))；毛眼水蝇属物种(Hydrellia spp.)(例如麦叶毛眼水蝇(H.griseola)(小米潜叶虫(small rice leafminer))、或稻茎毛眼水蝇(H.sasakii，rice stem maggot))；黄潜蝇属物种(Chlorops spp.)(例如秆蝇(C.oryzae，stem maggot))；根萤叶甲属物种(例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)；黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫)；玉米螟属物种(例如欧洲玉米螟(O.nubilalis，European corn borer)；地夜蛾属物种(例如小地老虎(黑色地老虎))；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)(例如，南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lessercornstalk borer))；梳爪叩头虫属物种(铁线虫)；圆头犀金龟属物种(Cyclocephalaspp.)(例如北方圆头犀金龟(C.borealis，northern masked chafer)或南方圆头犀金龟(C.immaculata，southern masked chafer))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)(例如日本甲虫(P.japonica，Japanese beetle))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)(例如玉米跳甲(C.pulicaria，corn flea beetle))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)(例如玉米谷象(S.maidis，maize billbug))；缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)(例如玉米蚜(R.maidis)(玉米叶蚜虫(corn leaf aphid))；圆尾蚜属物种(Anuraphis spp.)(例如玉米根蚜(A.maidiradicis，corn root aphid))；黑蝗属物种(Melanoplus spp.)(例如赤胫黑蝗(M.femurrubrum)(红胫蝗虫(redlegged grasshopper))、异黑蝗(M.differentialis，differential grasshopper)或血黑蝗(M.sanguinipes)(迁徙蝗虫(migratorygrasshopper))；种蝇属物种(Hylemya spp.)(例如玉米种蝇(H.platura，seedcornmaggot))；呆蓟马属物种(Anaphothrips spp.)(例如草蓟马(A.obscrurus，grassthrips))；水蚁属物种(Solenopsis spp.)(例如窃叶蚁(S.milesta，thief ant))；四爪螨属物种(Tetranychus spp.)(例如二斑叶螨(T.urticae，twospotted spider mite)、朱砂叶螨(T.cinnabarinus，carmine spider mite)；铃夜蛾属物种(例如玉米穗虫(棉螟蛉(cotton bollworm))、或棉铃虫(H.armigera)(美国螟蛉虫(American bollworm)))；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)(例如棉红铃虫(P.gossypiella，pink bollworm))；钻夜蛾属物种(Earias spp.)(例如翠纹钻夜蛾(E.vittella，spotted bollworm))；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)(例如烟芽夜蛾(H.virescens)(烟夜蛾(tobacco budworm)))；花象属物种(例如棉铃象甲(A.grandis)(棉铃象虫(boll weevil)))；Pseudatomoscelis属物种(例如棉跳盲蝽(P.seriatus，cotton fleahopper))；粉虱属物种(Trialeurodes spp.)(例如纹翅粉虱(T.abutiloneus)(结翅粉虱(banded-winged whitefly))、温室白粉虱(T.vaporariorum)(温室粉虱(greenhouse whitefly)))；小粉虱属物种(Bemisia spp.)(例如银叶粉虱(B.argentifolii)(银叶白粉虱(silverleaf whitefly))；蚜属物种(Aphisspp.)(例如棉蚜(A.gossypii)(棉花蚜虫(cotton aphid))；草盲蝽属物种(Lygus spp.)(例如牧草盲蝽(L.lineolaris)(无泽盲蝽(tarnished plant bug))或豆荚草盲蝽(L.hesperus)(西方无泽盲蝽(western tarnished plant bug)))；美洲蝽属物种(Euschistus spp.)(例如斑点美洲蝽(E.conspersus)(具散点的椿象(consperse stinkbug)))；Chlorochroa属物种(例如佐井氏蝽(C.sayi)(佐井氏椿象(Say stinkbug)))；绿蝽属物种(Nezara spp.)(例如稻绿蝽(N.viridula)(南方绿椿象(southern greenstinkbug)))；蓟马属物种(例如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips)))；花蓟马属物种(Frankliniella spp.)(例如烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))或西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower thrips))；叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)(例如马铃薯叶甲(L.decemlineata)(科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))、伪马铃薯叶甲(L.juncta)(伪马铃薯甲虫(false potatobeetle))或胡颓子叶茄叶甲(L.texana)(德克萨斯伪马铃薯甲虫(Texan false potatobeetle)))；Lema属物种(例如三线马铃薯甲虫(L.trilineata，three-lined potatobeetle))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)(例如马铃薯跳甲(E.cucumeris，potato fleabeetle)，烟草跳甲(E.hirtipennis)(跳甲(flea beetle))，或块茎跳甲(E.tuberis，tuberflea beetle))：豆芫菁属物种(例如横带芫青(E.vittata，striped blister beetle))；猿叶甲属物种(Phaedon spp.)(例如辣根猿叶甲(P.cochleariae)(芥菜叶甲虫(mustardleaf beetle)))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)(例如墨西哥豆瓢虫(E.varivetis)(墨西哥豆甲虫(mexican bean beetle)))；蟋蟀属物种(Acheta spp.)(例如家蟋蟀(A.domesticus)(室内蟋蟀(house cricket)))；小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)(例如马铃薯微叶蝉(E.fabae)(马铃薯微叶蝉(potato leafhopper)))；瘤蚜属物种(Myzus spp.)(例如桃蚜(M.persicae)(绿桃蚜(green peach aphid)))；木虱属物种(Paratrioza spp.)(例如考氏木虱(P.cockerelli)(木虱(psyllid)))；宽胸叩头虫属物种(Conoderus spp.)(例如南方马铃薯金针虫(C.falli，southern potato wireworm)或马铃薯金针虫(C.vespertinus，tobacco wireworm))；茄麦蛾属物种(例如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm))；长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)(例如马铃薯长管蚜(M.euphorbiae)(马铃薯蚜(potato aphid)))；Thyanta属物种(例如T.Pallidovirens(红肩椿象(redshouldered stinkbug)))；茄麦蛾属物种(例如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm))；铃夜蛾属物种(例如玉米穗虫(柿铃虫(tomato fruitworm)))；茄茎麦蛾属物种(例如番茄蠹蛾(番茄蛲虫))；Limonius属物种(Limonius spp.)(铁线虫)；天蛾属物种(Manduca spp.)，例如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)(例如美洲斑潜蝇(L.sativae)、三叶斑潜蝇(L.trifolli)或南美斑潜蝇(L.huidobrensis)(潜叶虫))；果蝇属物种(Drosophilla spp.)(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、D.yakuba、拟暗果蝇(D.Pseudoobscura)或拟果蝇(D.simulans))；林大步甲属物种(Carabus spp.)(例如粒步甲(C.granulatus))；摇蚊属物种(Chironomus spp.)(例如破伤风摇蚊(C.tentanus))；栉头蚤属物种(猫蚤(C.felis，cat flea))；Diaprepes属物种(例如根象甲(D.abbreviatus，root weevil))；Ips属物种(例如I.pini(pine engraver))；拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如赤拟谷盗(T.innotata，red floor beetle))；舌蝇属物种(Glossina spp.)(例如采采蝇(G.Morsitans，tsetse fly))；疟蚊属物种(Anophelesspp.)(例如冈比亚疟蚊(A.gambiae)(疟蚊(malaria mosquito)))；棉铃虫属物种(例如棉铃虫(H.armigera)(非洲螟蛉虫(African Bollworm))；无网管蚜属物种(Acyrthosiphonspp.)(例如豌豆蚜(A.pisum，pea aphid))；蚜属物种(Apis spp.)(例如意大利蜂(A.melifera)(蜜蜂))；叶蝉属物种(Homalodisca spp.)(例如琉璃叶蝉(H.coagulate)(玻璃翅叶蝉(glassy-winged sharpshooter)))；伊蚊属物种(Aedes spp.)(例如埃及伊蚊(Ae.aegypti)(黄热病伊蚊(yellow fever mosquito)))；蚕蛾属物种(Bombyx spp.)(例如家蚕(B.mori)(桑蚕(silkworm)))；飞蝗属物种(Locusta spp.)(例如非洲飞蝗(L.migratoria)(飞蝗(migratory locust)))；牛蜱属物种(Boophilus spp.)(例如微小牛蜱(B.microplus)(牛蜱(cattle tick)))；Acanthoscurria属物种(例如A.Gomesiana(红发巧克力色食鸟蛛(red-haired chololate bird eater)))；折翅属物种(Diploptera spp.)(例如太平洋折翅蠊(D.punctata，pacific beetle cockroach))；袖蝶属物种(Heliconiusspp.)(例如H.erato(红西番莲蝴(red passion flower butterfly))或红带袖蝶(H.melpomene)(邮差蝴蝶(postman butterfly)))；象虫属物种(Curculio spp.)(例如栎实象(C.glandium，acorn weevil))；菜蛾属物种(例如小菜蛾(P.xylostella，diamondbackmoth))；钝眼蜱属物种(Amblyomma spp.)(例如牛蜱(A.variegatum，cattle tick))；Anteraea属物种(例如天蚕(A.Yamamai)(柞蚕(silkmoth)))；和阿蚊属物种(Armigeresspp.)(例如骚扰阿蚊(A.subalbatus))。
本披露的RIP毒素可以与其他杀有害生物剂组合使用以增加有害生物的靶范围。此外，本披露的RIP毒素与第二杀昆虫剂(其具有不同的作用方式或靶向昆虫肠中不同的受体)相组合进行使用对于预防和/或管理昆虫抗性而言具有特定的功用。在一些实施例中，本披露的RIP毒素与选自下组的第二杀昆虫蛋白组合，该组由以下组成：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1B变体、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1D变体、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry46A、Cry51Aa1、PtIP-96、PtIP-83、PHI-4、MP467、MP81、PS149B1、DIG-3、DIG-5、DIG-10、DIG-11、DIG-17、DIG-657、IRDIG28688.1、IRDIG28688.1、IRDIG28684.1、IRDIG28682.1、IRDIG28680.1、IRDIG28674.1、IRDIG28672.1、IRDIG27642、IRDIG28688.1、IRDIG28686.1、IRDIG28684.1、IRDIG28682.1、IRDIG28680.1、IRDIG28674.1、IRDIG28672.1、IRDIG27642、IRDIG28678.2、IRDIG28678.1、IRDIG31125.1、IRDIG28696.1、IRDIG29781.1、IRDIG29779.1、IRDIG30844.1、IRDIG30850.1、IRDIG30852.1、IRDIG30854.1、IRDIG30856.1、IRDIG30858.1、IRDIG30862.1、IRDIG30860.1、IRDIG30848.1、RETIRE2021、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、二元VIP1和VIP2、或其他营养期杀昆虫蛋白、mCry3A、eCry3.1Ab、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、AXMI-036、AXMI-045、AXMI52、AXMI58、AXMI88、AXMI97、AXMI102、AXMI112、AXMI113、AXMI115、AXMI117、AXMI100、AXMI-115、AXMI-113、和AXMI-005、AXMI134、AXMI-150、AXMI171、AXMI-184、AXMI196、AXMI204、AXMI207、AXMI209、AXMI205、AXMI218、AXMI220、AXMI221z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z、AXMI238、AXMI270、AXMI279、AXMI345、AXMI-R1和其变体、IP3和其变体、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC836、TIC844、TIC853、TIC860或其变体、TIC867或其变体、TIC868或其变体、TIC869、TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1100、TIC1201、TIC1362、TIC1414、TIC1415、TIC1422、TIC1497、TIC1498、TIC1885、TIC1886、TIC1922、TIC1925、TIC1974、TIC2032、TIC2120、TIC2160、TIC3131、TIC3244、TIC6757、TIC7243、TIC7472、和TIC7473蛋白、或由任何前述杀昆虫蛋白制成的杂合蛋白或嵌合体。第二杀昆虫剂还可以是选自包含以下的组的药剂：α淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种(如嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)或伯氏致病杆菌(X.bovienii))杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种(如发光杆菌(P.luminescens)或P.asymobiotica)杀昆虫蛋白、短芽孢杆菌属物种(如侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporous))杀昆虫蛋白、赖氨酸芽孢杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)(如球形赖氨酸芽孢杆菌(L.Sphearicus))杀昆虫蛋白、色杆菌属物种(如C.subtsugae或C.piscinae)杀昆虫蛋白、耶尔森菌属物种(如噬虫霉耶尔森菌(Y.entomophaga))杀昆虫蛋白、类芽孢杆菌属物种(如丙型类芽孢杆菌(P.propylaea))杀昆虫蛋白、梭菌属物种(如双酶梭菌(C.bifermentans))杀昆虫蛋白和木质素。在其他实施例中，所述第二试剂可以是至少一种衍生自杀昆虫毒素复合物(Tc)(所述复合物来自发光杆菌属、异短杆菌属(Xenorhabus)、沙雷氏菌属或耶尔森菌属)的杀昆虫蛋白。在仍其他实施例中，第二杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌(如来自侧孢短芽孢杆菌的ISP1A和ISP2A或来自球形芽孢杆菌的BinA和BinB)的二元毒素。本披露的RIP和第二杀有害生物剂的组合可以通过两者在转基因植物中的表达。在一些实施例中，转基因植物是转基因玉米植物。在其他实施例中，转基因玉米植物中的组合是本披露的RIP和mCry3A和/或eCry3.1Ab和/或Cry3Bb1和/或Cry34/Cry35。
在一些实施例中，本披露的转基因植物可包含至少一种非蛋白的第二杀有害生物剂。在优选的实施例中，该第二杀有害生物剂是干扰RNA分子。干扰RNA分子典型地包含针对靶基因的至少一种RNA片段、间隔序列、和与第一RNA片段互补的第二RNA片段，从而可以形成双链RNA结构。当生物识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所得的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被称为小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)位于所述复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交，此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制(参见例如，公开物WO 2013/192256，其通过引用并入本文)。设计用于昆虫控制的干扰RNA产生非天然存在的双链RNA，其利用昆虫中的天然RNAi途径来触发靶基因的下调，这可能导致停止摄食和/或生长并可能导致昆虫有害生物死亡。干扰RNA分子可赋予针对与本披露的蛋白相同的靶标有害生物的昆虫抗性或可靶向不同的有害生物。靶标昆虫植物有害生物可以通过咀嚼、吸吮或刺穿来摄食。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制。在其他实施例中，干扰RNA可赋予针对非昆虫植物有害生物(如线虫有害生物或病毒有害生物)的抗性。
多于一种的杀有害生物剂在相同转基因植物中的共表达可以通过制造单一的重组载体(在一种所谓的分子堆积(molecular stack)中包含多于一种的杀有害生物剂的编码序列)并对植物进行遗传工程化以便在该转基因植物中含有并表达所有的杀有害生物剂而实现。此类分子叠加还可以通过使用微型染色体进行制备，如在例如美国专利7,235,716中所述的。可替代地，包含对第一杀有害生物剂进行编码的核酸的转基因植物可以用对第二有害生物剂等进行编码的不同的核酸进行再转化。可替代地，可以将植物(亲本1)遗传工程化，用于本披露的基因的表达。可以将第二植物(亲本2)遗传工程化，用于第二杀有害生物剂的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达被引入至亲本1和亲本2中的所有基因的子代植物。
包括本披露的杀昆虫蛋白的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如美国专利号5,849,320和5,876,739(通过引用并入本文)中所述的。在本披露的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子针对相同靶昆虫(例如鞘翅目有害生物或根萤叶甲属靶有害生物)具有活性的情况下，该组合(i)在用于进一步增强本披露的组合物针对该靶昆虫的活性的方法中以及(ii)在用于通过提供针对该靶昆虫的又另一种作用机制而防止对本披露的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，本披露提供了增强根萤叶甲属昆虫群体的控制的方法，该方法包括提供本披露的转基因植物或种子并且向该植物或该种子施用本披露的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。
即使在杀昆虫种子包衣针对不同昆虫具有活性的情况下，该杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将针对鳞翅目昆虫具有活性的杀昆虫种子包衣添加到本披露的转基因种子(在一些实施例中针对鞘翅目和一些鳞翅目具有活性)中，所产生的包被的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目有害生物两者。
此类杀昆虫剂和/或杀昆虫种子包衣的实例包括但不限于氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。在另一个实施例中，杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣选自由以下组成的组：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合。包含此类杀昆虫剂和杀昆虫种子包衣的商业产品包括但不限于
Figure BDA0003567056520000621
(克百威)、
Figure BDA0003567056520000622
(灭多虫、灭多威、纳乃得)、
Figure BDA0003567056520000623
(胺甲萘)、
Figure BDA0003567056520000624
(联苯菊酯)、
Figure BDA0003567056520000625
(七氟菊酯)、
Figure BDA0003567056520000626
(氯氰菊酯)、
Figure BDA0003567056520000627
(氯氰菊酯)、Delta
Figure BDA0003567056520000628
(溴氰菊酯)、
Figure BDA0003567056520000629
(λ-氯氟氰菊酯)、
Figure BDA00035670565200006210
(氯菊酯)、
Figure BDA00035670565200006211
(氯菊酯)、
Figure BDA00035670565200006212
(联苯菊酯)、
Figure BDA00035670565200006213
(联苯菊酯)、
Figure BDA00035670565200006214
(七氟菊酯))、
Figure BDA00035670565200006215
(λ氯氟氰菊酯)、
Figure BDA00035670565200006216
(毒死蜱)、
Figure BDA00035670565200006217
(氯氧磷)、
Figure BDA00035670565200006218
(灭克磷)、
Figure BDA00035670565200006219
(甲拌磷)、
Figure BDA00035670565200006220
(甲拌磷、氟氰戊菊酯(flucythinate))、
Figure BDA00035670565200006221
(甲拌磷)、
Figure BDA00035670565200006222
(特丁磷)、
Figure BDA00035670565200006223
(乐果)、异氯磷、
Figure BDA00035670565200006224
(氟虫腈))、
Figure BDA00035670565200006225
(噻虫嗪)、
Figure BDA00035670565200006226
(吡虫啉)、
Figure BDA00035670565200006227
(吡虫啉)、
Figure BDA00035670565200006228
(噻虫胺)和
Figure BDA00035670565200006229
(氟氯氰菊酯、嘧丙磷)。
在一些实施例中，本披露还涵盖一种组合物，其包含控昆虫有效量的本披露的杀昆虫蛋白。在进一步的实施例中，组合物包含合适的农业载剂和本披露的RIP。该农业载剂可包括有益于活性成分(如本披露的蛋白，包括包含以下、基本上由以下组成或由以下组成的蛋白：与SEQ ID NO:1-21中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的氨基酸序列)施用的佐剂、混合剂、增强剂等。合适的载剂不应对有价值的作物具有植物毒性(特别是在作物的存在下施用组合物时所用的浓度)，并且不应与本文的活性成分的化合物(即本披露的多肽或其他组合物成分)进行化学反应。此类混合物可以设计用于直接施用于作物，或者可以是浓缩物或配制品，其通常在施用前用另外的载剂和佐剂进行稀释。它们可以包括惰性或活性组分，并且可以是固体(如例如尘剂、粉剂、颗粒剂、水分散性颗粒剂或可湿性粉剂)或液体(例如可乳化浓缩物、溶液、乳剂或悬浮液)。合适的农业载剂可包括液体载剂，例如水、甲苯、二甲苯、石脑油、作物油、丙酮、甲基乙基酮、环己酮、三氯乙烯、全氯乙烯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、乙酸丁酯、丙二醇单甲醚和二乙二醇甲醚、甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、甘油等。水通常是用以稀释浓缩物的选用载剂。合适的固体载剂可包括滑石、叶腊石粘土、硅石、凹凸棒石粘土、砂藻土(kieselguhr)、白垩、硅藻土(diatomaxeous earth)、石灰、碳酸钙、膨润土、漂白土、棉子壳、小麦粉、大豆粉、浮石、木粉、核桃壳粉、木质素等。在其他实施例中，本披露的蛋白可以包封在合成基质(如聚合物)中，并施用于宿主(如植物)的表面。昆虫摄取宿主细胞允许将昆虫控制剂递送至昆虫并导致对昆虫有害生物的毒性作用。
在另外的实施例中，本披露的组合物可以是粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体或溶液。本披露的组合物可以通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩细菌细胞的培养物来制备。本披露的组合物可包含按重量计至少1％，约5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的本披露的多肽。本披露的组合物可包含至少第二杀有害生物剂(其可以是杀昆虫的、杀线虫的、杀真菌的、杀细菌的)。至少第二杀有害生物剂可以针对与本披露的多肽相同的昆虫或不同的昆虫具有杀昆虫作用。第二杀有害生物剂可以是多肽。杀有害生物剂可以是干扰RNA。第二杀有害生物剂可以是微生物(如细菌)，其包含编码杀有害生物剂的核酸分子和/或包含杀有害生物剂(如多肽或干扰RNA)。可对该微生物进行减毒、热灭活或冷冻干燥。微生物可能死亡或无法繁殖。第二杀有害生物剂可以是杀昆虫剂、例如克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos)、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺、及其组合，或含有如上所述的杀虫剂和杀虫种子包衣的商业产品。
本披露的组合物(例如包含本披露的蛋白和农业上可接受的载剂的组合物)可用于传统农业方法中。农业上可接受的载剂是可用于将包含本披露的多肽的组合物施用至植物或种子的配制品。例如，本披露的组合物可以与水和/或肥料混合，并且可以通过任何手段在出苗前和/或出苗后施用至所希望的场所，如飞机喷雾桶、灌溉设备、直接注射喷雾设备、背负式喷雾桶、家畜浸渍槽、在地面喷雾中使用的农场设备(例如，喷管式喷雾器、手动喷雾器)等。所希望的场所可以是土壤、植物等。
本披露的组合物可以在以下时间施用至处于任何生理状态下的种子或植物繁殖体：在种子收获和播种之间的任何时间；或在播种期间或播种后；和/或发芽后。优选种子或植物繁殖体处于足够耐用的状态，使得在处理过程期间不会造成损害或造成最小的损害，包括物理损害或生物损害。配制品可以使用常规的包衣技术以及机器(如流化床技术、滚筒研磨方法、静态转动(rotostatic)种子处理器和转鼓包衣器)施用至种子或植物繁殖体上。
在一些实施例中，本披露还包括控制鞘翅目有害生物群体的方法，所述方法包括使所述有害生物群体与控昆虫有效量的本披露的RIP接触，其中所述蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:1-21中的任一个至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。接触包括有害生物群体的成员摄食或摄取杀昆虫蛋白。所述杀昆虫蛋白可以并入昆虫膳食食物中，或者可以在昆虫群体然后摄取的植物组织中表达或存在。在另外的实施例中，控制鞘翅目有害生物群体包括通过使昆虫与控昆虫有效量的本披露的杀昆虫蛋白接触来杀死昆虫。
本披露进一步包含用于增加植物产量的方法，该方法包括在田地中生长已经在其基因组中稳定地并入本披露的表达盒的核酸分子的植物或其种子，并且其中所述田地被有害生物侵染，所述多肽针对该有害生物具有杀昆虫活性。
一旦将所希望的核酸转化至特定的植物物种中，它可以在那个物种中进行增殖或者使用传统的育种技术将其移至相同物种的其他品种中(特别是包括商品化的品种)。
在一些实施例中，本披露涵盖向玉米种植者提供控制玉米作物中根萤叶甲属昆虫有害生物群体的手段的方法，所述方法包括(a)向所述种植者出售或提供包含本披露的核酸分子、表达盒、载体或嵌合基因的转基因玉米种子；以及(b)向所述种植者宣传所述转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属有害生物群体的转基因玉米植物。
在一些实施例中，本披露还涵盖鉴定杀昆虫蛋白的方法，所述杀昆虫蛋白包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或具有100％序列同一性的核苷酸序列，所述方法包括以下步骤：(a)产生引物对，所述引物对将从核酸样品中扩增SEQ ID NO:22-25中任一个的多核苷酸或其互补序列，(b)从所述核酸样品中扩增直系同源多核苷酸，(c)鉴定直系同源多核苷酸的核苷酸序列，(d)产生由所述直系同源多核苷酸编码的蛋白，以及(e)确定步骤(d)的蛋白针对昆虫有害生物具有杀昆虫活性。
实例
本发明的实施例可以通过参考以下实例而被更好地理解。前述的和以下的本发明的实施例以及各种实施例的描述不是旨在限制权利要求，而是对其具有说明性。因此，应理解的是权利要求不旨在受限于这些实例的具体细节。本领域技术人员应理解的是本发明的其他实施例可以在不偏离本披露内容的精神和范围的情况下进行实践，本披露内容的范围是由所附权利要求限定的。本领域公认的重组DNA和分子克隆技术可以在以下文献中找到，例如J.Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第3版,Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约州]:Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社](2001)；T.J.Silhavy,M.L.Berman,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions[基因融合实验],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],Cold Spring Harbor[冷泉港],NY[纽约州](1984)和Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学实验手册],New York[纽约],John Wiley and Sons Inc.[约翰威利父子出版公司],(1988),Reiter等人,Methods inArabidopsis Research[拟南芥属研究方法],World Scientific Press[世界科学出版社](1992)，以及Schultz等人,Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册],Kluwer Academic Publishers[克鲁沃学术出版社](1998)。
实例1：鉴定来自根瘤菌科的编码杀昆虫蛋白的序列。
基于专有算法，在属于中华根瘤菌属、剑菌属、根瘤菌属及属于根瘤菌科的相关属的革兰氏阴性细菌的基因组中鉴定了编码本领域中描述为假设蛋白的蛋白的候选核苷酸序列。选择了四个候选序列用于针对昆虫有害生物的表达和测试。在阿里迪剑菌菌株(NCBI:txid1708715)(SEQ ID NO:22)、中华根瘤菌属物种GL28菌株(NCBI:txid1358418)(SEQ ID NO:23)、未分类的根瘤菌目细菌菌株(NCBI:txid1909294)(SEQ ID NO:24)和根瘤菌属物种菌株SPY-1(NCBI:txid2547961)(SEQ ID NO:25)的基因组中鉴定了四个候选核苷酸序列。产生每个候选编码序列的大肠杆菌(E.coli)密码子优化版本，分别为SEQ ID NO:26-29，并单独引入pET29a细菌表达载体，分别指定为pET29a-26、pET29a-27、pET29a-28和pET29a-29，以产生蛋白。将每个pET29a表达载体转化进入大肠杆菌BL21*(DE3)并且从异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导的培养物(在约18℃下过夜生产蛋白)制得裂解物。在饲料掺入生物测定实验中，检测了裂解物对西方玉米根虫(WCR)的杀昆虫活性。简言之，将大肠杆菌裂解物与等体积的加热的人造昆虫饲料(Bioserv公司，弗伦奇敦(Frenchtown)，新泽西州(NJ))在1.5mL离心管中混合，然后施用于小的培养皿中。在膳食-样品混合物冷却并固化后，向每个板中添加12只WCR幼虫。将板密封并且保持在就温度、光照以及相对湿度而言的环境实验室条件下。不含裂解物的缓冲液，来自大肠杆菌BL21*(DE3)培养物(含有空pET29a载体)的裂解物和单独的人工昆虫饲料作为阴性对照。获取侵染后4天和6天时的死亡率百分数和生长抑制观察，指定为s＝小型幼虫，m＝中型幼虫，并且l＝大型幼虫。
表1中显示的结果表明，来自大肠杆菌培养物的裂解物(其表达根瘤菌科细菌基因组中编码的蛋白)令人惊讶地具有针对根萤叶甲属昆虫有害生物的杀昆虫活性。这些根瘤菌科杀昆虫蛋白(RIP)被命名为Enf_adiCRW(RIP1Aa；SEQ ID NO:1)，其由pET29a-26载体表达；Sinorhiz_GL28CRW(RIP2Aa；SEQ ID NO:2)，其由pET29a-27载体表达；Rhizo_bactCRW(RIP3Aa；SEQ ID NO:3)，其由pET29a-28载体表达；和Rhiz_SPYCRW(RIP4Aa；SEQ ID NO:4)，其由pET29a-29载体表达。
表1：RIP针对WCR的杀昆虫活性
Figure BDA0003567056520000671
表2显示了针对WCR的活性RIP比对和序列同一性比较。对
Figure BDA0003567056520000672
(美国国立卫生研究院)基因序列数据库的
Figure BDA0003567056520000673
(美国国家医学图书馆)搜索表明，披露的RIP没有显著与任何其他序列相同。然而，本披露的RIP似乎具有细胞毒素结构域。Enf_adiCRW蛋白(RIP1Aa；SEQ ID NO:1)具有345个氨基酸，为38kDa，并包含从约40位氨基酸到约234位氨基酸的细胞毒素结构域。Sinorhiz_GL28CRW蛋白(RIP2Aa；SEQ ID NO:2)具有344个氨基酸，为37.7kDa，并包含从约39位氨基酸到约233位氨基酸的细胞毒素结构域。Rhizo_bactCRW蛋白(RIP3Aa；SEQ ID NO:3)具有351个氨基酸，为38.5kDa，并包含从约46位氨基酸到约240位氨基酸的细胞毒素结构域。Rhiz_SPYCRW蛋白(RIP4Aa；SEQ ID NO:4)具有347个氨基酸，为38.2kDa，并包含从约40位氨基酸到约234位氨基酸的细胞毒素结构域。已知其他细菌，例如苏云金芽孢杆菌会产生具有细胞毒素结构域的蛋白，这些蛋白主要对双翅目昆虫而不对鞘翅目昆虫，特别不对根萤叶甲属有害生物昆虫具有杀昆虫活性。然而，本披露的RIP的细胞毒素结构域似乎是独特的，并且不受理论的束缚，据信，本披露的RIP的这些独特的细胞毒素结构域是它们对抗鞘翅目昆虫害虫有害生物，特别是对抗根萤叶甲属有害生物的出人意料活性的原因。
表2.WCR-活性RIP的比对和同一性百分比比较。
Figure BDA0003567056520000681
Figure BDA0003567056520000691
在氨基酸下“.”表示相同的氨基酸
表3.RIP细胞毒素结构域的比对。
Figure BDA0003567056520000692
Figure BDA0003567056520000701
实例2.RIP对玉米根虫的效力。
为了确定本披露的RIP对西方玉米根虫(WCR；玉米根萤叶甲)的效力，在基本上如实例1中所述的饮食掺入测定中，在一定浓度范围内测试了包含本披露的RIP的裂解物对抗WCR幼虫。在每个浓度下测试了十二只新生幼虫。在第4天和第6天测定RIP2Aa的死亡率和生长百分比，在第3天和第6天测定RIP3Aa的死亡率和生长百分比。
如表4所示，即使在1:100稀释时，包含RIP2Aa(SEQ ID NO:2)的裂解物对WCR有效，在第6天产生至少25％的死亡率，相比之下对照处理中没有死亡率。RIP3Aa在1:64的最低浓度下是活性的，到第6天产生100％的死亡率。
表4.RIP裂解物对西方玉米根虫的效力。
Figure BDA0003567056520000702
Figure BDA0003567056520000711
RIP2Aa蛋白的杀昆虫特性被进一步表征。携带pET-rip2Aa的两升大肠杆菌BL21*(DE3)细胞在LB培养基中于37℃下生长。当O.D.达到0.8-1.0时将IPTG(1mM)添加到培养物中，然后将培养物移至18℃培养18小时。收获细胞沉淀，并将其重悬于含10％甘油的20mMTris(pH 8.5)中。使用弗氏压碎器裂解细胞；然后使裂解物在超速离心机中以100k x g旋转。收集上清液，然后过滤，然后将其加样到HiPrepQ阴离子交换柱上，将该HiPrepQ阴离子交换柱在含10％甘油的20mM Tris(pH 8.5)中预平衡。HiPrepQ柱有效地结合RIP2Aa；使用线性NaCl梯度从该柱洗脱蛋白。高盐缓冲液由20mM Tris(pH 8.5)、含10％甘油的0.5MNaCl组成。合并最纯的级分，然后将其浓缩至大约2mL。将RIP2Aa蛋白加样到已经在1X PBS中预平衡的Sephadex 200凝胶过滤柱上。通过SDS-PAGE分析来自Sephadex 200柱的级分的纯度(RIP2Aa(SEQ ID NO:2)具有37.7kDa的预测分子量)。合并最纯的级分，然后将其浓缩至约7mg/mL，然后储存在-80℃下。然后以基本上如以上描述的饮食掺入测定，将一系列浓度的纯的RIP2Aa蛋白针对12只WCR幼虫进行测试。如表5中所示，RIP2Aa对WCR有效；75μg/mL的RIP2Aa在第6天产生至少75％的死亡率。
表5.RIP2Aa针对西方玉米根虫的活性。
Figure BDA0003567056520000721
实例3.RIP变体的生物活性。
变体RIP是通过在天然RIP3Aa序列(SEQ ID NO:3)中进行单或双氨基酸取代而产生的。所制造的变体包括以下：I50残基改变为L(RIP3Aa-I150L；SEQ ID NO:5的Xaa50为L；SEQ ID NO:6)，I53残基改变为L(RIP3Aa-I53L；SEQ ID NO:5的Xaa53为L；SEQ ID NO:7)，I56残基改变为L(RIP3Aa-I56L；SEQ ID NO:5的Xaa56为L；SEQ ID NO:8)，A62残基改变为C或L(RIP3Aa-A62C或RIP3Aa-A62L；SEQ ID NO:5的Xaa62为C或L；SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10)，A64残基改变为C或L(RIP3Aa-A64C或RIP3Aa-A64L；SEQ ID NO:5的Xaa64为C或L；SEQID NO:11或SEQ ID NO:12)，I81残基改变为L(RIP3Aa-I81L；SEQ ID NO:5的Xaa81为L；SEQID NO:13)，I126残基改变为L(RIP3Aa-I126L；SEQ ID NO:5的Xaa126为L；SEQ ID NO:14)，I153残基改变为L(RIP3Aa-I153L；SEQ ID NO:5的Xaa153为L；SEQ ID NO:15)，I169残基改变为L(RIP3Aa-I169L；SEQ ID NO:5的Xaa169为L；SEQ ID NO:16)，I185残基改变为L(RIP3Aa-I185L；SEQ ID NO:5的Xaa185为L；SEQ ID NO:17)，I207残基改变为L(RIP3Aa-I207L；SEQ ID NO:5的Xaa207为L；SEQ ID NO:18)，I219残基改变为L(RIP3Aa-I219L；SEQID NO:5的Xaa219为L；SEQ ID NO:19)，并且I275残基改变为L(RIP3Aa-I275L；SEQ ID NO:5的Xaa275为L；SEQ ID NO:20)。
基本上如实例1中所述，在饮食掺入测定中针对新生WCR幼虫测试了每种变体。结果示于表6中。结果表明，在RIP中可以进行某些氨基酸取代，并且仍然保持对根萤叶甲属的杀昆虫活性。似乎确实存在延迟完全毒性的某些突变，表明这些位置在根瘤菌科杀昆虫蛋白的作用方式中可能很重要。
表6.变体RIP的杀昆虫活性。
Figure BDA0003567056520000731
实例4.用RIP编码序列转化玉蜀黍。
编码本披露的RIP1Aa、RIP2Aa、RIP3Aa、RIP4Aa或其变体的核苷酸序列，例如SEQID NO:1-5中的任一个，或玉蜀黍优化的核苷酸序列，例如可以如例如美国专利号6,051,760中所述产生的SEQ ID NO:42-45中的任一个，被转化到玉米中以控制玉米根虫。
构建了两个植物表达盒，以将RIP编码序列引入玉蜀黍。第一盒包含可操作地连接到rip编码序列的玉蜀黍泛素1(Ubi1)启动子，所述rip编码序列可操作地连接到玉蜀黍Ubi361终止子。第二盒包含可操作地连接到编码选择性标记磷酸甘露糖异构酶(PMI)的pmi编码序列的玉蜀黍Ubi1启动子，所述pmi编码序列可操作地连接到玉蜀黍Ubi1终止子。生成包含所述两个表达盒的重组植物转化二元载体，用于玉蜀黍转化实验。
使用标准分子生物学技术将所述二元载体转化到根癌农杆菌中。为了制备用于转化的农杆菌，将细胞在28℃和220rpm下在液体YPC培养基中培养过夜。
基本上如Negrotto等人,2000,Plant Cell Reports[植物细胞报告]19:798-803中所述进行未成熟玉蜀黍胚的农杆菌转化。对于这个实例，所有的培养基组分基本上如Negrotto等人(如上)所述。然而，本领域内已知的多种培养基组分可以被替代。
简言之，使包含二元载体植物转化载体的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在28℃下在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上生长2-4天。使大约0.8X 109个农杆菌悬浮于补充有100μM As的LS-inf培养基中(Negrotto等人，同上)。在这个培养基中对细菌预诱导30至60分钟。
将来自适合的基因型的未成熟胚从8-12天大的穗中切除到液体LS-inf+100μM As中。用新鲜的感染培养基漂洗这些胚。然后添加土壤杆菌溶液，并且将这些胚涡旋30秒并且允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在暗处培养两到三天。随后，将每皮氏板(petri plate)20与25个之间的胚转移到补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中，并且在28℃在黑暗中培养10天。
将产生胚性愈伤组织的未成熟胚转移至LSD1M0.5S培养基中。在这种培养基上对培养物进行持续大约6周的选择，具有大约3周的传代培养步骤。将存活的愈伤组织转移至补充有甘露糖的Reg1培养基中。之后在光照中(16小时光照/8小时黑暗方案)培养之后，将绿色组织转移至没有生长调节剂的Reg2培养基，孵育大约1至2周。将这些小植株转移至含有Reg3培养基的Magenta GA-7盒(马真塔公司(Magenta Corp)，芝加哥，伊利诺伊州)中并使其在光照中生长。
在转化、选择和再生后，使用
Figure BDA0003567056520000751
分析来测定植物中是否存在pmi基因和rip玉蜀黍密码子优化的编码序列。还测试了植物中是否存在载体骨架。将对载体骨架阴性并且包含来自二元载体的转基因的一个拷贝的植物转移到温室中，并测试其针对WCR的杀昆虫活性。
实例5.与第二杀昆虫剂组合的根瘤菌杀昆虫蛋白。
如实例2中所述纯化如上所述的本披露的RIP。制备针对必需靶标并已知具有杀昆虫活性的dsRNA。在非限制性实例中，dsRNA可靶向编码液泡ATP合酶、β-微管蛋白、26S蛋白体亚基p28蛋白、EF1α48D、肌钙蛋白I、跨膜四蛋白、网格蛋白重链、γ-外被体、β-外被体和/或保幼激素环氧化物水解酶的基因(PCT专利申请号PCT/US 17/044825；PCT/US 17/044831；PCT/US 17/044832；美国专利号7,812,219；各自通过引用并入本文)。在基本上如实例1所述进行的膳食掺入测定中测试dsRNA和纯化的蛋白针对WCR的功效。
实例6.在植物细胞中原位编辑基因组以生成经修饰的RIP。
以下实例说明了使用原位植物细胞基因组的基因组编辑，以将本文所述的突变(包括但不限于实例3中所述的突变)并入天然RIP(包括RIP3Aa(SEQ ID NO:3))的编码序列或并入已经修饰的RIP3Aa蛋白的编码序列。
定向基因组修饰(也称为基因组编辑)可用于在特定DNA序列中引入突变。这些基因组编辑技术，其包括锌指核酸酶(ZNF)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)，已成功施用至包括作物植物在内的50多种不同生物。参见，例如Belhaj,K.,等人,Plant Methods[植物方法]9,39(2013)；Jiang,W.,等人,Nucleic Acids Res[核酸研究],41,e188(2013))。用于基因组编辑的CRISPR/Cas系统基于Cas9核酸酶和指定靶多核苷酸序列的工程化单指导RNA(sgRNA)的瞬时表达。
Cas9是一种大的单体DNA核酸酶，其借助两个20个核苷酸(nt)的非编码RNA的复合物被引导至DNA靶序列：CRIPSR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，其功能上可作为单合成RNA嵌合体获得。Cas9蛋白含有两个与RuvC和HNH核酸酶同源的核酸酶结构域。HNH核酸酶结构域切割互补DNA链，而RuvC样结构域切割非互补链，因此，在靶DNA中引入钝的切口。
当Cas9和sgRNA在活的玉蜀黍细胞中瞬时表达时，在转基因玉蜀黍细胞中产生特异性靶DNA中的双链断裂(DSB)。通过非同源末端连接和同源定向DNA修复途径引入断裂位点处的突变。
通过使用在转基因玉蜀黍中表达Cas9核酸酶和sgRNA靶(针对rip3Aa或突变体rip3Aa序列进行了玉蜀黍密码子优化)的重组质粒，将特定突变(例如上述实例3中所述的突变)引入天然RIP3Aa杀昆虫蛋白(SEQ ID NO:3)或突变体RIP3Aa蛋白的编码序列。该方法的实施是通过根癌农杆菌的农杆菌浸润方法，该根癌农杆菌携带含有指定的目的靶序列的二元质粒。sgRNA与靶rip3Aa或突变体rip3Aa编码序列结合后，Cas9核酸酶对编码序列进行特异性切割，并在DNA修复过程中引入所需的一个或多个突变。因此，现在突变的rip3Aa编码序列将编码经修饰的变体RIP3Aa蛋白，例如实例3中描述的变体，例如，其中I50残基处的突变改变为L，则I53残基改变为L，I56残基改变为L，A62残基改变为C或L，A64残基改变为C或L，I81残基改变为L，I126残基改变为L，I153残基改变为L，I169残基改变为L，I185残基改变为L，I207残基改变为L，I219残基改变为L，I275残基改变为L，或其任意组合。
通过PCR和测序筛选包含基因组编辑的rip编码序列的植物细胞。诱导在rip或经修饰的rip编码序列中具有基因组编辑的突变的愈伤组织，以再生植物进行表型评估，评估表达的RIP对以下的杀昆虫活性：西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)，北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲食根亚种)和/或墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)。
实例8.测试RIP对鳞翅目有害生物的杀昆虫活性。
使包含rip1Aa(SEQ ID NO:21)的pET-6His-SUMO构建体表达经标记的RIP1Aa(SEQID NO:49)。将pET-6His-SUMO-rip1Aa构建体转化到大肠杆菌BL21*(DE3)中以用于蛋白生产。使用饮食叠加生物测定法测试了来自表达6his-SUMO-RIP1Aa的细菌培养物的裂解物对包括玉米穗蛾(CEW)、秋粘虫(FAW)和大豆尺蠖(SBL)在内的一组鳞翅目昆虫有害生物的生物活性。对于每个实验，使用来自BL21*细菌培养物的裂解物测试新生WCR幼虫，该细菌培养物含有编码SUMO-RIP1Aa(SEQ ID NO:1)的基因，该基因在N末端包含六组氨酸标签。阳性对照由暴露于表达Vip3蛋白的大肠杆菌BL21*裂解物的幼虫组成。将仅缓冲液和来自携带空pET29载体的BL21*(DE3)细菌培养物的裂解物用作阴性对照。在第7天评估死亡率。生物测定的结果表明，经标记的RIP1Aa对WCR有活性，但对任何测试的鳞翅目有害生物均无活性。
如上所述，还针对包括玉米穗蛾、欧洲玉米螟、黑地老虎和秋粘虫在内的鳞翅目有害生物测试了包含RIP2Aa(SEQ ID NO:2)的细菌裂解物。生物测定的结果表明，在所测试的浓度下，RIP2Aa对任何鳞翅目有害生物昆虫都没有杀昆虫活性。
应当理解的是，本文描述的实例和实施例仅是出于说明性的目的，并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。
在本说明书中提到的所有公开物和专利申请均指示本发明所属领域中的技术人员的技术水平。所有公开物和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开物或专利申请被明确地并单独地指示通过引用而并入。
序列表
<110> Syngenta Crop Protection AG
REYNOLDS, Clarance M.
<120> 杀昆虫蛋白
<130> 81942-US-REG-ORG-NAT-1
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 345
<212> PRT
<213> 阿里迪剑菌
<400> 1
Met Ala Asp Ile Leu Ala Pro Asp Glu Val Arg Leu Lys Asn Ile Ser
1 5 10 15
Ala Val Arg Arg Leu Arg Ser Arg Gly Gly Pro Phe Leu Phe Ile Gly
20 25 30
Ala Thr Ala Asp Val Ser Glu Gln Phe Gln Glu Ile Val Ala Ile Asp
35 40 45
Asn Ile Asp Tyr Leu Thr Gln Ala Val Gln Leu Thr Ala Leu Phe Asn
50 55 60
Gly Ala Ile Asn Asn Glu Thr Gly Arg Phe Glu Ser Asn Thr Ala Arg
65 70 75 80
Gln Leu Ile Ala Asp Phe Asn Ala Ser Leu Pro Glu Ser Asp Arg Ala
85 90 95
Tyr Lys Ile Gly Ile Phe Lys Ser Tyr Gln Thr Thr Leu Thr Gln Thr
100 105 110
His Ser Val Val Ser Gly Met Ile Asp Lys Ile Val Glu Ala Leu Lys
115 120 125
Gln Val Leu Gly Val Ala Leu Gly Thr Ser Thr Val Ala Gln Leu Thr
130 135 140
Ala Ala Val Thr Asp Ala Phe Thr Asp Leu Lys Ser Gln Glu Gly Asp
145 150 155 160
Ala Trp Ile Phe Trp Glu Lys Lys Thr Ala Glu Lys Thr Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Ser Ser Thr Gly Met Met Met
180 185 190
Phe Ala Met Pro Met Ser Leu Leu Ile Glu Val Asn Val Ser Tyr Glu
195 200 205
Lys Val Leu Trp Ile Thr Ile Asp Asp Thr Glu Thr Tyr Ser Val Thr
210 215 220
Leu Asp Thr Met Lys Val Gly Gln Ile Leu Phe Pro Pro Ser Pro Gly
225 230 235 240
Ser Ser Val Leu Arg Gln Ala Leu Ala Pro Pro Pro Arg Lys Ala Glu
245 250 255
Leu Gly Lys Glu Leu Glu Phe Ser Asp Ile Thr Asp Ile Gln Val Thr
260 265 270
Asn Trp Ser Lys Thr Lys Thr Phe Ala Thr Ala Lys His Gly Ser Tyr
275 280 285
Val Lys Glu Phe His Leu Glu Gln Val Met Ala Phe Gln Pro Glu Val
290 295 300
Leu His Pro Leu Gln Asp Glu Asp Lys Cys Leu Val Ser Phe Thr Arg
305 310 315 320
Ser Gly Glu Arg Lys Ser Val Gly Val Ile Leu Asn Gly Thr Leu Pro
325 330 335
Asp Gly Thr Leu Trp Phe Val Ser Gln
340 345
<210> 2
<211> 344
<212> PRT
<213> 中华根瘤菌属物种
<400> 2
Met Asn Glu Val Leu Arg Asn Ser Val Gly Gln His Ser His Ile Ser
1 5 10 15
Lys Arg Ala Leu Arg Pro Arg Ser Ser Pro Val Val Phe Ile Asn Thr
20 25 30
Thr Gln Glu Glu Ala Glu Gln Phe Gln Glu Ile Val Ala Ile Asp Asp
35 40 45
Ile Asp Tyr Leu Thr Gln Ala Ile Ala Leu Thr Ala Leu Phe Asn Gly
50 55 60
Ala Ile Asp Asn Thr Thr Gly Arg Phe Ile Pro Gly Lys Ala Arg Glu
65 70 75 80
Leu Ile Ala Asn Tyr Asn Glu Ser Leu Asp Ala Asn Ser Gln Pro Tyr
85 90 95
Lys Ile Gly Ile Phe Asn Thr His Gln Thr Thr Leu Thr Gln Gln Asn
100 105 110
Ser Ala Val Ser Ala Met Ile Ser Gln Ile Leu Glu Thr Leu Lys Arg
115 120 125
Val Met Gly Val Ala Leu Gly Ala Ser Ser Val Ala Gln Met Thr Ala
130 135 140
Ala Val Thr Asp Ala Phe Thr Asn Leu Asp Glu Gln Ser Gly Asp Ala
145 150 155 160
Trp Ile Phe Trp Glu Lys Lys Thr Ser Asn Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr
165 170 175
Ala Ile Leu Phe Ala Phe Gln Asp Ser Thr Thr Gly Lys Leu Met Phe
180 185 190
Ala Leu Pro Met Ser Leu Glu Ile Glu Val Asp Val Ser Tyr Glu Arg
195 200 205
Val Leu Phe Ile Thr Val Glu Asp Lys Glu Thr Tyr Ser Val Lys Leu
210 215 220
Asp Thr Met Lys Val Gly Gln Leu Leu Phe Pro Lys Ser Pro Gly Ala
225 230 235 240
Asn Ala Leu Gln Ser Ala Arg Arg Leu Gly Thr Arg Ser Gly Ser Ala
245 250 255
Asp Leu Leu Ala Glu Pro Arg Pro Ile Thr Asp Ile Val Val Thr Asn
260 265 270
Trp Ala Lys Thr Lys Thr Phe Ala Thr Ala Ala Thr Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Asn Asp His Pro Leu Val Gln Val Met Ala Ser Glu Pro Asn Val Val
290 295 300
Asn Pro Leu Tyr Asp Gly Asn Gln Tyr Leu Val Ser Phe Ala Leu Asp
305 310 315 320
Gly Val Arg Gln Thr Leu Gly Phe Leu Leu Asn Cys Thr Leu Pro Asp
325 330 335
Gly Glu Leu Trp Phe Val Ser Ile
340
<210> 3
<211> 351
<212> PRT
<213> 根瘤菌目物种
<400> 3
Met Lys Gln Gly Glu Ala Ala Met Asn Glu Val Leu Ala Asn Asn Ile
1 5 10 15
Gly Gln His Pro Gln Val Ser Arg Arg Ala Leu Arg Ser Pro Arg Ser
20 25 30
Pro Val Val Phe Ile Asn Thr Thr Ser Glu Glu Ala Glu Gln Phe Gln
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Glu Ile Val Ala Ile Asp Asp Ile Asp Tyr Leu Thr Gln Ala Val Ala
50 55 60
Leu Thr Ala Leu Phe Asn Gly Ala Ile Asp Asn Thr Thr Gly Arg Phe
65 70 75 80
Ile Pro Gly Arg Ala Arg Glu Leu Ile Ala Asn Tyr Asn Glu Ser Leu
85 90 95
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100 105 110
Thr Thr Leu Thr Gln Gln Asn Ser Ala Val Ser Ala Met Ile Asn Gln
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130 135 140
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145 150 155 160
Asn Glu Gln Ser Gly Asp Ala Trp Ile Phe Trp Glu Lys Lys Thr Ser
165 170 175
Asn Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Phe Gln Asp Ser
180 185 190
Ser Thr Gly Lys Leu Met Phe Ala Leu Pro Met Ser Leu Glu Ile Glu
195 200 205
Val Asp Val Ser Tyr Glu Arg Val Leu Phe Ile Thr Val Glu Asp Lys
210 215 220
Glu Thr Tyr Ser Val Lys Leu Asp Thr Met Lys Val Gly Gln Leu Leu
225 230 235 240
Phe Pro Lys Ser Pro Gly Ala Asn Ala Leu Gln Thr Val Arg Arg Leu
245 250 255
Arg Thr Arg Ser Gly Ser Ser Gly Leu Leu Thr Ala Pro Ser Pro Val
260 265 270
Thr Asn Ile Val Val Thr Asn Trp Ala Lys Thr Thr Thr Phe Ala Thr
275 280 285
Ser Ala Asn Gly Phe Tyr Thr Glu Asn His Pro Leu Val Gln Leu Met
290 295 300
Ala Val Gly Pro Thr Val Val Asn Pro Leu Tyr Asp Gly Asn Gln Tyr
305 310 315 320
Leu Val Ser Phe Asp Leu Asn Gly Gly Arg Gln Thr Arg Gly Leu Ile
325 330 335
Leu Asn Gly Thr Leu Pro Asp Gly Glu Leu Trp Phe Val Ser Met
340 345 350
<210> 4
<211> 347
<212> PRT
<213> 根瘤菌属物种
<400> 4
Met Asn Glu Ile Val Thr Asn Pro Ala Pro Ala His Ala Ser Arg Pro
1 5 10 15
Gln Leu Arg Ser Leu Thr Gly Lys Arg Ser Pro Ile Val Phe Leu Gln
20 25 30
Ala Ala Val Asp Gln Lys Glu Gln Tyr Gln Glu Ile Met Ala Leu Asp
35 40 45
Asp Ile Asp Tyr Val Thr Gln Ala Leu Gly Ile Gly Ala Leu Leu Asn
50 55 60
Gly Ala Ile Asp Thr Ala Thr Gly Arg Phe Asp Ala Gly Arg Ala Arg
65 70 75 80
Gln Leu Ile Val Asp Phe Asn Gln Ala Leu Pro Pro Ala Asp Ser Lys
85 90 95
Tyr Lys Leu Ala Ile Met Asn Ser Tyr Gln Ser Thr Val Ser Gln Glu
100 105 110
Asn Ser Val Val Ser Gly Met Ile Asp Lys Ile Leu Asp Val Leu Lys
115 120 125
Thr Ala Ile Gly Val Ala Leu Gly Gln Lys Ser Ile Asp Gln Ile Thr
130 135 140
Ala Ala Val Thr Asp Ala Phe Thr Asn Leu Lys Ser Gln Asp Gly Asp
145 150 155 160
Ala Trp Ile Phe Trp Gln Lys Arg Glu Ala His Lys Thr Val Tyr Ser
165 170 175
Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Val Gln Asp Glu Ser Thr Gly Arg Val Met
180 185 190
Leu Ala Phe Pro Met Ser Leu Glu Ile Glu Val Asn Val Glu Phe Glu
195 200 205
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210 215 220
Val Asp Ala Met Lys Ile Ala Gln Leu Leu Phe Pro Lys Ala Pro Gly
225 230 235 240
Ser Gln Thr Leu Gln Ser Ile Ala Ser Ala Pro Arg Leu Arg Gly Leu
245 250 255
Ala Asp Val Glu Tyr Gln Thr Arg Ala Ser Asp Ile Thr Asp Ile Thr
260 265 270
Val Thr Asn Trp Ser Gln Ser Thr Leu Phe Ala Arg Ala Ala Lys Gly
275 280 285
Ser Leu Val Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gln Ile Met Ala Phe Glu Pro
290 295 300
Ala Ile Asp Ile Pro Leu Glu Pro Glu Asn His Tyr Leu Val His Tyr
305 310 315 320
Lys Leu Asn Gly Glu Ala Lys Gln Ile Gly Met Ile Phe Asn Asp Tyr
325 330 335
Leu Pro Asp Ser Thr Leu Trp Phe Val Ser Arg
340 345
<210> 5
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 工程化的RIP3Aa变体.
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (50)..(50)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (53)..(53)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (56)..(56)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (62)..(62)
<223> X=A、C或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (64)..(64)
<223> X=A、C或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (81)..(81)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (126)..(126)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (153)..(153)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (169)..(169)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (185)..(185)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (207)..(207)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (219)..(219)
<223> X=I或L
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (275)..(275)
<223> X=I或L
<400> 5
Met Lys Gln Gly Glu Ala Ala Met Asn Glu Val Leu Ala Asn Asn Ile
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180 185 190
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210 215 220
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260 265 270
Thr Asn Xaa Val Val Thr Asn Trp Ala Lys Thr Thr Thr Phe Ala Thr
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Leu Val Ser Phe Asp Leu Asn Gly Gly Arg Gln Thr Arg Gly Leu Ile
325 330 335
Leu Asn Gly Thr Leu Pro Asp Gly Glu Leu Trp Phe Val Ser Met
340 345 350
<210> 6
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RIP3Aa- I50L
<400> 6
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1 5 10 15
Gly Gln His Pro Gln Val Ser Arg Arg Ala Leu Arg Ser Pro Arg Ser
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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165 170 175
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Ala Val Gly Pro Thr Val Val Asn Pro Leu Tyr Asp Gly Asn Gln Tyr
305 310 315 320
Leu Val Ser Phe Asp Leu Asn Gly Gly Arg Gln Thr Arg Gly Leu Ile
325 330 335
Leu Asn Gly Thr Leu Pro Asp Gly Glu Leu Trp Phe Val Ser Met
340 345 350
<210> 7
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RIP3Aa-I53L
<400> 7
Met Lys Gln Gly Glu Ala Ala Met Asn Glu Val Leu Ala Asn Asn Ile
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Gly Gln His Pro Gln Val Ser Arg Arg Ala Leu Arg Ser Pro Arg Ser
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Ile Leu Glu Thr Leu Lys Asn Val Met Gly Val Ala Leu Gly Thr Thr
130 135 140
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Asn Glu Gln Ser Gly Asp Ala Trp Ile Phe Trp Glu Lys Lys Thr Ser
165 170 175
Asn Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Phe Gln Asp Ser
180 185 190
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225 230 235 240
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260 265 270
Thr Asn Ile Val Val Thr Asn Trp Ala Lys Thr Thr Thr Phe Ala Thr
275 280 285
Ser Ala Asn Gly Phe Tyr Thr Glu Asn His Pro Leu Val Gln Leu Met
290 295 300
Ala Val Gly Pro Thr Val Val Asn Pro Leu Tyr Asp Gly Asn Gln Tyr
305 310 315 320
Leu Val Ser Phe Asp Leu Asn Gly Gly Arg Gln Thr Arg Gly Leu Ile
325 330 335
Leu Asn Gly Thr Leu Pro Asp Gly Glu Leu Trp Phe Val Ser Met
340 345 350
<210> 8
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RIP3Aa-I56L
<400> 8
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Gly Gln His Pro Gln Val Ser Arg Arg Ala Leu Arg Ser Pro Arg Ser
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65 70 75 80
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Leu Val Ser Phe Asp Leu Asn Gly Gly Arg Gln Thr Arg Gly Leu Ile
325 330 335
Leu Asn Gly Thr Leu Pro Asp Gly Glu Leu Trp Phe Val Ser Met
340 345 350
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<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RIP3Aa-A62C
<400> 9
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Gly Gln His Pro Gln Val Ser Arg Arg Ala Leu Arg Ser Pro Arg Ser
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Asn Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Phe Gln Asp Ser
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340 345 350
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<211> 351
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<213> 人工序列
<220>
<223> RIP3Aa-A62L
<400> 10
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340 345 350
<210> 12
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RIP3Aa-A64L
<400> 12
Met Lys Gln Gly Glu Ala Ala Met Asn Glu Val Leu Ala Asn Asn Ile
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130 135 140
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<220>
<223> SUMO-RIP1Aa
<220>
<221> 尚未归类的
<222> (1)..(119)
<223> SUMO标签
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<211> 1038
<212> DNA
<213> 阿里迪剑菌
<400> 22
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cttaggtctc gcggtggacc cttcctgttt attggtgcca cggcagacgt ctccgagcaa 120
tttcaagaaa ttgttgcaat cgataacatc gattatctca cccaggccgt tcagttaacg 180
gctctgttca atggtgccat taacaacgag accggaaggt tcgagtctaa tacagcacgc 240
cagctgatag cagatttcaa tgcgagtttg cctgaaagcg accgagcata caaaattggc 300
attttcaaaa gctaccaaac aacactcact cagacgcaca gcgtcgtctc cggcatgatc 360
gacaaaatcg ttgaggcgct gaaacaggtc ctcggcgtgg ctttgggcac gagcacggtt 420
gctcagctga ctgccgcagt cactgacgcg ttcacggatc tgaagtcgca ggagggcgac 480
gcatggattt tttgggagaa aaagaccgcg gaaaagacca catattccta cgctattctc 540
ttcgcgatcc aagacagcag cactggcatg atgatgttcg cgatgccgat gtctttgctg 600
atcgaggtga acgtcagcta tgagaaggtg ctgtggatta caattgatga cacagaaacc 660
tattccgtta cgctcgacac aatgaaggtc ggacaaatcc tgtttccacc gagtcccggt 720
tcgagtgtac tccggcaagc tctcgccccg ccgccccgca aagcggagct cggaaaggaa 780
ttggagtttt cagatatcac tgacatccag gtcacgaact ggtcgaagac aaagaccttt 840
gcaacggcaa agcacgggtc atatgtcaag gagttccatc ttgagcaggt gatggcgttt 900
caacccgaag ttcttcatcc cctccaggat gaagacaaat gccttgtgtc attcacacga 960
agcggtgagc gtaagagtgt gggagtcatt ctgaacggca cgttgccgga cggaacccta 1020
tggttcgtgt cgcaatag 1038
<210> 23
<211> 1035
<212> DNA
<213> 中华根瘤菌属物种
<400> 23
atgaatgaag tgctgaggaa ctccgttggg caacattctc acatctccaa gcgggctttg 60
cgcccgagaa gctcgcccgt cgtattcata aacaccactc aagaagaggc ggagcagttt 120
caggaaatcg tcgccatcga tgatatcgac tatctgaccc aggcgatcgc gttgacggcg 180
ctgtttaacg gcgccattga caatacaacc ggtcgcttca ttcccggcaa ggcccgcgag 240
ttgatcgcca actacaacga aagcctcgac gctaacagcc agccttacaa gatcggcatt 300
ttcaacaccc accagaccac gctgacccag caaaacagtg ctgtgtcggc gatgatcagc 360
cagattctcg aaaccttgaa gcgcgtgatg ggggtcgccc tcggcgcttc ttcggtcgcg 420
cagatgaccg cagcagtaac tgatgcgttc accaacctcg acgagcagtc gggggatgcc 480
tggatcttct gggaaaagaa gacgagcaac aagactacct acagctacgc gatccttttc 540
gcgtttcagg acagcacgac cgggaagctc atgtttgctc tgcccatgtc actggagatc 600
gaggtggacg tcagctacga gcgcgttctc ttcatcaccg tcgaagacaa ggaaacctat 660
tcggtcaaac tcgatacgat gaaggttggc cagcttctct tccccaagtc acctggtgcg 720
aacgcacttc aatcggcgcg ccggctcggt acgcgctcgg gcagcgccga tctgctggct 780
gaaccccgtc cgatcaccga catcgtcgtg acgaactggg caaaaacgaa gactttcgca 840
acggccgcaa ccggcctgta cactaacgat cacccgctcg ttcaggtgat ggcctcggaa 900
cccaatgtcg tcaatccgct gtacgacggc aaccagtacc tggtctcctt cgccctcgat 960
ggcgtacggc aaacactcgg gttccttctg aattgcacct tgcccgatgg tgaactgtgg 1020
ttcgtgtcga tctag 1035
<210> 24
<211> 1056
<212> DNA
<213> 根瘤菌目物种
<400> 24
atgaagcaag gagaagctgc aatgaatgaa gttctggcaa acaacattgg ccaacatcct 60
caggtatcca ggcgagcctt gcgttcgcca aggtcacccg tcgtattcat caacaccaca 120
tcggaagaag ctgaacagtt ccaggaaatc gtcgcgatcg atgacatcga ctatttgacc 180
caagcggtcg ctctgacggc attattcaat ggcgcgatcg acaatacgac cgggcgcttc 240
atccccggga gggctcgaga gctgattgcc aattacaatg aaagccttga tccggaaagc 300
cagcggtaca agatcggcat ctttaatacc catcaaacga cgctcactca gcaaaacagt 360
gccgtttccg caatgatcaa ccagatcctc gaaacgctga agaacgttat gggggtggcg 420
ctcggcacaa cttcggtcac ccagatgacc gctgcgataa ccgacgcttt caccaatctc 480
aatgagcagt caggcgacgc gtggatcttc tgggagaaaa agaccagcaa taagacgacc 540
tacagctacg cgatcctttt cgcgttccag gatagctcga ccgggaagct gatgttcgca 600
cttcccatgt cgttggaaat cgaagtcgac gtcagttacg aacgcgtcct cttcattaca 660
gtcgaagaca aggagaccta ttccgtgaag ctcgatacca tgaaggtcgg acagcttctc 720
tttccgaagt ctccgggcgc gaatgccctg cagacggtgc ggaggcttcg tacgcgttcg 780
gggagctccg gcttgctcac tgcgccgagt ccggtcacaa atatcgtcgt tacgaactgg 840
gcaaaaacga cgaccttcgc aacctccgca aatggttttt atacggagaa ccacccgcta 900
gttcagctga tggcggttgg ccccactgtg gtcaaccccc tgtacgacgg caaccagtac 960
ctggtctcct tcgatctcaa tggcggtcgg caaacacgcg gtctcatctt gaacggcacc 1020
ttgcctgatg gcgaactgtg gttcgtgtcg atgtag 1056
<210> 25
<211> 1044
<212> DNA
<213> 根瘤菌属物种
<400> 25
atgaatgaaa tcgtcaccaa tcccgcccca gcccatgctt cacgccctca gcttcgcagt 60
ctgaccggca aacgcagccc gattgtcttt cttcaggctg cggtcgacca gaaggagcag 120
taccaggaga tcatggcgct cgacgacatc gactatgtca cacaggcact cggtatcgga 180
gccttgctca atggcgccat cgacacggcg accggccgtt tcgatgcggg cagggcgcgc 240
cagctgatcg tcgatttcaa ccaggcgctg ccgccggccg acagcaaata caagctggcc 300
atcatgaaca gctaccagtc gaccgtatcg caagaaaact cggtcgtctc cggcatgatc 360
gacaagatcc tcgatgttct caagacggca atcggcgtgg cgctcggcca gaagtcgatc 420
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gcctggatct tctggcaaaa gcgggaggcc cataagaccg tgtattctta cgccatcctc 540
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tattcggtca aggtggatgc gatgaagatc gcccagctgc ttttccccaa ggcgccaggc 720
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gcctttgaac cagccatcga tattccgctc gaaccggaaa accattatct cgttcactac 960
aagctaaatg gggaggccaa gcagatcggg atgatcttca atgattatct ccctgacagc 1020
acactctggt tcgtcagccg ataa 1044
<210> 26
<211> 1038
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 26
atggccgaca tattagcgcc agacgaagtc agactgaaaa acatctccgc ggttcgcaga 60
cttagatcgc gcggcggccc ctttttgttt attggtgcga ccgccgatgt ttcggaacag 120
ttccaggaga tagtcgcaat agacaacatc gactatttga cccaggctgt gcaacttacc 180
gctttattca acggagctat caataatgaa actggacgtt ttgagagtaa taccgcgcgt 240
caattaatag ccgacttcaa tgcctcgtta cccgaatctg atcgtgccta taaaattggg 300
atattcaaat cataccagac aacactgact caaacacact cagtcgtctc cggcatgata 360
gacaaaattg tcgaagcatt aaagcaggtc ctgggtgtag ctttagggac gtcaactgtg 420
gcgcaattaa ccgcggccgt cacggatgcg ttcaccgact taaaatccca agagggggac 480
gcgtggattt tctgggagaa aaaaaccgcg gagaaaacta cttattccta cgctattctg 540
ttcgcgatcc aagacagctc tacaggcatg atgatgttcg caatgcctat gtcccttttg 600
atagaagtaa acgtatcata cgaaaaagtc ttgtggataa cgatagatga cactgagaca 660
tacagcgtca cattagacac tatgaaggta ggtcaaattt tatttcctcc ctccccaggc 720
tccagcgttt tgcggcaagc acttgcccca cctccccgta aagccgagct tggcaaagag 780
cttgagtttt cagacataac agatatacag gtgaccaact ggagtaaaac caagactttc 840
gcgaccgcca aacatggttc gtacgttaaa gagtttcatt tggagcaggt aatggccttc 900
cagcccgagg tattacatcc cttgcaagac gaggacaagt gtttagtctc attcacccgc 960
agcggagaac gcaagtcggt aggtgtcatc ttaaacggaa cgcttcccga tggcacgctg 1020
tggtttgtaa gccaataa 1038
<210> 27
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 27
atgaacgagg ttttacggaa ctcagtgggc caacattcgc acatctccaa acgggccctt 60
cggcctagat cgtcgcctgt ggtatttatc aacacaaccc aagaggaggc ggagcaattc 120
caggaaattg ttgcaatcga cgacatcgat tacttgaccc aggcaattgc tctgaccgct 180
ttattcaatg gggctatcga taataccact ggtcgcttta tcccaggcaa agctcgggaa 240
cttatagcca actacaacga atcgcttgat gctaacagtc aaccatataa aattggcata 300
tttaacacac accagaccac gcttactcaa caaaattcag cggttagtgc gatgattagc 360
cagattcttg agactcttaa gcgcgtaatg ggtgttgcgt tgggtgcatc aagtgtggcg 420
caaatgacag cggccgtaac cgacgcgttc acaaacctgg atgagcagtc gggcgatgct 480
tggatcttct gggagaagaa gacaagtaat aaaaccacct actcttacgc tatacttttc 540
gccttccaag acagcactac cggcaaattg atgttcgcct taccgatgtc cttagagatc 600
gaagtcgatg tgtcctatga acgcgttctt tttataacgg tggaggataa ggagacgtat 660
tcggttaaac ttgatacaat gaaggtgggg cagttactgt ttccaaagtc ccctggcgcg 720
aatgcgttac aaagtgcaag acgtttgggg actagaagtg gatccgcaga ccttttagcc 780
gagccacgtc cgataacgga catagtcgta actaattggg caaagacaaa gacatttgct 840
acagcggcga ctggcctgta cacaaatgac cacccgctgg tacaagtgat ggcatcggag 900
cctaatgtgg ttaatccgtt atatgacggc aatcagtatt tagtttcttt cgccttggac 960
ggtgtgcggc agacgcttgg cttcttatta aactgcacat taccagatgg tgagctttgg 1020
ttcgtcagta tataa 1035
<210> 28
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 28
atgaaacagg gagaggctgc gatgaacgaa gtattggcca acaatatcgg gcaacatcca 60
caggtatctc gccgtgcgtt gcgctcgccc cgcagccccg tggtgttcat taacacaaca 120
tccgaggaag ccgaacaatt tcaagagatc gttgcaatcg atgacattga ttatcttact 180
caggcagtgg ccctgacagc tttatttaac ggtgcaattg acaatactac tggtcgtttc 240
attccaggac gcgcacgtga attaattgct aattacaacg aatcattaga cccagaatcg 300
cagcgttaca agatcggaat ctttaatacc caccaaacga ccttgactca acaaaattcg 360
gctgtttccg cgatgattaa ccaaatttta gaaacactga agaatgtgat gggggtagct 420
ctggggacta cgtcggtcac gcagatgact gccgcaatca ccgatgcatt cactaacctg 480
aatgagcaat cgggggacgc ttggatcttt tgggaaaaaa agacctccaa taagacaaca 540
tattcctacg caatcttatt tgcttttcag gattcgtcaa caggtaaact gatgtttgca 600
ttgccaatgt cacttgaaat cgaggtagac gtatcatacg aacgtgtcct gtttattacg 660
gtcgaggaca aagaaactta ctcggtcaag cttgatacca tgaaagttgg ccagttgttg 720
ttcccgaaaa gtccgggggc aaatgctttg cagacagtgc gtcgcttgcg tacgcgctca 780
ggttcatcgg ggttgttgac ggccccgtca ccagtaacta atatcgttgt aacgaactgg 840
gctaagacga ccacatttgc gacctcggca aatgggtttt atacggaaaa tcatcccttg 900
gttcagttga tggcggttgg ccctacggtc gtaaaccccc tttacgacgg caaccagtac 960
ttagtgagct tcgacttgaa tggtggtcgc cagacacgcg ggcttatcct gaatgggacg 1020
cttccagacg gagagttgtg gtttgtctct atgtaa 1056
<210> 29
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 29
atgaatgaga ttgtaactaa tcctgctccg gctcacgcgt cacgcccgca actgcgcagt 60
ttgacgggga aacgtagtcc tattgttttt ttacaagccg ccgttgacca aaaagaacaa 120
tatcaggaga tcatggcttt ggatgacatc gattatgtta cgcaagcact ggggattggc 180
gcgttactga atggagcgat tgacaccgct acgggacgtt tcgatgccgg gcgcgcacgt 240
cagctgatcg ttgactttaa ccaagccttg cctcccgctg actcgaagta caaactggcg 300
attatgaact cttaccaatc gacagtgtca caagaaaact cagtggtgtc cggaatgatt 360
gacaaaatct tagatgtttt gaaaacggcg atcggggtag cattgggtca aaagtctatt 420
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gcgtggattt tctggcaaaa acgtgaggct cataaaacag tttatagcta cgcaattctt 540
ttcgccgttc aggatgaatc gaccggccgt gttatgttag catttccgat gtctcttgaa 600
attgaggtta atgtggagtt tgaaaaggtt ctgtggatca cggttaagga ctcacacaat 660
tactccgtca aagttgacgc tatgaaaatt gctcaattgc tgttccccaa ggcccccggt 720
tctcagactc ttcagtccat tgcgagcgcg cctcgtctgc gcggattagc cgacgttgaa 780
tatcagactc gcgcctcgga catcacagac atcacggtca cgaactggtc gcaaagcact 840
ttgttcgcgc gcgctgccaa gggaagtctg gttacagctg gatcgttaca acagatcatg 900
gcgttcgaac ctgccatcga catcccgctg gaaccagaga atcactatct ggtccattac 960
aaactgaatg gagaagcgaa acagatcgga atgatcttta acgattactt gccagacagc 1020
acgctgtggt ttgtgtctcg ttaa 1044
<210> 30
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 30
atgaaacagg gagaggctgc gatgaacgaa gtattggcca acaatatcgg gcaacatcca 60
caggtatctc gccgtgcgtt gcgctcgccc cgcagccccg tggtgttcat taacacaaca 120
tccgaggaag ccgaacaatt tcaagagctt gttgcaatcg atgacattga ttatcttact 180
caggcagtgg ccctgacagc tttatttaac ggtgcaattg acaatactac tggtcgtttc 240
attccaggac gcgcacgtga attaattgct aattacaacg aatcattaga cccagaatcg 300
cagcgttaca agatcggaat ctttaatacc caccaaacga ccttgactca acaaaattcg 360
gctgtttccg cgatgattaa ccaaatttta gaaacactga agaatgtgat gggggtagct 420
ctggggacta cgtcggtcac gcagatgact gccgcaatca ccgatgcatt cactaacctg 480
aatgagcaat cgggggacgc ttggatcttt tgggaaaaaa agacctccaa taagacaaca 540
tattcctacg caatcttatt tgcttttcag gattcgtcaa caggtaaact gatgtttgca 600
ttgccaatgt cacttgaaat cgaggtagac gtatcatacg aacgtgtcct gtttattacg 660
gtcgaggaca aagaaactta ctcggtcaag cttgatacca tgaaagttgg ccagttgttg 720
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cttccagacg gagagttgtg gtttgtctct atgtaa 1056
<210> 31
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 31
atgaaacagg gagaggctgc gatgaacgaa gtattggcca acaatatcgg gcaacatcca 60
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tccgaggaag ccgaacaatt tcaagagatc gttgcacttg atgacattga ttatcttact 180
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gctgtttccg cgatgattaa ccaaatttta gaaacactga agaatgtgat gggggtagct 420
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gctaagacga ccacatttgc gacctcggca aatgggtttt atacggaaaa tcatcccttg 900
gttcagttga tggcggttgg ccctacggtc gtaaaccccc tttacgacgg caaccagtac 960
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<210> 32
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 32
atgaaacagg gagaggctgc gatgaacgaa gtattggcca acaatatcgg gcaacatcca 60
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cagcgttaca agatcggaat ctttaatacc caccaaacga ccttgactca acaaaattcg 360
gctgtttccg cgatgattaa ccaaatttta gaaacactga agaatgtgat gggggtagct 420
ctggggacta cgtcggtcac gcagatgact gccgcaatca ccgatgcatt cactaacctg 480
aatgagcaat cgggggacgc ttggatcttt tgggaaaaaa agacctccaa taagacaaca 540
tattcctacg caatcttatt tgcttttcag gattcgtcaa caggtaaact gatgtttgca 600
ttgccaatgt cacttgaaat cgaggtagac gtatcatacg aacgtgtcct gtttattacg 660
gtcgaggaca aagaaactta ctcggtcaag cttgatacca tgaaagttgg ccagttgttg 720
ttcccgaaaa gtccgggggc aaatgctttg cagacagtgc gtcgcttgcg tacgcgctca 780
ggttcatcgg ggttgttgac ggccccgtca ccagtaacta atatcgttgt aacgaactgg 840
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cttccagacg gagagttgtg gtttgtctct atgtaa 1056
<210> 33
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 33
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cagcgttaca agatcggaat ctttaatacc caccaaacga ccttgactca acaaaattcg 360
gctgtttccg cgatgattaa ccaaatttta gaaacactga agaatgtgat gggggtagct 420
ctggggacta cgtcggtcac gcagatgact gccgcaatca ccgatgcatt cactaacctg 480
aatgagcaat cgggggacgc ttggatcttt tgggaaaaaa agacctccaa taagacaaca 540
tattcctacg caatcttatt tgcttttcag gattcgtcaa caggtaaact gatgtttgca 600
ttgccaatgt cacttgaaat cgaggtagac gtatcatacg aacgtgtcct gtttattacg 660
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ttcccgaaaa gtccgggggc aaatgctttg cagacagtgc gtcgcttgcg tacgcgctca 780
ggttcatcgg ggttgttgac ggccccgtca ccagtaacta atatcgttgt aacgaactgg 840
gctaagacga ccacatttgc gacctcggca aatgggtttt atacggaaaa tcatcccttg 900
gttcagttga tggcggttgg ccctacggtc gtaaaccccc tttacgacgg caaccagtac 960
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cttccagacg gagagttgtg gtttgtctct atgtaa 1056
<210> 34
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 34
atgaaacagg gagaggctgc gatgaacgaa gtattggcca acaatatcgg gcaacatcca 60
caggtatctc gccgtgcgtt gcgctcgccc cgcagccccg tggtgttcat taacacaaca 120
tccgaggaag ccgaacaatt tcaagagatc gttgcaatcg atgacattga ttatcttact 180
cagcttgtgg ccctgacagc tttatttaac ggtgcaattg acaatactac tggtcgtttc 240
attccaggac gcgcacgtga attaattgct aattacaacg aatcattaga cccagaatcg 300
cagcgttaca agatcggaat ctttaatacc caccaaacga ccttgactca acaaaattcg 360
gctgtttccg cgatgattaa ccaaatttta gaaacactga agaatgtgat gggggtagct 420
ctggggacta cgtcggtcac gcagatgact gccgcaatca ccgatgcatt cactaacctg 480
aatgagcaat cgggggacgc ttggatcttt tgggaaaaaa agacctccaa taagacaaca 540
tattcctacg caatcttatt tgcttttcag gattcgtcaa caggtaaact gatgtttgca 600
ttgccaatgt cacttgaaat cgaggtagac gtatcatacg aacgtgtcct gtttattacg 660
gtcgaggaca aagaaactta ctcggtcaag cttgatacca tgaaagttgg ccagttgttg 720
ttcccgaaaa gtccgggggc aaatgctttg cagacagtgc gtcgcttgcg tacgcgctca 780
ggttcatcgg ggttgttgac ggccccgtca ccagtaacta atatcgttgt aacgaactgg 840
gctaagacga ccacatttgc gacctcggca aatgggtttt atacggaaaa tcatcccttg 900
gttcagttga tggcggttgg ccctacggtc gtaaaccccc tttacgacgg caaccagtac 960
ttagtgagct tcgacttgaa tggtggtcgc cagacacgcg ggcttatcct gaatgggacg 1020
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<210> 35
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<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 35
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<210> 36
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 36
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<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 37
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<211> 1056
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<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
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<211> 1056
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<220>
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<400> 39
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<210> 40
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 40
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<210> 41
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 41
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cttccagacg gagagttgtg gtttgtctct atgtaa 1056
<210> 42
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 42
atgaaacagg gagaggctgc gatgaacgaa gtattggcca acaatatcgg gcaacatcca 60
caggtatctc gccgtgcgtt gcgctcgccc cgcagccccg tggtgttcat taacacaaca 120
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<210> 43
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 43
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<210> 44
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌密码子优化的
<400> 44
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tattcctacg caatcttatt tgcttttcag gattcgtcaa caggtaaact gatgtttgca 600
ttgccaatgt cacttgaaat cgaggtagac gtatcatacg aacgtgtcct gtttattacg 660
gtcgaggaca aagaaactta ctcggtcaag cttgatacca tgaaagttgg ccagttgttg 720
ttcccgaaaa gtccgggggc aaatgctttg cagacagtgc gtcgcttgcg tacgcgctca 780
ggttcatcgg ggttgttgac ggccccgtca ccagtaacta atcttgttgt aacgaactgg 840
gctaagacga ccacatttgc gacctcggca aatgggtttt atacggaaaa tcatcccttg 900
gttcagttga tggcggttgg ccctacggtc gtaaaccccc tttacgacgg caaccagtac 960
ttagtgagct tcgacttgaa tggtggtcgc cagacacgcg ggcttatcct gaatgggacg 1020
cttccagacg gagagttgtg gtttgtctct atgtaa 1056
<210> 45
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SUMO-rip1Aa
<220>
<221> 尚未归类的
<222> (1)..(357)
<223> SUMO标签
<400> 45
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac ggcagcggcc tggtgccgcg cggcagcgct 60
agcatgtcgg actcagaagt caatcaagaa gctaagccag aggtcaagcc agaagtcaag 120
cctgagactc acatcaattt aaaggtgtcc gatggatctt cagagatctt cttcaagatc 180
aaaaagacca ctcctttaag aaggctgatg gaagcgttcg ctaaaagaca gggtaaggaa 240
atggactcct taagattctt gtacgacggt attagaattc aagctgatca gacccctgaa 300
gatttggaca tggaggataa cgatattatt gaggctcaca gagaacagat tggtggtatg 360
gccgacatat tagcgccaga cgaagtcaga ctgaaaaaca tctccgcggt tcgcagactt 420
agatcgcgcg gcggcccctt tttgtttatt ggtgcgaccg ccgatgtttc ggaacagttc 480
caggagatag tcgcaataga caacatcgac tatttgaccc aggctgtgca acttaccgct 540
ttattcaacg gagctatcaa taatgaaact ggacgttttg agagtaatac cgcgcgtcaa 600
ttaatagccg acttcaatgc ctcgttaccc gaatctgatc gtgcctataa aattgggata 660
ttcaaatcat accagacaac actgactcaa acacactcag tcgtctccgg catgatagac 720
aaaattgtcg aagcattaaa gcaggtcctg ggtgtagctt tagggacgtc aactgtggcg 780
caattaaccg cggccgtcac ggatgcgttc accgacttaa aatcccaaga gggggacgcg 840
tggattttct gggagaaaaa aaccgcggag aaaactactt attcctacgc tattctgttc 900
gcgatccaag acagctctac aggcatgatg atgttcgcaa tgcctatgtc ccttttgata 960
gaagtaaacg tatcatacga aaaagtcttg tggataacga tagatgacac tgagacatac 1020
agcgtcacat tagacactat gaaggtaggt caaattttat ttcctccctc cccaggctcc 1080
agcgttttgc ggcaagcact tgccccacct ccccgtaaag ccgagcttgg caaagagctt 1140
gagttttcag acataacaga tatacaggtg accaactgga gtaaaaccaa gactttcgcg 1200
accgccaaac atggttcgta cgttaaagag tttcatttgg agcaggtaat ggccttccag 1260
cccgaggtat tacatccctt gcaagacgag gacaagtgtt tagtctcatt cacccgcagc 1320
ggagaacgca agtcggtagg tgtcatctta aacggaacgc ttcccgatgg cacgctgtgg 1380
tttgtaagcc aataa 1395
<210> 46
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的rip1Aa
<400> 46
atggctgaca tactcgcccc ggacgaggtg cggctgaaaa atatatccgc tgttaggcgt 60
ttgaggagca ggggagggcc ttttttgttc atcggcgcga ccgctgacgt gtctgagcag 120
tttcaagaga tagtggctat agacaacatc gactacctca cgcaggccgt ccagttgacc 180
gccctgttca acggcgcgat taacaacgag acgggccgtt tcgagtcgaa taccgccaga 240
cagctgatcg cggacttcaa tgcctccctg cccgagagtg acagagctta caagatcggc 300
atcttcaagt cttaccaaac tacactcact cagacgcata gcgttgtgtc cgggatgatc 360
gacaagatag tggaagcgct taaacaggtt ctgggggtgg ccctcggcac tagtacggtg 420
gctcagctca ccgccgccgt cacagacgct ttcacggacc tcaagagcca agagggggat 480
gcgtggattt tctgggagaa gaagactgcc gagaagacca catactcata cgccatcctg 540
ttcgctattc aagactcctc aactggcatg atgatgttcg caatgccgat gtctctcctg 600
attgaggtta atgtgtcata cgaaaaggtt ctctggatca ctatcgacga taccgagacc 660
tactctgtta ctctcgacac gatgaaggtg ggacagatac tcttccctcc gtcgcctggg 720
tcttccgtgc tgaggcaagc cctcgcgccc ccgccacgta aggccgagct gggcaaagag 780
cttgagttct cagatatcac ggacatccag gttaccaact ggagtaagac gaagaccttc 840
gctactgcta agcacggatc ttatgtcaag gagttccacc tcgagcaggt tatggctttt 900
caaccagagg ttctgcaccc ccttcaagat gaagacaaat gcctggtctc ttttacgcgg 960
tcgggcgagc ggaagagtgt cggggtgatc ctgaatggta cccttccaga cggtacgctc 1020
tggtttgtta gccag 1035
<210> 47
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的RIP2Aa
<400> 47
atgaacgaag ttctcaggaa ctctgtcggc cagcactcgc atattagcaa gagggccctc 60
cggcccagaa gtagcccggt tgttttcata aatacgacgc aagaggaagc cgagcaattc 120
caagagatcg tcgctatcga tgacattgat taccttacgc aggcgatcgc tctcactgct 180
ctgttcaacg gtgctataga caacacgacg gggaggttta tccctgggaa ggcccgcgag 240
ctcatagcga attataacga gtccctcgat gcgaactcgc agccttacaa gatcggtata 300
ttcaacaccc accagacgac gctgacccag caaaattctg cagtctcagc catgatcagc 360
cagatccttg agaccctcaa gcgcgtcatg ggtgtcgcac tgggggcctc atcggtggct 420
caaatgaccg ctgctgtgac cgatgcgttt actaatctcg acgagcagtc aggcgacgcc 480
tggatcttct gggagaagaa gacctctaat aagaccacct actcttatgc catcctcttc 540
gcatttcaag acagtacgac ggggaaattg atgtttgcac tcccgatgtc gctcgaaatt 600
gaggtcgacg tcagctacga acgtgttctg ttcattacag tggaggataa ggagacatac 660
tcagtgaagc tggacaccat gaaggtgggt cagcttttgt tcccgaagtc tcctggggct 720
aatgcgctcc aaagcgcccg gcgcctgggc actcggagtg gcagcgccga cttgctggcc 780
gaaccgcgcc ccataaccga tatcgtggtg accaactggg ccaagacgaa aacattcgct 840
actgcagcta ccggacttta cacaaacgac cacccgctcg ttcaggtcat ggcaagtgag 900
cccaatgtcg ttaacccgtt gtatgacggc aaccagtatt tggtgagctt tgcactcgac 960
ggggtgcggc agacgttggg ctttttgctc aactgcaccc tccccgacgg ggagttgtgg 1020
ttcgtttcta tt 1032
<210> 48
<211> 1053
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的RIP3Aa
<400> 48
atgaagcagg gtgaggcagc catgaacgaa gttcttgcaa acaacatagg acagcacccc 60
caagtgtccc gccgggcgtt gagatcacca aggagccctg ttgtgttcat aaacacgacc 120
tccgaggagg cggagcaatt ccaggagatc gttgctattg acgacataga ctacctcacc 180
caggcggtcg ctttgacagc gctgtttaac ggcgccatcg ataacaccac cgggcggttc 240
atcccgggaa gggcgagaga gctgatcgcc aactacaatg agtcgttgga cccggaatct 300
cagagatata aaatcggaat ctttaatacc caccagacta ccctgaccca gcaaaattct 360
gcagtgagcg ccatgattaa tcaaattctc gagacactga agaatgtgat gggtgtggca 420
cttggaacca cgtccgtgac tcagatgaca gccgcgataa ccgatgcgtt caccaacctg 480
aacgagcaga gtggtgatgc ttggattttc tgggagaaga agacctctaa caagaccacg 540
tactcttacg ccatcctgtt tgcttttcag gactccagca ccggcaagct gatgttcgcc 600
ctgccaatgt ctcttgagat tgaggtggat gtctcctacg agagggtgct cttcatcacg 660
gtggaggaca aagagacata ctctgtgaag ctggatacga tgaaagtggg gcagctgttg 720
ttcccaaagt ctcccggggc aaatgcactc cagacagtca gaaggctcag gactaggtcg 780
ggtagctcgg gtttgctcac tgcccctagc cctgtgacaa atatcgttgt cacaaactgg 840
gccaagacca ctaccttcgc gacatcggcg aatggattct acacggagaa tcatccgctt 900
gtccagctca tggctgtggg cccgaccgtt gtgaaccccc tttatgatgg aaatcaatat 960
ctggtgtcat ttgacctcaa cggtggccgg cagacgcgtg gccttatcct gaacggcact 1020
cttcccgacg gtgagctgtg gtttgtctct atg 1053
<210> 49
<211> 1041
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 玉蜀黍优化的RIP4Aa
<400> 49
atgaatgaga ttgtgacgaa tcccgctcct gctcacgcca gtagacccca actccggtcg 60
cttacgggta agaggtcccc tatcgtgttt ctccaggcgg cagtcgacca gaaagagcaa 120
taccaggaga ttatggcgct ggacgacata gattatgtga ctcaggcgct ggggatcggc 180
gctcttttga atggagctat cgacacggcg acaggtagat tcgatgctgg ccgcgcacgg 240
caactcatag tcgattttaa tcaggcgctg cctcctgctg acagcaagta caagttggcg 300
atcatgaatt cttaccagtc gacagtgtcg caagagaaca gcgttgtgag cggtatgatt 360
gataagatcc tcgatgtcct gaagaccgca attggtgttg cgttgggaca gaagtcaata 420
gaccaaatta cggcagcggt gactgatgcc ttcacgaacc tcaaaagtca agacggcgat 480
gcgtggatct tttggcagaa aagggaggca cataaaaccg tgtactccta cgcgatactc 540
tttgctgttc aagatgagtc cacgggacgc gtgatgctgg cgttccctat gagcctggag 600
atcgaagtga acgtggagtt cgagaaggtc ctttggatca cggttaagga ttcacataac 660
tattcagtta aggtggacgc catgaaaatc gctcagcttt tgttccctaa agctccgggt 720
agtcagactc ttcaaagcat agcatcagct cctcgcctca gaggccttgc agacgttgag 780
taccagacca gagccagtga tatcacagac ataaccgtca cgaactggag ccagtctacg 840
ctgtttgcta gagctgctaa ggggtcactg gtgacagccg gctcgctcca acaaattatg 900
gctttcgagc ccgccatcga tatcccactt gaacccgaga atcactacct ggtgcactac 960
aagttgaacg gtgaggccaa gcaaatcggg atgattttca atgactatct gccggactcg 1020
acgctttggt ttgtttcgag a 1041
<210> 50
<211> 195
<212> PRT
<213> 阿里迪剑菌
<400> 50
Gln Phe Gln Glu Ile Val Ala Ile Asp Asn Ile Asp Tyr Leu Thr Gln
1 5 10 15
Ala Val Gln Leu Thr Ala Leu Phe Asn Gly Ala Ile Asn Asn Glu Thr
20 25 30
Gly Arg Phe Glu Ser Asn Thr Ala Arg Gln Leu Ile Ala Asp Phe Asn
35 40 45
Ala Ser Leu Pro Glu Ser Asp Arg Ala Tyr Lys Ile Gly Ile Phe Lys
50 55 60
Ser Tyr Gln Thr Thr Leu Thr Gln Thr His Ser Val Val Ser Gly Met
65 70 75 80
Ile Asp Lys Ile Val Glu Ala Leu Lys Gln Val Leu Gly Val Ala Leu
85 90 95
Gly Thr Ser Thr Val Ala Gln Leu Thr Ala Ala Val Thr Asp Ala Phe
100 105 110
Thr Asp Leu Lys Ser Gln Glu Gly Asp Ala Trp Ile Phe Trp Glu Lys
115 120 125
Lys Thr Ala Glu Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Ile
130 135 140
Gln Asp Ser Ser Thr Gly Met Met Met Phe Ala Met Pro Met Ser Leu
145 150 155 160
Leu Ile Glu Val Asn Val Ser Tyr Glu Lys Val Leu Trp Ile Thr Ile
165 170 175
Asp Asp Thr Glu Thr Tyr Ser Val Thr Leu Asp Thr Met Lys Val Gly
180 185 190
Gln Ile Leu
195
<210> 51
<211> 195
<212> PRT
<213> 中华根瘤菌属物种
<400> 51
Phe Gln Glu Ile Val Ala Ile Asp Asp Ile Asp Tyr Leu Thr Gln Ala
1 5 10 15
Ile Ala Leu Thr Ala Leu Phe Asn Gly Ala Ile Asp Asn Thr Thr Gly
20 25 30
Arg Phe Ile Pro Gly Lys Ala Arg Glu Leu Ile Ala Asn Tyr Asn Glu
35 40 45
Ser Leu Asp Ala Asn Ser Gln Pro Tyr Lys Ile Gly Ile Phe Asn Thr
50 55 60
His Gln Thr Thr Leu Thr Gln Gln Asn Ser Ala Val Ser Ala Met Ile
65 70 75 80
Ser Gln Ile Leu Glu Thr Leu Lys Arg Val Met Gly Val Ala Leu Gly
85 90 95
Ala Ser Ser Val Ala Gln Met Thr Ala Ala Val Thr Asp Ala Phe Thr
100 105 110
Asn Leu Asp Glu Gln Ser Gly Asp Ala Trp Ile Phe Trp Glu Lys Lys
115 120 125
Thr Ser Asn Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Phe Gln
130 135 140
Asp Ser Thr Thr Gly Lys Leu Met Phe Ala Leu Pro Met Ser Leu Glu
145 150 155 160
Ile Glu Val Asp Val Ser Tyr Glu Arg Val Leu Phe Ile Thr Val Glu
165 170 175
Asp Lys Glu Thr Tyr Ser Val Lys Leu Asp Thr Met Lys Val Gly Gln
180 185 190
Leu Leu Phe
195
<210> 52
<211> 195
<212> PRT
<213> 根瘤菌目物种
<400> 52
Gln Phe Gln Glu Ile Val Ala Ile Asp Asp Ile Asp Tyr Leu Thr Gln
1 5 10 15
Ala Val Ala Leu Thr Ala Leu Phe Asn Gly Ala Ile Asp Asn Thr Thr
20 25 30
Gly Arg Phe Ile Pro Gly Arg Ala Arg Glu Leu Ile Ala Asn Tyr Asn
35 40 45
Glu Ser Leu Asp Pro Glu Ser Gln Arg Tyr Lys Ile Gly Ile Phe Asn
50 55 60
Thr His Gln Thr Thr Leu Thr Gln Gln Asn Ser Ala Val Ser Ala Met
65 70 75 80
Ile Asn Gln Ile Leu Glu Thr Leu Lys Asn Val Met Gly Val Ala Leu
85 90 95
Gly Thr Thr Ser Val Thr Gln Met Thr Ala Ala Ile Thr Asp Ala Phe
100 105 110
Thr Asn Leu Asn Glu Gln Ser Gly Asp Ala Trp Ile Phe Trp Glu Lys
115 120 125
Lys Thr Ser Asn Lys Thr Thr Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Phe
130 135 140
Gln Asp Ser Ser Thr Gly Lys Leu Met Phe Ala Leu Pro Met Ser Leu
145 150 155 160
Glu Ile Glu Val Asp Val Ser Tyr Glu Arg Val Leu Phe Ile Thr Val
165 170 175
Glu Asp Lys Glu Thr Tyr Ser Val Lys Leu Asp Thr Met Lys Val Gly
180 185 190
Gln Leu Leu
195
<210> 53
<211> 195
<212> PRT
<213> 根瘤菌属物种
<400> 53
Gln Tyr Gln Glu Ile Met Ala Leu Asp Asp Ile Asp Tyr Val Thr Gln
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ile Gly Ala Leu Leu Asn Gly Ala Ile Asp Thr Ala Thr
20 25 30
Gly Arg Phe Asp Ala Gly Arg Ala Arg Gln Leu Ile Val Asp Phe Asn
35 40 45
Gln Ala Leu Pro Pro Ala Asp Ser Lys Tyr Lys Leu Ala Ile Met Asn
50 55 60
Ser Tyr Gln Ser Thr Val Ser Gln Glu Asn Ser Val Val Ser Gly Met
65 70 75 80
Ile Asp Lys Ile Leu Asp Val Leu Lys Thr Ala Ile Gly Val Ala Leu
85 90 95
Gly Gln Lys Ser Ile Asp Gln Ile Thr Ala Ala Val Thr Asp Ala Phe
100 105 110
Thr Asn Leu Lys Ser Gln Asp Gly Asp Ala Trp Ile Phe Trp Gln Lys
115 120 125
Arg Glu Ala His Lys Thr Val Tyr Ser Tyr Ala Ile Leu Phe Ala Val
130 135 140
Gln Asp Glu Ser Thr Gly Arg Val Met Leu Ala Phe Pro Met Ser Leu
145 150 155 160
Glu Ile Glu Val Asn Val Glu Phe Glu Lys Val Leu Trp Ile Thr Val
165 170 175
Lys Asp Ser His Asn Tyr Ser Val Lys Val Asp Ala Met Lys Ile Ala
180 185 190
Gln Leu Leu
195

Claims (56)

1.一种核酸分子，其包含编码对昆虫有害生物有毒的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列(a)编码包含与SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白；或(b)与SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列同一性；或者(c)是(a)或(b)的合成序列，所述合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述杀昆虫蛋白包含SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒性片段的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:22-49中的任一个或其毒素编码片段。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述合成核苷酸序列包含SEQ ID NO:26-49中的任一个或其毒素编码片段。
5.一种嵌合基因，其包含可操作地连接至如权利要求1-4中任一项所述的核酸分子的异源启动子。
6.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。
7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述植物可表达型启动子选自由以下组成的启动子的组：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、稻肌动蛋白、稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
8.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。
9.如权利要求8所述的嵌合基因，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。
10.如权利要求9所述的嵌合基因，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。
11.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述转基因生物是细菌或植物。
12.如权利要求11所述的嵌合基因，其中所述转基因细菌选自由以下组成的属的组：芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、土壤杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属和产碱杆菌属。
13.如权利要求11所述的嵌合基因，其中所述植物是玉蜀黍植物。
14.一种对昆虫有害生物有毒的蛋白，其中所述蛋白包含(a)与SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或(b)包含SEQ ID NO:1-21中的任一个或其毒素片段的氨基酸序列；或(c)由与SEQ ID NO:21-49中的任一个或其毒素编码片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(d)由包含SEQ ID NO:21-49中的任一个或其毒素编码片段的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或(e)(a)-(d)的氨基酸序列，其包含选自由SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53组成的组的细胞毒素结构域。
15.如权利要求14所述的蛋白，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。
16.如权利要求15所述的蛋白，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。
17.如权利要求16所述的蛋白，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。
18.一种重组载体，其包含如权利要求5所述的嵌合基因。
19.一种宿主细胞，其包含如权利要求18所述的重组载体，其中所述宿主细胞是细菌细胞或植物细胞。
20.如权利要求19所述的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞在芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴斯德氏芽菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯菌属、沙门氏菌属、巴氏杆菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、剑菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、土壤杆菌属、醋杆菌属、乳杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属中。
21.如权利要求20所述的转基因芽孢杆菌属细胞，其中所述芽孢杆菌属细胞是苏云金芽孢杆菌细胞。
22.如权利要求19所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。
23.如权利要求22所述的转基因植物细胞，其中(a)所述双子叶植物细胞选自由以下组成的组：大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、甜菜细胞以及烟草细胞；或(b)所述单子叶植物细胞选自由以下组成的组：大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞以及小麦细胞。
24.一种转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分包含如权利要求23所述的转基因植物细胞。
25.如权利要求24所述的转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分是转基因玉蜀黍植物或植物部分。
26.一种工程化的杀昆虫蛋白，所述工程化的杀昆虫蛋白包含以下氨基酸序列，所述氨基酸序列与a)SEQ ID NO:1具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQID NO:1的氨基酸位置1-345中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变；或与b)SEQ ID NO:2具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置1-344中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变；或与c)SEQ ID NO:3具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:3的氨基酸位置1-351中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变；或与d)SEQ ID NO:4具有至少80％到至少99％序列同一性，并且进一步在对应于SEQ ID NO:4的氨基酸位置1-347中的任一个或其任意组合的位置处包含至少一个突变。
27.如权利要求26所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述突变位于与SEQ ID NO:3的氨基酸位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219或275或其任意组合对应的氨基酸位置处。
28.如权利要求27所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述突变位于SEQ ID NO:3的位置50、52、56、62、64、81、126、153、169、185、207、219或275处。
29.如权利要求28所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中位置50处的突变为I50L，位置52处的突变为I52L，位置56处的突变为I56L，位置62处的突变为A62C或A62L，位置64处的突变为A64C或A64L，位置81处的突变为I81L，位置126处的突变为I126L，位置153处的突变为I153L，位置169处的突变为I169L，位置185处的突变为I185L，位置207处的突变为I207L，位置219处的突变为I219L或位置275处的突变为I275L。
30.如权利要求29所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
31.如权利要求26-30中任一项所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述蛋白针对至少鞘翅目昆虫有害生物具有活性。
32.如权利要求31所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属昆虫有害生物。
33.如权利要求32所述的工程化的杀昆虫蛋白，其中所述根萤叶甲属昆虫有害生物选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。
34.一种杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含如权利要求14所述的蛋白和农业上可接受的载剂。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述农业上可接受的载剂选自由以下组成的组：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述组合物通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌菌株的培养物而制备。
37.如权利要求34所述的组合物，所述组合物包含按重量计从约1％至约99％的所述杀昆虫蛋白。
38.如权利要求34-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二杀有害生物剂。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述第二杀有害生物剂是生物剂或化学剂。
40.如权利要求39所述的组合物，其中(a)所述生物剂是或衍生自苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽孢杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属物种杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、Paenibacillus popiliae杀昆虫蛋白、或梭菌属物种杀昆虫蛋白；(b)所述生物剂是或衍生自dsRNA、Cry蛋白、Vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；(c)所述化学剂是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或者(d)所述化学剂包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
41.一种用于产生杀昆虫蛋白的方法，所述方法包括在如权利要求17所述的宿主细胞产生所述杀昆虫蛋白的条件下培养所述宿主细胞或包含所述宿主细胞的生物。
42.一种产生与对照植物或植物部分相比具有增强的昆虫抗性的转基因植物或植物部分的方法，所述方法包括：(a)向植物或植物部分中引入如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述杀昆虫蛋白在所述植物或植物部分中表达，从而产生具有增强的昆虫抗性的植物或植物部分。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述引入步骤通过以下实现：(a)转化所述植物或植物部分；或者(b)使包含所述嵌合基因的第一植物与不同的第二植物杂交。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述嵌合基因编码具有SEQ ID NO:1-21中任一个的氨基酸序列的杀昆虫蛋白。
45.一种控制昆虫有害生物的方法，所述方法包括将有效量的如权利要求12所述的杀昆虫蛋白递送至所述昆虫有害生物或其环境。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述杀昆虫蛋白通过转基因植物或通过局部施用包含所述杀昆虫蛋白的杀昆虫组合物递送。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述转基因植物或所述杀昆虫组合物包含不同于所述杀昆虫蛋白的第二杀昆虫剂。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述第二杀昆虫剂是蛋白、dsRNA或化学品。
49.如权利要求48所述的方法，其中(a)所述蛋白选自由以下组成的组：Cry蛋白、Vip蛋白、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶；(b)所述化学品是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合；或(c)所述化学品包含选自下组的活性成分，该组由以下组成：克百威、胺甲萘、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯氧磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
50.如权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述昆虫有害生物是鞘翅目昆虫有害生物。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述鞘翅目昆虫有害生物是根萤叶甲属物种。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述根萤叶甲属物种选自由以下组成的组：玉米根萤叶甲、巴氏根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种和玉蜀黍根萤叶甲。
53.一种降低根萤叶甲属昆虫群体对如权利要求5所述的杀昆虫蛋白的抗性发展的方法，所述方法包括在由所述根萤叶甲属昆虫群体摄食的转基因植物中表达所述杀昆虫蛋白和干扰RNA分子，所述干扰RNA分子抑制幼虫和成虫根萤叶甲属昆虫中靶基因的表达，从而使所述根萤叶甲属昆虫群体中的抗性发展与仅暴露于所述杀昆虫蛋白的根萤叶甲属昆虫群体相比降低。
54.一种向玉米种植者提供控制玉米作物中根萤叶甲属昆虫有害生物群体的手段的方法，所述方法包括(a)向所述种植者出售或提供包含如权利要求1所述的核酸分子的转基因玉米种子；以及(b)向所述种植者宣传所述转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属有害生物群体的转基因玉米植物。
55.一种鉴定杀昆虫蛋白的方法，所述杀昆虫蛋白包含与SEQ ID NO:22-25中的任一个具有至少80％到至少99％序列同一性的核苷酸序列，所述方法包括以下步骤：(a)产生引物对，所述引物对将从核酸样品中扩增SEQ ID NO:21-25中任一个的多核苷酸或其互补序列，(b)从所述核酸样品中扩增直系同源基因，(c)鉴定直系同源基因的多核苷酸序列，(d)产生由所述直系同源基因编码的蛋白，以及(e)确定步骤(d)的蛋白针对昆虫有害生物具有杀昆虫活性。
56.一种变体杀昆虫蛋白，所述变体杀昆虫蛋白包含与SEQ ID NO:3中选自由I50L、I53L、A62C或L、A64C或L、I81L、I126L、I153L、I169L、I185L、I207L、I219L和I275L组成的组的氨基酸取代对应的氨基酸取代，其中所述变体与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性，并且针对根萤叶甲属昆虫有害生物具有活性。
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