CN114502160A

CN114502160A - 钙蛋白酶抑制剂及其用于治疗神经病症的用途

Info

Publication number: CN114502160A
Application number: CN202080068919.8A
Authority: CN
Inventors: 普拉巴·易卜拉欣; 玛丽亚·富恩特斯; P·T·拉维·拉贾戈帕兰; 沃尔特·余
Original assignee: Blade Therapeutics Inc
Current assignee: Blade Therapeutics Inc
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2022-05-13
Also published as: MX2022001155A; EP4003336A4; WO2021021816A1; TW202120082A; EP4003336A1; AU2020323923A1; KR20220041169A; BR112022001660A2; JP2022542992A; US20220257570A1; CA3148822A1

Abstract

提供了使用钙蛋白酶抑制剂治疗与蛋白质聚集相关的神经疾病和病症的方法。所述与蛋白质聚集相关的神经系统疾病包括多聚谷氨酰胺扩大性疾病，如亨廷顿氏病、马查多‑约瑟夫病和脊髓小脑共济失调。

Description

钙蛋白酶抑制剂及其用于治疗神经病症的用途

背景技术

技术领域

本申请涉及药物化学、生物化学和医学领域。更具体地，本申请涉及钙蛋白酶抑制剂及其作为治疗剂的用途。

相关技术的描述

多聚谷氨酰胺(PolyQ)相关病症是遗传性病症，表现为进行性神经变性，导致行为和身体障碍。含PolyQ的蛋白质在身体各处普遍表达；然而，病理主要局限于神经元组织。抑制钙蛋白酶可能对PolyQ病症有益。

亨廷顿氏病是一种遗传性进行性神经退行性病症，其特征在于舞蹈病样运动、精神问题和痴呆。亨廷顿氏病是由亨廷顿(HTT)基因中胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复长度的扩大引起的，导致亨廷顿蛋白中多聚谷氨酰胺束的扩大，并导致大脑中突变亨廷顿蛋白的积累，导致突触后信号传导中断。CAG重复次数越多，发病年龄越早，疾病越严重。并发症通常在发病后10-30年导致死亡。

脊髓小脑共济失调(SCA)是一个由扩大的CAG重复引起的遗传和临床异质性病症的大家族。马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease,MJD)或脊髓小脑共济失调3(SCA3)是最常见的SCA，其特征是小脑的缓慢变性，这会导致共济失调和认知障碍。MJD是由编码共济失调蛋白3(ataxin 3)的MJD基因中的CAG重复长度扩大引起的。这种突变导致神经元包涵体的形成和随后的神经变性。大多数患者在发病后10-15年需要轮椅。

PolyQ相关病症的当前照护标准需要使用抗精神病药物和多巴胺耗竭剂进行对症治疗，同时提供支持性照护。不幸的是，目前没有可用于PolyQ相关病症的疾病改善疗法。

发明内容

在一些实施方案中，本文提供了一种治疗与蛋白质聚集相关的神经疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐或前药，其中：

R¹可以是-C_1-6烷基或-(CH₂)_n-C_6-10芳基，其任选地被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：-卤素、-C_1-6烷基、-C_1-6卤代烷基、-C_1-6烷氧基和-C_1-6卤代烷氧基；

Z是-NR²R³或-OR⁴；

R²是-氢或-C_1-6烷基；

R³是-氢、-C_1-6烷基、-C_3-10环烷基或-OR⁴；

R⁴是-氢或-C_1-6烷基；

Q是-5-10元杂芳基，其任选地被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：-卤素；-C_1-6烷基；-C_1-6卤代烷基；-C_1-6烷氧基；-C_1-6卤代烷氧基；和-C_6-10芳基，其任选地被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：-卤素、-C_1-6烷基、-C_1-6卤代烷基、-C_1-6烷氧基和-C_1-6卤代烷氧基；或者

Q是-C_6-10芳基，其任选地被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：-卤素；-C_1-6烷基；-C_1-6卤代烷基；-C_1-6烷氧基；-C_1-6卤代烷氧基；和-5-10元杂芳基，其任选地被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：-卤素、-C_1-6烷基、-C_1-6卤代烷基、-C_1-6烷氧基和-C_1-6卤代烷氧基；且

n是1或2。

在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括向受试者施用一种或多种第二药剂。在一些实施方案中，第二药剂可以选自丁苯那嗪(tetrabenazinem)、氘代丁苯那嗪(deutetrabenazine)、西酞普兰(citalopram)、依他普仑(escitalipram)、氟西汀(fluoxetine)、舍曲林(sertraline)、喹硫平(quetiapine)、利培酮(risperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、氯丙嗪(chlorpromazine)、丙戊酸盐(valproate)、卡马西平(carbamazepine)、拉莫三嗪(lamotrigine)、左旋多巴(levodopa)、巴氯芬(baclofen)和肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)。

在一些实施方案中，与蛋白质聚集相关的神经病症可以是多聚谷氨酰胺疾病或病症。在一些具体实施方案中，多聚谷氨酰胺病症可以是亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩症、脊髓延髓性肌萎缩症、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、脊髓小脑共济失调2型(SCA2)、脊髓小脑共济失调6型(SCA6)、脊髓小脑共济失调7型(SCA7)或脊髓小脑共济失调17型(SCA17)。在一些实施方案中，与蛋白质聚集相关的神经病症可以是阿尔茨海默病、帕金森病或肌萎缩性侧索硬化。

优选实施方案的详细描述

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所有专利、申请、公开申请和其他出版物均通过引用整体并入。当本文中术语存在多个定义时，除非另有说明，否则以本节中的定义为准。

如本文所用，“受试者”是指人或非人哺乳动物(例如狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊、非人灵长类动物)或鸟类(例如鸡)以及任意其他脊椎动物或无脊椎动物。

术语“哺乳动物”以其通常的生物学意义使用。因此，它具体包括但不限于灵长类动物(包括猿类(黑猩猩、猿、猴)和人类)、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、大鼠和小鼠，还包括许多其他物种。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指在一定程度上有效缓解疾病或病况的一种或多种症状或降低疾病或病况的一种或多种症状发作的可能性(包括治愈疾病或病况)的治疗剂的量。“治愈”意指疾病或病况的症状被消除；然而，即使在治愈后，也可能存在某些长期或永久的影响(例如大量组织损伤)。

本文所用的“治疗”受试者的疾病或病症是指1)预防易患或尚未表现出该疾病或病症的症状的受试者发生该疾病或病症；2)抑制该疾病或病症或阻止其发展；或3)改善或减轻该疾病或病症消退的原因。

如本文所用，术语“前药”是指在体内转化为母体药物的药剂。前药通常是有用的，因为在某些情况下，它们可能比母体药物更容易施用。例如，它们可以通过口服施用而被生物利用，而母体药物则不能。与母体药物相比，前药在药物组合物中还可以具有提高的溶解度。前药的一个实例(但不限于此)是作为酯(“前药”)被施用以促进跨细胞膜传递(其中水溶性对移动性是有害的)但随后在进入细胞后代谢水解成活性实体羧酸(在细胞中水溶性是有益的)的化合物。前药的另一个实例可以是与酸基团键合的短肽(聚氨基酸)，其中肽被代谢以使活性部分显现。用于选择和制备合适的前药衍生物的常规方法在例如《前药设计》(编辑H.Bundgaard,Elsevier,1985)中进行描述，其全部内容通过引用并入本文。

如本文所用，术语“前药酯”是指通过添加任何几种在生理条件下水解的酯形成基团而形成的本文公开的化合物的衍生物。前药酯基团的实例包括新戊酰氧基甲基(pivoyloxymethyl)、乙酰氧基甲基、邻苯二甲酰基(phthalidyl)、茚满基和甲氧基甲基，以及本领域已知的其它这种基团，包括(5-R-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基((5-R-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl)基团。前药酯基团的其他实例可见于例如T.Higuchi和V.Stella的"Pro-drugs as Novel Delivery Systems",Vol.14,A.C.S.SymposiumSeries,American Chemical Society(1975)；及"Bioreversible Carriers in DrugDesign:Theory and Application"，E.B.Roche编辑，Pergamon Press:New York,14-21(1987)(提供可用作含有羧基基团的化合物的前药的酯的实例)。上述每篇参考文献都通过引用整体并入本文。

本文公开的化合物的“代谢物”包括在将化合物引入生物环境中时产生的活性物质。

“溶剂化物”是指通过溶剂和本文所述的化合物、其代谢物或盐的相互作用而形成的化合物。合适的溶剂化物是药学上可接受的溶剂化物，包括水合物。

术语“药学上可接受的盐”是指保留了在生物学上或其他方面不适合用于药物的化合物的生物有效性和性质的盐。在许多情况下，由于存在氨基和/或羧基基团或与其类似的基团，本文的化合物能够形成酸式和/或碱式盐。可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。可以衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。可以衍生盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等；特别优选的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。可以衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺(包括天然存在的取代的胺、环胺、碱性离子交换树脂)等，特别是例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。许多这种盐是本领域已知的，如1987年9月11日公开的Johnston等人的WO 87/05297(通过引用整体并入本文)中所述。

如本文所用，“C_a至C_b”或“C_a-b”(其中“a”和“b”是整数)是指特定基团中的碳原子数。也就是说，该基团可含有“a”至“b”(包括“a”和“b”)个碳原子。因此，例如，“C₁-C₄烷基”或“C_1-4烷基”基团是指具有1至4个碳的所有烷基基团，即CH₃-、CH₃CH₂-、CH₃CH₂CH₂-、(CH₃)₂CH-、CH₃CH₂CH₂CH₂-、CH₃CH₂CH(CH₃)-和(CH₃)₃C-。

如本文所用，术语“卤素”或“卤代”是指元素周期表第7列的放射稳定性原子中的任意一种，例如氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是优选的。

如本文所用，“烷基”是指完全饱和的(即，不含双键或三键)直链或支链烃链。烷基基团可具有1至20个碳原子(无论何时在本文中出现，数值范围如“1至20”是指给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意指烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等组成，直至并包括20个碳原子，但本发明的定义也涵盖其中没有指定数值范围的术语“烷基”的出现)。烷基基团也可以是具有1至9个碳原子的中等大小的烷基。烷基基团也可以是具有1至4个碳原子的低级烷基。化合物的烷基基团可以被指定为“C_1-4烷基”或类似的名称。仅举例来说，“C_1-4烷基”表示在烷基链中存在1至4个碳原子，即烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。

如本文所用，“卤代烷基”是指在链中具有1至12个碳原子的、一个或多个氢被卤素取代的直链或支链烷基基团。卤代烷基基团的实例包括但不限于-CF₃、-CHF₂、-CH₂F、-CH₂CF₃、CH₂CHF₂、-CH₂CH₂F、-CH₂CH₂Cl、-CH₂CF₂CF₃，并且根据本领域普通技术和本文提供的教导的其他基团将其认为等同于前述实例中的任意一个。

如本文所用，“烷氧基”是指式-OR，其中R是如上定义的烷基，例如“C_1-9烷氧基”，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。

如本文所用，“聚乙二醇”是指式

其中n是大于1的整数，并且R是氢或烷基。重复单元的数目“n”可以通过参考成员的数目来指示。因此，例如，“2元至5元聚乙二醇”是指n是选自2至5的整数。在一些实施方案中，R选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基(异丙氧基)、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。

如本文所用，“杂烷基”是指在链骨架中含有一个或多个杂原子(即除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的直链或支链烃链。杂烷基基团可具有1至20个碳原子，但本发明的定义也涵盖其中未指定数值范围的术语“杂烷基”的出现。杂烷基基团也可以是具有1至9个碳原子的中等大小的杂烷基。杂烷基基团也可以是具有1至4个碳原子的低级杂烷基。在各种实施方案中，杂烷基可具有1至4个杂原子、1至3个杂原子、1或2个杂原子或1个杂原子。化合物的杂烷基基团可以被指定为“C_1-4杂烷基”或类似的名称。杂烷基基团可含有一个或多个杂原子。仅举例来说，“C_1-4杂烷基”表示在杂烷基链中存在1至4个碳原子并且在链的骨架中另外存在一个或多个杂原子。

术语“芳族”是指具有共轭π电子系统的环或环系统，并且包括碳环芳族(例如苯基)和杂环芳族基团(例如吡啶)。该术语包括单环或稠环多环(即，共享相邻原子对的环)基团，条件是整个环系统是芳族的。

如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅含有碳的芳环或环系统(即，共享两个相邻碳原子的两个或多个稠环)。当芳基是环系统时，该系统中的每个环都是芳族的。芳基基团可具有6至18个碳原子，但本发明的定义也涵盖其中没有指定数值范围的术语“芳基”的出现。在一些实施方案中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被指定为“C_6-10芳基”、“C₆或C₁₀芳基”或类似的名称。芳基基团的实例包括但不限于苯基、萘基、甘菊环基(azulenyl)和蒽基。

如本文所用，“芳氧基”和“芳硫基”是指RO-和RS-，其中R是如上定义的芳基，例如“C_6-10芳氧基”或“C_6-10芳硫基”等，包括但不限于苯氧基。

“芳烷基”或“芳基烷基”是通过亚烷基基团作为取代基连接的芳基，例如“C_7-14芳烷基”等，包括但不限于苄基、2-苯乙基、3-苯丙基和萘基烷基。在某些情况下，亚烷基基团是低级亚烷基基团(即C_1-4亚烷基基团)。

如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系统(即，共享两个相邻原子的两个或多个稠环)。当杂芳基是环系统时，该系统中的每个环都是芳族的。杂芳基基团可具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子数，包括碳原子和杂原子)，但本发明的定义也涵盖其中未指定数值范围的术语“杂芳基”的出现。在一些实施方案中，杂芳基基团具有5至10个环成员或5至7个环成员。杂芳基基团可以被指定为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。在各种实施方案中，杂芳基含有1至4个杂原子、1至3个杂原子、1至2个杂原子或1个杂原子。例如，在各种实施方案中，杂芳基含有1至4个氮原子、1至3个氮原子、1至2个氮原子、2个氮原子和1个硫原子或氧原子、1个氮原子和1个硫原子或氧原子、或1个硫原子或氧原子。杂芳基环的实例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。

“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”是通过亚烷基基团作为取代基连接的杂芳基基团。实例包括但不限于2-噻吩基甲基、3-噻吩基甲基、呋喃基甲基、噻吩基乙基、吡咯基烷基、吡啶基烷基、异噁唑基烷基(isoxazollylalkyl)和咪唑基烷基。在某些情况下，亚烷基基团是低级亚烷基基团(即C_1-4亚烷基基团)。

如本文所用，“碳环基”是指在环系统骨架中仅含有碳原子的非芳族环状环或环系统。当碳环基是环系统时，两个或多个环可以以稠合、桥接或螺连接的方式连接在一起。碳环基可具有任意饱和度，条件是环系统中的至少一个环不是芳族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可具有3至20个碳原子，但本发明的定义也涵盖其中没有指定数值范围的术语“碳环基”的出现。碳环基基团还可以是具有3至10个碳原子的中等大小的碳环基。碳环基基团也可以是具有3至6个碳原子的碳环基。碳环基基团可以被指定为“C_3-6碳环基”或类似的名称。碳环基环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基和螺[4.4]壬基。

“(碳环基)烷基”是通过亚烷基基团作为取代基连接的碳环基基团，例如“C_4-10(碳环基)烷基”等，包括但不限于环丙基甲基、环丁基甲基、环丙基乙基、环丙基丁基、环丁基乙基、环丙基异丙基、环戊基甲基、环戊基乙基、环己基甲基、环己基乙基、环庚基甲基等。在某些情况下，亚烷基基团是低级亚烷基基团。

如本文所用，“环烷基”是指完全饱和的碳环基环或环系统。实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

如本文所用，“环烯基”是指具有至少一个双键的碳环基环或环系统，其中环系统中没有环是芳族的。实例是环己烯基。

如本文所用，“杂环基”是指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系统。杂环基可以以稠合、桥接或螺连接的方式连接在一起。杂环基可具有任意饱和度，条件是环系统中的至少一个环不是芳族的。(多个)杂原子可以存在于环系统中的非芳族环或芳族环中。杂环基基团可具有3至20个环成员(即，构成环骨架的原子数，包括碳原子和杂原子)，但本发明的定义也涵盖其中没有指定数值范围的术语“杂环基”的出现。杂环基基团也可以是具有3至10个环成员的中等大小的杂环基。杂环基基团也可以是具有3至6个环成员的杂环基。杂环基基团可以被指定为“3-6元杂环基”或类似的名称。

在各种实施方案中，杂环基含有1至4个杂原子、1至3个杂原子、1至2个杂原子或1个杂原子。例如，在各种实施方案中，杂环基含有1至4个氮原子、1至3个氮原子、1至2个氮原子、2个氮原子和1个硫原子或氧原子、1个氮原子和1个硫原子或氧原子、或1硫原子或氧原子。在优选的六元单环杂环基中，(多个)杂原子选自O、N或S中的一个至三个，在优选的五元单环杂环基中，(多个)杂原子选自从O、N或S选择的一个或两个杂原子。杂环基环的实例包括但不限于，氮杂基(azepinyl)、吖啶基、咔唑基、噌啉基(cinnolinyl)、二氧杂环戊烷基(dioxolanyl)、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基(oxiranyl)、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基(pyrrolidonyl)、吡咯烷酮基(pyrrolidionyl)、4-哌啶基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二氧杂环己烯基(dioxinyl)、1,3-二噁烷基、1,4-二氧杂环己烯基(dioxinyl)、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基(1,3-oxathianyl)、1,4-氧硫杂环己烯基(1,4-oxathiinyl)、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-二氧杂环戊烯基(1,3-dioxolyl)、1,3-二氧杂环戊烷基(1,3-dioxolanyl)、1,3-二硫杂环戊烯基(1,3-dithiolyl)、1,3-二硫杂环戊烷基(1,3-dithiolanyl)、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异吲哚啉基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。

“(杂环基)烷基”是通过亚烷基基团作为取代基连接的杂环基基团。实例包括但不限于咪唑啉基甲基和吲哚啉基乙基。

如本文所用，“酰基”是指-C(＝O)R，其中R是如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。非限制性实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基和丙烯酰基。

“O-羧基”基团是指“-OC(＝O)R”基团，其中R选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“C-羧基”基团是指“-C(＝O)OR”基团，其中R选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。非限制性实例包括羧基(即-C(＝O)OH)。

“氰基”基团是指“-CN”基团。

“氰酰基”基团是指“-OCN”基团。

“异氰酰基”基团是指“-NCO”基团。

“硫氰基”基团是指“-SCN”基团。

“异硫氰基”基团是指“-NCS”基团。

“亚磺酰基”基团是指“-S(＝O)R”基团，其中R选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“磺酰基”基团是指“-SO₂R”基团，其中R选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“S-磺酰氨基”基团是指“-SO₂NR_AR_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“N-磺酰氨基”基团是指“-N(R_A)SO₂R_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“O-氨基甲酰基”基团是指“-OC(＝O)NR_AR_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“N-氨基甲酰基”基团是指“-N(R_A)OC(＝O)R_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“O-硫代氨基甲酰基”基团是指“-OC(＝S)NR_AR_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“N-硫代氨基甲酰基”基团是指“-N(R_A)OC(＝S)R_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“C-酰氨基”基团是指“-C(＝O)NR_AR_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“N-酰氨基”基团是指“-N(R_A)C(＝O)R_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“氨基”基团是指“-NR_AR_B”基团，其中R_A和R_B各自独立地选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。

“氨基烷基”基团是指通过亚烷基基团连接的氨基基团。

“烷氧基烷基”基团是指通过亚烷基基团连接的烷氧基基团，例如“C_2-8烷氧基烷基”等。

如本文所用，“天然氨基酸侧链”是指天然存在的氨基酸的侧链取代基。天然存在的氨基酸具有与α-碳连接的取代基。天然存在的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

如本文所用，“非天然氨基酸侧链”是指非天然存在的氨基酸的侧链取代基。非天然氨基酸包括β-氨基酸(β³和β²)、同源氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸和N-甲基氨基酸。示例性的非天然氨基酸可从Sigma-Aldridge获得，列于“非天然氨基酸和衍生物”下。还参见Travis S.Young和Peter G.Schultz,“Beyond the Canonical 20Amino Acids:Expanding the Genetic Lexicon,”J.Biol.Chem.2010 285:11039-11044，其全部内容通过引用并入本文。

如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已经存在一个或多个氢原子替换为另一个原子或基团。除非另有说明，否则当基团被认为是“取代的”时，意指该基团被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：C₁-C₆烷基、C₁-C₆烯基、C₁-C₆炔基、C₁-C₆杂烷基、C₃-C₇碳环基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、C₃-C₇-碳环基-C₁-C₆-烷基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5-10元杂环基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5-10元杂环基-C₁-C₆-烷基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、芳基(C₁-C₆)烷基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、5-10元杂芳基(C₁-C₆)烷基(任选地被卤素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆卤代烷基和C₁-C₆卤代烷氧基取代)、卤素、氰基、羟基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基(C₁-C₆)烷基(即醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤代(C₁-C₆)烷基(例如-CF₃)、卤代(C₁-C₆)烷氧基(例如-OCF₃)、C₁-C₆烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C₁-C₆)烷基、硝基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酰基、异氰酰基、硫氰基、异硫氰基、亚磺酰基、磺酰基和氧基(＝O)。无论何处将基团描述为“任选取代的”，该基团可以被上述取代基取代。

在一些实施方案中，(多个)取代的基团被一个或多个取代基取代，所述取代基各自独立地选自C₁-C₄烷基、氨基、羟基和卤素。

应理解，取决于背景，某些自由基命名规则可包括单自由基或双自由基。例如，当取代基需要与分子其余部分有两个连接点时，应理解取代基是双自由基。例如，被鉴定为需要两个连接点的烷基的取代基包括双自由基，例如–CH₂–、–CH₂CH₂–、–CH₂CH(CH₃)CH₂–等。其他自由基命名规则清楚地表明该自由基是双自由基，例如“亚烷基”或“亚烯基”。

当两个R基团被称为“与它们所连接的原子一起”形成环(例如，碳环基、杂环基、芳基或杂芳基环)时，意指该原子和两个R基团的集合单元是所述环。当单独采用时，环不受每个R基团的定义的限制。例如，当存在以下子结构：

并且R¹和R²被定义为选自由氢和烷基组成的组，或R¹和R²与它们所连接的氮一起形成杂环基时，意指R¹和R²可选自氢或烷基，或者，子结构具有以下结构：

其中环A是含有所示氮的杂环基环。

类似地，当两个“相邻”R基团被称为“与它们所连接的原子一起”形成环时，意指该原子、中间键和两个R基团的集合单元是所述环。例如，当存在以下子结构：

并且R¹和R²被定义为选自由氢和烷基组成的组，或R¹和R²与它们所连接的原子一起形成芳基或碳环基时，意指R¹和R²可选自氢或烷基，或者，子结构具有以下结构：

其中A是芳基环或含有所示双键的碳环基。

无论何处将取代基描述为双自由基(即，与分子其余部分具有两个连接点)，应理解，除非另有说明，否则取代基可以以任意方向构型连接。因此，例如，被描述为-AE-或

的取代基包括被定向以使A连接在分子的最左侧连接点以及A连接在分子的最右侧连接点的情况的取代基。

如本文所用，化学基团的“等排体(isostere)”是表现出相同或相似性质的其他化学基团。例如，四唑是羧酸的等排体，因为它模仿羧酸的性质，即使它们都具有非常不同的分子式。四唑是羧酸的许多可能的等排替代物之一。预期的其他羧酸等排体包括-SO₃H、-SO₂HNR、-PO₂(R)₂、-PO₃(R)₂、-CONHNHSO₂R、-COHNSO₂R和-CONRCN，其中R选自如本文所定义的氢、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7碳环基、C_6-10芳基、5-10元杂芳基和3-10元杂环基。此外，羧酸等排体可包括处于任意化学稳定氧化态的5-7元碳环或杂环(含有CH₂、O、S或N的任意组合)，其中所述环结构的任意原子任选地在一个或多个位置被取代。以下结构是预期的碳环和杂环等排体的非限制性实例。所述环结构的原子可以在一个或多个位置任选地被如上所定义的R取代。

还预期当将化学取代基加入到羧酸等排体中时，该化合物保留羧酸等排体的性质。预期当羧酸等排体任选地被一个或多个选自如上定义的R的部分取代时，那么对取代和取代位置进行选择使得它不消除该化合物的羧酸等排性质。类似地，还预期在碳环或杂环羧酸等排体上放置一个或多个R取代基不是在一个或多个维持化合物的羧酸等排性质或化合物的羧酸等排性质不可或缺的原子上的取代，如果这样的取代基会破坏化合物的羧酸等排性质的话。

还考虑了在本说明书中未具体举例说明的其他羧酸等排体。

术语“试剂”或“测试剂”包括任意物质、分子、元素、化合物、实体或其组合。它包括但不限于例如蛋白质、多肽、肽或模拟物、有机小分子、多糖、多核苷酸等。它可以是天然产物、合成化合物或化学化合物、或两种或更多种物质的组合。除非另有说明，否则术语“试剂”、“物质”和“化合物”在本文中可互换使用。

本文使用的术语“类似物”是指在结构上类似于参照分子但已经通过用替代取代基取代参照分子的特定取代基而以靶向和受控方式进行修饰的分子。与参照分子相比，本领域技术人员可以预期类似物表现出相同、相似或改善的效用。为了找到具有改善特征(例如对靶分子的结合亲和力更高)的已知化合物的变体而进行的类似物的合成和筛选是药物化学中众所周知的方法。

化合物

在一些实施方案中，钙蛋白酶抑制剂可以选自具有式I的结构的化合物：

或其药学上可接受的盐或前药，其中：

R¹是-C_1-6烷基或-(CH₂)_n-C_6-10芳基，其任选地被一个、两个或三个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：-卤素、-C_1-6烷基、-C_1-6卤代烷基、-C_1-6烷氧基和-C_1-6卤代烷氧基；

Z是-NR²R³或-OR⁴；

R²是-氢或-C_1-6烷基；

R³是-氢、-C_1-6烷基、-C_3-10环烷基或-OR⁴；

R⁴是-氢或-C_1-6烷基；

n是1或2。

在一些实施方案中，式(1)的化合物具有式(I-a)

其中：

X是S或NR⁵；

Y是CH或N；

R⁵是-氢或-C_1-6烷基；

每个R⁶独立地选自由以下组成的组：-卤素、-C_1-6烷基、-C_1-6卤代烷基、-C_1-6烷氧基和-C_1-6卤代烷氧基；且

m是0、1、2或3。

在一些实施方案中，X可以是S。在其他实施方案中，X可以是NR⁵。在一些具体实施方案中，R⁵可以是氢或-CH₃。

在一些实施方案中，Y可以是CH。在其他实施方案中，Y可以是N。

在一些实施方案中，X可以是S且Y可以是N。在其他实施方案中，X可以是NR⁵且Y可以是CH。

在一些实施方案中，R⁶可以独立地是-F、-Cl、-CH₃、-CF₃、-OCH₃或-OCF₃。

在一些实施方案中，其中m可以是0、1、2或3。

在一些实施方案中，式(1)的化合物具有式(I-b)

其中：

每个R⁷独立地选自由以下组成的组：-卤素、-C_1-6烷基、-C_1-6卤代烷基、-C_1-6烷氧基和-C_1-6卤代烷氧基；且

t是0、1、2或3。

在一些实施方案中，每个R⁷可以独立地是-F、-Cl、-CH₃、-CF₃、-OCH₃或-OCF₃。

在一些实施方案中，t可以是0、1、2或3。

在本文描述的一些实施方案中，Z可以是-NR²R³。在一些实施方案中，R²可以是-氢。在一些实施方案中，R³可以是-氢、-CH₃或-环丙基。在其他实施方案中，R³可以是-OH或-OCH₃。

在一些实施方案中，Z可以是-OR⁴。在一些实施方案中，R⁴可以是-氢或-CH₃。

在一些实施方案中，化合物可以选自由以下组成的组：

及其药学上可接受的盐。

第二药剂

本文所述化合物可以与一种或多种第二药剂组合施用。在一些实施方案中，上述化合物可以与一种第二药剂组合施用。在一些实施方案中，上述化合物可以与两种第二药剂组合施用。在一些实施方案中，上述化合物可以与三种或更多种第二药剂组合施用。

在一些实施方案中，本文所述化合物可以与一种或多种第二药剂同时施用。在其他实施方案中，本公开的化合物可以与一种或多种第二药剂相继施用。

在一些实施方案中，第二药剂可以是：囊泡单胺转运蛋白2抑制剂，包括但不限于丁苯那嗪和氘代丁苯那嗪；抗抑郁药，包括但不限于西酞普兰、依他普仑、氟西汀和舍曲林；抗精神病药物，包括但不限于喹硫平、利培酮、氟哌啶醇和氯丙嗪；或情绪稳定剂，包括但不限于丙戊酸盐、卡马西平和拉莫三嗪。另外的第二药剂包括但不限于：左旋多巴、巴氯芬和肉毒杆菌毒素。

治疗方法

在一些实施方案中，本文公开的化合物是钙蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，这些化合物可以有效地充当CAPN1、CAPN2和/或CAPN9抑制剂。一些实施方案提供了药物组合物，其包含一种或多种本文公开的化合物和药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，本文所述的化合物和包含所述化合物的组合物可用于治疗由一些蛋白质中的多聚谷氨酰胺束扩大引起的多种神经病况。示例性病况包括但不限于亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩症、脊髓延髓性肌萎缩症、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、脊髓小脑共济失调2型(SCA2)、脊髓小脑共济失调6型(SCA6)、脊髓小脑共济失调7型(SCA7)或脊髓小脑共济失调17型(SCA17)。

在一些实施方案中，本文公开的化合物和包含化合物的药物组合物可用于治疗亨廷顿氏病。不受特定理论的限制，钙蛋白酶介导的亨廷顿蛋白(Htt)裂解可能导致神经变性和亨廷顿氏病的进展。与野生型Htt相比，钙蛋白酶抗性Htt突变细胞表现出降低的Htt聚集和细胞毒性。Gafni et al,J.Biol.Chem.2004,279,20211-20220。在HD敲入鼠模型中，纹状体和皮质中的钙蛋白酶活性和Htt蛋白水解增加。钙蛋白酶抑制因子(一种内源性钙蛋白酶抑制剂)的过表达改善了小鼠的疾病发病机制和症状，而钙蛋白酶抑制因子的去除则加剧了细胞和小鼠体内的Htt聚集。Menzies et al.,Cell Death Diff.2015,22,433-444；Weber et al,Neuropharmacol.2008,133(1),94-106。与对照相比，人类亨廷顿氏病患者中的钙蛋白酶活化增加。此外，HD组织中主要的Htt片段似乎来源于钙蛋白酶裂解。Gafni etal,J.Neurosci.2002,22(12),4842-4849。

在一些实施方案中，本文公开的化合物和包含化合物的药物组合物可用于治疗马查多-约瑟夫病(MJD)。不受特定理论的限制，钙蛋白酶裂解扩大的多聚谷氨酰胺重复中的共济失调蛋白-3，并且抑制钙蛋白酶消除了MJD细胞中神经元包涵体的破碎和形成。Haackeet al.,J.Biol.Chem.2007,282,18851-18856；Hubener,2013,Hum Mol Genetics；Koch,2011,Nature。钙蛋白酶抑制因子的去除导致MJD小鼠突变型共济失调蛋白-3片段、核包涵体和神经变性增加。Hubener,2013,Hum Mol Genetics。钙蛋白酶抑制因子的过表达减少了MJD小鼠中突变型共济失调蛋白-3包涵体的大小和数量以及神经变性(Simoes,2012,Brain)，且施用钙蛋白酶抑制剂减少了突变型共济失调蛋白-3的聚集和细胞变性，并防止了运动行为缺陷(Simoes,2014,Hum Mol Genetics)。钙蛋白酶还裂解MJD患者来源的细胞和死后脑组织中的共济失调蛋白-3。Weber,2017,Brain。

在一些实施方案中，本文公开的化合物和包含化合物的药物组合物可用于治疗与蛋白质聚集相关的其他神经疾病或病症。示例性病况包括但不限于肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆和朊病毒病。

施用和药物组合物

化合物以治疗有效剂量施用。虽然人体剂量水平尚未针对本文所述化合物进行优化，但通常，每日剂量可为约0.25mg/kg至约120mg/kg体重或更高，约0.5mg/kg或更低至约70mg/kg，约1.0mg/kg至约50mg/kg体重，或约1.5mg/kg至约10mg/kg体重。因此，对于向70kg的人施用，剂量范围为约17mg/天至约8000mg/天，约35mg/天或更低至约7000mg/天或更高，约70mg/天至约6000mg/天，约100mg/天至约5000mg/天，或约200mg至约3000mg/天。当然，施用的活性化合物的量将取决于受试者和所治疗的疾病状态、痛苦的严重程度、施用方式和计划以及处方医师的判断。

本文公开的化合物或其药学上可接受的盐的施用可以通过用于具有类似用途的药剂的任意可接受的施用方式，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、局部、透皮、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道、直肠或眼内。

可以将如上所述有用的化合物配制成用于治疗这些病况的药物组合物。使用标准药物制剂技术，例如Remington的The Science and Practice of Pharmacy，第21版本，Lippincott Williams&Wilkins(2005)(通过引用整体并入本文)中公开的那些技术。因此，一些实施方案包括药物组合物，其包括：(a)安全且治疗有效量的本文所述化合物(包括其对映异构体、非对映异构体、互变异构体、多晶型物和溶剂化物)，或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或其组合。

除了如上所述有用的所选化合物之外，一些实施方案还包括含有药学上可接受的载体的组合物。术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分均不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。另外，可以包括例如本领域常用的各种佐剂。例如，在Gilman等人(编辑)(1990)；Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Pergamon Press(其全部内容通过引用并入本文)中描述了在药物组合物中包含各种组分的考虑因素。

可用作药学上可接受的载体或其组分的物质的一些实例是糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如TWEENS；润湿剂，如十二烷基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐水；和磷酸盐缓冲溶液。

与主题化合物联合使用的药学上可接受的载体的选择基本上由化合物的施用方式决定。

本文所述的组合物优选以单位剂型提供。如本文所用，“单位剂型”是含有一定量的化合物的组合物，所述组合物适于根据良好的医学实践以单一剂量施用给动物，优选哺乳动物受试者。然而，单一剂型或单位剂型的制备并不意味着每天或每疗程施用一次该剂型。预期此类剂型每天施用一次、两次、三次或更多次，并且可以在一段时间内(例如，约30分钟至约2-6小时)作为输注施用，或作为连续输注施用，并且可以在一个疗程中施用超过一次，尽管没有特别排除单次施用。技术人员将认识到该制剂没有特别考虑整个疗程，并且这些决定留给治疗领域而非制剂领域的技术人员。

如上所述有用的组合物可以是用于多种施用途径(例如用于口服、鼻腔、直肠、局部(包括透皮)、眼部、脑内、颅内、鞘内、动脉内、静脉内、肌肉内或其他肠道外施用途径)的多种合适形式中的任意一种。技术人员将理解，口服和鼻腔组合物包含通过吸入施用并使用可用的方法制备的组合物。根据所需的特定施用途径，可以使用本领域熟知的多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括，例如，固体或液体填充剂、稀释剂、助溶剂、表面活性剂和包封物质。可以包括基本上不干扰化合物的抑制活性的任选的药物活性物质。与化合物联合使用的载体的量足以提供每单位剂量化合物施用的物质的实际量。用于制备可用于本文所述方法的剂型的技术和组合物描述于以下参考文献中，所有文献均通过引用并入本文：Modern Pharmaceutics,第4版,第9章和第10章(Banker&Rhodes,编辑,2002)；Lieberman等人,Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets(1989)；和Ansel,Introductionto Pharmaceutical Dosage Forms第8版(2004)。

可以使用多种口服剂型，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和散装粉剂等固体形式。片剂可以是压片的、片剂研磨剂、包有肠溶衣的、包有糖衣的、薄膜包衣的或多重压片的，其含有合适的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂、流动诱导剂和熔化剂。液体口服剂型包括水溶液、乳剂、混悬剂、由非泡腾颗粒重构的溶液和/或混悬剂、以及由泡腾颗粒重构的泡腾制剂，其含有合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、熔化剂、着色剂和调味剂。

适于制备用于口服施用的单位剂型的药学上可接受的载体是本领域熟知的。片剂通常包含常规的药学上相容的佐剂作为惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂，如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂，如淀粉、海藻酸和交联羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石粉。诸如二氧化硅的助流剂可用于改善粉末混合物的流动特性。可以添加着色剂(例如FD&C染料)用于外观。甜味剂和调味剂(例如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果调味剂)是可咀嚼片剂的有用佐剂。胶囊剂通常包含一种或多种上文公开的固体稀释剂。载体组分的选择取决于并不关键的次要考虑因素如味道、成本和货架稳定性，并且可以由本领域技术人员容易地做出。

口服组合物还包括液体溶液、乳剂、混悬剂等。适用于制备此类组合物的药学上可接受的载体是本领域熟知的。用于糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬剂的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨糖醇和水。对于混悬剂，典型的悬浮剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、AVICEL RC-591、黄蓍胶和海藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚山梨醇酯80；典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。口服液体组合物还可含有一种或多种组分，例如上面公开的甜味剂、调味剂和着色剂。

此类组合物还可以通过常规方法包衣，通常使用pH或时间依赖性包衣，使得主题化合物在胃肠道中在期望的局部施用附近释放，或在不同时间释放以使所期望的作用延长。此类剂型通常包括但不限于邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、Eudragit包衣、蜡和虫胶中的一种或多种。

本文所述的组合物可任选地包含其他药物活性物质。

用于实现主题化合物的全身递送的其他组合物包括舌下、口腔和鼻腔剂型。此类组合物通常包含一种或多种可溶性填充物质，例如蔗糖、山梨糖醇和甘露醇；和粘合剂，例如阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。还可包括上文公开的助流剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、抗氧化剂和调味剂。

配制用于局部眼科使用的液体组合物，使其可以向眼睛局部施用。应尽可能地使舒适度最大化，但是有时制剂考虑因素(例如药物稳定性)可能迫使低于最佳舒适度。在不能使舒适度最大化的情况下，应该配制液体使得液体对于患者的局部眼科使用是可耐受的。另外，眼科上可接受的液体应该包装成一次性使用或者含有防腐剂以防止多次使用间的污染。

对于眼科应用，通常使用生理盐水溶液作为主要溶媒来制备溶液或药物。眼科溶液应优选用适当的缓冲系统保持在舒适的pH。制剂还可含有常规的药学上可接受的防腐剂、稳定剂和表面活性剂。

可用于本文公开的药物组合物的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、PHMB、氯丁醇、硫柳汞、苯基汞、乙酸盐和硝酸苯汞。有用的表面活性剂是例如吐温80。类似地，多种有用的溶媒可用于本文公开的眼用制剂中。这些溶媒包括但不限于聚乙烯醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和纯净水。

可以根据需要或方便添加张力调节剂。它们包括但不限于盐(特别是氯化钠、氯化钾)、甘露醇和甘油，或任意其它合适的眼科上可接受的张力调节剂。

可以使用多种缓冲剂和手段来调节pH，只要所得制剂是眼科上可接受的即可。对于许多组合物，pH将在4和9之间。因此，缓冲剂包括乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂和硼酸盐缓冲剂。根据需要，可以使用酸或碱来调节这些制剂的pH。

以类似的方式，眼科上可接受的抗氧化剂包括但不限于偏亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、乙酰半胱氨酸、丁基化羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯。

可以包括在眼科制剂中的其他赋形剂组分是螯合剂。有用的螯合剂是依地酸二钠，但也可以使用其它螯合剂替代依地酸二钠或与其结合使用。

对于局部使用，使用含有本文公开的化合物的乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂或混悬剂等。局部制剂通常可以包含药物载体、共溶剂、乳化剂、渗透增强剂、防腐剂体系和润肤剂。

对于静脉内施用，可以将本文所述的化合物和组合物溶解或分散在药学上可接受的稀释剂(例如盐水或右旋糖溶液)中。可包含合适的赋形剂以达到所需的pH，所述赋形剂包括但不限于NaOH、碳酸钠、乙酸钠、HCl和柠檬酸。在各种实施方案中，最终组合物的pH范围为2至8，或优选4至7。抗氧化剂赋形剂可包括亚硫酸氢钠、丙酮亚硫酸氢钠、甲醛钠、次硫酸盐(sulfoxylate)、硫脲和EDTA。在最终静脉内组合物中可见的合适赋形剂的其他非限制性实例可包括磷酸钠或磷酸钾、柠檬酸、酒石酸、明胶和碳水化合物如右旋糖、甘露糖醇和葡聚糖。其他可接受的赋形剂描述于Powell,et al.,Compendium of Excipients forParenteral Formulations,PDA J Pharm Sci and Tech 1998,52 238-311和Nema etal.,Excipients and Their Role in Approved Injectable Products:Current Usageand Future Directions,PDA J Pharm Sci and Tech 2011,65 287-332(均通过引用整体并入本文)。还可以包括抗微生物剂以获得抑制细菌或抑制真菌的溶液，所述抗微生物剂包括但不限于硝酸苯汞、硫柳汞、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯酚、甲酚和氯丁醇。

用于静脉内施用的组合物可以以一种或多种固体的形式提供给照护者，在施用前不久用合适的稀释剂(如无菌水、盐水或右旋糖)使该固体在水中重构。在其他实施方案中，组合物以溶液提供，准备肠胃外施用。在其他实施方案中，组合物以溶液提供，该溶液在施用前进一步被稀释。在包括施用本文所述化合物和另一种药剂的组合的实施方案中，该组合可以作为混合物提供给照护者，或者照护者可以在施用前将这两种药剂混合，或者这两种药剂可以分开施用。

本文所述活性化合物的实际剂量取决于具体化合物和待治疗的病况；适当剂量的选择完全在技术人员的知识范围内。

如果需要，本文所述的化合物和组合物可以存在于包含一个或多个含有活性成分的单位剂型的包装或分配器装置中。这种包装或装置可以例如包括金属或塑料箔(如泡罩包装)或玻璃以及橡胶塞(如小瓶中的)。包装或分配器装置可附有施用说明。将本文所述的化合物和组合物配制在相容性药物载体中，也可以制备、置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的病况。

制剂中化合物的量可以在本领域技术人员使用的全部范围内变化。通常，以重量百分比(wt％)为基础，制剂将包含基于总制剂的约0.01至约99.99wt％的本技术的化合物，余量为一种或多种合适的药物赋形剂。优选地，化合物的存在水平为约1至约80wt％。代表性的药物制剂描述如下。

制剂实施例

以下是含有式I化合物的代表性药物制剂。

制剂实施例1——片剂制剂

使以下成分充分混合并压制成单刻痕片剂。

制剂实施例2——胶囊制剂

使以下成分充分混合并装入硬壳明胶胶囊中。

制剂实施例3——混悬剂制剂

将以下成分混合以形成用于口服施用的混悬剂。

制剂实施例4——可注射制剂

将以下成分混合以形成可注射制剂。

制剂实施例5——栓剂制剂

通过将本技术的化合物与

H-15(饱和植物脂肪酸的甘油三酯；RichesNelson公司，纽约)混合来制备总重2.5g的栓剂，所述栓剂具有以下组成：

出于说明目的，包括以下实施例。当然，不应将这些实施例解释为具体限制本公开的范围。在权利要求范围内的这些实施例的变化在本领域技术人员的视界内，并且被认为落入本文所述和要求保护的本发明的范围内。读者将认识到，具备本公开内容的技术人员和本领域技术人员能够在没有详尽实施例的情况下制备和使用本文公开的主题。以下实施例将进一步描述本发明，并且仅用于说明的目的，不应视为限制。

实施例

实施例1—钙蛋白酶抑制

通过连续荧光测定法来评估钙蛋白酶1、2和9的活性及其抑制。对SensoLyte 520钙蛋白酶底物(Anaspec Inc)进行了优化，以检测钙蛋白酶活性。该底物包含内部淬火的5-FAM/QXLTM 520FRET对。钙蛋白酶1、2和9将FRET底物切割成两个独立的片段，导致5-FAM荧光增加，其与钙蛋白酶活性成正比。

测定通常使用如下自动化液体处理在黑色384孔板中进行。钙蛋白酶测定碱性缓冲液通常含有50mM Tris(pH 7.5)、100mM NaCl和1mM DTT。将抑制剂在DMSO中连续稀释，并用于在上述缓冲液中与钙蛋白酶一起建立2x混合物。在环境温度(25℃)孵育后，通过在相同缓冲液中加入荧光肽底物和CaCl₂(原位钙蛋白酶活化所需)的2x混合物来引发反应。通常在SpectraMax i3x或FLIPR-Tetra读板器(Molecular Devices Inc)上使用490nm/520nm的激发/发射波长来收集10分钟的反应进程曲线数据。通常从1-5分钟内的进程曲线斜率来计算反应速率。通常将剂量响应曲线(速率对抑制剂浓度的对数)拟合为4参数逻辑函数以提取IC₅₀值。

通过使用细胞渗透性和前荧光钙蛋白酶底物Suc-LLVY-AMC(Sigma-Aldrich Inc)的均相荧光测定法来评估SH-SY5Y细胞中的钙蛋白酶活性及其抑制。在细胞内钙蛋白酶切割Suc-LLVY-AMC后，荧光氨基-甲基-香豆素(AMC)被释放到培养基中，导致荧光信号的连续增加，荧光信号与细胞内钙蛋白酶活性成正比。

测定通常通过如下方法进行：在含有1％血清的RPMI-1640中以40k/孔在黑色384孔板中接种SH-SY5Y细胞，然后37℃过夜孵育。第二天早上，将细胞与连续稀释的化合物一起预孵育30分钟，然后加入100μM的Suc-LLVY-AMC底物。使用FLIPR Tetra读板器(Molecular Devices Inc)监测AMC荧光的连续增加，并测量斜率以报告钙蛋白酶活性。通常将剂量响应曲线(斜率对抑制剂浓度的对数)拟合为4参数逻辑函数以提取IC50值。

还通过基于蛋白质印迹的测定法来评估SH-SY5Y细胞中的钙蛋白酶活性及其抑制，该基于蛋白质印迹的测定法测量非红细胞血影蛋白(SBDP-150)的α链的钙蛋白酶特异性分解产物。添加钙离子载体A23187用于诱导钙蛋白酶活性和SBDP-150形成。

通过在含3mM氯化钙的无血清MEM和F12培养基(1:1混合物)中以250k/孔将SH-SY5Y细胞加入96孔板中来进行这些测定。然后将细胞与连续稀释的化合物一起预孵育20分钟，然后加入5μM A23187并进一步孵育30分钟。板离心后，除去培养基上清液。将细胞沉淀溶解在含有5mM EDTA和蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合物(Thermofisher Inc)的MPER缓冲液中，并储存在-80℃直到分析。将裂解样品解冻并离心，上清液用于在Jess平台(ProteinSimple Inc.)上使用AA6抗体(Enzo Inc.)对血影蛋白分解产物(SBDP)进行定量。GAPDH和HSP60作为内参蛋白进行测量。将标准化的SBDP水平对抑制剂浓度的对数作图，得到剂量响应曲线，通常将其拟合为4参数逻辑函数以提取IC₅₀值。

表1：钙蛋白酶抑制测定数据

实施例2—神经学数据

从立体定位注射前2天开始，每天使用20G管饲针将本文公开的化合物口服施用于下述小鼠模型(30mg/kg，在1％吐温80盐水中，体积等于5mL/kg)，直至处死。对小鼠进行下述分析，并与未接受受试化合物的对照进行比较。

小脑颗粒神经元的培养

大鼠小脑颗粒神经元的原代培养物由P7出生后的Wistar大鼠幼鼠制备。解剖小脑，并用溶于不含Ca²⁺-和Mg²⁺的Krebs缓冲液(120mM NaCl，5mM KCl，1.2mM KH₂PO₄，13mM葡萄糖，15mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)，0.3％BSA，pH 7.4)中的胰蛋白酶(0.01％，15min，及37℃，Sigma，T0303)和DNase(0.045mg/ml，Sigma，D5025)解离。然后用含有胰蛋白酶抑制剂(0.3mg/ml,Sigma,T9128)的Krebs缓冲液洗涤小脑以终止胰蛋白酶活性。细胞在该溶液中解离，离心，然后重悬于补充有25mM KCl、30mM葡萄糖、26mM NaHCO₃、1％青霉素-链霉素(100U/ml，100mg/ml)和10％胎牛的基础培养基Eagle中。将细胞铺在涂有聚-D-赖氨酸的6或12孔板(1×10⁶或5×10⁵细胞/孔)上。将培养物在潮湿的培养箱中保持3周(5％CO₂/95％空气，在37℃)。

动物

使用四周龄的C57BL/6J小鼠(Charles River)。这些动物被关在一个保持12小时光照/12小时黑暗周期的温控室内。食物和水是随意提供的。这些实验是根据欧盟指令2010/63/EU进行的，该指令涵盖了对用于科学目的的动物的保护。

病毒载体生产

用四质粒系统在293T细胞中产生编码人野生型共济失调蛋白-3的慢病毒载体(ATX-3 27Q)或编码人突变型共济失调蛋白-3的慢病毒载体(ATX-3 72Q)，如先前在deAlmeida et al,Neurobiol.Dis.,2001,8,433–446中所述。将慢病毒颗粒重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％牛血清白蛋白(BSA)中。通过评估HIV-1p24抗原水平(RETROtek，Gentaur，Paris，France)来确定批次的病毒颗粒含量。病毒储备液储存在-80℃直到使用。

小脑颗粒神经元的慢病毒感染

在铺板后1天(1DIV)，用慢病毒载体以10ng p24抗原/10⁵个细胞的比率感染细胞培养物(参见Zala et al.,Neurobiol.Dis.2005,20,785-798)。在2DIV，用新鲜制备的培养基替换培养基，并加入两种不同浓度的本发明化合物(50和100nM，在DMSO中)。DMSO用作对照。每3天更换一次培养基加抑制剂或DMSO。

纹状体和小脑中的体内注射

将浓缩的病毒储备液在冰上解冻。将编码人野生型共济失调蛋白-3的慢病毒载体(ATX-3 27Q)或编码人突变型共济失调蛋白-3的慢病毒载体(ATX-3 72Q)立体定向注射入纹状体，坐标如下：前后：+0.6mm；内外：+1.8mm；背腹：23.3mm；并注射入小脑，坐标如下：前后：22.4mm；内外：0mm；背腹：22.9mm。通过施用阿佛丁(200mg/g，腹膜内)麻醉动物。

对于蛋白质印迹方法和RNA提取，野生型小鼠每侧接受单次2mL注射0.3mg p24/mL慢病毒：左侧半脑(ATX-3 27Q)和右侧半脑(ATX-3 72Q)。对于免疫组织化学方法，野生型小鼠每侧接受单次1ml注射0.4mg p24/mL慢病毒：左侧半脑(ATX-3 27Q)和右侧半脑(ATX-372Q)。将小鼠在它们的家笼中饲养4或8周，然后分别处死用于蛋白质印迹分析和RNA提取或免疫组织化学分析。

对于行为分析和小脑形态学评估，野生型小鼠接受单次4mL注射0.25mgp24/mL编码ATX-3 72Q的慢病毒。相同年龄的未注射小鼠

用作对照。

行为评估

从4周龄开始对小鼠进行运动测试。让动物在一个安静的房间中适应1小时，该房间温度和通风得到控制，光线变暗，并在行为测试之前进行处理，以克服可能对表现产生重大影响的动物的自然恐惧和焦虑反应。在评估下一只小鼠之前，用10％乙醇溶液的湿布将所有装置擦拭干净并干燥。

横梁平衡/行走：通过测量小鼠穿过一系列分级窄横梁到达封闭安全平台的能力来评估小鼠的运动协调和平衡(Carter et al.,J.Neurosci.,1999,19,3248–3257)。横梁由18或9mm平方宽、9或6mm圆形直径截面的长木条(1m)组成。横梁水平放置，高出工作台表面25cm，一端安装在一个窄支架上，另一端连接到一个封闭的盒子(20cm平方)上，小鼠可以逃到盒子里面。将一盏60W的台灯放在靠近横梁起点的上方，产生一种令人厌恶的刺激(强光)来引诱老鼠穿过它。小鼠在每个横梁上进行两次连续试验，从最宽的横梁到最窄的横梁行进，取平均值进行分析。考虑每只动物穿过所有横梁所花费的平均等待时间。

握力：测量小鼠肢体力量作为神经肌肉功能的指标。该装置由一个300g的金属网格组成，该网格在一个秤上。动物被吊起来，前爪放在网格的中央位置。由从秤上推出的重量(g)确定其力量。握力测试进行三次，取平均值进行分析。小鼠体重被用作标准化因子。

足迹测试：通过足迹测试来评估步态分析。为了获得足迹，分别用黑色和白色无毒涂料涂布小鼠的后足和前足。让小鼠在一张绿色的纸上沿着100×10×15cm的跑道行走。步长是指每一步之间向前移动的平均距离。选择前后足的一系列六个连续步幅进行评估。考虑每只动物12步的平均值。

免疫组织化学程序

过量使用阿佛丁(2.5×200mg/g,i.p.)后，用磷酸盐溶液对小鼠进行经心灌注，然后用4％多聚甲醛(PFA)固定。取出大脑，在4％PFA中后固定24小时，并通过在25％蔗糖/磷酸盐缓冲液中孵育48小时进行冷冻保护。冷冻大脑，使用低温恒温器(LEICA CM3050 S)在-80℃下切割25mm冠状纹状体切片和35mm正中矢状小脑切片。在解剖系列中收集整个大脑区域的切片，并以在补充有0.05mM叠氮化钠的PBS中的自由浮动切片的形式储存在48孔托盘中。将托盘保存在4℃，直至进行免疫组织化学处理。

用以下一抗处理来自注射小鼠的切片：小鼠单克隆抗共济失调蛋白-3抗体(1H9,1:5000；Chemicon,Temecula,CA)，识别来自氨基酸F112-L249的人共济失调蛋白-3片段；兔多克隆抗泛素抗体(Dako,1:1000；Cambridgeshire,UK)；和兔抗DARPP-32抗体(1:1000；Chemicon,Temecula,CA)，然后与相应的生物素化的二抗(1:200；Vector Laboratories)孵育。使用Vectastain ABC试剂盒，用3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB金属浓缩物；Pierce)作为底物，使结合的抗体可视化。

对共济失调蛋白-3(1H9,1:3000；Chemicon,Temecula,CA)、核标记[4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，蓝色]和泛素(Dako,1:1000；Cambridgeshire,UK)、裂解的胱天蛋白酶-3(Asp175,1:2000；Cell Signaling)或钙结合蛋白(Ab1778,1:500；Chemicon,Temecula,CA)进行双重染色。将来自注射小鼠的自由浮动切片在室温(RT)下在含有10％NGS(Gibco)的PBS/0.1％Triton X-100中放置2小时，然后在含有一抗的封闭溶液中于4℃放置过夜。将切片洗涤三次，并在室温下与在各自封闭溶液中稀释的荧光团偶联的相应二抗(1:200；Molecular Probes,Oregon,USA)一起孵育2小时。将切片洗涤三次，然后在显微镜载玻片上的Fluorsave

(Calbiochem,Germany)中固定。

使用配备有AxioCam HR彩色数码相机(Carl Zeiss Microimaging)的ZeissAxioskop 2plus、Zeiss Axiovert 200和Zeiss LSM 510Meta成像显微镜(Carl ZeissMicroimaging,Germany)，使用5×、20×、40×和63×Plan-Neofluar和63×Plan/Apochromat物镜以及AxioVision 4.7软件包(Carl Zeiss Microimaging)，对染色进行可视化。

甲酚紫染色

预固定的切片用甲酚紫染色30s，在70％乙醇中分化，通过两次穿过95％乙醇、100％乙醇和二甲苯溶液进行脱水，并用

(Sigma)固定在显微镜载玻片上。

耗尽DARPP-32的体积和小叶V体积的评估

通过以下方法分析纹状体或小脑小叶V体积中的共济失调蛋白-3损伤的程度：用1.25×物镜拍照，每只动物8个DARPP-32染色切片(间隔200mm)或每只动物8个小脑甲酚紫切片(间隔210mm)，选择这些切片以获得纹状体或半小脑的完整取样，并用半自动图像分析软件包(Image J software,USA)来量化损伤或小叶的面积。然后用下面的公式估算体积：体积＝d(a₁+a₂+a₃...)，其中d是连续切片之间的距离，a₁+a₂+a₃是单个连续切片的面积。

共济失调蛋白-3和泛素包涵体以及小叶V分子层的细胞计数和形态计量分析

使用20×物镜扫描显示纹状体完整吻尾取样(11个切片中的1个)的冠状切片。纹状体的分析区域包括含有ATX-3和泛素包涵体的整个区域，如通过用抗共济失调蛋白-3和抗泛素抗体染色所揭示的。使用半自动图像分析软件包(Image J software，USA)对所有包涵体进行人工计数。通过使用63×物镜在四个不同的切片中扫描针道上方的区域来评估包涵体直径。使用LSM Image Browser分析每只动物的至少100个包涵体。通过对共济失调蛋白-3包涵体与裂解的胱天蛋白酶-3进行双重染色，通过使用63×物镜在三个不同切片中扫描针道上方的区域，进一步评估包涵体的直径。使用LSM Image Browser分析每只动物的至少100个包涵体。

用20×物镜扫描半小脑的正中矢状切片。以210mm间隔手动计数六个切片的小叶V的所有钙结合蛋白阳性浦肯野细胞。通过四个不同测量的平均值来评估小叶V分子层厚度。在每幅图像中，使用半自动图像分析软件包(Image J software，USA)手工绘制从浦肯野细胞体到软脑膜表面的分子层周围的边界线，但不包括在内。

蛋白质印迹分析

为了评估马查多-约瑟夫病的慢病毒模型中的共济失调蛋白-3蛋白水解，用含有10mM乙二胺四乙酸(EDTA)和10mM烷基化试剂N-乙基马来酰亚胺的冰冷磷酸盐缓冲盐水对小鼠进行经心灌注，以避免死后钙蛋白酶过度活化。然后解剖注射后的纹状体，并立即在放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，7mM EDTA，1％NP-40，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，10mg/ml二硫苏糖醇(DTT)，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，200mg/ml亮肽素，蛋白酶抑制剂混合物)中超声处理。

在细胞裂解前一周，用200mM N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)加2.5mM CaCl₂在不含MgCl₂的Krebs缓冲液中处理小脑颗粒神经元1小时以进行兴奋性刺激，随后在加抑制剂或DMSO的新鲜培养基中培养，直到收获并在RIPA缓冲液中超声处理，如上所述。

等量(20mg蛋白质)在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用单克隆抗共济失调蛋白-3抗体(1H9,1:1000；Chemicon,Temecula,CA)、单克隆抗多聚谷氨酰胺抗体(1C2,MAB1574,1:1000；Chemicon)、单克隆抗myc标签(克隆4A6,1:1000；Cell Signaling)、单克隆抗血影蛋白抗体(MAB1622,1:1000；Chemicon)和单克隆抗β-肌动蛋白(克隆AC-74,1:5000；Sigma)或单克隆抗β-微管蛋白I(克隆SAP.4G5,1:15000；Sigma)进行免疫印迹。使用Quantity-one一维图像分析软件版本4.5进行半定量分析。计算肌动蛋白或微管蛋白的分配比。

小鼠纹状体总RNA的纯化及cDNA的合成

通过颈椎脱位处死小鼠，解剖注射后的纹状体，并在含有RNAlater RNA稳定试剂(QIAGEN)的试管中于4℃储存过夜。然后将样品保存在-80℃，直到RNA提取。根据制造商的说明，使用RNeasyMiniKit(QIAGEN)分离总RNA。简言之，细胞裂解后，将总RNA吸附到二氧化硅膜上，用推荐的缓冲液洗涤，并通过离心用30ml不含RNA酶的水洗脱。使用Nanodrop 2000分光光度计(ThermoScientific)通过光密度(OD)来定量RNA的总量，并且通过测量260和280nm处的OD比率来评估纯度。然后根据制造商的说明，使用iScript Select cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)，通过转化1mg总RNA来获得互补DNA(cDNA)，并储存在-80℃。

定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)

在iQ5热循环仪(Bio-Rad)中使用96孔微量滴定板和QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix(QIAGEN)进行定量PCR。靶标人基因(ATXN3，NM_004993)和参照小鼠基因(Hprt，NM_013556和Gapdh，NM_008084)的引物由QIAGEN(QuantiTect Primers，QIAGEN)预先设计和验证。为每个引物组制备一个主混合物，包含适当体积的QuantiTect SYBR Green PCRMaster Mix(QIAGEN)、QuantiTect Primers(QIAGEN)和模板cDNA。根据制造商的建议，重复进行所有反应：95℃15分钟，然后按94℃15秒、55℃30秒和72℃30秒进行40个循环。由iQ5光学系统软件(Bio-Rad)自动确定每个引物对的扩增效率和阈值循环测定(Ct)的阈值。考虑到所有基因的不同扩增效率，通过Pfaffl方法确定相对于对照样品的mRNA倍数增加或倍数减少。

统计分析

使用不成对学生t检验或单因素ANOVA进行统计分析，然后对选定的成对比较进行Bonferroni检验。P≤0.05的值被认为具有统计学意义；P<0.01非常显著；P<0.001极显著。

尽管已参照实施方案和实施例对本发明进行了描述，但应理解，在不背离本发明精神的情况下，可进行大量和多种修改。因此，本公开仅受以下权利要求的限制。

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文引用的参考文献，在它们尚未被引用的范围内，均通过引用整体并入本文。如果一个或多个并入的文献和类似材料不同于本申请或与本申请矛盾，包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术等，则以本申请为准。

Claims

1.一种治疗与蛋白质聚集相关的神经疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐或前药，其中：

Z是-NR²R³或-OR⁴；

R²是-氢或-C_1-6烷基；

R³是-氢、-C_1-6烷基、-C_3-10环烷基或-OR⁴；

R⁴是-氢或-C_1-6烷基；

n是1或2。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是式(I-a)的化合物

其中：

X是S或NR⁵；

Y是CH或N；

R⁵是-氢或-C_1-6烷基；

m是0、1、2或3。

3.根据权利要求2所述的方法，其中X是S。

4.根据权利要求2所述的方法，其中X是NR⁵。

5.根据权利要求4所述的方法，其中R⁵是氢或-CH₃。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中Y是CH。

7.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中Y是N。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中每个R⁶独立地是-F、-Cl、-CH₃、-CF₃、-OCH₃或-OCF₃。

9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中m是0。

10.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中m是1。

11.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中m是2。

12.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中m是3。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述化合物是式(I-b)的化合物

其中：

t是0、1、2或3。

14.根据权利要求13所述的方法，其中每个R⁷独立地是-F、-Cl、-CH₃、-CF₃、-OCH₃或-OCF₃。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中t是0。

16.根据权利要求13或14所述的方法，其中t是1。

17.根据权利要求13或14所述的方法，其中t是2。

18.根据权利要求13或14所述的方法，其中t是3。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中Z是-NR²R³。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中R²是-氢。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中R³是-氢、-CH₃或-环丙基。

22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中R³是-OH或-OCH₃。

23.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中Z是-OR⁴。

24.根据权利要求23所述的方法，其中R⁴是-氢或-CH₃。

25.一种治疗与蛋白质聚集相关的神经疾病或病症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用选自由以下组成的组的化合物：

及其药学上可接受的盐。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向受试者施用一种或多种第二药剂。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第二药剂选自丁苯那嗪、氘代丁苯那嗪、西酞普兰、依他普仑、氟西汀、舍曲林、喹硫平、利培酮、氟哌啶醇、氯丙嗪、丙戊酸盐、卡马西平、拉莫三嗪、左旋多巴、巴氯芬和肉毒杆菌毒素。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述与蛋白质聚集相关的神经病症是多聚谷氨酰胺疾病或病症。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述多聚谷氨酰胺病症是亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩症、脊髓延髓性肌萎缩症、脊髓小脑共济失调1型(SCA1)、脊髓小脑共济失调2型(SCA2)、脊髓小脑共济失调6型(SCA6)、脊髓小脑共济失调7型(SCA7)或脊髓小脑共济失调17型(SCA17)。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述与蛋白质聚集相关的神经病症是阿尔茨海默病、帕金森病或肌萎缩性侧索硬化。