CN114504681A - 一种磁性复合材料填充的金属支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性复合材料填充的金属支架，所述金属支架由纳米磁性粒子、明胶、羟基磷灰石粉体形成的磁性复合材料和三维多孔金属支架组成，所述磁性复合材料填充在金属支架内部。所述磁性复合材料中羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.1‑1。本发明采用两种骨基质主要成分(胶原和纳米羟基磷灰石)，在多孔钛的每一个孔洞中，搭建可降解的仿生三维微支架；同时引入纳米磁性粒子和静磁场以促进血管新生、刺激前成骨细胞向成骨细胞的分化以及细胞外基质的沉积，以期给骨形成相关细胞提供一个最佳的增殖、分化环境。

Description

一种磁性复合材料填充的金属支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种磁性复合材料填充的金属支架及其制备方法。

背景技术

股骨头坏死是(Osteonecrosis of femoral head,ONFH)一种相对影响年轻人群的使人衰弱的疾病，导致股骨头的进行性塌陷和随后的症状性髋关节炎。在美国，每年诊断出超过2万例股骨头坏死的新病例，而中国仅非创伤性ONFH患者就高达812万人。尽管全髋关节置换术被用于晚期ONFH的治疗已取得了令人满意的效果，然而对于年轻早期ONFH患者，考虑到活动需求、假体寿命以及翻修手术的困难，在不可逆的股骨头塌陷之前予以理想的保髋治疗，对延缓疾病进展，从而推迟甚至避免行全髋关节置换术具有重要意义。

髓芯减压术作为最常用的保髋治疗措施可以在一定程度上延缓股骨头坏死的进程。然而减压后坏死区缺乏有效的力学支撑，并且该方法也没有解决坏死区域血管生成、骨重建、关节面修复等问题。为此，需要在减压后为缺损通道提供移植物或植入物来防止股骨头的进一步塌陷。

现有的钛合金材料已经应用于临床多年，充分证实了其安全性和优异的力学性能。此外，3D打印技术的发展，使其同时具有个性化、多孔性等多方面的优势。但目前钛合金材料仍然具有一定弊端：其一，推荐细胞生长到支架中的孔径约为100-300μm，而目前3D打印钛合金材料的孔径多在500-1500μm之间，对于细胞平均15-25μm的直径大小来说显然过于空旷。其二，钛是一种生物惰性材料，其植入体内后缺乏与周围组织间的相互作用。为了解决上述问题，许多研究将钛合金材料进行改性，如化学处理、生物活性涂层及表面粘附各种生长因子、干细胞等，但不幸的是，这些措施多集中在孔洞内表面二维层次，不能实现细胞在整个孔洞内三维层次的充填生长。

因此，开发一个既具有生物活性，同时具有促进血管新生和促成骨的有机无机复合的3D打印支架用于股骨头坏死髓芯减压后骨髓道的填充物，将会具有重要应用前景。

发明内容

为了克服现有技术村子的上述不足，本发明的目的是提供一种磁性复合材料填充的金属支架及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

本发明首先提供了一种磁性复合材料填充的金属支架，所述金属支架由纳米磁性粒子、明胶、羟基磷灰石形成的磁性复合材料和三维多孔金属支架组成，所述磁性复合材料填充在金属支架内部。

在一些实施方式中，所述磁性复合材料中羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.1-1。

在一优选的实施方式中，所述磁性复合材料中羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:1。

在一些实施方式中，所述纳米磁性粒子包括氧化铁结构为Fe₃O₄和/或γ-Fe₂O₃的磁性纳米氧化铁。

在一些实施方式中，所述羟基磷灰石粉体被替换为磷酸钙、硫酸钙、聚乳酸及聚乳酸衍生物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚二氧六环酮，聚富马酸二羟丙酯、聚原酸酯、聚酐以及聚氨酯的一种或几种；所述明胶被替换为胶原、葡萄糖胺聚糖、纤维蛋白、真丝、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸一种或几种。

在一些实施方式中，所述三维多孔金属支架由正十二面体或菱形十二面体为基本单位，按照孔径为500-1000μm和孔柱的为300-800μm和孔隙率为75％-85％3D数字模型打印的具有孔孔连通的三维多孔贯通支架。

进一步地，本发明提供了一种磁性复合材料填充的金属支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)运用CAD软件构建多孔结构的三维模型；

(2)依据步骤1)中的三维模型打印多孔金属支架；

(3)将纳米磁性粒子粉末溶于去离子水中，混合均匀，得到纳米磁性粒子溶液；将羟基磷灰石粉体加入上述溶液中，搅拌均匀，得到混合溶液a，然后往所述混合溶液a中加入明胶颗粒，搅拌均匀，充分溶解，形成均匀的混合溶液b；

(4)加入交联剂至步骤(3)获得的混合溶液b中，以交联明胶；

(5)将步骤(2)中制备的多孔支架浸入步骤(4)获得的混合溶液中；

(6)除去支架表面多余的凝胶，再用离子水浸泡、洗涤；

(7)将步骤(6)得到的支架放入-80℃冰箱4h，随后取出冻存物，放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得到磁性复合材料填充的金属支架。

在一些实施方式中，所述步骤(1)中构建多孔结构的三维模型以菱形十二面体作为多孔结构的单元，所述孔柱是300-800μm，孔径是500-1000μm，孔隙率是75-85％。在保证力学强度的前提下，尽可能增大孔隙率为细胞的生长及后期的骨长入提供有效空间。

在一些实施方式中，所述三维多孔金属支架的材料为钛合金、纯钛、钴合金或不锈钢。

在一优选的实施方式中，所述三维多孔金属支架的材料为钛合金。

所述三维多孔钛合金支架由Ti6Al4V粉末采用选择性激光熔融制成。

在一些实施方式中，所述步骤(3)纳米磁性粒子溶液质量浓度为0.5％-5％。

在一些实施方式中，步骤(3)中混合溶液b中羟基磷灰石、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.1-1。

更进一步地，本发明提供了所述的磁性复合材料填充的金属支架或所述的磁性复合材料填充的金属支架的制备方法在制备预防和/或治疗股骨头坏死的产品中的应用。

所述磁性复合材料填充的金属支架具有促进成骨和成血管的作用，且在所述磁性复合材料填充的金属支架中的纳米磁性粒子与施加的静磁场以协同方式促进细胞增殖。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明应用3D打印技术制备力学结构稳定、具有合适孔径、高孔隙率、孔孔连通且弹性模量与人体骨组织相匹配的多孔钛合金支架。采用两种骨基质主要成分(胶原和纳米羟基磷灰石)，在多孔钛的每一个孔洞中，搭建可降解的仿生三维微支架；同时引入纳米磁性粒子和静磁场以促进血管新生、刺激前成骨细胞向成骨细胞的分化以及细胞外基质的沉积，以期给骨形成相关细胞提供一个最佳的增殖、分化环境，从而构建一个具有生物活性的多孔钛合金骨科内植物用于股骨头坏死髓芯减压后骨髓道的填充物。

附图说明

图1为实施例1-3不同比例制备磁性复合支架对细胞生长的影响；

图2为扫描电镜分析不同比例制备的磁性复合支架对细胞生长的影响；

图3为ELISA检测不同比例磁性复合制剂处理的细胞培养基中的ALP(图3A)和VEGF(图3B)的含量；

图4为不同组支架对细胞的增殖情况；A-D：单纯钛合金支架；Gel-nHA Ti支架；磁性复合支架；磁性复合支架+静磁场2mT；

图5为不同支架对细胞的增殖影响。A-D依次为钛支架，Gel-nHA支架，磁性复合支架，磁性复合支架+2mT静磁场；右侧为Image J软件分析图；

图6为股骨头宏观观察图，其中A正常组，B钛支架组，C磁性复合支架组，D单纯减压组，E-F坏死组；

图7为microCT对股骨头区骨量进行分析。A左侧坏死组，右侧正常组；B上、中、下分别为单纯减压组、钛支架组及磁性复合支架组；

图8为各组股骨头区BS/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、Tb.Pf的变化情况；其中，骨体积(BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨表面积骨体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)；

图9各组缺损通道及钛支架内骨长入情况。上、中、下依次为钛支架组、磁性复合支架组以及单纯髓芯减压组；

图10各组三维模式分析骨长入，根据阈值确定的新骨形成。上、中、下依次为磁性复合支架组、钛支架组以及单纯髓芯减压组；

图11各组缺损通道及钛支架内骨长入的定量分析，其中，骨体积(BV)、骨体积分数(BV/TV)、骨长入率(Bone ingrowth radio)、BMD骨表面积骨体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明提供一种磁性复合材料填充的钛合金支架，在保证力学强度的前提下，尽可能大的孔隙率模拟骨的多孔结构。此外，均匀联通的孔隙结构有利于骨细胞的粘附增殖以及微血管的生长，为新骨生成提供充足的空间结构，并且较低的弹性模量实现与正常骨组织的匹配从而降低应力遮挡效应。在钛骨骼支架的基础上，冷冻干燥技术将骨基质有机成分及无机成分最主要的构成物质明胶及羟基磷灰石作为主要材料，在多孔结构中建立具有仿生结构的三维微支架，进一步的将纳米磁性粒子及磁场引入该体系，给成骨相关细胞的增殖、分化以及最终的骨质沉积提供一个良好的微环境。在整个体系中，多孔钛合金支架尽可能制备成大孔洞和高孔隙率结构，在保障力学性能的前提下，不但实现了金属的最少化，同时也实现了骨长入量的最大化，更不必担心材料降解与新骨形成不匹配的问题，为坏死区提供永久的力学支撑；而三维微支架则不必再受力学强度的限制，可以为细胞提供最好的生长微环境，支架内明胶等材料降解的同时，形成自体骨替代，进一步达到最佳的生物学固定，最终实现两者的优势互补。

最终通过体外细胞实验，我们证实当三种材料比例为1:1:1，以及磁场强度为2mT时，对细胞的增殖及分化能力最强；并且磁性复合支架+磁场组相较于其他对照组结果最优。此外，在股骨头坏死模型中，该磁性复合支架也表现出了对股骨头坏死最强的修复作用。

实施例1

本实施例的磁性复合材料填充的钛合金支架按照纳米羟基磷灰石粉末、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:1制备。

上述磁性复合材料填充的钛合金支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔柱300μm，孔径500μm，孔隙率80％的3D数字模型。

(2)依据步骤(1)中的3D数字模型打印多孔钛合金支架；

(3)将2.5g纳米磁性粒子粉末(γ-Fe₂O₃，瑞存，聚葡萄糖山梨醇羧基甲基醚包裹的三氧化二铁)溶于50ml去离子水，先在超声清洗机中超声分散，再使用超声波细胞粉碎机处理，使纳米磁性粒子均匀分散于去离子水中，得到质量溶度为5％的纳米磁性粒子溶液。

(4)将2.5g nHA粉末(南京埃谱瑞纳米材料有限公司，H5-XW，20nm，99％)加入上述纳米磁性粒子溶液中，先在超声清洗机中超声分散，再使用超声波细胞粉碎机处理，使nHA粒子均匀分散在纳米磁性粒子溶液中。

(5)将2.5g明胶颗粒(Gelatin,Solarbio,Cat#G8061)，加入上述溶液中，搅拌，充分溶解，形成均匀的混合溶液。

(6)加入0.625％戊二醛溶液以交联明胶。

(7)将多孔钛支架浸入溶液，搅拌器快速搅拌溶液，使用离心力使泡沫浸入每一个钛合金孔洞。

(8)置于摇床，4℃下交联12h。液体已成为凝胶状并填充到支架中，刮除支架表面多余的凝胶。

(9)加入0.1mol/L甘氨酸溶液，室温下浸泡，来阻断残余的戊二醛。

(10)在37℃，300r/min磁力搅拌器中用双蒸馏水彻底洗涤3次，持续2小时。再用去离子水浸泡，清洗3遍，约4h。

(11)然后将样品置于放入-80℃冰箱4h，随后取出冻存物，放入真空冷冻干燥机中，-46℃冷冻干燥48h，即得到磁性复合材料填充的金属支架支架。

(12)将填充好的支架置于加有双抗的培养基中清洗3次，70％乙醇溶液中消毒灭菌，PBS清洗，放入环氧乙烷灭菌箱，最后独立分装处理、备用。

实施例2

本实施例的磁性复合材料填充的钛合金支架按照羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.5制备。

上述磁性复合材料填充的钛合金支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔柱300μm，孔径500μm，孔隙率80％的3D数字模型。

(2)依据步骤(1)中的3D数字模型打印多孔钛合金支架；

(3)将1.25g纳米磁性粒子粉末溶于50ml去离子水，先在超声清洗机中超声分散，再使用超声波细胞粉碎机处理，使纳米磁性粒子均匀分散于去离子水中，得到质量溶度为2.5％的纳米磁性粒子溶液。

(4)将2.5g nHA粉末加入上述纳米磁性粒子溶液中，先在超声清洗机中超声分散，再使用超声波细胞粉碎机处理，使nHA粒子均匀分散在纳米磁性粒子溶液中。

(5)将2.5g明胶颗粒加入上述溶液中，搅拌，充分溶解，形成均匀的混合溶液。

步骤(6)-(12)参照实施例1的制备方法。

实施例3

本实施例的磁性复合材料填充的钛合金支架按照羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.1制备。

上述磁性复合材料填充的钛合金支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔柱300μm，孔径500μm，孔隙率80％的3D数字模型。

(2)依据步骤(1)中的3D数字模型打印多孔钛合金支架；

(3)将0.25g纳米磁性粒子粉末溶于50ml去离子水，先在超声清洗机中超声分散，再使用超声波细胞粉碎机处理，使纳米磁性粒子均匀分散于去离子水中，得到质量溶度为0.5％的纳米磁性粒子溶液。

(4)将2.5g nHA粉末加入上述纳米磁性粒子溶液中，先在超声清洗机中超声分散，再使用超声波细胞粉碎机处理，使nHA粒子均匀分散在纳米磁性粒子溶液中。

(5)将2.5g明胶颗粒加入上述溶液中，搅拌，充分溶解，形成均匀的混合溶液。

步骤(6)-(12)参照实施例1的制备方法。

实施例4

本实施例的磁性复合材料填充的钛合金支架按照纳米羟基磷灰石粉末、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:1制备。运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔柱800μm，孔径800μm，孔隙率75％的3D数字模型。其他的制作步骤请参照实施例1中所述。

实施例5

本实施例的磁性复合材料填充的钛合金支架按照纳米羟基磷灰石粉末、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.5制备。运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔柱500μm，孔径1000μm，孔隙率85％的3D数字模型。其他的制作步骤请参照实施例1中所述。

实施例6

本实施例的磁性复合材料填充的钛合金支架按照纳米羟基磷灰石粉末、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:1制备。运用CAD软件构建以菱形十二面体为基本单位、孔柱500μm，孔径1000μm，孔隙率85％的3D数字模型。其他的制作步骤请参照实施例1中所述。

试验例1

1、本发明提供磁性复合材料填充的钛合金支架，置于PBS缓冲液中，浸泡2个月后，可见钛骨骼支架孔径中的磁性复合材料成分即纳米羟基磷灰石(nHA)粉末、明胶(Gel)和纳米磁性粒子(IONPs)逐渐出现降解。

2、力学性能

传统钛合金弹性模量为110GPa，而多孔钛合金的弹性模量可调至0.70-3.00GPa，甚至低于目前股骨头坏死植入材料多孔钽棒(3GPa)。而本发明3D打印出的钛骨骼支架力学性能如表1所示，抗压强度77.8±1.924MPa，高于大多数股骨头坏死植入相关材料；弹性模量0.987±0.049GPa，有效降低了应力遮挡效应。其中，试样1-5制作支架的孔柱300um，孔径500um，孔隙率80％。

表1力学性能

试验例2

发明人前期将明胶及纳米羟基磷灰石复合到钛合金支架，证明这两种材料质量比例为1:1时对细胞及骨缺损优势最大。

本实施例将纳米磁性粒子、磁场作为变量，筛选出最佳的条件，如下。

CCK8实验筛选最佳条件

在一个密闭铁盒两端放置钕铁硼强力磁铁，将96孔板放入中间，用特斯拉计测每孔的磁场强度，分别找到0mT、0.5mT、1mT、2mT和4mT所对应的孔径，记录下来。

分别将磁性复合材料填充好的钛合金支架(Gel：nHA：IONPs的比例分别为1:1:1、1:1:0.5、1:1:0.1)加入到对应磁场的孔径中。将胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)铺于上述对应的孔径中，1x10⁴/孔，每个比例每个场强设置两个复孔，培养72h后每孔加入10μLCCK8检测液，在细胞培养箱中孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，找到最适的磁场强度和磁性复合材料的比例。

根据CCK8实验，发现最适宜细胞生长的磁性复合材料的比例为1:1:1(即Gel：nHA：IONPs)，且最适的磁场强度为2mT(图1)。

试验例3

将磁场强度设定为2mT，然后利用扫描电镜与DAPI染色，验证不同比例(Gel：nHA：IONPs比例为1:1:1、1:1:0.5、1:1:0.1)的磁性复合材料填充的钛合金支架对细胞生长的影响。

在一个密闭铁盒两端放置钕铁硼强力磁铁，将96孔板放入中间，用特斯拉计测每孔的磁场强度，找到2mT所对应的孔径。

分别按照实施例1-3中方法制备的三种磁性复合材料填充的钛合金支架，将其放置于96孔板中，每比例两个，分别铺细胞1×10⁴/孔，置于培养箱中培养。每隔两天换液一次，细胞孵育7天。取出支架，PBS冲洗两次，2.5％戊二醛固定1h，PBS洗两次。每个比例分别取一个进行DAPI染色10min，PBS洗3次。将处理好的6个支架进行冷冻干燥。将支架固定在电镜的样本架上，进行喷金处理以增加导电性。进行电镜观察，拍照。

在3D打印钛合金支架孔洞内部，形成了多孔联通的明胶细胞外基质结构，类似于天然骨组织脱钙后形成的多孔结构，明胶孔洞周围可观察到纳米羟基磷灰石的存在，粒径约在7μm-33μm之间，多孔明胶结构在比例1:1:0.1材料组中最为明显。在电镜视野下，测量并计数视野内100个孔大小，并取平均值，明胶孔洞直径大约分布在70μm至180μm之间。随着纳米磁性粒子比例的增加，可观察到明胶孔洞周围及内部的磁性纳米颗粒数量也逐渐增多，证明在3D打印的多孔钛支架内部成功构建了含有明胶、纳米羟基磷灰石及纳米磁性颗粒的三维微支架。此外，相较于其他两组，在比例1:1:1材料组中的可观察更多形态较为丰满的类圆形细胞，并且与微支架的粘附及相互作用更加充分，相邻细胞之间的伪足延伸也更为明显(图2)。结合DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色结果表明比例1:1:1材料组更有利于细胞的粘附以及增值。扫描电镜下的部分区域也沉积了较厚呈簇状的物质，发明人推测这是细胞在成骨分化过程中分泌的细胞外基质，这些表现在比例1:1:1材料组最为明显。这些结果进一步说明复合材料增强了前成骨细胞的分化以及细胞外基质(ECM)的分泌。

试验例4

随后，进行ELISA试验，检测培养基上清，确定三种不同比例(Gel：nHA：IONPs比例为1:1:1、1:1:0.5、1:1:0.1)的磁性复合材料填充的钛合金支架对成骨标志物ALP以及成血管标志物VEGF表达水平的影响。

根据实施例1-3的方法制备磁性复合材料填充的钛合金支架。

在一个密闭铁盒两端放置钕铁硼强力磁铁，将96孔板放入中间，用特斯拉计测每孔的磁场强度，找到2mT所对应的孔径。分别将不同比例材料的钛合金支架放置于96孔板中，每个比例7个，铺细胞1×10⁴/孔，置于培养箱中培养。分别在培养第3d、5d、7d、9d、11d、14d、21d时收集培养基，放于负80度冰箱中储存，以空白培养基为对照，记为0d。

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。样本孔先加待测样本(培养基)10μL；再加样本稀释液40ul，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满1x洗涤液(20x洗涤缓冲液用蒸馏水稀释为1x)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同,15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

根据ELISA试验，发明人发现加入不同比例材料的钛合金支架处理的细胞培养基中的ALP和VEGF的含量也不同，且随着时间的延长有上升趋势，在比例1:1:1材料组中11d时ALP的含量最多(图3A)，在比例1:1:1材料组11d和14d时VEGF的含量最多(图3B)。在11或14d后，所有组的ALP浓度均下降，表明由于培养周期较长，导致了细胞死亡或接触抑制。

以下实施例，在细胞和动物实验中选用Gel-nHA-IONPs比例为1:1:1制备的磁性复合材料填充钛合金支架，选用Gel-nHA比例为1:1制备的Gel-nHA Ti支架。

试验例5

检测不同钛合金支架的CCK8增殖能力。

本实施例CCK8方法参照实施例2中的步骤，依次分A-D组为：单纯钛合金支架(TiScaffold)；Gel-nHA Ti支架(Gel-nHA Ti Scaffold)；磁性复合支架(Gel-nHA-IONPs TiScaffold)；磁性复合支架+静磁场2mT(Gel-nHA-IONPs Ti Scaffold+MF)。

结果如图4显示，磁性复合支架对细胞的增殖能力最强，优于单纯钛支架与Gel-nHA支架。此外，发明人认为磁性复合支架中的纳米磁性粒子γ-Fe₂O₃可以与施加的静磁场以协同方式促进细胞增殖。

试验例6

然后采用哺乳动物细胞LIVE/DEAD试剂盒分析样品的细胞毒性。试剂盒包含两种探针：钙黄绿素与乙二胺四乙酸二聚体(EthD-1)。钙黄绿素通过活细胞内活性酯酶转化为钙黄绿素，产生绿色荧光。EthD-1穿过破碎的细胞膜，产生红色荧光。

将细胞悬液接种于各组钛骨骼支架上，于37℃培养箱中，每2-3天换液一次。培养72小时后进行LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂染色。

在检测前将LIVE/DEAD细胞活性/细胞毒性试剂盒从冰箱取出，恢复室温。配置LIVE/DEAD细胞液：在10μL的2mM EthD-1原液中(试剂B)加入5ml灭菌PBS，搅拌保证充分混合，从而得到约4μM的EthD-1溶液。在上述5ml EthD-1溶液中加入2.5μL的钙黄绿素原液(试剂A)搅拌以保证彻底混合，由此得含2μM钙黄绿素和4μM EthD-1的工作溶液，其DMSO终浓度≤0.1％，对大多数细胞无害。将培养液弃掉，后用PBS漂洗3次，以清除血清酯酶，血清酯酶可通过水解Calcein-AM，造成细胞外出现荧光，干扰观察。200μL上述LIVE/DEAD工作液，加入到小皿中，确保液面没过钛片。孵育过程应该防止污染和干燥。在室温下避光孵育30-45分钟，(如果染料浓度高或孵化温度高，可以适当缩短孵育时间)。送共聚焦显微镜下观察并采集图像；每组取3个样本，随机在100×视野下取6个感兴趣区域，通过Image J软件分析各组细胞面积和细胞密度。

结果如图5显示，进一步验证磁性复合支架对细胞的增殖具有促进作用，也发现磁性复合支架中的纳米磁性粒子γ-Fe₂O₃可以与施加的静磁场以协同方式促进细胞增殖。

试验例7

实验动物：健康成年雌性新西兰大白兔20只(40髋)，月龄3.5±0.2，体重2.5kg，经伦理审查后由中国医学科学院实验动物研究所提供。

分组：将实验对象按照髋部分为5组：即正常组(6髋)，单纯坏死组(6髋)，单纯髓芯减压(CD)组(6髋)，CD+单纯Ti支架植入组(6髋)，CD+磁性复合支架(Gel-nHA-IONPs Ti)植入组(6髋)。剩余5只兔子为预防造模及手术失败或死亡时提供候补。

造模股骨头坏死：所有动物适应性饲养1周，之后除正常组3只兔子外，均采用激素+内毒素联合注射的方式诱导兔股骨头坏死模型。具体方法为：脂多糖10μg/kg静脉注射，24h后，醋酸甲基强的松龙20mg/kg右臀中肌注，共3次，间隔24h。

按照分组情况进行手术，共9只兔子18髋，每只兔子两侧植入不同材料或单纯进行髓芯减压。具体操作如下：

使用戊巴比妥钠和生理盐水配制3％戊巴比妥钠。

将新西兰兔从饲养笼中取出，称重后送到动物手术室，使用固定器固定。麻醉：使用静脉输液针进行耳缘静脉穿刺，见到回血后，使用胶带将输液针妥善固定在兔耳上，使用注射器抽取3％戊巴比妥钠，按照1ml/kg剂量缓慢进行耳缘静脉注射，至肌力及角膜反射减弱。

将兔从固定器中取出，俯卧于手术台上，四肢肢分别使用绷带固定。备皮：用推子紧贴兔皮肤剃去手术区毛发。剃毛的范围以两侧髋臼为中心，周围直径6cm的范围。剃毛后，用碘伏消毒上述区域2次。完成备皮后，洗手，穿手术衣，戴无菌手套，手术区铺洞巾。

设计手术切口：再次明确髋臼和股骨干的位置及走行，切口从髋臼下缘开始，向股骨干走行方向延伸，全长约4-5cm，显露股骨大转子。沿手术切口逐层切开皮肤及皮下组织，钝性分离，找到肌间隙(白色)并切开。暴露骨膜，切开骨膜并向两侧分离，暴露股骨大转子及股骨干。在股骨大转子下方4mm处用骨刀结合骨锤刻出划痕(方便进针)，用左手握住膝关节，右手持电钻(前端装有直径为3mm的克氏针)，相对于股骨头斜45°进针，持续进针至有突破感(穿透骨皮质)，阻力减小，减慢转速及进针速度，再次感到阻力时即达到股骨头下方，进针长度一般为2.2-2.5cm(若并未达到进针长度，可调整进针角度稍偏尾侧，考虑前倾角即可)。之后拔出克氏针。

将构建的支架顺隧道方向插入隧道，用钝头克氏针和锤子将其推入隧道末端。后逐层缝合皮下及皮肤，敷料包扎。术后3d肌肉注射青霉素钠20-30万单位。

处死：手术后6周采用过量麻醉联合空气栓塞的方法处死各组兔子，然后分离股骨周围肌肉及韧带，完整取出股骨，置入50ml离心管中，倒入4％中性甲醛溶液固定。

经过减压或支架的修复后，股骨头颜色为乳白色(图6)，说明有新骨形成。其中磁性复合支架组新骨形成更多，说明了磁性复合材料提供了与正常骨组织相似的微环境以促进细胞的增殖及分化，从而加速新生组织骨化。其中，A正常组，B钛支架组，C磁性复合支架组，D单纯减压组，E-F坏死组。

宏观观察股骨头后，在4％中性甲醛溶液固定至少3天。然后使用microCT系统(Inveon MultiModalityGantry-STD CT)对股骨近端约1/3进行扫描，每次扫描1个样本，从影像学角度评估股骨头坏死和修复情况以及髓心减压缺损通道的新骨形成。扫描视野(Field of view,FOV)41*42mm，分辨率20.6μm，在电压80kV下360度旋转以1°步长获得数据集。然后，利用Cobra软件对原始数据进行处理，进行股骨近端的三维重建。最后，我们在Inveon reaearch workplace v4.2.0中计算了骨体积、骨密度及骨小梁等相关参数。

首先打开要分析的序列并进行三维重建。然后在2D图像中选取股骨头冠状面骨骺线中点下方1mm内的全部50个层面以及髓芯减压缺损通道圆柱形区域作为感兴趣区域(Region of Interest,ROI)进行相关参数分析，应用阈值来区分感兴趣区域新骨形成的骨体积及骨密度等相关参数。最后在3D图像中利用阈值进行骨小梁等相关参数分析。

由于在骨坏死早期阶段，影像学检查对于发现骨坏死区域的价值不大，甚至磁共振成像(MRI)也需要在发病后6-12周，所以我们并未采用传统的X线或MRI来验证造模情况以及支架对股骨头坏死的修复能力，而应用microCT对股骨头区骨量进行分析，以期找到不同组别之间的差异。图7A为坏死组(左)与正常组股骨头区(右)microCT，可见两组股骨头均无塌陷等形态上的表现，但坏死组骨小梁稀疏，骨量明显低于右侧正常组。

经过髓芯减压及不同支架植入后，股坏死较模型组均有一定改善，骨量明显增多，其中以磁性复合支架组最为显著，如图7B(上中下分别为单纯减压组、钛支架组及磁性复合支架组)所示。

股骨头区骨量分析提示骨体积(BV)及骨体积分数(BV/TV)(图8)与图7表现一致。而对其他以及骨小梁相关参数进行分析，主要包括骨表面积骨体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)(图8)。

其中骨体积指感兴趣区域中被定义为骨组织的体积；骨体积分数表示骨组织体积与组织体积比值，可直接反应骨量变化情况；骨表面积组织体积比又称为骨表面积密度，可以间接反映骨量多少；骨小梁厚度表示骨小梁平均厚度；骨小梁数目代表感兴趣区域中，每mm中骨组织与非骨组织交点数量的平均值；骨小梁分离度表示骨小梁之间髓腔平均宽度；骨小梁模式因子是衡量骨小梁连接度的一个指标，有相对凸性或凹性，该值降低提示骨小梁由杆状向板状变化，发生骨质疏松时该值增加，即骨小梁从板状变为杆状。分析可见其余五个指标基本与上述趋势相符，磁性复合支架组的结果最优。

然后对减压通道以及钛支架内部区域进行骨量分析，评估骨长入情况。结果如图9-10所示，表明磁性复合支架组在缺损通道内修复了大部分缺损，骨长入最优，而钛支架组次之，单纯髓芯减压组几乎无骨长入。其中图9中上、中、下依次为钛支架组、磁性复合支架组以及单纯髓芯减压组；图10中上、中、下依次为磁性复合支架组、钛支架组以及单纯髓芯减压组。对缺损区域进行定量分析，结果如图11显示，在所有组中，磁性复合支架组的新骨形成体积(BV)、骨体积百分比(BV/TV)、骨长入率及骨矿物质密度结局最优，而单纯减压组结局最差。其余骨小梁等相关参数与之大体一致。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种磁性复合材料填充的金属支架，其特征在于，所述金属支架由纳米磁性粒子、明胶、羟基磷灰石粉体形成的磁性复合材料和三维多孔金属支架组成，所述磁性复合材料填充在金属支架内部。

2.如权利要求1所述的金属支架，其特征在于，所述磁性复合材料中羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.1-1。

3.如权利要求3所述的金属支架，其特征在于，所述纳米磁性粒子包括氧化铁结构为Fe₃O₄和/或γ-Fe₂O₃的磁性纳米氧化铁。

4.如权利要求1所述的金属支架，其特征在于，所述羟基磷灰石粉体被替换为磷酸钙、硫酸钙、聚乳酸及聚乳酸衍生物、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚二氧六环酮，聚富马酸二羟丙酯、聚原酸酯、聚酐以及聚氨酯的一种或几种；所述明胶被替换为胶原、葡萄糖胺聚糖、纤维蛋白、真丝、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸一种或几种。

5.如权利要求1所述的金属支架，其特征在于，所述三维多孔金属支架由正十二面体或菱形十二面体为基本单位，按照孔径为500-1000μm、孔柱的为300-800μm和孔隙率为75％-85％3D数字模型打印的具有孔孔连通的三维多孔贯通支架。

6.一种磁性复合材料填充的金属支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)运用CAD软件构建多孔结构的三维模型；

(2)依据步骤1)中的三维模型打印多孔金属支架；

(3)将纳米磁性粒子粉末溶于去离子水中，混合均匀，得到纳米磁性粒子溶液；将羟基磷灰石粉体加入上述溶液中，搅拌均匀，得到混合溶液a，然后往所述混合溶液a中加入明胶颗粒，搅拌均匀，充分溶解，形成均匀的混合溶液b；

(4)加入交联剂至步骤(3)获得的混合溶液b中，以交联明胶；

(5)将步骤(2)中制备的多孔金属支架浸入步骤(4)获得的混合溶液中；

(6)除去支架表面多余的凝胶，再用离子水浸泡、洗涤；

(7)将步骤(6)得到的支架放入-80℃冰箱4h，随后取出冻存物，放入真空冷冻干燥机中，冷冻干燥，即得到磁性复合材料填充的金属支架。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)得到的纳米磁性粒子溶液质量浓度为0.5％-5％。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述混合溶液b中羟基磷灰石粉体、明胶和纳米磁性粒子的质量比为1:1:0.1-1。

9.权利要求1～5中任一项所述的磁性复合材料填充的金属支架或权利要求6～8中任一项所述的磁性复合材料填充的金属支架的制备方法在制备预防和/或治疗股骨头坏死的产品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述磁性复合材料填充的金属支架具有促进成骨和成血管的作用，且在所述磁性复合材料填充的金属支架中的纳米磁性粒子与施加的静磁场以协同方式促进细胞增殖。

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