CN114457003A - 预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细胞的方法 - Google Patents

预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细胞的方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于用表达促血管生成因子的核酸构建体转导的血管细胞的预调节(preconditioning)、转导和/或低温保存的方法和组合物。还提供了这样的细胞在疗法中的用途。

Description

预调节血管细胞用于转导的方法、转导方法和保存转导的细 胞的方法
本申请要求美国临时专利申请第63/111,661号、第63/111,682号、第63/111,693号和第63/111,696号的优先权权益，所有这些申请均于2020年11月10日提交并且每一份申请通过引用以其整体并入本文。
序列表声明
在提交本申请时同时提交的标题为“89898 SequenceListing.txt”、创建于2021年11月8日、包含18,806字节的ACSII文件通过引用并入本文。
发明领域和背景
本发明涉及化学、生物化学、细胞生物学、基因工程和医学领域。具体地，本发明涉及制备用于在使用前进行储存的转导的细胞的方法。具体地，本发明涉及预调节(preconditioning)血管细胞用于转导的方法、转导的方法、保存转导的细胞的方法以及保存的转导的细胞在临床中的用途。
外周动脉疾病(PAD)及其晚期、严重的肢体缺血影响着全球约2亿人。与下肢PAD相关的症状包括跛行，以及甚至更严重的表现，诸如静息痛(rest pain)、缺血性溃疡和组织损失。经皮血运重建术(percutaneous revascularization)或外科旁路术仅适用于具有生活方式受限的严重跛行的患者，然而在腹股沟韧带以下，经皮血运重建术受限于高再狭窄率，并且外科血运重建术受限于可能的移植失败和与血管手术相关的风险。因此，需要用于生活方式受限的跛行的替代治疗策略。
血管生成或侧枝重塑是一个复杂的过程，需要祖细胞、驻留内皮细胞(residentendothelial cells)、平滑肌细胞和生长因子(包括VEGF、FGF、胎盘生长因子和Ang-1)的及时参与，它们可以通过许多步骤以协调的方式起作用，从而导致血管形成。理论上，这可以通过施用(重组)蛋白质、基因转移或细胞治疗(cell therapy)方法来实现。然而，系统性施用生长因子(例如，VEGF、bFGF)或相关转录因子(例如HIF-1α)和通过基因转移局部表达单种生长因子的临床经验未能提供任何显著的治疗益处(Ouma等人，Vasc Med 2012，17:174-92)。
血管生成细胞转移疗法不仅提供了自我补充的生长因子来源，而且通过血管细胞植入积极参与血管的发育和扩张。
另外的相关背景技术：
Chae等人,Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20:2573-78；
Ouma等人,Vasc Med 2012,17:174-92；
Latchana等人,J Thorac Disease,2014；6:1143-49；
美国专利申请20120015343；
Baust等人Adv Exp Med Biol 2016；951:13-29；
美国专利第5,405,742号；
美国专利第5,514,536号；
美国专利第6,492,103号；
美国专利申请第20040053207号；
美国专利申请第20110177488号；
美国专利申请第20100105133号
美国专利申请第20160046685号；
美国专利申请第2003/0073237号；
美国专利申请第2009/0209630号；
WO2002/12539。
发明概述
根据本发明的一方面，提供了人类平滑肌(SM)细胞，所述人类平滑肌(SM)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，其中所述预调节包括使所述SM细胞与0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE-葡聚糖接触，与用1.0mg/ml或更高的DEAE-葡聚糖预调节的类似SM细胞相比，所述SM细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
根据本发明的一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1中列出的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，预调节用0.125mg/ml-0.5mg/ml DEAE-葡聚糖进行并且进行1分钟和4分钟之间。
根据本发明的一些实施方案，预调节用0.125mg/ml DEAE-葡聚糖进行并且进行1分钟。
根据本发明的一些实施方案，接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基是无血清培养基。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞选自由以下组成的组：新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞、冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞以及培养的人类平滑肌细胞。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞在转导之前和之后在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含5％-25％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞是在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中的从静脉组织分离的平滑肌细胞。
根据本发明的一方面，提供了人类内皮(EC)细胞，所述人类内皮(EC)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，其中预调节包括：
(a)用包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基从静脉组织中分离所述EC细胞；
(b)用包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的EC培养基培养所述分离的EC细胞，以及
(c)用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖预调节所述人类血管内皮细胞，
其中与(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基相比，所述EC细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
根据本发明的一些实施方案，逆转录病毒构建体包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞在步骤(a)中在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞在步骤(b)中在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和5％-25％胎牛血清的生长培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，步骤(b)的生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含10％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基还包含1-10mM谷氨酰胺。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基是无血清培养基。
根据本发明的一方面，提供了一种用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，该方法包括：
(a)用0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE-葡聚糖预调节所述人类平滑肌细胞，以及
(b)使人类平滑肌细胞与所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含所述核酸构建体的转导培养基中接触。
根据本发明的一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，预调节用0.125mg/ml-0.5mg/ml DEAE-葡聚糖进行。
根据本发明的一些实施方案，预调节用0.125mg/ml DEAE-葡聚糖进行。
根据本发明的一些实施方案，预调节进行1分钟和4分钟之间。
根据本发明的一些实施方案，预调节进行2分钟和3分钟之间。
根据本发明的一些实施方案，预调节进行1分钟。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中分离。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞在转导之前被培养。
根据本发明的一些实施方案，步骤(b)的接触在1ml转导培养基的体积中进行。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞在转导之前和之后在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含5％-25％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一方面，提供了一种用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，该方法包括：
(a)用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖预调节所述人类血管内皮细胞，以及
(b)在包含所述核酸构建体的转导培养基中使所述人类内皮细胞接触至少2.5个连续的小时且不超过3.5连续的小时的持续时间。
根据本发明的一些实施方案，核酸构建体包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，持续时间是2.8-3.2个连续的小时。
根据本发明的一些实施方案，持续时间是2.5-3.0个连续的小时。
根据本发明的一些实施方案，持续时间是2.5个连续的小时。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的内皮细胞。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞在转导之前被培养。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞在转导之前和之后在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的生长培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含5％-25％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含10％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基包含M199培养基。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基还包含1-10mM谷氨酰胺。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基还包含2-8mM谷氨酰胺。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
根据本发明的一些实施方案，转导培养基是无血清培养基。
根据本发明的一方面，提供了一种低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在细胞内型低温保存溶液中孵育所述转导的人类平滑肌细胞。
根据本发明的一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液和能量底物(energy substrate)。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液还包含Trolox、Na离子、K离子、钙离子和Mg离子。
根据本发明的一些实施方案，能量底物包含腺苷和谷胱甘肽。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐-40、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液、Trolox、Na离子、K离子、钙离子、Mg离子、腺苷和谷胱甘肽。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液是
Figure BDA0003347657360000081
FRS。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据本发明的一些实施方案，转导的人类平滑肌细胞在低温保存之前在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一些实施方案，与保存在等渗多电解质溶液中的相同的转导的平滑肌细胞相比，转导的平滑肌细胞的特征在于低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或低温保存后转基因表达增强中的至少一种。
根据本发明的一方面，提供了一种低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在包含等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育所述转导的人类内皮细胞。
根据本发明的一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
根据本发明的一些实施方案，等渗多电解质溶液补充有右旋糖、肝素和白蛋白。
根据本发明的一些实施方案，等渗多电解质溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子和葡萄糖酸根离子。
根据本发明的一些实施方案，用碳酸氢钠将等渗型低温保存溶液的pH调节至7.4-7.7。
根据一些实施方案，等渗低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子、葡萄糖酸根离子、右旋糖、肝素。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液包含补充有0.1％右旋糖、100U/ml肝素和1％人类白蛋白的Plasma-Lyte
Figure BDA0003347657360000091
并用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
根据本发明的一些实施方案，转导的人类内皮细胞在低温保存之前在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，与保存在细胞内型低温保存溶液中的相同的转导的内皮细胞相比，转导的内皮细胞的特征在于低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或低温保存后转基因表达增强中的至少一种。
根据本发明的一些实施方案，孵育进行最多96小时。
根据本发明的一些实施方案，孵育进行12-72小时。
根据本发明的一些实施方案，孵育进行24-48小时。
根据本发明的一些实施方案，孵育在4℃和6℃之间进行。
根据本发明的一些实施方案，孵育在4℃进行。
根据本发明的一方面，提供了一种可注射组合物，所述可注射组合物包含悬浮在细胞内型低温保存溶液中的用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌(SM)细胞，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，编码VEGF165多肽的多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出。
根据本发明的一些实施方案，细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液和能量底物。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液还包含Trolox、Na离子、K离子、钙离子和Mg离子。
根据本发明的一些实施方案，能量底物包含腺苷和谷胱甘肽。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐-40、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液、Trolox、Na离子、K离子、钙离子、Mg离子、腺苷和谷胱甘肽。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液是
Figure BDA0003347657360000101
FRS。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据本发明的一些实施方案，转导的人类平滑肌细胞在悬浮于低温保存溶液中之前在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
根据本发明的一方面，提供了一种可注射组合物，所述可注射组合物包含悬浮在包含等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中的用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方案，编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出。
根据本发明的一些实施方案，等渗型低温保存溶液还补充有右旋糖、肝素和白蛋白。
根据本发明的一些实施方案，等渗多电解质溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子和葡萄糖酸根离子。
根据本发明的一些实施方案，用碳酸氢钠将等渗型低温保存溶液的pH调节至7.4-7.7。
根据本发明的一些实施方案，等渗低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子、葡萄糖酸根离子、右旋糖、肝素和人类白蛋白，并用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
根据本发明的一些实施方案，低温保存溶液包含补充有0.1％右旋糖、100U/ml肝素和1％人类白蛋白的Plasma-Lyte
Figure BDA0003347657360000111
并用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
根据本发明的一些实施方案，人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
根据本发明的一些实施方案，转导的人类内皮细胞在低温保存之前在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的培养基中培养。
根据本发明的一方面，提供了一种低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含在2℃和8℃之间的如上所述的可注射组合物。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物包含特征在于以下中的至少一种的转导的平滑肌细胞：与低温保存在等渗多电解质溶液中的相同的转导的平滑肌细胞相比，所述转导的平滑肌细胞活力增强、低温保存后细胞增殖增强或转基因表达增强。
根据本发明的一方面，提供了一种低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含在2℃和8℃之间的如上所述的可注射组合物。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含特征在于以下中的至少一种的转导的内皮细胞：与保存在细胞内型低温保存溶液中的相同的转导的内皮细胞相比，所述转导的内皮细胞在低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或低温保存后转基因表达增强。
根据本发明的一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括含有人类平滑肌细胞的可注射组合物的第一容器和含有人类内皮细胞的可注射组合物的单独的第二容器。
根据本发明的一些实施方案，试剂盒处于2℃和8℃之间。
根据本发明的一些实施方案，可注射组合物在2℃和4℃之间。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射人类血管细胞组合物遵循在所述温度低温保存6小时和96小时之间。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射人类血管细胞组合物遵循在所述温度低温保存12小时和48小时之间。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射人类血管细胞组合物遵循在所述温度低温保存24小时或48小时。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射人类血管细胞组合物或试剂盒用于血管生成细胞治疗。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射人类血管细胞组合物或试剂盒用于治疗有相应需要的受试者的血管状况或疾病。
根据本发明的一些实施方案，血管状况或疾病选自由动脉粥样硬化、外周动脉疾病、糖尿病的血管并发症、缺血和慢性肾衰竭组成的组。
根据本发明的一些实施方案，低温保存的可注射人类血管细胞组合物或试剂盒用于有相应需要的受试者的新血管形成。
根据本发明的一方面，提供了一种血管生成细胞治疗的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用如上所述的可注射组合物或低温保存的可注射人类血管细胞组合物或试剂盒。
根据本发明的一方面，提供了一种治疗有相应需要的受试者的血管状况或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用如上所述的可注射组合物或低温保存的可注射人类血管细胞组合物或试剂盒。
根据本发明的一些实施方案，血管状况或疾病选自由动脉粥样硬化、外周动脉疾病、糖尿病的血管并发症、缺血和慢性肾衰竭组成的组。
根据本发明的一方面，提供了一种影响有相应需要的受试者的新血管形成的方法，所述方法包括施用如上所述的可注射组合物、低温保存的可注射人类血管细胞组合物或试剂盒。
根据本发明的一些实施方案，新血管形成通过将可注射组合物直接施用至受试者的受影响的血管而受到影响。
附图的若干视图的简要描述
本文仅以示例的方式参考附图描述本发明的一些实施方案。现在详细地具体参考附图，要强调的是，所示的细节是以示例的方式并且是为了说明性地讨论本发明的实施方案的目的。在这方面，使用附图进行的描述使得可以如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员来说是明显的。
图1是示出EC培养基对分离的内皮细胞(EC)的生长速率的影响的直方图。从来自4名人类供体的5个静脉区段(H1081B、H1082、H1085、H1086A和H1086B)分离的EC在6孔板中在EC-G(黑色柱)或补充有10％胎牛血清(FBS)的EGM培养基(EGM10％，灰色柱)中培养，每48-72小时更换培养基，直到准备通过胰蛋白酶酶解(trypsinization)收获(1/4-1/2的培养板表面被覆盖)。细胞通过Coulter计数器进行计数。细胞数代表第一次分离后收获(第1次传代)之后的两个合并的孔。注意到EGM 10％对生长中的细胞的持续的显著影响；
图2是示出SMC培养基对分离的平滑肌细胞(SMC)的生长速率的影响的直方图。从来自3名人类供体的6个静脉区段(H1075A、H1075B、H1075C、H1076B、H1076C和H1077A)分离的SMC在6孔板中在SMC-G(黑色柱)或补充有20％胎牛血清(FBS)的SMGM培养基(SMGM20％，灰色柱)中培养，每48-72小时更换培养基，直到准备通过胰蛋白酶酶解收获(1/4-1/2的培养板表面被覆盖)。细胞通过Coulter计数器进行计数。细胞数代表第一次分离后收获(第1次传代)之后的两个合并的孔。来自SMGM 20％的H1076C和H1077A细胞在分离后7天收获，而生长在SMC-G中的细胞在分离后10天收获。注意到SMGM 20％对生长中的细胞的持续的显著影响；
图3是示出SMC培养基的FBS浓度对分离的平滑肌细胞(SMC)的生长速率的影响的直方图。从来自4名供体的6个静脉区段(H1077B、H1078B、H1079、H1085、H1086A和H1086B)分离的SMC在6孔板中在补充有15％FBS的SMGM(SMGM 15％，黑色柱)或补充有20％FBS的SMGM培养基(SMGM20％，灰色柱)中培养，每48-72小时更换培养基，直到准备通过胰蛋白酶酶解收获(1/4-1/2的培养板表面被覆盖)。细胞通过Coulter计数器进行计数。细胞数代表第一次分离后收获(第1次传代)之后的两个合并的孔。注意到SMGM20％对生长中的细胞的显著影响；
图4是示出与EC-G培养基相比，EGM培养基对内皮细胞(EC)的生长速率的影响的直方图。EC细胞接种和生长在不同的培养基中，收获、计数并在第4天重新接种并生长3天，然后再收获并计数。柱代表所有三个供体中经7天的平均生长速率+/-SD。注意到使用EGM培养基+10％FBS时生长速率的显著加快；
图5是示出与SMC-G培养基相比，SMGM和231G培养基对平滑肌细胞(SMC)的生长速率的影响的直方图。SMC细胞接种和生长在不同的培养基中，收获、计数并在第4天重新接种并生长4天，然后再收获并计数。柱代表所有三个供体中经8天的平均生长速率+/-SD。注意到使用SMGM培养基+20％FBS时生长速率的显著加快；
图6是示出与SMC-G培养基相比，SMGM和231G培养基对转导后的平滑肌细胞(SMC)的生长速率的影响的直方图。SMC细胞用TGA-Lac Z转导、接种并生长在不同的培养基中，收获、计数并在第4天重新接种并生长4天，然后再收获并计数。柱代表两个供体中经8天的平均生长速率+/-SD。注意到使用SMGM培养基+20％FBS时生长速率的显著加快；
图7是示出与SMC-G培养基相比，SMGM和231G培养基对转导后的平滑肌细胞(SMC)的转导率的影响的直方图。SMC细胞用TGA-Lac Z转导、接种并生长在不同培养基中三天，然后用X-Gal染色以监测转导率。柱代表转导后三天SMC细胞的平均转导率，表示为总细胞计数中的％LacZ阳性细胞+/-SD；
图8A-8B是示出在用TGA-LacZ转导(步骤3，图8A)后4天和在G418选择(步骤3b，图8B)后来自3名供体的SMC细胞的平均日生长速率的直方图，表明了SMGM 20％和15％FBS对在SMC转导后的生长速率超过SMC-G培养基的明显优势；
图9是示出在添加和不添加生长因子的无血清转导培养基中转导的EC细胞的转导率的直方图。EC细胞用TGA-Lac Z转导、接种并生长在EGM培养基+2％FBS中四天，然后用X-Gal染色以监测转导率；
图10是示出在添加和不添加生长因子的无血清转导培养基中转导的EC细胞的生长速率的直方图。将来自三名供体的转导的EC细胞接种并生长在EMG培养基+2％FBS中四天，收获并计数。柱代表所有三个供体中经4天的平均生长速率+/-SD。
图11是示出与EC-G培养基相比，补充有不同量的FBS的EGM培养基对转导后的内皮细胞(EC)的生长速率的影响的直方图。EC细胞用TGA-Lac Z转导、接种并生长在不同培养基中四天，收获并计数。柱代表两名供体中经4天的平均生长速率，表示为在EGM培养基+15％FBS时经TGA LacZ转导的EC生长速率的百分比+/-SD；
图12是示出与EC-G培养基相比，补充有不同量的FBS的EGM培养基对用TGA LacZ转导的内皮细胞(EC)的转导率的影响的直方图。将来自两名供体的经转导的EC细胞接种并生长在不同培养基中三天，然后用X-Gal染色以监测转导率；
图13是示出在培养过程的不同阶段，与EC-G培养基相比，补充有不同量的FBS的EGM培养基对转导后的内皮细胞(EC)的生长速率的影响的直方图。EC细胞用TGA-Lac Z转导，在选择剂(新霉素)的存在下接种和生长在不同的培养基中，收获，重新接种，并在早期(p3，p4)传代、第5次传代和步骤3b(第6次传代，选择结束)时计数。柱代表经持续时间的平均生长速率，表示为所有三名供体的生长速率(分裂/天)+/-SD；
图14A-14D是示出在培养过程的不同阶段，与EC-G培养基相比，补充有不同量FBS的EGM培养基对用Ang-1转导后的内皮细胞(EC)的转导率和Ang-1分泌的影响的直方图。来自三名供体的EC细胞在EC-G培养基或EGM培养基+10％FBS中生长，用逆转录病毒Ang-1载体转导，并在用G418选择10天之前(图14A和14C)和之后(14B和14D)在EC-G培养基或EGM培养基+10％FBS中培养。选择前(图14A)和选择后(图14B)经转导的细胞中Ang-1表达的免疫组织化学评估揭示了在EMG+10％FBS中培养的细胞的转导率的明显优势。选择前(图14C)和选择后(图14D)由转导的细胞分泌的Ang-1的ELISA测定揭示了EC-G培养基生长的细胞对G418选择的强依赖性，但在EMG+10％FBS中培养的细胞没有相同的效果；
图15A-15C是用TGA-LacZ载体转导期间和紧接其后的SMC照片，显示了用0.125mg/ml DEAE葡聚糖(DD)预处理的积极效果。在用TGA-LacZ载体进行2.5小时转导之前，SMC与0.25mg/ml DD(图15B)或0.125mg/ml DD(图15C)孵育1分钟，并且然后描述地进行培养。图15A示出了未暴露于病毒载体或DD的幼稚细胞(
Figure BDA0003347657360000161
cells)；
图16是示出与用0.25mg/ml DD预处理相比，用0.125mg/ml DD预处理SMC对早期转导后增殖的效果的直方图。将两名人类供体(H1058B和H1071A)的SMC以一式两份接种在6孔板(1.3x105细胞/孔)上进行转导。第二天，用0.25mg/ml或0.125mg/ml DEAE葡聚糖处理后，用TGA逆转录病毒转导细胞。转导后2天收获转导的细胞并计数。结果是来自两名供体的以一式两份接种并计数的细胞的平均值±SD。“幼稚细胞”是未暴露于病毒载体或DD的SMC；
图17是示出与用0.25mg/ml DD预处理相比，用0.125mg/ml DD预处理SMC对晚期转导后增殖的效果的直方图。将两名人类供体(H1058B和H1071A)的SMC接种用于转导，并如图15A-15C所描述地进行转导。转导的细胞以一式三份接种到12孔板(6,000-10,000个细胞/孔)上。培养基每2天更换。五天后，收获细胞并计数。结果是来自两名供体的以一式两份转导、以一式三份接种并计数的细胞的平均值±SD。“幼稚细胞”如图16所示；
图18是示出转导后两天固定并用X-gal染色Lac-Z的转导的SMC的照片。将SMC预处理、接种用于转导，并且如图16中描述地进行转导。Lac-Z阳性细胞染成蓝色；
图19是示出与用0.25mg/ml DD预处理相比，用0.125mg/ml DD预处理SMC对用病毒载体转导的SMC转导率的影响的直方图。将SMC预处理、接种用于转导，并且如图16所描述地进行转导，并用X-gal对LacZ表达进行染色。拍摄10-15个代表性区域，并且通过Coulter计数器对细胞进行计数。以一式两份对细胞染色并计数。结果在此示出为总细胞数中TGA阳性细胞(染为蓝色)的百分比。来自两名供体的结果的平均值±SD；
图20A和20B是示出当用血管生成素-1逆转录病毒载体转导不同转导时间(白色柱＝2.5小时转导，黑色柱＝4小时转导)时，在转导后2天(步骤3)和13天(步骤3a)(步骤3b包括10天的G418选择)时，来自两名单独供体的内皮细胞的生长速率的直方图。注意到两种转导方案之间生长速率的相似性；
图21A-21B是示出不同低温保存溶液对转导的血管细胞在低温条件的生存的影响的图。原代分离的血管(隐静脉)细胞用编码血管生成因子的逆转录病毒载体转导(内皮细胞，“EC”，图21A，用Ang-1转导，并且平滑肌细胞，“SMC”，图21B，用VEGF165转导)，洗涤并悬浮在细胞内型的HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)或等渗的碳酸氢盐缓冲的具有白蛋白的低温保存溶液(PL)中。细胞通过Coulter计数器计数(0小时)，转移到4-8℃并在24小时和48小时时再计数。结果(“细胞数”)表示为来自三名人类供体的一式两份样品的平均值中在0小时(100％)时初始细胞数的百分比。注意到低温保存溶液对EC和SMC细胞的不同影响；
图22A-22B是示出不同低温保存溶液对转导的血管细胞在低温条件的活力的影响的图。原代分离的血管(隐静脉)细胞用编码血管生成因子的逆转录病毒载体转导(内皮细胞，“EC”，图22A，用Ang-1转导，并且平滑肌细胞，“SMC”，图22B，用VEGF165转导)，洗涤并悬浮在细胞内型的HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)或等渗的碳酸氢盐缓冲的具有白蛋白的低温保存溶液(PL)中。对细胞悬浮液取样用于在0小时时用台盼蓝评估(显微评估)活力，然后转移到4-8℃并在24小时和48小时时再评估。结果(“细胞活力”)表示为来自三名人类供体的一式两份样品的平均值中活细胞/总细胞数(100％)的百分比。注意到低温保存溶液对EC和SMC细胞的不同影响；
图23A-23D是示出不同低温保存溶液对低温条件下孵育后培养的转导的血管细胞的状况的影响的图。原代分离的血管(隐静脉)细胞用编码血管生成因子的逆转录病毒载体转导(内皮细胞，“EC”，图23A和图23B，用Ang-1转导，并且平滑肌细胞，“SMC”，图23C和图23D，用VEGF165转导)，在4-8℃洗涤并悬浮在细胞内型的HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)(图23B和图23D)或等渗的碳酸氢盐缓冲的具有白蛋白的低温保存溶液(PL)(图23A和图23C)中24小时。在低温孵育后，将细胞接种到6孔板上或烧瓶中的生长培养基中、培养24小时并拍照。注意到低温保存溶液对EC和SMC细胞的密度和与培养板表面的黏附的不同影响；
图24A-24D是示出不同低温保存溶液对低温条件下孵育后24小时培养的转导的血管细胞的状况的影响的图。原代分离的血管(隐静脉)细胞用编码血管生成因子的逆转录病毒载体转导(内皮细胞，“EC”，图24A和图24B，用Ang-1转导，并且平滑肌细胞，“SMC”，图24C和图24D，用VEGF165转导)，在4-8℃洗涤并悬浮在细胞内型的HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)(图24B和图24D)或等渗的碳酸氢盐缓冲的具有白蛋白的低温保存溶液(PL)(图24A和图24C)中48小时。在低温孵育后，将细胞接种到6孔板上或烧瓶中的生长培养基中、培养24小时并拍照。注意到低温保存溶液对EC和SMC细胞的密度和与培养板表面的黏附的不同影响；
图25A-25B是示出不同低温保存溶液对低温条件下孵育后培养72小时的转导的血管细胞的细胞增殖速率的影响的图。原代分离的血管(隐静脉)细胞用编码血管生成因子的逆转录病毒载体转导(内皮细胞，“EC”，图25A,用Ang-1转导，并且平滑肌细胞，“SMC”，图25B，用VEGF165转导)，在4-8℃洗涤并悬浮在细胞内型的HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)或等渗的碳酸氢盐缓冲的具有白蛋白的低温保存溶液(PL)中24小时或48小时。在低温孵育后，将细胞接种到6孔板上或烧瓶中的生长培养基中、培养72小时、收获并通过Coulter计数器进行计数。细胞生长速率表示为来自三名人类供体的一式两份样品在24小时内细胞分裂的平均次数。注意到低温保存溶液对48小时低温孵育后的EC细胞和SMC细胞生长速率的显著不同影响。
图26示出了血管生成素-1和VEGF 165的核酸构建体和序列。
本发明的具体实施方案的描述
本发明涉及化学、生物化学、细胞生物学、基因工程和医学领域。特别地，本发明涉及制备用于在使用前进行储存的转导的细胞的方法。具体地，本发明涉及预调节血管细胞用于转导的方法、转导的方法、保存转导的细胞的方法以及保存的转导的细胞在临床中的用途。
本发明的方面涉及：
(i)可转导的血管细胞组合物；
(ii)用于细胞转导的方法；
(iii)用于低温保存转导的细胞的方法；
(iv)低温保存的转导的血管细胞；
所有这些或其实施方案在本文中描述，以产生用于在疗法或相关病症中使用的细胞。
应当理解，本发明可以涉及i+ii+iii+iv；i+ii+iii；i+ii；ii+iii+iv；ii+iii；或iii-iv。
I.可转导的血管细胞组合物
本发明人已经发现实现有效制备血管组织细胞(例如SM和EC细胞)用于用编码促血管生成因子的构建体进行逆转录病毒转导的方法。根据这些方法制备的血管组织细胞的特征在于增强的增殖和转导率以及重组促血管生成因子的分泌，并且可以被制备用于尤其是在用于诱导新血管形成以治疗血管疾病的移植中使用。
本发明人已经示出，特定的血管细胞分离程序、培养条件(参见实施例1)和血管细胞的预调节(参见实施例2)的组合导致血管内皮细胞和平滑肌细胞在逆转录病毒转导之前和之后具有较大活力。特别地，本发明人已经发现，在平滑肌细胞预调节中DEAE葡聚糖浓度的降低提供了转导的细胞的增强的转导率和活力/生长速率(参见下文的实施例2)。此外，本发明人已经发现，在转导之前和之后使用EGM培养基(内皮生长培养基(EGM)TM-2 BulletKit培养基)和SMGM(SmGM-2TM BulletkitTM(Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland，Cat#CC-3182))导致分离的血管细胞的较高的转导率和生长速率(参见实施例1)。
因此，根据一个方面，本发明涉及被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌(SM)细胞，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，其中预调节包括使SM细胞与0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE-葡聚糖接触，并且其中与用1.0mg/ml或更高的DEAE-葡聚糖预调节的类似SM细胞相比，所述SM细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
根据另一个方面，本发明涉及被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮(EC)细胞，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，其中预调节包括：
(a)用包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基从静脉组织分离EC细胞；
(b)用包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的EC培养基培养分离的EC细胞，以及
(c)用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖预调节人类血管内皮细胞，其中与不用内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基分离和/或预调节的类似EC细胞相比，所述EC细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
适用于本发明的方法的血管细胞(SM和EC)包括新鲜分离的来自血管组织的血管细胞以及保存的血管细胞和培养的血管细胞。用于从血管组织分离平滑肌细胞的方法是本领域熟知的。
根据本发明，根据本发明的方法从个体中取出血管内皮细胞和平滑肌细胞用于转导。血管内皮细胞和平滑肌细胞不需要来自同一血管，尽管最方便地它们从在患者中取出的血管组织的同一区段分离。血管组织可以从若干个部位中的任何一个取出，但是应当从对患者造成最少量的不适和潜在伤害的部位，例如浅静脉诸如小隐静脉、大隐静脉、头静脉和其他类似的静脉取出。被取出的血管的量应当足以提供内皮细胞和平滑肌细胞，用于转导和在低传代次数的增殖，例如，通常长度至少约2cm以及多达10cm或更长，尽管这可能取决于血管、患者的状况等而广泛地变化。
根据本领域技术人员已知的技术，可以从切下的血管或其他微血管或大血管组织中选择性地取出内皮细胞。参见，例如，Vohra等人,Vasc.Surg.22:393-397(1989)；Folkman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5217-5221(1979)；Kern等人,J.Clin.Invest.71:1822-1829(1983)和Sterpetti等人,J.Surg.Res.48:101-106(1990)以及特别地WO 02/12539，这些文献通过引用并入本文。例如，可以在静脉剥离之后多达约48小时将胶原酶的溶液引入到切下的血管中，然后将其孵育短的时间段，并且然后将细胞从静脉中冲洗出来。然后收集内皮细胞，并且可以通过在适当的培养基中培养来扩增。
在一些实施方案中，血管细胞在类似于生长培养基的分离培养基中从血管组织分离，并且在其他实施方案中，分离培养基与生长培养基的至少一种组分不同。在具体的实施方案中，血管内皮细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的EGM培养基(EGM-2TM BulletKitTM培养基(Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland，Cat#CC-3162))中分离。内皮细胞分离可以在标准条件(例如，在37℃具有5％CO2/95％空气的加湿的培养箱)下进行。在分离之后，当分离的EC形成覆盖1/4-1/2的板表面的大集落时，可以收获细胞(例如酶促：胰蛋白酶酶解)并且转移到组织培养板(第1次传代，p1)。在一些实施方案中，组织培养板用明胶或纤连蛋白预包被。
在从切下的血管中收获内皮细胞之后，可以使用已建立的技术，例如酶消化和/或从培养的血管块(pieces of vessel)中长出(outgrowth)来取出平滑肌细胞。对于酶消化，去内皮化的血管区段可以用适当的酶溶液，例如胶原酶处理。为了从培养的外植体分离平滑肌细胞，将小块的经酶处理的血管(例如，1-2mm2)放置在适当的分离培养基中。在具体的实施方案中，SMC分离培养基包含补充有20％血清(例如FBS)的SMGM(SmGM-2TM BulletkitTM(Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland，Cat#CC-3182))。然后，分离的SMC细胞可以在5％CO2/95％空气在37℃孵育。当获得平滑肌细胞的长出时，组织片段被取出并且平滑肌细胞被收获和扩增。
根据一些实施方案，人类SM和EC细胞可以是新鲜分离的细胞、冷冻保存并解冻的SM和EC细胞和/或培养的SM和EC细胞，或其任何组合。
如本文所使用的，术语“新鲜的”或“新鲜分离的”SM或EC细胞指的是已经从组织分离并且尚未被培养或保存的细胞。这样的新鲜分离的SM细胞或EC在细胞群体的组成方面可能不同。一般来说，血管平滑肌细胞可以被分为收缩性和合成性平滑肌细胞，并且特征在于诸如但不限于以下平滑肌细胞标志物的表达：α-SM肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、SM22α、Smoothelin、Telokin、结蛋白CRBP-1、Smemb、Meta-黏着斑蛋白、VE-钙黏着蛋白、钙调蛋白结合蛋白/CALD1、钙调理蛋白1、Hexim1、组胺H2 R、胃动素R/GPR38和转胶蛋白(Transgelin)/TAGLN。血管内皮细胞的特征在于诸如但不限于以下标志物的表达：VIII因子相关抗原、CD31/PECAM-1、血管紧张素转化酶、1型清道夫受体、血管内皮钙黏着蛋白、CD34、CD102/ICAM-2、CD51/61(玻连蛋白受体)、CD105/内皮联蛋白、CD36、CD73/VAP-1、S-endo-1/MUC18、HEMCAM、Sca-1、AAMP、CD106/VCAM-1、CD54/CAM-1、CD62E、CD62P、VEGFR-1、VEGFR-2、Tie-1、Tie-2、FB5、纤连蛋白ED-B。“新鲜分离的”SM或EC细胞可以是在从收获血管组织用于细胞分离起数分钟、1小时、1-5小时或多达24小时内分离的SM或EC细胞。
在分离之后，血管细胞可以根据形态学、FACS和/或免疫组织化学以及所评估的分离的细胞群体的纯度来表征。在一些实施方案中，EC细胞通过用抗人类CD31染色用于阳性鉴定和用抗α-人类平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色用于鉴定EC群体内的平滑肌细胞和成纤维细胞来鉴定和评估。在一些实施方案中，SMC细胞可以用抗α-人类平滑肌肌动蛋白(α-SMA)鉴定并评估其纯度。用于血管细胞培养物的纯度的标准可以根据指定的标志物的阳性鉴定来表示。在一些实施方案中，SMC细胞培养物是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的α-SMA阳性染色。
在一些具体实施方案中，EC细胞培养物是至少65％CD31阳性和小于15％α-SMA阳性。在一些实施方案中，SMC细胞培养物是至少60％α-SMA阳性。
在一些实施方案中，SMC细胞培养物是至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的CD31阳性染色和小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％的α-SMA阳性染色。
在一些具体的实施方案中，EC细胞培养物是至少65％CD31阳性和小于15％α-SMA阳性。在一些实施方案中，SMC细胞培养物是至少60％α-SMA阳性。
在一些情况下，血管组织是保存的(例如冷冻保存的)血管组织。
如本文所使用的，术语“冷冻保存的”SM或EC细胞指的是已经在超低温度在特殊缓冲液中保存并且其可以根据熟知的方案通过解冻而复苏的细胞。冷冻保存的SM或EC细胞可以是当“新鲜分离”时保存的细胞或在冷冻保存之前经过培养的细胞。
如本文所使用的，术语“培养的血管细胞”、“培养的SM”或“培养的EC细胞”指的是已经被转移到培养基用于繁殖的细胞。在一些实施方案中，血管细胞(例如EC和SM细胞)在转导之前，例如在准备好转导之前被培养。SM和EC细胞可以从新鲜分离的细胞或冷冻保存的细胞中培养，可以是原代细胞培养物(从新鲜组织中培养)或从现有的细胞培养物中培养，或者可以是源自细胞培养系的培养细胞。
用于在转导之前、期间或之后培养血管细胞的合适的培养基和条件是本领域熟知的。这样的培养基包括但不限于MCBD 131RTM、Dulbecco改良的Eagle培养基RTM(DMEM)、DMEMF12培养基RTM、Eagle最小必需培养基RTM、F-12K培养基RTM、Iscove改良的Dulbecco培养基RTM、RPMI-1640培养基RTM、M-199和无血清培养基。在具体的实施方案中，内皮细胞可以在EGM-2TMBulletKitTM培养基(Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland，Cat#CC-3162)中培养，并且平滑肌细胞可以在SmGM-2TM BulletkitTM(Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland，Cat#CC-3182)中培养。许多培养基还作为具有或不具有丙酮酸钠的低葡萄糖制剂可获得。
在一些实施方案中，生长培养基包含血清，例如胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，培养基包含在5％和25％之间、10％和20％之间和10％-15％之间的范围内的血清(例如FBS)。在一些实施方案中，生长培养基包含5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％或25％血清。在特定的实施方案中，内皮细胞生长培养基包含10％FBS。在特定的实施方案中，平滑肌细胞生长培养基包含15％FBS。
另外的补充剂也可以有利地用于为细胞提供用于最佳生长和扩增的必需的微量元素。这样的补充剂包括胰岛素、转铁蛋白、亚烯酸钠及其组合。这些组分可以包含在盐溶液中，所述盐溶液诸如但不限于Hanks平衡盐溶液RTM(HBSS)、Earle盐溶液RTM、抗氧化剂补充剂、MCDB-201RTM补充剂、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、抗坏血酸和抗坏血酸-2-磷酸酯，以及另外的氨基酸。许多细胞培养基已经包含氨基酸，然而，一些需要在培养细胞之前补充。这样的氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。
激素也可以有利地用于本发明的细胞培养物中，并且包括但不限于D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、β-雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长抑素/人类生长激素(HGH)、促甲状腺素、甲状腺素和L-甲状腺素。
脂质和脂质载体也可以用于补充细胞培养基，这取决于细胞的类型和分化的细胞的命运。这样的脂质和载体可以包括但不限于环糊精(α、β、γ)、胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、未缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸-油酸-花生四烯酸，以及未与白蛋白缀合的和与白蛋白缀合的油酸等。
血管细胞(例如EC和SMC)还可以在低血清或无血清培养基中培养。用于培养细胞的无血清培养基在例如美国专利第7,015,037号中描述。
本发明人已经发现，在不具有另外的生长因子的生长培养基+血清中培养血管上皮细胞(EC细胞)在对细胞增殖的影响方面通常等同于在具有添加的生长因子的培养基中的生长(参见实施例1)。特别地，从生长培养基中去除包括氢化可的松、hEGF、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、抗坏血酸和肝素的因子没有显著地负面影响EC细胞生长。因此，在一些实施方案中，血管细胞可以在缺乏选自由氢化可的松、hEGF、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、抗坏血酸和肝素组成的组的至少一种添加的生长因子的培养基中培养。在一些实施方案中，血管上皮细胞在包含EGM和FBS并且缺乏选自由氢化可的松、hEGF、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、抗坏血酸和肝素组成的组的至少一种、至少两种、至少三种添加的生长因子的培养基中培养。在一些实施方案中，EC细胞在包含EGM并且缺乏选自由氢化可的松、hEGF、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、抗坏血酸和肝素组成的组的全部的添加的生长因子的培养基中培养。
根据本发明的一些实施方案，血管细胞在分离之后和在生长培养基中转导之前被培养。在具体的实施方案中，在转导之前，分离的EC细胞在补充有10％FBS的EGM-2TMBulletKitTM培养基中培养。在具体的实施方案中，在转导之前，分离的SMC细胞在补充有15％FBS的SmGM-2TM BulletKitTM培养基中培养。
根据一些实施方案，与在没有指示的条件的情况下分离和预调节的类似血管细胞相比，本发明的血管细胞，凭借预调节和/或培养条件，其特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。特别地，与在没有内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的情况下分离和/或预调节的类似EC细胞相比，本发明的EC细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种，并且与用1.0mg/ml或更高的DEAE-葡聚糖预调节的类似SM细胞相比，本发明的SMC细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
如本文所使用的，术语“增殖”被定义为细胞群体的细胞数的增长或增加。细胞增殖测定主要基于定量每体积培养基的细胞数的增加/减少、测量DNA复制的速率、分析代谢活性和/或细胞表面抗原识别的概念来设计。每体积培养基的细胞数的增加或减少可以通过细胞或颗粒计数器诸如Coulter计数器来评估，该Coulter计数器通过电区域感测来计数和估量悬浮在电解质中的颗粒。此外，DNA复制速率的合适的测定包括但不限于放射性或标记的核苷酸类似物的掺入，即基于3H-胸苷和基于BrdU的测定。合适的代谢活性测定包括但不限于3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)测定、(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-苯胺基甲酰)(XTT)测定、水溶性四唑鎓(WST)盐测定、刃天青测定和ATP的测定。在增殖细胞中存在的靶抗原的合适的测定包括但不限于标志物诸如Ki-67、拓扑异构酶IIB、磷酸组蛋白H3和PCNA的测定。在一些实施方案中，血管细胞增殖通过以下来评估：测量样品中的细胞密度，例如，在细胞培养物的传代中的一次传代时收获之后，通过coulter计数器来测量，并且将细胞数(例如，培养容器中的总细胞数、每体积细胞培养物的细胞数等)与相同或另一种细胞培养物的先前值进行比较。在一些实施方案中，培养物中细胞的生长速率或增殖速率被表示为每单位时间，例如每天的分裂的细胞分裂的数量(时间“t”时的细胞数减去时间“0”时的细胞数再除以时间“0”时的细胞数)。在其他实施方案中，生长速率被表示为在标准或预定条件下细胞的生长速率的分数或百分比(例如，“与在EGM+15％FBS中的生长速率的差异，图11)。培养的血管细胞的增殖还可以被表示为与在培养之前或在收获和重新接种之前的原始血管细胞分数相比，血管细胞的倍数增加(例如，扩增或倍数扩增)。
在一种实施方案中，根据本发明的培养的血管细胞的群体的细胞增殖在将血管细胞接种在培养物中之后的预定时间(例如，约10小时、12小时、约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、约1周、2周、3周、4周或更长)测量。
如本文所使用的，术语“转导率”被定义为在转导过程中将逆转录病毒载体和其中包含的DNA转移到细胞中的效率。应当理解，表观转导率可以不仅受实际经历转导的细胞数的影响，而且受转导的细胞的活力及其在培养物中继续增殖的能力的影响。在一些实施方案中，所要求保护的血管细胞的转导率通过转导的细胞的代谢或其他报告物反应，诸如Lac-Z表达细胞中的β-半乳糖苷酶与溴氯吲哚酚半乳糖苷(X-Gal)(半乳糖-吲哚化合物)的反应来测定，其在β-半乳糖苷酶的存在下导致特征性的蓝色调染色。这样的测定可以对沉积在载玻片上的细胞的样品进行，以便通过显微镜检测和计数。转导率的测定还可以基于检测转导的细胞和/或其后代中的载体DNA或其表达来进行。例如，来自培养物的细胞的样品可以被接种到载玻片上，并且重组产物通过例如免疫组织化学(IHC)在细胞中检测。
包含载体DNA的细胞的比例可以是用于评估转导率的基础。转导率还可以包括包含逆转录病毒载体的细胞相对于暴露于转导过程的细胞的总数量(转导前的细胞数)的比例的计算。在其他实施方案中，转导率可以通过定量检测到的具有转导的载体的表达产物的细胞的比例来评估，例如，使用抗Ang-1或抗VEGF抗体来评估。在又其他实施方案中，转导率通过在培养基中检测靶向的从转导的血管细胞分泌的重组表达产物来评估，诸如通过用Ang-1特异性或VEGF特异性抗体对培养基进行酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估。
对培养的血管细胞的评估可以包括对活力的评估。培养物中血管细胞的术语“活力”通常涉及确定细胞是活着的还是死亡的，并且对于细胞的群体而言，提供了对所研究的特定群体中活细胞的比例的良好估计。用于适用于本发明的血管细胞的这样的测量的方法包括但不限于代谢活力和染料排斥活力测定。染料排斥测定基于细胞膜排斥特定染色(“活体染料”)的能力。合适的染料排斥测定的非限制性列表包括台盼蓝染色、碘化丙啶染色染色、7-氨基放线菌素-D(“7-AAD”)和吖啶橙。代谢测定包括但不限于四唑鎓还原、刃天青还原、蛋白酶标志物和ATP检测。
根据本发明的一些实施方案，人类平滑肌细胞用包含编码血管内皮生长因子165(VEGF165)多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导。合适的VEGF165多肽包括但不限于GenBank登录号BAG70136.1、AAM03108.1、BAA78418.1和BAG70265.1。根据本发明的其他实施方案，人类内皮细胞用包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导。合适的Ang-1多肽包括但不限于GenBank登录号AAM92271.1和NP-00130980。如本文所使用的，术语“逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体”指的是核酸表达构建体。为了在哺乳动物细胞中表达外源多肽，将编码VEGF-A家族生长因子VEGF165(例如，GenBank登录号AF486837、GenBank登录号AB021221、GenBank登录号FLJ08203AAAN)或Ang-1多肽(例如，GenBank登录号AY124380.1、BC152419.1、AB084454.1)的多核苷酸序列连接到适用于哺乳动物细胞表达的核酸构建体中。这样的核酸构建体包括用于以组成型或诱导型方式指导细胞中多核苷酸序列的转录的启动子序列。
本发明的一些实施方案的核酸构建体(在本文中也被称为“表达载体”)包括另外的序列，其使得该载体适用于在原核生物、真核生物或优选地两者中复制和整合(例如，穿梭载体)。此外，典型的克隆载体还可以包含转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子以及多腺苷酸化信号。通过实例的方式，这样的构建体将通常包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成起点和3'LTR或其一部分。
本发明的一些实施方案的核酸构建体通常包括信号序列，以用于从放置有信号序列的宿主细胞分泌该肽。在一些实施方案中，用于该目的的信号序列是哺乳动物信号序列或对本发明的一些实施方案的多肽变体有特异性的信号序列。
真核启动子通常包含两种类型的识别序列，即TATA盒和上游启动子元件。位于转录起始位点上游25-30个碱基对的TATA盒被认为参与指导RNA聚合酶开始RNA合成。其他上游启动子元件决定转录启动的速率。增强子元件可以刺激来自连接的同源或异源启动子的多达1,000倍的转录。增强子在放置于转录起始位点的下游或上游时是有活性的。许多来源于病毒的增强子元件具有广宿主范围，并且在各种组织中是有活性的。例如，SV40早期基因增强子适用于许多细胞类型。适用于本发明的一些实施方案的其他增强子/启动子组合包括来源于多瘤病毒、人类或鼠巨细胞病毒(CMV)、来自各种逆转录病毒诸如鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒或劳斯肉瘤病毒和HIV的长末端重复序列的增强子/启动子组合。参见，Enhancers and Eukaryotic Expression,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,N.Y.1983，其通过引用并入本文。
本发明的一些实施方案的核酸构建体所使用的启动子和增强子元件在所转化的特定细胞群体，例如SC和/或EC细胞中，是有活性的。可以被本发明的核酸构建体使用的合适的启动子/增强子的实例包括内皮特异性启动子：参见Harats等人的美国专利公布2014/0155467，前内皮素原-1(preproendothelin-1)、PPE-1启动子(Harats D,J ClinInvest.1995年3月；95(3):1335-44)、PPE-1-3x启动子[PCT/IL01/01059；Varda-Bloom N,Gene Ther 2001年6月；8(11):819-27]、TIE-1(S79347,S79346)和TIE-2(U53603)启动子[Sato T N,Proc Natl Acad Sci USA 1993年10月15日；90(20):9355-8]、内皮联蛋白启动子[Y11653；Rius C,Blood 1998年12月15日；92(12):4677-90]、血管性血友病因子[AF152417；Collins C J Proc Natl Acad Sci USA 1987年7月；84(13):4393-7]、KDR/flk-1启动子[X89777,X89776；Ronicke V,Circ Res 1996年8月；79(2):277-85]、FLT-1启动子[D64016AJ224863；Morishita K,:J Biol Chem 1995年11月17日；270(46):27948-53]、Egr-1启动子[AJ245926；Sukhatme V P,Oncogene Res 1987年9月-10月；1(4):343-55]、E-选择素启动子[Y12462；Collins T J Biol Chem 1991年2月5日；266(4):2466-73]；内皮黏附分子启动子：ICAM-1[X84737；Horley K J EMBO J 1989年10月；8(10):2889-96]、VCAM-1[M92431；Iademarco M F,J Biol Chem 1992年8月15日；267(23):16323-9]、PECAM-1[AJ313330X96849；CD31,Newman P J,Science 1990年3月9日；247(4947):1219-22]；血管平滑肌特异性元件：CArG盒X53154和主动脉羧肽酶样蛋白(ACLP)启动子[AF332596；LayneM D,Circ Res.2002；90:728-736]以及主动脉优先表达基因-1(Aortic PreferentiallyExpressed Gene-1)[Yen-Hsu Chen J.Biol.Chem.,第276卷,第50期,47658-47663,2001年12月14日]；可以使用包含主动脉优先表达基因-1(APEG-1)E盒基序的合成启动子(Hsieh等人,J Biol Chem 274(20):14344-14351(1999)，其在此通过引用以其整体并入)。此外，可以使用对微血管内皮细胞有特异性的启动子，诸如降钙素受体样受体(CRLR)的启动子(Nikitenko等人,FASEB J.17(11):1499-501(2003)，其在此通过引用以其整体并入)。其他合适的血管特异性启动子是本领域熟知的，诸如例如EPCR启动子(Gu等人的美国专利第6,200,751号)和VEGF启动子(Williams等人的美国专利第5,916,763号)。
在表达载体的构建中，启动子优选地被定位在距异源转录起始位点的距离与启动子在其自然环境中距转录起始位点的距离大致相同的位置。然而，如本领域已知的，该距离中的一些变化可以被调整而不损失启动子功能。
多腺苷酸化序列还可以被添加到表达载体，以增加mRNA翻译的效率。精确且有效的多腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于多腺苷酸化位点的下游的富含GU或U的序列和位于上游11-30个核苷酸的高度保守的六核苷酸序列AAUAAA。适用于本发明的一些实施方案的终止和多腺苷酸化信号包括来自SV40的终止和多腺苷酸化信号。
除了已经描述的元件之外，本发明的一些实施方案的表达载体通常可以包含意在增加克隆的核酸的表达水平或促进携带重组DNA的细胞的鉴定的其他专门元件。例如，许多动物病毒包含促进许可的细胞类型中病毒基因组的染色体外复制的DNA序列。具备这些病毒复制子的质粒被附加型地复制，只要由质粒上携带的基因或用宿主细胞的基因组提供合适的因子。
载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果真核复制子存在，那么载体在真核细胞中可使用适当的选择性标志物扩增。如果载体不包含真核复制子，则附加型扩增是不可能的。与之相比，重组DNA整合到工程化细胞的基因组中，其中启动子指导期望的核酸的表达。
本发明的一些实施方案的表达载体还可以包括允许例如从单个mRNA诸如内部核糖体进入位点(IRES)翻译若干种蛋白的另外的多核苷酸序列以及用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列。
应当理解，表达载体中包含的各个元件可以以各种配置排列。例如，增强子元件、启动子等以及甚至一个或更多个多核苷酸编码序列可以以“头对尾(head-to-tail)”配置排列，可以作为反向互补序列存在，或以互补配置、作为反平行链存在。虽然这样的各种配置更有可能与表达载体的非编码元件一起出现，但是还设想了表达载体内的编码序列的替代配置。
合适的载体包括病毒表达载体，诸如逆转录病毒、慢病毒或疱疹病毒。在一些具体的实施方案中，核酸构建体是逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体。如本文所使用的，术语“逆转录病毒核酸表达构建体”指的是用于表达多核苷酸序列的核酸构建体，该多核苷酸序列包含提供病毒包装、细胞附着和编码序列转录的逆转录病毒基因组的部分，以及任选地其他逆转录病毒调节元件。载体系统用于用核酸构建体感染自体或外源血管细胞，该血管细胞进而表达血管生成增殖和成熟因子。
病毒构建体诸如逆转录病毒构建体包括至少一个转录启动子/增强子或基因座定义元件，或通过其他手段诸如选择性剪接、核RNA输出或信使的翻译后修饰控制基因表达的其他元件。这样的载体构建体还包括包装信号、长末端重复序列(LTR)或其部分，以及适于所使用的病毒的正链和负链引物结合位点，除非其已经存在于病毒构建体中。此外，这样的构建体通常包括信号序列，以用于从放置有信号序列的宿主细胞分泌该肽。优选地，用于该目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的一些实施方案的多肽变体的信号序列。任选地，构建体还可以包括指导多腺苷酸化的信号，以及一个或更多个限制性位点和翻译终止序列。
已经被修饰以形成合适的核酸构建体用于将编码VEGF165或Ang-1多肽的重组基因递送到SC或EC细胞中的逆转录病毒载体在Flugelman等人的美国专利第7,524,493号中公开，该美国专利在此通过引用以其整体并入。
在具体的实施方案中，包含编码VEGF 165多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒载体在SEQ ID NO:1中列出。
在其他具体的实施方案中，包含编码血管生成素-1多肽的多核苷酸的逆转录病毒载体在SEQ ID NO:2中列出。
说明性逆转录病毒包括但不限于：Moloney鼠白血病病毒(M-MuLV)、Moloney鼠肉瘤病毒(MoMSV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(Spumavirus)、Friend鼠白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))以及慢病毒。如本文所使用的，术语“慢病毒”指的是复杂逆转录病毒的群(group)(或属)。说明性慢病毒包括但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)；visna-maedi(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一种实施方案中，基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)是优选的。逆转录病毒载体并且更特别地慢病毒载体可以用于实施本发明。因此，如本文所使用的术语“逆转录病毒”或“逆转录病毒载体”分别意指包括“慢病毒”和“慢病毒载体”。另外的慢病毒载体还包括在Arya的美国专利第6,790,657号、Kafri等人的美国专利申请公布第2004/0170962号以及Arya的美国专利申请公布第2004/0147026号中描述的慢病毒载体，这些美国专利在此通过引用以其整体并入。SV40载体包括pSVT7和pMT2。来源于牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且来源于Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许在以下的指导下表达蛋白的任何其他载体：SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或示出在真核细胞中有效表达的其他启动子。
本发明设想准备血管细胞用于转导和/或用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导细胞。在体外，细胞通常遭受在转导之后延长的恢复和受损的活力，对采用转导的细胞的治疗方法的效率和效力产生负面影响。根据本发明的方法提供的血管细胞提供了增强在转导之后的细胞的治疗潜力的有效方式。可选择地或另外地，根据本发明的方法的血管细胞转导提供了增强转导的细胞的治疗潜力的有效方式。
使用逆转录病毒或慢病毒载体通过病毒感染而不是通过转染的手段来递送基因或其他多核苷酸序列被称为转导。在一种实施方案中，逆转录病毒载体通过感染和前病毒整合被转导到细胞中。在某些实施方案中，如果细胞(例如靶细胞)包含通过使用病毒载体或逆转录病毒载体感染递送到细胞的基因或其他多核苷酸序列，则该细胞(例如靶细胞)被“转导”。在特定的实施方案中，转导的细胞在其细胞基因组中包含由逆转录病毒载体或慢病毒载体递送的一个或更多个基因或其他多核苷酸序列。
逆转录病毒可以用于使用本领域熟知的技术离体或体外感染细胞。例如，当细胞，例如平滑肌细胞或内皮细胞被离体或体外转导时，逆转录病毒载体颗粒可以使用通常在1至50之间的感染复数(MOI)的数量级的剂量与细胞一起孵育，该剂量还对应于每1×105个细胞1×105个至50×105个病毒载体的转导单位。当然，这包括对应于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45和50MOI的载体的量。
病毒浓度还可以根据病毒滴度(TU/mL)来表示和提供，病毒滴度可以例如通过使用商购可得的外壳蛋白(coat protein)滴度测定来测量，外壳蛋白滴度测定是针对病毒外壳蛋白的ELISA。下式可以用于计算外壳蛋白的pg/mL：慢病毒的每个物理颗粒(PP)存在约n个外壳蛋白的分子，(n)X(每个PP的外壳蛋白的摩尔质量)＝Y,Y/Avogadro＝(Y)/(6X1023)＝每个PP的外壳蛋白的Z g或每克外壳蛋白的1/Z PP。合理良好包装的VSV-G假型慢病毒载体会具有在每1000个物理颗粒(PP)1TU至每100个PP 1TU(或更少)的范围内的感染性指数，其可以被转化为TU/外壳蛋白的质量。
根据本发明，用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类平滑肌细胞包括(a)用DEAE葡聚糖预调节人类平滑肌细胞和(b)使人类平滑肌细胞与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含该构建体的转导培养基中接触。
根据本发明的一些方面，制备用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类血管内皮细胞和平滑肌细胞尤其包括使人类血管内皮细胞和平滑肌细胞与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含该构建体的转导培养基中接触之前，用DEAE葡聚糖预调节人类血管内皮细胞和平滑肌细胞。
相同的教导可以用于转导本身。
根据本发明，用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类平滑肌细胞包括(a)用DEAE葡聚糖预调节人类平滑肌细胞和(b)使人类平滑肌细胞与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含该构建体的转导培养基中接触。
如本文所使用的，术语“DEAE-葡聚糖”指的是阳离子聚合物二乙基氨基乙基-葡聚糖，或O,O′-双[2-(N-琥珀酰亚胺基-琥珀酰氨基)乙基]聚乙二醇。DEAE-葡聚糖在1000kDa至500,000kDa或更大的平均分子量范围内是可获得的。在具体的实施方案中，DEAE-葡聚糖具有>500,000千道尔顿的平均分子量。DEAE-葡聚糖与DNA复合，促进与膜的黏附并且促进DNA进入细胞中。然而，暴露于DEAE-葡聚糖可以损伤细胞并且在转导之后损害其活力。本发明人已经确定了有效增强血管细胞转导而不损害转导的血管细胞的活力和治疗价值的用DEAE-葡聚糖预调节的特定浓度和持续时间。
因此，在一些实施方案中，平滑肌细胞用0.10mg/ml和0.9mg/ml DEAE-葡聚糖之间的范围内的DEAE-葡聚糖浓度预调节。在一些实施方案中，预调节用0.125mg/ml-0.8mg/mlDEAE-葡聚糖之间、0.25mg/ml-0.75mg/ml DEAE-葡聚糖之间、0.30mg/ml-0.72mg/ml DEAE-葡聚糖之间、0.42mg/ml-0.67mg/ml DEAE-葡聚糖之间、0.48mg/ml-0.62mg/ml DEAE-葡聚糖之间、0.125mg/ml-0.5mg/ml DEAE-葡聚糖之间或0.125mg/ml-0.75mg/ml DEAE-葡聚糖之间的DEAE-葡聚糖范围进行。在一些实施方案中，预调节用0.125mg/ml DEAE-葡聚糖、0.20mg/ml DEAE-葡聚糖、0.25mg/ml DEAE-葡聚糖、0.40mg/ml DEAE-葡聚糖、0.50mg/mlDEAE-葡聚糖或0.75mg/ml DEAE-葡聚糖进行。在具体的实施方案中，预调节用0.125mg/mlDEAE-葡聚糖进行。
预调节的持续时间也最终是在用逆转录病毒构建体进行的平滑肌细胞转导的效力中的一个因素。因此，根据一些实施方案，用DEAE-葡聚糖预调节平滑肌细胞进行0.5分钟和5分钟之间。在一些实施方案中，预调节进行0.5分钟和5分钟之间、1分钟和5分钟之间、1分钟和4分钟之间、1.5分钟和3.5分钟之间、2分钟和3分钟之间、1.7分钟和3.2分钟之间、0.8分钟和2分钟之间。在一些实施方案中，预调节进行0.5分钟、0.75分钟、1.0分钟、1.5分钟、2.0分钟、2.5分钟、3.0分钟、3.5分钟或4.0分钟。在具体的实施方案中，用DEAE-葡聚糖预调节进行1分钟。在具体的实施方案中，用DEAE-葡聚糖预调节用0.125mg/ml DEAE-葡聚糖进行1分钟。
在本发明的一些实施方案中，血管内皮细胞在转导之前用DEAE-葡聚糖预调节。用DEAE-葡聚糖预调节内皮细胞用0.5mg/ml和1.5mg/ml DEAE-葡聚糖之间的范围内的DEAE-葡聚糖浓度进行。在一些实施方案中，EC的预调节用0.75mg/ml-1.25mg/ml DEAE-葡聚糖之间或0.8mg/ml-1.2mg/ml DEAE-葡聚糖之间的DEAE-葡聚糖范围进行。在一些实施方案中，EC的预调节用0.5mg/ml DEAE-葡聚糖、0.75mg/ml DEAE-葡聚糖、0.9mg/ml DEAE-葡聚糖、1.0mg/ml DEAE-葡聚糖、1.2mg/ml DEAE-葡聚糖或1.4mg/ml DEAE-葡聚糖进行。在具体的实施方案中，EC的预调节用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖进行。
根据一些实施方案，用DEAE-葡聚糖预调节内皮细胞(EC)进行0.5分钟和5分钟之间。在具体的实施方案中，预调节进行1分钟至3分钟之间。在具体的实施方案中，用DEAE-葡聚糖预调节进行1分钟。在具体的实施方案中，用DEAE-葡聚糖预调节EC用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖进行1分钟。
用DEAE-葡聚糖预调节可以用在用于EC细胞和SM细胞的任何合适的培养基中提供的DEAE-葡聚糖进行。在具体的实施方案中，SM细胞和EC细胞的预调节在不具有FBS的转导培养基中进行。在其他实施方案中，当使用预调节时，预调节在孵育培养基(不具有血清的M199+谷氨酰胺)中进行。
在预调节之后，在准备用于转导中，将血管细胞洗去预调节培养基，并且准备用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体进行转导。用于血管细胞的合适的转导培养基包括但不限于M199、DMEM和MCB131。根据具体的实施方案，血管细胞转导培养基包含M199培养基。根据另外的实施方案，血管细胞转导培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方案中，转导培养基包含1mM和10mM之间的范围内的谷氨酰胺。在一些实施方案中，转导培养基包含1mM和10mM之间、2mM和8.0mM之间、2.5mM和7.5mM之间、3mM和6.5mM之间、4mM和6mM之间或4mM-5mM的范围内的谷氨酰胺。在一些实施方案中，转导培养基包含1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM的谷氨酰胺。在具体的实施方案中，转导培养基包含2mM谷氨酰胺。在其他具体的实施方案中，血管细胞转导培养基包含M199培养基和2mM谷氨酰胺。在具体的实施方案中，包含M199培养基和2mM谷氨酰胺的转导培养基是无血清培养基。
本发明的血管细胞可以在合适的容器中转导，所述容器包括但不限于管、毛细管、细胞培养容器、细胞培养板等。本发明人已经发现，在血管细胞转导期间转导培养基的体积可以影响转导的血管细胞的转导效力和活力。
根据一些实施方案，转导包括在0.5ml-2.0ml转导培养基的体积中在包含逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体的转导培养基中使人类血管细胞(SM或EC)接触。在一些实施方案中，接触在0.5ml、0.60ml、0.70ml、0.80ml、1.0ml、1.5ml或2.0ml转导培养基的体积中进行。在具体的实施方案中，本发明的预调节的人类SM细胞与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在1ml转导培养基的体积中接触。在具体的实施方案中，本发明的预调节的人类EC细胞可以与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在0.70ml转导培养基的体积中接触。
血管细胞的逆转录病毒转导的持续时间的适当时机可以一方面对转导的效力(例如转导率)具有重要贡献，而且另一方面影响转导的细胞的活力和治疗有用性。根据本发明的一些实施方案，流线型的转导过程提供了良好的转导效率，同时在转导的血管细胞中保持高水平的活力。
因此，根据一些实施方案，本发明的血管细胞的转导包括在包含逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体的转导培养基中使人类血管细胞(SM或EC)与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体接触至少2.5个且不超过3.5个连续的小时的持续时间。在一些实施方案中，持续时间在2.6-3.3个连续的小时、2.8-3.2个连续的小时或2.9-3.1个连续的小时的范围内。在一些实施方案中，接触的持续时间是2.5个、2.75个、3.0个、3.25个或3.5个连续的小时、2.8-3.2个连续的小时或2.9-3.1个连续的小时。在具体的实施方案中，EC和SM细胞的接触的持续时间是2.5个连续的小时。
转导的效力(率)可以通过测量转导的血管细胞的表型变化，诸如逆转录病毒标志物或由构建体编码的重组蛋白来评估，如上文详细描述的。在一些实施方案中，转导率通过以下两者来评估：对于在转导的细胞中的细胞内重组蛋白(例如转导的EC细胞中的Ang-1)，通过免疫组织化学来评估，以及对于分泌的蛋白水平，可以在转导之后在细胞的培养期间通过细胞培养基的ELISA来测定。根据本发明，当测量细胞内重组蛋白和分泌的重组蛋白的水平两者时，已经发现较短的转导时间(例如2.5个连续的小时)与较长的(例如4小时)持续时间同等有效。
根据本发明，血管细胞(SM或EC细胞)可以在转导之后在生长培养基中培养，根据用于转导的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体上携带的选择性标志物通常在选择剂例如G418、新霉素等的存在下培养，培养持续至少足以允许有效选择对选择剂的负面影响具有抗性的细胞的培养持续时间。用于培养血管细胞的一些合适的培养基在上文中详细描述。在一些实施方案中，人类平滑肌细胞在转导后在包含平滑肌生长培养基(SmGm)-2Bullet Kit培养基TM(CloneticsTM,Lonza,Basel)的生长培养基中培养。简言之，平滑肌生长培养基(SmGm)-2 Bullet Kit培养基TM包含基础平滑肌生长培养基加上补充剂和生长因子(例如hEGF、胰岛素、hFGF-B、胎牛血清FBS、庆大霉素/两性霉素B)。在一些实施方案中，生长培养基还包含胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，生长培养基包含5％和25％之间、10％和20％之间和10％-15％之间的范围内的FBS。在一些实施方案中，生长培养基包含5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％或25％FBS。在具体的实施方案中，转导的平滑肌细胞在转导后在包含生长培养基和15％FBS的生长培养基中培养。在其他具体的实施方案中，平滑肌细胞在转导后在包含平滑肌生长培养基(SmGm)-2 Bullet Kit培养基TM和15％FBS的生长培养基中培养。
在一些实施方案中，人类EC细胞在转导后在包含内皮细胞生长培养基(EGM)-2Bullet Kit培养基TM(CloneticsTM,Lonza,Basel)的生长培养基中培养。简言之，内皮生长培养基(EGM)-2 Bullet Kit培养基TM包含基础内皮生长培养基加上补充剂和生长因子(例如hEGF、氢化可的松、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、肝素、胎牛血清FBS、庆大霉素/两性霉素B)。在其他实施方案中，内皮生长培养基不含所叙述的生长因子或者是所叙述的生长因子中的至少一种、至少两种或全部。在一些实施方案中，生长培养基还包含胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，生长培养基包含5％和25％之间、10％和20％之间和10％-15％的范围内的FBS。在一些实施方案中，生长培养基包含5％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％或25％FBS。在具体的实施方案中，转导的EC细胞在转导后在包含生长培养基和10％FBS的生长培养基中培养。在其他具体的实施方案中，EC细胞在转导后在包含内皮生长培养基(EGM)-2 Bullet Kit培养基TM和10％FBS的生长培养基中培养。
II.细胞转导的方法
本发明人已经发现了这样的方法：实现用编码促血管生成因子的构建体对血管细胞(例如SM和EC细胞)进行有效逆转录病毒转导，产生了表达促血管生成因子的高活力、增殖的血管细胞，这些细胞可以被制备用于诱导新血管形成以治疗血管疾病，尤其是在移植中用于诱导新血管形成以治疗血管疾病。
因此，根据一个方面，本发明涉及用包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导平滑肌(SM)细胞的方法，该方法包括：(a)用0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE-葡聚糖预调节人类SM细胞，和(b)使SM细胞与逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含该核酸构建体的转导培养基中接触。
根据一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
根据一些实施方案，预调节用0.125mg/ml-0.5mg/ml的DEAE-葡聚糖进行。
根据一些实施方案，预调节用0.125mg/ml的DEAE-葡聚糖进行。
根据一些实施方案，预调节进行1分钟和4分钟之间。
根据一些实施方案，预调节进行2分钟和3分钟之间。
根据一些实施方案，预调节进行1分钟。
根据一些实施方案，人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据一些实施方案，人类平滑肌细胞在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 BulletKit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中分离。
根据一些实施方案，人类平滑肌细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据一些实施方案，人类平滑肌细胞在转导之前被培养。
根据一些实施方案，步骤(b)的接触在1ml转导培养基的体积中进行。
根据一些实施方案，人类平滑肌细胞在所述转导之前和之后在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
根据一些实施方案，生长培养基还包含5％-25％的胎牛血清(FBS)。
根据一些实施方案，生长培养基还包含10％-20％的胎牛血清(FBS)。
根据一些实施方案，生长培养基还包含15％的胎牛血清(FBS)。
根据另一个方面，本发明涉及用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导内皮细胞(EC)的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，该方法包括：(a)用1.0mg/ml的DEAE-葡聚糖预调节人类EC细胞，和(b)在包含核酸构建体的转导培养基中使内皮细胞接触至少2.5个连续的小时且不超过3.5个连续的小时的持续时间。
根据一些实施方案，核酸构建体包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
根据一些实施方案，持续时间是2.8-3.2个连续的小时。
根据一些实施方案，持续时间是2.5-3.0个连续的小时。
根据一些实施方案，持续时间是2.5个连续的小时。
根据一些实施方案，所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
根据一些实施方案，人类内皮细胞在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。
根据一些实施方案，人类内皮细胞是冷冻保存和解冻的来自静脉组织的内皮细胞。
根据一些实施方案，人类内皮细胞在转导之前被培养。
根据一些实施方案，人类内皮细胞在所述转导之前和之后在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的生长培养基中培养。
根据一些实施方案，生长培养基还包含5％-25％的胎牛血清(FBS)。
根据一些实施方案，生长培养基还包含10％-20％的胎牛血清(FBS)。
根据一些实施方案，生长培养基还包含10％的胎牛血清(FBS)。
根据一些实施方案，转导培养基包含M199培养基。
根据一些实施方案，转导培养基还包含1mM-10mM谷氨酰胺。
根据一些实施方案，转导培养基还包含2mM-8mM谷氨酰胺。
根据一些实施方案，转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
根据一些实施方案，转导培养基是无血清培养基。
适合用于本发明的方法的血管细胞(SM和EC)包括新鲜分离的来自血管组织的血管细胞以及保存的血管细胞和培养的血管细胞。用于从血管组织中分离平滑肌细胞的方法是本领域熟知的。
根据转导方面的关于转导的教导的细节在上文部分(I)中提供。
III.转导的细胞的低温保存方法
本发明在其一些实施方案中涉及用于有效保存逆转录病毒转导的血管组织细胞(例如内皮细胞EC和/或平滑肌细胞SM)的方法和组合物。表达促血管生成因子诸如VEGF和Ang-1的转导的血管组织细胞可以以延长转导的细胞的有效保存期(shelf life)、增加它们在促血管生成疗法中使用的实用性的方式被制备用于低温保存。
本发明人已经发现，逆转录病毒转导的血管细胞(例如SM和EC细胞)在降低的温度在不同保存溶液中对孵育的反应特征性地不同，影响它们的活力以及增殖能力和转基因表达，最终影响它们对用于治疗血管疾病的移植的适用性。
在2℃和8℃之间，在包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的细胞内型低温保存溶液中或者在包含补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育持续长达48小时后，仔细监测逆转录病毒转导的平滑肌细胞和内皮细胞的命运指示出：在用包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的细胞内型低温保存溶液冷孵育的平滑肌细胞中，转导的平滑肌细胞增殖(参见图21B)、细胞活力(参见图22B)、培养物中的细胞状况(参见图23C、图23D以及图24C和图24D)和转基因表达(参见表10和表11)是优异的，同时，在包含补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中，转导的平滑肌细胞增殖(参见图21A)、细胞活力(参见图22A)、培养物中的细胞状况(参见图23A、图23B以及图24A和图24B)和转基因表达(参见表10和表11)是优异的(参见下文实施例4)。
因此，根据一个方面，本发明涉及低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，该方法包括在2℃和8℃之间在包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的细胞内型低温保存溶液中孵育转导的人类平滑肌细胞。
根据另一个方面，本发明涉及低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在包含补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育转导的人类内皮细胞。
如本文使用的，术语“低温”被定义为与低于室温的平均温度相关。例如，“低温”温度包括但不限于约0℃至约15℃之间的温度、约2℃至约8℃之间的温度、约3℃至约5℃之间的温度，等等。在具体的实施方案中，“低温”涉及4℃和8℃之间的温度。在其他实施方案中，“低温”涉及4℃的温度。应注意，术语“低温(hypothermal)”和“低温(hypothermic)”在本文中可互换地使用。
用于使细胞和其他生物材料冷却至低温的设备是本领域熟知的。冷却块、冰箱、冰浴、化学冷却(吸热反应)、珀尔帖效应冷却器等以各种配置大量存在。但是，温度的精确调节是至关重要的，一方面是为了保护细胞(或其他样品)免于冷冻以及冷冻和解冻的不期望后果，并且另一方面是为了保护细胞免于对培养物升温的细胞毒性反应。在转导的血管细胞的低温保存期间不超过2-3度的波动是合意的，并且在甚至更窄范围内的温度调节是更合意的。
在特定的实施方案中，用于低温保存的转导的血管细胞被预定通过注射施用至有相应需要的患者，诸如罹患外周血管疾病、缺血或糖尿病血管并发症的患者。因此，应理解，低温保存溶液必须包含适合于注射到患者中的组分。
根据本发明的一个方面，用包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌细胞通过在包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的细胞内型低温保存溶液中孵育来低温保存。
如本文使用的，术语“细胞内型”低温保存溶液是指这样的保存溶液：被设计成平衡在低温和在营养物剥夺条件(nutrient-deprived conditions)下孵育细胞所产生的改变的细胞离子浓度。在一些实施方案中，这样的“细胞内型”低温保存溶液除了包含维持离子平衡所需要的电解质(主要是单价阳离子)之外，还包含被设计成进行以下的组分：抵消钠泵活性降低导致的不正常(irregular)钠离子和氯离子浓度、抵消由水流入产生的细胞内渗透压增加导致的细胞溶胀、抵消细胞内胶体渗透压、补救低温保存期间预期的能量不足、提供pH稳定性以及为从低温保存恢复后细胞增加的代谢需求提供ATP合成底物。
在一些实施方案中，“细胞内型”低温保存溶液包含：乳糖酸盐，以替代细胞外氯离子(Cl-)；不渗透分子，诸如乳糖酸盐、蔗糖和甘露糖醇，以抵消细胞内渗透压导致的细胞溶胀；右旋糖酐-40，以平衡胶体渗透压；低水平的葡萄糖，作为能量来源；HEPES，作为在低温有活性并且足够大以有助于渗透支持的缓冲剂；和能量底物(诸如腺苷和谷胱甘肽)。Taylor在美国专利第6,492,103号中详细描述了示例性的“细胞内型”低温保存溶液。
在具体的实施方案中，“细胞内型”低温保存溶液包含维生素E或6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸(Trolox)、Na离子、钙离子、K离子和Mg离子。在其他特定的实施方案中，“细胞内型”低温保存溶液包含腺苷和谷胱甘肽。在特定的实施方案中，“细胞内型”低温保存溶液是
Figure BDA0003347657360000431
或
Figure BDA0003347657360000432
-FRS。
Figure BDA0003347657360000433
或
Figure BDA0003347657360000434
-FRS(HTS)是商购可得的，并且由BioLife Solutions,Inc(Bothell,WA)制造。HTS适合于在低温储存，并且可以被直接施用至需要血管细胞的患者，而不需要另外的处理或测试。
根据本发明的另一个方面，用包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞通过在包含补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育来低温保存。
如本文使用的，术语“等渗型”低温保存溶液是指这样的可注射保存溶液：被配制成提供流体源(例如水)、电解质和卡路里，以在低温保存期间维持细胞的电解质平衡。添加的白蛋白(例如人类白蛋白)可以充当自由基清除抗氧化剂，抵消保存的细胞的自由基损伤，调节胶体渗透压并且使悬浮液中的细胞稳定，作为配体结合剂和过渡金属离子结合剂发挥功能以增强细胞生存，并且通常增强悬浮液中的细胞的活力和生存。添加的肝素可以发挥功能以抵消细胞团聚和增强注射的内皮细胞的血管生成效力。肝素和添加的右旋糖，由于它们的分子量，都充当不渗透物质(impermeants)以抵消细胞内胶体渗透压导致的细胞溶胀。
在一些实施方案中，等渗型低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、Cl离子、乙酸根离子和葡萄糖酸根离子，并且用碳酸氢钠调节至pH7.4-7.7。在其他实施方案中，等渗低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子、葡萄糖酸根离子、右旋糖、肝素和人类白蛋白，并且用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
在特定的实施方案中，“等渗型”低温保存溶液包含补充有0.1％右旋糖、100U/ml肝素和1％人类白蛋白的Plasma-Lyte
Figure BDA0003347657360000441
等渗溶液，用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。1升的溶解在水中的Plasma-Lyte
Figure BDA0003347657360000442
具有140mEq钠、5mEq钾、3mEq镁、98mEq氯离子、27mEq乙酸根和23mEq葡萄糖酸根的离子浓度。容量渗透摩尔浓度(osmolarity)是294mOsmol/L(计算)。正常生理容量渗透摩尔浓度范围是280mOsmol/L至310mOsmol/L。热量含量是21kcal/L。Plasma-Lyte
Figure BDA0003347657360000443
(PL)是商购可得的，并且由Baxter Heathcare Corp(Deerfield,IL)制造。
PL适合于在低温储存，并且可以被直接施用至需要血管细胞的患者，而不需要另外的处理或测试。
冷冻保存溶液通常包含偶极非质子溶剂(例如DMSO)，用于在冷冻-解冻循环期间玻璃化。然而，重要的是应强调，这样的偶极非质子溶剂与可注射的保存溶液不相容。因此，在本发明的特定的实施方案中，低温保存溶液不含偶极非质子溶剂。
如所述的，与在“等渗型”低渗保存溶液中低温保存的转导的平滑肌细胞相比，在“细胞内型”低温保存溶液(HTS)中低温保存的转导的平滑肌细胞在低温保存后呈现出良好的活力、细胞增殖和VEGF165转基因表达。因此，根据本发明的一些实施方案，与保存在补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液中的相同的转导的平滑肌细胞相比，转导的平滑肌细胞的特征在于以下中的至少一种：低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或者低温保存后转基因表达增强。
同样，与在“细胞内型”保存溶液中低温保存的转导的内皮细胞相比，在“等渗型”低温保存溶液(PL)中低温保存的转导的内皮细胞在低温保存后呈现出良好的活力、细胞增殖和Ang-1转基因表达。因此，根据本发明的一些实施方案，与保存在包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的“细胞内型”低温保存溶液中的相同的转导的内皮细胞相比，转导的内皮细胞的特征在于以下中的至少一种：低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或者低温保存后转基因表达增强。
因此，本发明的实施方案涉及以下。
根据本发明的一方面，提供了低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在细胞内型低温保存溶液中孵育转导的人类平滑肌细胞。
根据一些实施方案，逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
根据一些实施方案，细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物。
根据一些实施方案，低温保存溶液还包含Trolox、Na离子、K离子、钙离子和Mg离子。
根据一些实施方案，能量底物包含腺苷和谷胱甘肽。
根据一些实施方案，低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐-40、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂、Trolox、Na离子、K离子、钙离子、Mg离子、腺苷和谷胱甘肽。
根据一些实施方案，低温保存溶液是
Figure BDA0003347657360000451
FRS。
根据一些实施方案，人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
根据一些实施方案，转导的人类平滑肌细胞在低温保存之前在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中培养。
根据一些实施方案，生长培养基还包含15％的胎牛血清(FBS)。
根据一些实施方案，与保存在等渗多电解质溶液中的相同的转导的平滑肌细胞相比，转导的平滑肌细胞的特征在于以下中的至少一种：低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或者低温保存后转基因表达增强。
根据本发明的一方面，提供了低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在包含等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育转导的人类内皮细胞。
根据一些实施方案，等渗多电解质溶液补充有右旋糖、肝素和白蛋白。
根据一些实施方案，等渗多电解质溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子和葡萄糖酸根离子。
根据一些实施方案，用碳酸氢钠将等渗型低温保存溶液的pH调节至7.4-7.7。
根据一些实施方案，等渗低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子、葡萄糖酸根离子、右旋糖、肝素。
根据一些实施方案，低温保存溶液包含补充有0.1％右旋糖、100U/ml肝素和1％人类白蛋白的Plasma-Lyte
Figure BDA0003347657360000461
并且用碳酸氢钠调节至pH7.4-7.7。
根据一些实施方案，人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
根据一些实施方案，转导的人类内皮细胞在低温保存之前在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的培养基中培养。
根据一些实施方案，与保存在细胞内型低温保存溶液中的相同的转导的内皮细胞相比，转导的内皮细胞的特征在于以下中的至少一种：低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或者低温保存后转基因表达增强。
根据一些实施方案，孵育进行最多96小时。
根据一些实施方案，孵育进行12-72小时。
根据一些实施方案，孵育进行24-48小时。
根据一些实施方案，孵育在4℃和6℃之间进行。
根据一些实施方案，孵育在4℃进行。
IV.低温保存的转导的血管细胞
本发明涉及用于逆转录病毒转导的血管组织细胞(例如内皮细胞EC和/或平滑肌细胞SM)的有效保存的方法和组合物。表达促血管生成因子诸如VEGF和Ang-1的转导的血管组织细胞可以以延长转导的细胞的有效保存期、增加它们在促血管生成疗法中使用的实用性的方式被制备用于低温保存。
本发明人已经发现，逆转录病毒转导的血管细胞(例如SM和EC细胞)在降低的温度在不同保存溶液中对孵育的反应特征性地不同，影响它们的活力以及增殖能力和转基因表达，最终影响它们对用于治疗血管疾病的移植的适用性。
在2℃和8℃之间，在包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的细胞内型低温保存溶液中或者在包含补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育持续长达48小时后，仔细监测逆转录病毒转导的平滑肌细胞和内皮细胞的命运指示出：在用包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物的细胞内型低温保存溶液冷孵育的平滑肌细胞中，转导的平滑肌细胞增殖(参见图21B)、细胞活力(参见图22B)、培养物中的细胞状况(参见图23C、图23D以及图24C和图24D)和转基因表达(参见表10和表11)是优异的，同时，在包含补充有右旋糖、肝素和白蛋白的等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中，转导的平滑肌细胞增殖(参见图21A)、细胞活力(参见图22A)、培养物中的细胞状况(参见图23A、图23B以及图24A和图24B)和转基因表达(参见表10和表11)是优异的(参见下文实施例4)。
因此，根据一个方面，本发明提供了一种可注射组合物，该可注射组合物包含悬浮在细胞内型低温保存溶液中的用包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌(SM)细胞。在一些实施方案中，细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露糖醇、HEPES缓冲剂和能量底物。
根据另一个方面，本发明提供了一种可注射组合物，该可注射组合物包含悬浮在等渗型低温保存溶液中的用包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列的逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞。在一些实施方案中，等渗型低温保存溶液补充有右旋糖、肝素和白蛋白。
在具体的实施方案中，包含用于低温保存的转导的血管细胞的可注射组合物被预定通过注射施用至有相应需要的患者，诸如罹患血管疾病的患者，所述血管疾病诸如但不限于外周血管疾病、缺血或糖尿病血管并发症。因此，应理解，低温保存溶液必须包含适合于注射到患者中的组分。
本发明的低温保存的逆转录病毒转导的人类血管细胞组合物可以用于治疗血管疾病或血管相关状况。常见的血管状况包括但不限于急性血栓性闭塞、动脉瘤、主髂动脉和下闭塞性动脉疾病、动脉闭塞、动脉硬化(arteriosclerosis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、头臂和上肢闭塞性疾病、白塞综合征(Behcet's Syndrome)、颈动脉疾病、慢性排斥、与糖尿病相关的血管病变、动脉阻塞、degos、痴呆、早期栓塞性中风、头痛、痔疮、肝素过量(heparin overdose)、遗传性血管性水肿、冠状动脉内血栓、内膜增生、缺血、淋巴水肿、myoamoya、心肌梗死、肌内膜增生、外周动脉疾病(PAD)、弹性假黄瘤、再狭窄硬化、硬皮病、胸廓出口狭窄综合征、血栓闭塞性脉管炎、血栓、静脉曲张、血管炎、以及静脉和淋巴疾病。
在一些实施方案中，本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物可以用于预防或治疗移植的器官中的血管衰竭。目前，器官移植和器官再灌注中最大的单个未解决问题是血管的衰竭。施用本发明的可注射人类血管细胞组合物可以延长器官从供体中取出之后保持移植活力的时间段，并且有助于防止术后恶化，以降低术后血管状况的可能性，术后血管状况包括但不限于动脉粥样硬化、再狭窄、移植物动脉硬化、狭窄和缺血。
当用于治疗用于移植的器官的血管时，低温保存的转导的人类血管细胞的低温保存溶液可以任选地包含一种或更多种另外的剂。例如，这样的剂可以减少术后再狭窄或动脉粥样硬化，或减少收获之后但移植之前的细胞萎缩。另外的剂的实例包括但不限于次黄嘌呤、糖皮质激素、非糖皮质激素lazaroid、四环素、pentoxyphyline、青霉素、胰岛素、地塞米松、别嘌呤醇、dbcyclic AMP、海藻糖、硝酸甘油或保存溶液制备领域中已知的任何其他剂。本文的灌注液溶液可以在收获之前、运输期间或移植之后施用至器官的血管系统。因此，运输的灌注液溶液既可以体内也可以离体应用于被移植的器官。
在其他实施方案中，本发明还预期了低温保存的可注射人类血管细胞组合物用于治疗慢性排斥、血管病变或其他与1型糖尿病相关的并发症的用途。1型糖尿病经常导致血管并发症和/或神经损伤，这可能影响身体的任何器官，包括但不限于眼睛、肾和心脏。
与1型糖尿病相关的血管并发症包括狭窄、血管病(包括微血管病)、高血压(highblood pressure)、心脏病发作、中风、心力衰竭、高血压(hypertension)和肾损伤。与1型糖尿病相关的神经损伤或神经病也引起可能影响整个身体的重大并发症。例如，连接脊髓、肌肉、皮肤、血管和其他器官的神经可能由于糖尿病而受损。特别严重的是影响心脏的神经损伤。影响糖尿病患者的其他血管和神经状况包括由血管和外周神经系统中的并发症发展的足部问题和足部疼痛。这样的并发症可能导致糖尿病患者足部的骨骼结构和软组织结构两者的改变。它还可能引起难以治愈的足部溃疡。
1型糖尿病也是成人失明新病例的主要原因，成人失明通常是视网膜病变的结果。影响糖尿病患者并可能导致失明的其他眼病症包括白内障和青光眼。
因此，本发明预期了本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物用于治疗血管病变和/或与1型糖尿病相关的其他并发症的用途。这样的状况包括但不限于青光眼、足部溃疡、心绞痛、心肌梗死和缺血后(post ischemia)。本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物优选地被局部递送至狭窄或微血管病的部位(例如，肾动脉、冠状动脉、足部溃疡等中)。可以通过导管(例如，DispatchTM或ThrulumenTM导管)、显微注射或其他局部递送系统进行递送。组合物根据施用途径配制，并且可以包含另外的治疗剂。
本发明还预期了本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物用于治疗和预防与静脉移植相关的血管状况，例如移植物冠状动脉疾病和移植物外周动脉疾病的用途。术语“移植物”、“血管”、“导管(conduit)”和“区段”在本文中可互换地使用，以指导管的任何全长或部分的区段，无论是天然存在的还是合成的，其可以被移植以绕过血管系统中的阻塞或增加流向血管系统中特定区域的血流。静脉移植的示例性用途包括：冠状动脉旁路移植术(CABG)、外周动脉旁路移植术(PABG)和静脉-动脉移植术(VAG)。
本文的可注射血管细胞组合物被悬浮在无菌的生理学上合适的保存溶液中。
在一些特定的实施方案中，本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物也可以用于治疗外周动脉疾病(PAD)。PAD是指由动脉高血压和/或斑块形成引起的外周动脉损伤。通常，动脉被胆固醇沉积物堵塞时，PAD状况也被称为动脉粥样硬化，并且动脉被矿物沉积物堵塞时，状况被称为动脉硬化。
PAD是一种常见的病症，当通常具有平滑衬里的动脉区段变得狭窄且粗糙，允许在壁上形成凝块从而进一步使动脉变窄时发生。由于动脉变窄，器官(例如，脑、心脏、腿、肾)接收的血液量不足。这可能导致器官和/或器官周围的肌肉痉挛。PAD通常使用以下手段中的任何一种进行诊断：病史和体检、踝-臂指数(ABI)、踏板运动测试(treadmill exercisetest)、反应性充血测试、节段性压力测量(segmental pressure measurements)、PVR波形分析、双动脉成像或超声成像、光学体积描记术(photoplethysmography)和动脉造影(arteriogram)。在确诊后，PAD通常通过生活方式改变(戒烟)、运动、药物(例如，氯吡格雷(Clopidogrel)、西洛他唑(cilostazol)、阿司匹林和降胆固醇药物)或手术来治疗。手术可以包括动脉内膜切除术，即打开动脉，清洁动脉，并且将其缝合回一起。动脉内膜切除术对骨盆(髂动脉)或腹股沟(股动脉)堵塞效果最好。其他堵塞可以使用旁路手术绕过。治疗PAD的旁路手术包括但不限于主动脉双股动脉(aortobifemoral)(其中血液从腹主动脉流向两个股动脉)、股腘动脉(femoropopliteal)(其中血液从股动脉流向腘动脉)和股胫动脉(femorotibial)(其中血液从股动脉流向胫动脉)。
对于较小的动脉，血管成形术或支架术可能更有效。血管成形术广泛用于治疗由于堵塞引起的冠状动脉和外周动脉疾病。然而，在许多情况下，支架术比血管成形术更可取。支架(Stent)是可以在血管成形术程序之前、期间或之后插入动脉的支架(scaffold)，或者作为血管成形术手术的替代物。本发明预期了支架用于打开动脉或静脉同时将本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物施用至支架区域的用途。在一些实施方案中，局部施用本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物。局部施用可以通过本领域已知的任何手段来实现，包括优选地使用Dispatch.TM.导管，诸如由Sci Med,Maple Grove,Minn制造的。本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物可以在支架术或血管成形术之前、期间或之后在体内和局部施用。
本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物可以独立地施用或与一种或更多种另外的剂组合施用。可以施用的另外的剂包括但不限于紫杉醇、子囊霉素等。
本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物也可以用于治疗肾血管状况，诸如恶性肾血管硬化(magligant nephroangiosclerosis)、主要肾血管闭塞引起的梗死、硬皮病、动脉粥样硬化栓塞(atheromatous embolization)、肾皮质坏死、肾静脉血栓、坏死性动脉炎和韦格纳肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)。因此，本发明预期了本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物治疗或预防肾血管状况的用途。例如，本发明的低温保存的可注射人类血管细胞组合物可以在体内施用至肾血管系统。
本发明还预期了本文的组合物治疗或预防肺血管状况的用途。这样的状况包括但不限于肺不张、酸中毒、急性支气管炎、急性高山病、急性肺水肿、急性肺血栓栓塞症、成人呼吸窘迫综合征、支气管哮喘、肺气肿、肺脂肪栓塞、肝素鱼精蛋白反应、高血压、缺氧、透明膜病、肺部炎症、Kartaagener综合征、军团病(Legionnaire's disease)、全腺泡型肺气肿、新生儿持续性肺动脉高压、心脏手术后急性肺炎、产前吸入综合征(prenatal aspirationsyndrome)、肺动脉高压和慢性阻塞性肺病。
本发明还预期可以用本文的组合物治疗和/或预防与性功能障碍相关的血管状况。与性功能障碍相关的血管状况包括但不限于勃起功能障碍、佩罗尼综合征(Peyronie'ssyndrome)、阴茎异常勃起、早泄、女性性功能障碍、阴道润滑、阴道充血、性交期间疼痛(例如，性交疼痛(dyspareunia)或外阴疼痛)、先兆子痫、泌尿生殖系统感染、外阴疼痛以及雌激素剥夺状况，诸如更年期、绝经后和潮热。
可以用本文的组合物治疗和/或预防的眼部血管状况包括但不限于白内障、眼内压、干眼、糖尿病性视网膜病变和青光眼。青光眼是一种与血管收缩相关的眼部血管状况，引起特定类型的视神经损伤。虽然这种模式的损伤通常是由于增加的眼内压导致的，但也可能发生在正常眼压或甚至低于正常眼压的情况下。
还预期本文的组合物可以用于治疗皮肤血管状况，包括但不限于皮肤老化、坏死性筋膜炎、褥疮性溃疡、肛裂、雷诺现象(Raynaud's phenomenon)、硬皮病、脱发(例如，斑秃、全秃、普秃、生长期脱发(Anagen Effluvium)、休止期脱发(Telogen Effluvium)，斑秃被认为是免疫病症的斑状脱发，全秃是整个头皮的脱发，普秃是全身脱发，生长期脱发(Anagen Effluvium)是经常由化疗引起的生长中的毛发的突然脱落，休止期脱发(TelogenEffluvium)是当大量毛囊进入休止期时突然脱发，通常是暂时的，并且可能是由严重的压力、药物等引起的)、弥漫性皮肤系统性硬化、冻伤和伤口愈合。
在一些实施方案中，用于配制成本发明的转导的血管细胞组合物的转导的SMC和EC细胞的制备包括用注射溶液或低温保存溶液洗涤先前培养基(通常是转导培养基或生长培养基)的细胞(例如温和洗涤和离心以去除痕量的生长培养基)，并且使新转导的细胞悬浮在合适的低温保存溶液中，优选地在良好生产规范(GMP)条件下。
在一些实施方案中，在洗涤和重悬之后，包含重悬在低温保存溶液中的血管细胞沉淀的可注射组合物然后可以被转移用于在4℃-8℃的无菌容器中使用。在一些实施方案中，可注射组合物被配制在两个单独的小瓶(例如聚丙烯小瓶)中，每个小瓶包含悬浮在5ml-50ml、10ml-40ml、10ml-20ml或5ml-15ml的低温保存溶液中的预定数目的EC或SMC(取决于剂量组；表2)。在一些实施方案中，转导的血管细胞被悬浮在10ml-20ml低温保存溶液中。
每小瓶可注射组合物的血管细胞的数目当然取决于待治疗的状况或疾病，受试者的个体状态、尺寸和病史，以及特定病例管理的另外的个体考虑因素。在一些实施方案中，可以制备包含以下范围内的血管细胞的小瓶：每小瓶0.5×106个至100×106个、1×106个至80×106个、3×106个至70×106个、5×106个至65×106个、5×106个至50×106个、5×106个至45×106个、5×106个至40×106个、5×106个至35×106个、5×106个至25×106个、5×106个至15×106个细胞。在一些具体的实施方案中，低温保存的逆转录病毒转导的血管细胞以每小瓶5×106个至35×106个细胞的小瓶制备。
在低温保存下具有改善的稳定性的本发明的可注射血管细胞组合物可以低温保存，直到需要递送至待治疗的血管状况、闭塞或疾病。在一些实施方案中，可注射血管细胞组合物在递送之前被低温保存持续以下范围：6小时-96小时、12小时和72小时之间、12小时和48小时之间、24小时-48小时之间或最多24小时。在特定的实施方案中，可注射的转导的血管细胞组合物在施用之前低温保存24小时或48小时。在一些实施方案中，本发明的可注射的转导的血管细胞组合物被低温保存24小时-48小时之间，例如，在2℃-4℃。因此，在一些实施方案中，转导的血管细胞组合物的使用在6℃-96℃、12℃-72℃或2℃-4℃的低温保存之后。
本发明的一些实施方案的可注射的转导的血管细胞组合物或药物组合物可以本身被施用至生物体，或者在与合适的载体或赋形剂混合的药物组合物中被施用至生物体。
如本文使用的，“药物组合物”是指本文描述的一种或更多种活性成分与其他化学组分诸如生理学上合适的载体和赋形剂的制品。药物组合物的目的是促进向生物体施用化合物或化合物的组合。
本文中，术语“活性成分”是指可对生物学作用负责的化合物或其组合。
在下文中，可以可互换地使用的措辞“生理学上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”是指不对生物体造成显著刺激，并且不消除所施用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些措辞包括辅料(adjuvant)。
本文中，术语“赋形剂”是指添加至药物组合物以进一步促进活性成分的施用的惰性物质。赋形剂的实例包括，但不限于，碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的配制和施用技术可以在“Remington's Pharmaceutical Sciences”，MackPublishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，其通过引用并入本文。
本发明的一些实施方案的药物组合物可以通过本领域熟知的工艺制造，例如借助于常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、磨细、乳化、包封、包埋或冻干工艺。
因此，根据本发明的一些实施方案使用的包含转导的血管细胞的可注射组合物的药物组合物可以使用包含赋形剂和辅助剂(auxiliaries)的一种或更多种生理学上可接受的载体以常规方式配制，其有助于将活性成分加工成可以药学上使用的制品。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以配制在水溶液中，优选地在生理学相容的缓冲液中，诸如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐缓冲液。对于经黏膜施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
适用于本发明的一些实施方案的背景下的药物组合物包括其中活性成分以有效实现预期目的的量被包含的组合物。更具体地，治疗有效量意指有效预防、缓解或改善病症的症状或延长被治疗受试者的生存期的活性成分(低温保存的转导的血管细胞)的量。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的详细公开内容，完全在本领域技术人员的能力内。
对于本发明的方法中使用的任何制品，治疗有效量或剂量可以最初从体外和细胞培养测定估计。这样的信息可以被用于更精确地确定在人类中有用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效力可以通过体外、细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制用于人类的一系列剂量。剂量可以取决于使用的剂型和使用的施用途径而变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由医师个人鉴于患者的状况来选择。(参见，例如，Fingl等人，1975，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章，第1页)。
如所示的，本发明的可注射的转导的血管细胞组合物可以直接施用至受试者，到血管闭塞、状况或疾病的部位，例如通过导管(catheter)，诸如DispatchTM.或ThrulumenTM导管施用。在确认导管的合适位置后，在一些实施方案中，本发明的转导的血管细胞组合物可以以预定的速率(例如在每分钟0.5ml-10ml、1ml-10ml、2ml-5ml或2.0ml的范围内)递送。在一些实施方案中，转导的血管细胞组合物以2.0ml/min的速率递送。
将本发明的组合物和方法应用于有相应需要的血管组织(例如缺血)可以在应用后几周内导致血管再生或新血管形成。在一些情况下，本发明的转导的血管细胞组合物的单次应用可以足以在几个月至几年的时间段内实现恢复。在其他实施方案中，由于环境因素(例如氧气供应)，恢复可以进行得更慢。因此，在一些情况下，一些治疗可能需要连续(重复)应用本发明的转导的血管细胞组合物，以及任选的另外的因子。
应理解，取决于结果、受影响的血管系统或组织的尺寸、添加因子的需要等，可能需要重复应用本发明的转导的血管细胞组合物。
取决于待治疗的状况的严重程度和反应性，给药可以是单次施用或多于一次施用，治疗过程持续数天至数周或直到实现治愈或达到疾病状态的减退。
待施用的本发明的转导的血管细胞组合物的量当然取决于所治疗的受试者、罹患病症(affliction)的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。
本发明的转导的血管细胞组合物可以按需要在包装或分配装置诸如FDA批准的药盒(其可以包含一个或更多个含有活性成分的单位剂型)中呈现。包装可以例如包括金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配装置可以附有施用说明。包装或分配器还可以在容器上以规范药物制造、使用或销售的政府机构规定的形式附上公告，所述公告反映了组合物的形式或者人类或兽医施用被该机构批准。例如，这样的公告可以是美国食品药品监督管理局批准的处方药物的标签或批准的产品插页。包含配制于相容药物载体中的本发明的制品的组合物也可以被制备，放置在合适的容器中，并且加上关于对指示的状况的治疗的标签，如上文进一步详细描述的。
如本文使用的，措辞“治疗方案”是指治疗计划，其规定了向有相应需要的受试者(例如，被诊断患有血管病症的受试者)提供的治疗的类型、剂量、时间表和/或治疗的持续时间。所选择的治疗方案可以是预期导致最佳临床结果(例如，病症的完全治愈)的积极的治疗方案，或者可以缓解病症的症状但导致病症的不完全治愈的更温和的治疗方案。应理解，在某些情况下，更积极的治疗方案可能与受试者的一些不适或不良副作用(例如，对健康细胞或组织的损伤)相关。治疗的类型可以包括手术干预(例如，去除病变、患病细胞、组织或器官)、细胞替代疗法、以局部或全身方式施用治疗药物(例如，受体激动剂、拮抗剂、激素、化疗剂)、暴露于使用外部源(例如，外部射束)和/或内部源(例如，近距离放射疗法)的放射疗法和/或其任何组合。治疗的剂量、时间表和持续时间可以取决于病症的严重程度和所选择的治疗的类型而变化，并且本领域技术人员能够以剂量、时间表和治疗的持续时间来调整治疗的类型。
如本文使用的，术语“约”是指±10％。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”及其同源词意指“包括但不限于”。该术语包括术语“由...组成(consisting of)”和“基本上由...组成(consisting essentially of)”。
术语“基本上由...组成”意指组合物或方法可以包括另外的成分和/或步骤，但前提是另外的成分和/或步骤不实质性地改变要求保护的组合物或方法的基础特性和新颖特性。
如本文使用的，除非上下文另外清楚指明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。例如，术语“化合物(a compound)”或“至少一种化合物(at leastone compound)”可以包括多于一种化合物，包括其混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围的形式呈现。应理解，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，范围的描述应被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单独的数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为已经具体地公开了子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在该范围内的单独的数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
无论何时本文指示数值范围，其意在包括所指示的范围内的任何引用的数值(分数或整数)。措辞“范围在(ranging/ranges between)”第一个指示数字和第二个指示数字“之间”以及“范围为从(ranging/ranges from)”第一个指示数字“到(to)”第二个指示数字在本文可交换地使用并且意在包括第一个指示数字和第二个指示数字及其之间的所有分数和整数。
如本文使用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式(manners)、手段(means)、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物、生物化学和医疗领域的从业者已知或已经从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文使用的，术语“治疗”包括消除、大体上抑制、减缓或逆转状况的进展，大体上改善状况的临床或美学(aesthetical)症状，或大体上防止状况的临床和美学症状的出现。
应理解，为了清楚而在单独的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方案中以组合来提供。与之相反，本发明的为了简洁而在单个实施方案的上下文中描述的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或适当地在本发明的任何其他描述的实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征并不被认为是那些实施方案的必需特征，除非实施方案无那些要素则不起作用。
如上文描绘的以及如在以下权利要求书部分中要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，所述实施例连同以上说明以非限制性方式例证了本发明。
实施例1:平滑肌和内皮细胞的分离和培养
用于移植的血管生成组合物包含从人类来源的静脉区段分离的修饰的内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)。以两步酶促反应从静脉分离细胞，首先分离EC，并且静脉的剩余部分用于分离SMC。在这个初始步骤期间分离的细胞的活力和平滑肌细胞的数量似乎是整个过程中的瓶颈。测试了含有多种生长因子的新培养基配方，以评估对细胞分离功效和细胞产量的影响，特别是缩短血管生成组合物的产生时间。
方法：
细胞
内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)从剥离自患者的人类来源的静脉区段分离，并转移到细胞处理单元。以两步酶促反应从静脉分离细胞：首先分离EC，并且静脉的剩余部分用于分离SMC。
从不同的人类供体(5名供体用于EC，并且6名供体用于SMC)分离EC和SMC在静脉剥离后不超过48小时进行。简而言之，通过酶促消化和侵蚀性洗涤分离EC，而通过酶促消化和接种组织外植体分离SMC。
将EC细胞培养物接种到纤连蛋白包被的6孔组织板上(第0代，p0)，并在生长培养基中培养，直到形成覆盖板表面的1/4至1/2的大集落(“单层”)，并通过胰蛋白酶酶解收获。
用于SMC分离的SMC细胞培养在标准条件下在生长培养基中开始，直到平滑肌细胞从外植体萌发成覆盖板表面的1/4至1/2的集落，并通过胰蛋白酶酶解收获。
收获后，将分离的EC和SMC细胞重新接种到明胶包被的6孔组织培养容器或25cm3烧瓶中(第1代，“p1”)。
生长培养基
分离的细胞和外植体在标准生长培养基中或在富集培养基(Lonza,Ltd.,Basel,Switzerland)中生长。用于EC的标准生长培养基(EC-G)是补充有L-谷氨酰胺、肝素、碱性FGF和20％胎牛血清(FBS)的MCDB 131培养基(Thermo-Fisher Scientific,Waltham,MA)。用于SMC的标准生长培养基(SMC-G)是补充有L-谷氨酰胺、碱性FGF和20％FBS的DMEM培养基(Thermo-Fisher Scientific,Waltham,MA)。用于EC的富集生长培养基(EGM)是补充有FBS的EGMTM-2 BulletKitTM(Cat#CC-3162,Lonza,Ltd,Basel,Switzerland)(EGM％)。用于SMC的富集生长培养基(SMGM)是补充有FBS的SmGM-2TM BulletkitTM(Cat#CC-3182,Lonza,Ltd,Basel,Switzerland)(SMGM％)。
培养
培养EC和SMC直到第1代(p1)或第2代(p2)。收获期间对细胞进行计数(Coultercounter)。
为了对生长培养基进行一些比较，分离后从第4代、第5代或第9代培养EC和SMC。
转导：
将意图用于转导的血管细胞转移到转导培养基(补充有2mM谷氨酰胺的M199培养基，在37℃，5％CO2)中，并预先暴露于DEAE-葡聚糖。然后用PBS洗涤细胞3次，并与悬浮在高达1ml/孔的转导培养基中的逆转录病毒载体一起在37℃、5％CO2孵育长达4小时。根据细胞数和8的感染复数(MOI)计算将使用的逆转录病毒载体的量和体积。从转导后48小时起，用G418(0.35mg/ml)选择维持细胞十天。每2-3天收获细胞和用血细胞计数器计数，并评估其活力、细胞增殖速率和/或转导率。
监测
通过CD31+细胞的流式细胞术或通过免疫组织化学(IHC)验证EC身份。对通过对α平滑肌肌动蛋白(αSMA)的IHC测试EC纯度(成纤维细胞污染)。
结果：
EC分离培养基
将分离的EC单层平均分到6孔组织培养板的4个孔中。两个孔在EC-G培养基中培养，并且两个孔在补充有10％FBS的EGM培养基(EGM 10％)中培养。每48-72小时更换培养基，直到细胞准备收获。图1显示了第一次分离后细胞收获之后的EC数。从图1中可以看出，在EGM 10％培养基中培养的EC比在EC-G培养基中培养的EC以显著更大的速率增殖。
为了评价新培养基对EC标志物表达和纯度的影响，通过免疫组织化学或FACS对培养和收获的EC进行CD31和αSMA检测。结果总结在以下表1和表2中。
表1：在EGM 10％中生长的EC的EC身份。
Figure BDA0003347657360000601
*接受标准：>85％
表2：EC纯度
Figure BDA0003347657360000602
*接受标准：<15％
从表1中可以看出，所有测试的培养细胞具有极高的CD31+表达百分比，这表明用EGM 10％培养EC不会降低EC分离的效率。表2进一步显示，与使用EC-G培养基分离的EC相比，用EGM 10％培养实际上具有优势，降低了EC群体中成纤维细胞的百分比。
SMC分离培养基
EC分离后，用胶原酶消化静脉区段，切成1-2mm的外植体，并置于6孔组织培养板上。两个孔在SMC-G培养基中培养，并且两个孔在补充有20％FBS的SMGM培养基(SMGM 20％)中培养。每48-72小时更换生长培养基，直到细胞准备收获。从图2中可以看出，当在第一次分离后细胞收获(第1代，p1)之后测量时，在SMGM 20％培养基中培养的SMC从外植体中萌出，并且以比在SMC-G培养基中培养的SMC显著更大的速率增殖。
为了进一步评价新培养基对SMC生长的影响，对补充有15％FBS的SMGM和补充有20％FBS的SMGM中的SMC分离进行了比较。从图3中可以明显看出，在20％SMGM中培养SMC对SMC分离程序明显有利。
EC生长培养基
在分离培养基中分离后，在为细胞生长和增殖设计并保持其生活力和强健性的培养基中培养血管细胞，为逆转录病毒转导做准备。
低传代(第4代)人类EC细胞在EGM+FBS中生长的增殖速率始终优于在标准培养基(EC-G，即补充有20％FBS、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、两性霉素B和肝素的MCB131)中培养的相同细胞。通过在含有20％FBS的EGM中培养，来自三个供体的EC细胞在7天时间内的平均生长速率(以每天的细胞分裂次数表示)(在第4天收获并重新接种)显著加快(参见图4)。
对使用包含不同量的FBS补充剂的EGM时的EC生长速率进行的比较表明，即使标准培养基(EC-G)的FBS含量高(20％)，但补充有5％至20％中任意百分比的FBS的EGM比EC-G培养基显著更好地促进了EC细胞增殖(数据未显示)。用EGM和较高FBS补充获得最佳效果。
为了确定在相对低传代的EC细胞(第4代)中观察到的生长速率(增殖速率)差异是否也是较老细胞(与较早传代的细胞相比，较老细胞具有特征性较慢的生长速率和较差的细胞健康)的特征，用补充有FBS的EGM对第9代EC细胞进行相同增殖试验。对6天期间(在第4天收获并重新接种)的平均增殖速率的评价显示，通过在含有FBS的EGM中培养，以与第4代细胞观察到的相同的方式加速了更高传代的EC细胞增殖(数据未显示)。
由于补充有10％-20％FBS的EGM实现了EC增殖速率的显著提高，因此选择含有10％FBS的EGM用于EC生长。
SMC生长培养基
低传代(第4代)人类SMC细胞在SMGM+FBS中生长的增殖速率始终优于在标准培养基(SMC-G，即补充有5％FBS、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、两性霉素B和肝素的DMEM)或231G(补充有FBS 5％、rhbFGF、rhEGF和胰岛素的Gibco基础培养基)中培养的相同细胞。通过在含有20％FBS的SMGM中培养，来自三个供体的SMC细胞在7天时间内的平均生长速率(以每天的细胞分裂次数表示)(在第4天收获并重新接种)显著加快(参见图5)。由于补充有15％-20％FBS的SMGM实现了SMC增殖速率的显著提高(结果未显示)，因此选择含有15％FBS的SMGM用于SMC生长。
生长培养基效力
在长达一个月的储存后，对EGM+FBS和SMCM+FBS促进增殖的效力的测试表明，它们对血管细胞培养的增殖促进作用在长时间储存期间得以保持(结果未显示)。
生长培养基对增殖和转导的影响
为了确保转导期间和之后血管细胞的最大活力，评估了培养基组分促进血管细胞转导和随后增殖的能力。
SMC培养基和转导：使用用TGA-LacZ逆转录病毒载体转导的SMC细胞进行初步评估。图6显示了来自两个供体的SMC的平均生长速率(以每天的分裂次数计)，这些SMC在逆转录病毒转导后立即接种用于增殖测定，在各种培养基中培养四天，收获并计数，并且然后收获的细胞的一半重新接种并再生长四天，收获并计数。转导后8天，在SMGM 20％FBS中生长的SMC的平均生长速率优于在含有20％FBS的231G培养基或SMC-G中生长的那些细胞。
还评估了用TGA-LacZ转导并在不同培养基中生长的SMC的转导率。用TGA-LacZ转导并培养三天的人类SMC细胞的X-Gal染色显示，在SMGM 20％FBS中生长的细胞的转导率明显优于含有20％FBS的231G和SMC-G培养基(参见图7)。
当评估SMC培养基对用逆转录病毒VEGF载体转导的SMC的生长速率的影响时，在步骤3(转导后3-4天，此时细胞状态通常较差)和步骤3b(G418选择结束，此时细胞通常正在恢复)监测对转导细胞的生长速率的影响。图8A-图8B显示了转导后四天(步骤3，图8A)和G418选择后(步骤3b，图8B)来自3个供体的细胞的平均日生长速率，表明对于SMC转导后的生长速率，SMGM 20％和15％FBS明显优于SMC-G培养基。
EC培养基和转导：为了简化EC转导程序，使用TGA-LacZ逆转录病毒系统评估了向血管细胞转导培养基中添加生长因子的效果。当在添加或不添加生长因子(氢化可的松、hEGF、VEGF、hFGF-B、R3-IGF-1、抗坏血酸和肝素)的无血清培养基中转导EC时，三天后的X-Gal染色显示，添加生长因子在用TGA-LacZ载体的转导率方面没有提供任何显著优势(图9)。转导后4天，转导的EC细胞的生长速率因生长因子的存在或不存在而同样基本保持不变(图10)。因此，向转导培养基中添加补充剂被认为是任选的。
对EC细胞转导后有效生长条件的进一步研究表明，对于幼稚(未诱导)和TGA-LacZ转导的EC细胞二者，加入10％FBS的EGM培养基在转导后提供了优异的细胞增殖(图11)以及转导细胞的LacZ表达(转导率)的显著改善(图12)。
当评估EC培养基对逆转录病毒Ang-1载体转导的EC的生长速率的影响时，在早期传代(步骤2和3，第3和4代)、第5代和步骤3b(第6代，新霉素选择结束)时监测存在选择剂(新霉素)的情况下对转导细胞生长速率的影响。图13显示了转导后四天(步骤3，图13)、新霉素选择期间(步骤3，第5代)和新霉素选择后(步骤3b，图13)来自3个供体的细胞的平均日生长速率，表明对于EC转导后的生长速率，EGM 10％FBS明显优于EC-G培养基。
当评估EC培养基对使用逆转录病毒Ang-1载体的EC转导率的影响时，通过评价转导的EC细胞中Ang-1表达(免疫组织化学)和Ang-1分泌(ELISA)二者来监测效果。在接种到IHC玻片上时，用EGM 10％FBS生长的细胞在显微镜下状态良好，用EC-G生长的细胞状态不佳，无论是低传代还是高传代。当通过免疫组织化学(IHC)评估转导率时，也证实了这种差异--Ang-1表达(图14A和图14B)的检测揭示了在EC-G培养基中生长的EC细胞的转导显著低于用EGM 10％FBS生长的EC细胞的转导(在供体H1069A和H1070B的情况下低得多)。尽管事实上，在某些情况下，在10天G418选择后(步骤3b，图14B)的细胞生长速率对于EGM 10％和EC-G培养基是相似的，但是当在IHC载玻片上观察时，细胞状态是非常不同的。事实上，在EC-G中生长的细胞状态如此差，以至于它们显示出与健康外观的EGM 10％FBS处理的细胞完全不同的染色模式。
对转导的EC细胞分泌Ang-1的测量(ELISA)(图14C和图14D)也揭示了在不同培养基中生长的细胞之间的差异。图14C和图14D显示，EC-G处理的细胞比经EGM处理的细胞更依赖于G418选择。事实上，在10天G418选择之前(图14C)和之后(图14D)，EGM处理的细胞显示出很少或没有Ang-1分泌的差异。
实施例2：DEAE-葡聚糖浓度对转导后SMC恢复的影响
细胞数和活力(表3)
在转导前降低DEAE-葡聚糖浓度导致其中一个细胞供体中SMC的更好恢复。转导后48小时(选择开始)用0.25mg/ml DEAE-葡聚糖预处理(暴露1分钟)的SMC比用1mg/ml DEAE-葡聚糖预处理的细胞损伤更小。从表3中可以看出，在转导后的第一次分开(split)(部分耗尽)(S.O.S.)时，包含用0.25mg/ml DEAE-葡聚糖预处理1分钟的细胞的孔中的细胞数与用1mg/ml DEAE-葡聚糖预处理相同时间的细胞的孔中的细胞数相比显著更高(参见供体A，孔3和4与孔1、2、5和6相比)。尽管这种效应在用不同浓度的DEAE-葡聚糖进行转导前孵育后的来自供体B的细胞中没有反映出来(参见表3)，但是在用0.25mg/ml DEAE-葡聚糖预调节的细胞转导后以及在额外的代表性转导平滑肌培养物的选择(例如G418)步骤期间，观察到增殖增强。
在与病毒一起孵育4小时期间，将转导培养基的体积从0.7ml改变为1ml，对两个供体的细胞恢复或最终细胞数没有影响。然而，平滑肌细胞对体积增加的响应反映在第一次分开期间暴露于选择剂(G418)时细胞增殖的增加(选择开始-参见表3，供体A，孔3和4)。转导的SMC在所有处理中和在转导程序后测试的所有时间点的活力>95％。
表3：处于选择下的人类SMC的细胞数和活力
供体A
Figure BDA0003347657360000651
表3，供体B：
Figure BDA0003347657360000652
**S.O.S-选择开始(G418)
转导功效(参见表4)
改变DEAE-葡聚糖浓度或转导培养基的体积不会损害两个供体中VEGF的转导率：
1.对于所有转导条件，在选择开始时，表达VEGF的SMC的百分比相似。
2.在选择结束时，发现VEGF表达[IHC(>60％)]和分泌[ELISA(>0.05pg/细胞/天])均高于接受标准。
表4：用编码VEGF的病毒载体转导的人类平滑肌细胞的IHC概述
供体A：
Figure BDA0003347657360000661
**S.O.S＝选择开始；E.O.S＝选择结束
**TM＝转导培养基
供体B：
Figure BDA0003347657360000662
DEAE葡聚糖预处理的效价测定
为了进一步确定改变DEAE葡聚糖预处理参数对SMC细胞病毒转导结果的影响，进行了用TGA-LacZ逆转录病毒载体代替VEGF逆转录病毒的实验转导。
虽然用VEGF转导细胞需要一周的选择过程，然后是免疫组织化学测定，但Lac操纵子系统允许使用简单的酶促程序，然后计数LacZ阳性细胞在转导后3-4天内确定转导率。
方法：
将来自两个人类供体的细胞一式两份接种到6孔板上(130,000个细胞/孔)。在转导前，将细胞在含有0.25mg/ml或0.125mg/ml DEAE葡聚糖(DD)的1ml转导培养基(补充有2mM谷氨酰胺的M199基础培养基，无血清)中孵育1分钟。
转导后两天，收获细胞并用Coulter计数器计数。然后将每个孔的0.6-1x104个细胞重新接种到12孔板上，使用标准方案进行增殖测定。简而言之，将0.6-1x104个细胞在SMCG培养基中孵育，并接种在12孔板中。5天后，收获细胞并用Coulter计数器计数。
将每个孔的2x105个细胞重新接种到6孔板上，固定和使用标准的X-Gal方案对LacZ染色。拍摄培养板的10-15个代表性区域，并计数细胞。
SMC的生长速率根据以下公式确定：
Figure BDA0003347657360000671
结果：
细胞状态：
细胞在转导期间和培养基换成常规生长培养基后2.5小时被拍照。图15A显示，所有用DEAE葡聚糖处理并用TGA逆转录病毒转导的细胞在转导过程期间受到了损伤。然而，虽然用0.25mg/ml DD处理的细胞显示出明显的应激形态学迹象(图15B)，但用0.125mg/ml DD处理的细胞表现更健壮和健康(图15C)。
细胞增殖：
图16和图17分别显示了转导后2天或5天，DD浓度对TGA逆转录病毒转导的SMC增殖速率的影响。与转导后2天和5天用0.25mg/ml DD预处理的SMC相比，用0.25mg/ml DD预处理的SMC增殖没有可辨别的明显优势。
转导效率：
转导后两天，转导的SMC被固定并对LacZ染色。图18显示了染色细胞的代表性照片(LacZ阳性细胞被染成蓝色)。Lac-Z阳性细胞的定量(Lac-Z阳性细胞占观察到的总细胞的百分比，图19)清楚地显示，用0.125mg/ml DD预处理SMC导致了与用0.25mg/ml DD预处理相似的TGA-LacZ转导效率。
结论：
综上所述，上述结果表明，与在无EGM或SMGM培养基中分离和/或培养的类似血管细胞的相比，在EGM 10％(EC细胞)或SMGM 20％(SMC细胞)中分离、并且然后在EGM 10％(EC细胞)或SMGM 15％(SMC细胞)中生长并用DEAE-葡聚糖预处理的血管细胞(内皮细胞和平滑肌细胞)在转导血管生成因子后的培养中被赋予增加的转导率和/或增强的增殖。此外，与用1.0mM或更大浓度的DEAE-葡聚糖预调节的类似平滑肌细胞的相比，用浓度为0.25mg/ml或甚至更低的0.125mg/ml的DEAE-葡聚糖预调节的平滑肌细胞在用血管生成因子转导后的培养中表现出增加的转导率和/或增强的增殖。
实施例3：高效的平滑肌和内皮细胞转导方案
减少用于患者再施用的细胞离体操作的时长和次数对于细胞治疗方法的成功可以是至关重要的。检查了内皮细胞和平滑肌细胞离体逆转录病毒转导时间的减少，以及转导培养基的改进。
方法：
细胞：制备和冷冻保存的来自两个人类供体(H1065A和H1066)的内皮细胞(EC)和来自两个人类供体(H1058A和H1057C)的平滑肌细胞(SMC)在第2代解冻，生长至汇合，收获并接种在6孔组织培养板中用于转导。
转导：第二天，用血管生成素-1(Ang-1)逆转录病毒载体转导EC细胞3.5或4小时，或2.5小时，一式两份进行。用VEGF165载体转导SMC细胞3.5小时或2.5小时。转导后，将培养基改为生长培养基，并将细胞在37℃和5％CO2孵育3天。
测定：转导后两天，收获细胞并计数。接种载玻片以通过免疫组织化学(IHC)和通过ELISA测定评估上清液(分泌的)或细胞裂解物中血管生成因子的存在来评估Ang-1(AC)或VEGF(SMC)转导率。
生长：将细胞重新接种到组织培养皿中，并在存在0.5mg/ml G418的情况下生长10天。
评估：10天选择期后，收获细胞并计数。报告了来自免疫组织化学载玻片和ELISA试验的结果。增殖速率(每天分裂次数)根据以下公式计算：
对于步骤3(转导加2天)：Log2(在步骤3的细胞数/1.3x105(为转导而接种的细胞数))/3(从转导开始的天数)。
对于步骤3b(转导加13天，包括在G418选择培养基中的10天)：Log2(在步骤3b的细胞数/接种的细胞数)/3或6(自上次收获的天数)。
SMC转导培养基：
在一些实验中，研究了DEAE-葡聚糖浓度对SMC转导的影响。如上所述，制备来自两个人类供体的平滑肌细胞(SMC)用于转导(6孔板的1.3x105个细胞/孔)。第二天，将用于转导的细胞转移到转导培养基(补充有2mM谷氨酰胺的M199培养基，在37℃，5％CO2)并预先暴露于1mg/ml DEAE-葡聚糖1分钟，或0.25mg/ml DEAE-葡聚糖1分钟或5分钟。然后用PBS洗涤细胞3次，并与悬浮在0.7ml/孔或1ml/孔的转导培养基中的逆转录病毒载体一起在37℃、5％CO2孵育4小时。根据细胞数和8的感染复数(MOI)计算将使用的逆转录病毒载体的量和体积。转导后48小时，用G418(0.35mg/ml)选择维持细胞十天。每2-3天收获细胞，并且用血细胞计数器计数，并确定其活力。每次细胞分开(半耗尽)后，将每次处理的1.0-1.3x105个细胞接种到6孔组织培养板的孔中。为了评价VEGF转基因表达，在G418选择期开始和结束时进行免疫组织化学(IHC)测定。用ELISA对供体B的样品进行上清液中VEGF水平的评价。
结果：
增殖速率—用Ang-1或VEGF载体转导2.5小时的细胞的细胞生长/增殖速率(生长/增殖速率＝分裂/天)与用载体转导3.5或4小时的那些细胞相似，无论何时测定增殖速率(图20A和图20B：步骤3＝转导+2天；步骤3b＝转导+13天，包括G418选择的10天)。
转导率—内皮细胞用Ang-1逆转录病毒载体或平滑肌细胞用VEGF载体的转导率通过细胞内蛋白水平的免疫组织化学和分泌蛋白水平的ELISA来评估。用Ang-1载体转导2.5小时的EC细胞的转导率(转导细胞占总数的百分比)与用载体转导4小时或3.5小时的细胞相似，并且甚至更高，无论何时测定转导率(表5、表6、表7和表8，+2天—步骤3，或+3或+6天—步骤3b)。
用VEGF载体转导2.5小时的SMC细胞的转导率与用相同载体转导3.5小时的细胞的转导率相似，如果不是更高的话，无论何时进行测定或测定类型如何。
Ang-1转导率结果总结在下表5(受试者H1065A)和表6(受试者H1057C)中：
表5–H1065A中的转导率：
Figure BDA0003347657360000701
表6–H1057C中的转导率：
Figure BDA0003347657360000702
注意：*IHC结果以Ang-1阳性染色细胞的％表示。
**ELISA结果以pg Ang分泌/细胞/天表示。
***表中的每个值代表两个重复值的平均值。
VEGF转导率结果总结在下表7(受试者H1058A)和表8(受试者H1057C)中：
表7–H1058A中的SMC转导率：
Figure BDA0003347657360000711
表8–H1057C中的SMC转导率：
Figure BDA0003347657360000712
注意：*IHC结果以VEGF阳性染色细胞的％表示。
**ELISA结果以pg VEGF分泌/细胞/天表示。
***表中的每个值代表两个重复值的平均值。
实施例4：转导的分离的血管细胞的低温保存
材料和方法：
人类内皮细胞和平滑肌细胞的原代培养
内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)从剥离自患者的人类来源的静脉区段分离，并转移到细胞处理单元。通过两步酶促反应从静脉分离细胞：首先分离EC，并且静脉的剩余部分用于分离SMC。
从不同人类供体分离EC和SMC在静脉剥离后不超过48小时进行。简而言之，通过酶促消化和侵蚀性洗涤分离EC，而通过酶促消化和接种组织外植体分离SMC。
将EC细胞培养物接种到纤连蛋白包被的6孔组织板上并在生长培养基中培养，直到形成覆盖板表面的1/4至1/2的大集落(“单层”)，并通过胰蛋白酶酶解收获。
用于SMC分离的SMC细胞培养在标准条件下在生长培养基中开始，直到平滑肌细胞从外植体萌发成覆盖板表面的1/4至1/2的集落，并通过胰蛋白酶酶解收获。
收获后，将分离的EC和SMC细胞重新接种到明胶包被的6孔组织培养容器或25cm3烧瓶中。
病毒转导
使用逆转录病毒载体分别转导内皮细胞和平滑肌细胞。内皮细胞由编码Ang-1的逆转录病毒载体转导，并且平滑肌细胞由编码VEGF165的逆转录病毒载体转导。
将意图用于转导的血管细胞转移到转导培养基(补充有2mM谷氨酰胺的M199培养基，在37℃，5％CO2)中，并预先暴露于DEAE-葡聚糖。然后用PBS洗涤细胞3次，并与悬浮在高达1ml/孔的转导培养基中的逆转录病毒载体一起在37℃、5％CO2孵育长达4小时。根据细胞数和8的感染复数(MOI)计算将使用的逆转录病毒载体的量和体积。转导后48小时，用G418(0.35mg/ml)选择维持细胞十天。每2-3天收集细胞和用血细胞计数器计数，并评估其活力、细胞增殖速率和/或转导率。
转导的血管细胞的配制和释放
EC细胞和SMC细胞的处理相似且彼此分开。收获足够量的每种细胞类型，洗涤(三次)以除去残留的培养基试剂，每种类型的细胞在Coulter计数器中计数，并重悬在10ml低温保存溶液(参见下面的更多细节)中。在准备注射时，将最终转导的血管细胞组合物配制在两个用注射器注射帽密封的独立的20ml无胶乳聚丙烯注射器中。在本实验中，注射器在组合物配制后立即在4-8℃储存在无菌可再封闭的塑料袋中直到注射，最多48小时。
低温保存溶液
·等渗的碳酸氢盐缓冲的溶液[Plasma-lyte
Figure BDA0003347657360000721
(Baxter,USA)、1％人类白蛋白溶液(ZENALB 20,BPL,UK)、0.1％右旋糖、100U/ml肝素。用8.4％碳酸氢钠将pH调节至7.4-7.7]。所有溶液是无菌的，并被批准用于I.V注射(PlasmaLyte)(PL)。
·细胞内-HEPES-缓冲的[
Figure BDA0003347657360000731
-FRS(BioLife,cat#80093-710)(HTS)]。
测定准备
为了评价悬浮在低温保存溶液中的细胞的活力，测试了来自三个人类供体的内皮细胞和平滑肌细胞。收获细胞并分到两个试管中，每个试管用于一种低温保存溶液。用低温保存溶液洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，用Coulter计数器对细胞进行计数，并使用台盼蓝和计数室评估活力。将细胞在低温保存溶液中稀释至0.5-1x106个细胞/ml，一式两份。将细胞保持在4-6℃。24和48小时后进行细胞计数和活力测试。最终计数后(在48小时)，根据剩余的细胞数，将细胞接种到25cm2烧瓶或6孔板上。
活力测定
在低温保存溶液中孵育后，使用两个参数测试细胞培养物的活力—悬浮液中完整细胞的数量和存活细胞的活力。通过Coulter计数器在每个时间点评估每个样品中完整细胞的数量。通过用0.04％台盼蓝试剂(Sigma)以1:1取样细胞悬液来评估完整细胞的活力。活细胞和死细胞用计数室在倒置光显微镜下计数。细胞活力表示为活细胞(台盼蓝排除细胞)和总细胞数的比率。从最终产物配制(时间0)开始，在4℃在低温保存溶液中孵育细胞后0、24和48小时确定活力。
在注射溶液中孵育后的细胞状态和增殖
将在冷注射溶液中孵育24和48小时的细胞在其生长培养基中铺板(根据最低的细胞数，将细胞以相同数量接种到6孔板或25cm2烧瓶中)。接种后24小时和72小时，对细胞拍照并评价其状态。接种后72小时，收获细胞并用Coulter计数器(Beckman Z系列)计数。
在低温保存溶液中孵育后的基因表达和细胞身份
计数后，接种细胞用于通过ELISA和免疫组织化学(IHC)测定确定基因表达，和通过FACS的细胞身份测定。IHC允许使用Ang-1或VEGF的特异性抗体来可视化表达各个基因的细胞(Ang-1或VEGF)。ELISA允许定量测量转基因表达水平。根据制造商的说明使用R&DR血管生成素-1ELISA试剂盒(R&D Systems，Quantikine人类血管生成素-1免疫测定，cat:DANG10)测量Ang-1水平和使用VEGF ELISA试剂盒(R&D Systems，Quantikine人类VEGF免疫测定，cat:DVE00)确定VEGF165蛋白水平。EC的身份通过特异性细胞表面标志物CD31用流式细胞术测定确定，并且SMC的身份通过特异性细胞表面标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)也用流式细胞术测定确定。
结果
低温保存溶液的类型对EC和SMC的数量和活力的影响：
比较储存在等渗的碳酸氢盐缓冲的低温保存溶液(PL)和细胞内HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)中的血管细胞样品中的细胞数，发现孵育24小时后EC(图21A)或SMC(图21B)中细胞数几乎没有变化。然而，在48小时后，发现HTS样品中的EC细胞的细胞数有少量但显著的减少，而PL样品中的EC细胞的细胞数保持不变。
相比之下，图21B显示，虽然在24小时后悬浮液中的SMC细胞的数量没有发现显著变化，但是在PL中孵育48小时后(图21B)，SMC细胞数有少量但显著的减少，而用HTS孵育的SMC细胞数保持不变。
在等渗的碳酸氢盐缓冲的低温保存溶液(PL)和细胞内HEPES缓冲的低温保存溶液(HTS)中孵育后的细胞活力(通过台盼蓝排除法评估)反映了类似的趋势。
在EC细胞中，在HTS中孵育24小时后活力显著降低，而在PL中基本保持不变(图22A)。在低温保存溶液中孵育48小时后，EC细胞活力在HTS和PL中都有所下降，但在HTS中下降更显著(平均活力为80％，对比PL中为88％)。在PL溶液中孵育48小时后，所有测试的EC(3个供体)的活力不低于83％。
图22B显示，两种溶液都能在24小时的孵育期内有效维持SMC的活力。孵育48小时后，在PL低温保存溶液中孵育的SMC细胞的细胞活力显著降低，而在HTS低温保存溶液中孵育的SMC的活力保持不变(图22B)。在HTS低温保存溶液中孵育48小时后，所有储存的SMC细胞样品(3个供体)的活力不低于89％。
低温保存溶液类型对培养的细胞状态的影响
接种的血管细胞向培养板基底的附着是分离的细胞功能完整性的指示，也是分离的细胞健壮性的良好预测物。在培养物中原位监测也提供了培养物中增殖速率的指示。
在等渗的碳酸氢盐缓冲的低温保存溶液(PL)或细胞内HEPES缓冲的低温保存溶液(HST)中孵育24或48小时后对血管细胞的观察显示，在PL低温保存溶液中处理和孵育24小时(图23A)和48小时(图24A)的EC细胞比在HTS低温保存溶液中孵育类似持续时间的EC细胞(图23B和图24B)更好地粘附于板表面，具有更高的细胞浓度和更好的增殖能力。
另一方面，用细胞内HEPES缓冲的低温保存溶液(HST)孵育24小时(图23D)或48小时(图24D)的SMC细胞比用PL低温保存溶液孵育24小时(图23C)或48小时(图24C)的SMC细胞更好地粘附于板表面，具有更高的浓度并展示更好的增殖能力。
低温保存溶液类型对细胞增殖速率的影响：
在低温保存溶液中孵育24或48小时后，EC细胞和SMC细胞接种后72小时的细胞增殖速率(分裂/天)详述于图25A(EC细胞)、图25B(SMC细胞)和下表9。
与用HTS溶液孵育的EC细胞的增殖速率相比，在低温保存溶液中孵育24小时和48小时的EC细胞中检测到EC细胞增殖速率(分裂/天)显著增加(图25A)。
在SMC中，在HTS溶液中孵育24小时和48小时后，检测到SMC细胞的增殖能力显著增加(图25A)。
表9：在低温保存溶液中孵育24小时和48小时后，接种后72小时的EC和SMC生长速率。结果显示为每个实验条件两次重复的平均值。
Figure BDA0003347657360000751
Figure BDA0003347657360000761
在低温保存溶液中孵育后的基因表达和细胞身份：
使用特异性抗体，通过IHC和ELISA评价在测试溶液中孵育后的转基因表达水平。
如下表10(24小时孵育)和表11(48小时孵育)所示，内皮和平滑肌转导的血管细胞在两种低温保存溶液中孵育后具有相似的转基因表达水平(通过IHC试验)。在PL低温保存溶液中孵育SMC细胞导致比在HTS低温保存溶液中孵育的SMC细胞更丰富的转基因蛋白(VEGF)分泌。然而，所有测试条件的分泌水平均高于预定的接受标准(>0.05pg/细胞/天)。在EC中，转基因蛋白分泌水平对于在PL和HTS两种低温保存溶液中孵育的细胞是相似的。
孵育后对测试溶液中EC和SMC二者的所有样品的培养物纯度和细胞表征的流式细胞术结果均高于预定的接受标准(对于EC，>85％的CD31阳性细胞；对于SMC，>60％的αSMA阳性细胞)。
表10：在低温保存溶液中孵育24小时后的EC和SMC转基因表达。结果显示为每个实验条件两次重复的平均值。
Figure BDA0003347657360000762
表11：在注射溶液中孵育48小时后的EC和SMC转基因表达。结果显示为每个实验条件两次重复的平均值。
Figure BDA0003347657360000771
综上所述，这些数据有力地表明，特定的制剂在获得不同血管细胞类型的改进的低温保存方面是有效的，支持了使用定制低温保存溶液制剂用于细胞治疗的可移植的转导的血管细胞。
本文提供的数据表明，在4℃保存人类SMC超过48小时最佳地使用细胞内HEPES缓冲的低温保存溶液(HST)来实现。相比之下，等渗的碳酸氢盐缓冲的低温保存溶液(PL)(补充有1％人类白蛋白溶液、0.1％右旋糖、100U/ml肝素，用8.4％碳酸氢钠调节pH至7.4-7.7)对于在4℃保存人类EC细胞超过48小时是最好的。
在不归因于单一假设的情况下，对每种低温保存溶液所揭示的不同水平的细胞保护的一种可能解释是，在血管SMC细胞保存期间和之后启动的细胞响应和死亡级联可能不同于血管EC细胞。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入本文一样。此外，本申请中对任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术。就使用章节标题而言，它们不应被解释为必然限制。此外，本申请的任何优先权文件通过引用以其整体并入本文。
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tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60
ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120
tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180
gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240
ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300
tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360
taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420
agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480
ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540
ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcattt gggggctcgt 600
ccgggatttg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggcc 660
agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg tttgatgtta tgcgcctgcg 720
tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa ctgacgagtt 780
ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg 840
cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg tggttctggt 900
aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggaa 960
ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1020
gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact gttaccactc ccttaagttt 1080
gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa 1140
gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc agaatggcca acctttaacg tcggatggcc 1200
gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc 1260
tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320
tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380
atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440
tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattcgttaa ctcgaggatc cgaaaccatg 1500
aactttctgc tgtcttgggt gcattggagc cttgccttgc tgctctacct ccaccatgcc 1560
aagtggtccc aggctgcacc catggcagaa ggaggagggc agaatcatca cgaagtggtg 1620
aagttcatgg atgtctatca gcgcagctac tgccatccaa tcgagaccct ggtggacatc 1680
ttccaggagt accctgatga gatcgagtac atcttcaagc catcctgtgt gcccctgatg 1740
cgatgcgggg gctgctgcaa tgacgagggc ctggagtgtg tgcccactga ggagtccaac 1800
atcaccatgc agattatgcg gatcaaacct caccaaggcc agcacatagg agagatgagc 1860
ttcctacagc acaacaaatg tgaatgcaga ccaaagaaag atagagcaag acaagaaaat 1920
ccctgtgggc cttgctcaga gcggagaaag catttgtttg tacaagatcc gcagacgtgt 1980
aaatgttcct gcaaaaacac agactcgcgt tgcaaggcga ggcagcttga gttaaacgaa 2040
cgtacttgca gatgtgacaa gccgaggcgg tgatgaatga atgaggatcc ggctgtggaa 2100
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 2160
catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2220
aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc 2280
catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt 2340
ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag ctattccaga agtagtgagg 2400
aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagcttggg ctgcaggtcg aggcggatct 2460
gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt 2520
tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc 2580
tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag 2640
accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg 2700
gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac 2760
tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc 2820
gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc 2880
tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc 2940
ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg 3000
ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat 3060
gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc 3120
cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa 3180
gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat 3240
tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt 3300
tcgataaaat aaaagatttt atttagtctc cagaaaaagg ggggaatgaa agaccccacc 3360
tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca aggcatggaa aaatacataa 3420
ctgagaatag agaagttcag atcaaggtca ggaacagatg gaacagctga atatgggcca 3480
aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggaaca 3540
gctgaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca 3600
agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg 3660
tttccagggt gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag 3720
ttcgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctcaataaaa gagcccacaa 3780
cccctcactc ggggcgccag tcctccgatt gactgagtcg cccgggtacc cgtgtatcca 3840
ataaaccctc ttgcagttgc atccgacttg tggtctcgct gttccttggg agggtctcct 3900
ctgagtgatt gactacccgt cagcgggggt ctttcatttg ggggctcgtc cgggatcggg 3960
agacccctgc ccagggacca ccgacccacc accgggaggt aagctggctg cctcgcgcgt 4020
ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt 4080
ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg 4140
tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact 4200
atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca 4260
gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 4320
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 4380
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 4440
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 4500
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 4560
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 4620
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 4680
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 4740
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 4800
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 4860
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 4920
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 4980
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 5040
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 5100
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 5160
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 5220
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 5280
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 5340
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 5400
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 5460
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 5520
atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 5580
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 5640
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 5700
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 5760
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 5820
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca catagcagaa 5880
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 5940
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 6000
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 6060
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 6120
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 6180
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 6240
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtcttcaag 6300
aattgctagc aattcatacc agatcaccga aaactgtcct ccaaatgtgt ccccctcaca 6360
ctcccaaatt cgcgggcttc tgcctcttag accactctac cctattcccc acactcaccg 6420
gagccaaagc cgcggccctt ccgtttcttt gct 6453
<210> 2
<211> 7389
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 血管生成素核酸构建体
<400> 2
tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60
ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120
tgaataccaa acaggatatc tgtggtaagc ggttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca 180
gatgagacag ctgagtgatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg 240
ctcggggcca agaacagatg gtccccagat gcggtccagc cctcagcagt ttctagtgaa 300
tcatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtacc ttatttgaac 360
taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc cgctctccga gctcaataaa 420
agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcttccgat agactgcgtc gcccgggtac 480
ccgtattccc aataaagcct cttgctgttt gcatccgaat cgtggtctcg ctgttccttg 540
ggagggtctc ctctgagtga ttgactaccc acgacggggg tctttcattt gggggctcgt 600
ccgggatttg gagacccctg cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggcc 660
agcaacttat ctgtgtctgt ccgattgtct agtgtctatg tttgatgtta tgcgcctgcg 720
tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc cgtggtggaa ctgacgagtt 780
ctgaacaccc ggccgcaacc ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg 840
cccgacctga ggaagggagt cgatgtggaa tccgaccccg tcaggatatg tggttctggt 900
aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa tttttgcttt cggtttggaa 960
ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1020
gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact gttaccactc ccttaagttt 1080
gaccttaggt cactggaaag atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa 1140
gaagagacgt tgggttacct tctgctctgc agaatggcca acctttaacg tcggatggcc 1200
gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt aagatcaagg tcttttcacc 1260
tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 1320
tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag cctccgcctc ctcttcctcc 1380
atccgccccg tctctccccc ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta 1440
tccagccctc actccttctc taggcgccgg aattcgttaa ctcgaggatc tgctggcagt 1500
acaatgacag ttttcctttc ctttgctttc ctcgctgcca ttctgactca catagggtgc 1560
agcaatcagc gccgaagtcc agaaaacagt gggagaagat ataaccggat tcaacatggg 1620
caatgtgcct acactttcat tcttccagaa cacgatggca actgtcgtga gagtacgaca 1680
gaccagtaca acacaaacgc tctgcagaga gatgctccac acgtggaacc ggatttctct 1740
tcccagaaac ttcaacatct ggaacatgtg atggaaaatt atactcagtg gctgcaaaaa 1800
cttgagaatt acattgtgga aaacatgaag tcggagatgg cccagataca gcagaatgca 1860
gttcagaacc acacggctac catgctggag ataggaacca gcctcctctc tcagactgca 1920
gagcagacca gaaagctgac agatgttgag acccaggtac taaatcaaac ttctcgactt 1980
gagatacagc tgctggagaa ttcattatcc acctacaagc tagagaagca acttcttcaa 2040
cagacaaatg aaatcttgaa gatccatgaa aaaaacagtt tattagaaca taaaatctta 2100
gaaatggaag gaaaacacaa ggaagagttg gacaccttaa aggaagagaa agagaacctt 2160
caaggcttgg ttactcgtca aacgtatata atccaggagc tggaaaagca attaaacaga 2220
gctaccacca acaacagtgt ccttcagaag cagcaactgg agctgatgga cacagtccac 2280
aaccttgtca atctttgcac taaagaaggt gttttactaa agggaggaaa aagagaggaa 2340
gagaaaccat ttagagactg tgcagatgta tatcaagctg gttttaataa aagtggaatc 2400
tacactattt atattaataa tatgccagaa cccaaaaagg tgttttgcaa tatggatgtc 2460
aatgggggag gttggactgt aatacaacat cgtgaagatg gaagtctaga tttccaaaga 2520
ggctggaagg aatataaaat gggttttgga aatccctccg gtgaatattg gctggggaat 2580
gagtttattt ttgccattac cagtcagagg cagtacatgc taagaattga gttaatggac 2640
tgggaaggga accgagccta ttcacagtat gacagattcc acataggaaa tgaaaagcaa 2700
aactataggt tgtatttaaa aggtcacact gggacagcag gaaaacagag cagcctgatc 2760
ttacacggtg ctgatttcag cactaaagat gctgataatg acaactgtat gtgcaaatgt 2820
gccctcatgt taacaggagg atggtggttt gatgcttgtg gcccctccaa tctaaatgga 2880
atgttctata ctgcgggaca aaaccatgga aaactgaatg ggataaagtg gcactacttc 2940
aaagggccca gttactcctt acgttccaca actatgatga ttcgaccttt agatttttga 3000
agatccggct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag 3060
gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag 3120
gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 3180
cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 3240
atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat 3300
tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag cttgggctgc 3360
aggtcgaggc ggatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga 3420
tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc 3480
acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc 3540
ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc 3600
gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac 3660
tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc 3720
tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 3780
gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg 3840
tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 3900
cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 3960
cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 4020
attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 4080
ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 4140
tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 4200
agcgggactc tggggttcga taaaataaaa gattttattt agtctccaga aaaagggggg 4260
aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 4320
atggaaaaat acataactga gaatagagaa gttcagatca aggtcaggaa cagatggaac 4380
agctgaatat gggccaaaca ggatatctgt ggtaagcagt tcctgccccg gctcagggcc 4440
aagaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata tctgtggtaa gcagttcctg 4500
ccccggctca gggccaagaa cagatggtcc ccagatgcgg tccagccctc agcagtttct 4560
agagaaccat cagatgtttc cagggtgccc caaggacctg aaatgaccct gtgccttatt 4620
tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc cccgagctca 4680
ataaaagagc ccacaacccc tcactcgggg cgccagtcct ccgattgact gagtcgcccg 4740
ggtacccgtg tatccaataa accctcttgc agttgcatcc gacttgtggt ctcgctgttc 4800
cttgggaggg tctcctctga gtgattgact acccgtcagc gggggtcttt catttggggg 4860
ctcgtccggg atcgggagac ccctgcccag ggaccaccga cccaccaccg ggaggtaagc 4920
tggctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga 4980
gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc 5040
agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt 5100
gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 5160
tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc 5220
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 5280
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 5340
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 5400
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 5460
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 5520
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 5580
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 5640
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 5700
gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 5760
agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 5820
tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 5880
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 5940
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 6000
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 6060
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 6120
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 6180
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 6240
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 6300
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 6360
ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 6420
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctgcagg catcgtggtg 6480
tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 6540
acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 6600
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 6660
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 6720
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaacacg ggataatacc 6780
gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 6840
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 6900
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 6960
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 7020
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 7080
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 7140
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 7200
ccctttcgtc ttcaagaatt gctagcaatt gctagcaatt gctagcaatt cataccagat 7260
caccgaaaac tgtcctccaa atgtgtcccc ctcacactcc caaattcgcg ggcttctgcc 7320
tcttagacca ctctacccta ttccccacac tcaccggagc caaagccgcg gcccttccgt 7380
ttctttgct 7389

Claims (122)

1.人类平滑肌(SM)细胞，所述人类平滑肌(SM)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，其中所述预调节包括使所述SM细胞与0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE-葡聚糖接触，与用1.0mg/ml或更高的DEAE-葡聚糖预调节的类似SM细胞相比，所述SM细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的人类平滑肌细胞，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1中列出的多核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的人类SM细胞，其中所述预调节用0.125mg/ml-0.5mg/mlDEAE-葡聚糖进行，并且进行1分钟和4分钟之间。
4.根据权利要求1或2所述的人类SM细胞，其中所述预调节用0.125mg/ml DEAE-葡聚糖进行并且进行1分钟。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的人类SM细胞，其中所述接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。
6.根据权利要求4所述的人类SM细胞，其中所述转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
7.根据权利要求5或6所述的人类SM细胞，其中所述转导培养基是无血清培养基。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的人类SM细胞，其中所述人类平滑肌细胞选自由以下组成的组：新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞、冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞以及培养的人类平滑肌细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的人类SM细胞，其中所述人类平滑肌细胞在所述转导之前和之后被培养在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中。
10.根据权利要求9所述的人类SM细胞，其中所述生长培养基还包含5％-25％胎牛血清(FBS)。
11.根据权利要求9所述的人类SM细胞，其中所述生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
12.根据权利要求9所述的人类SM细胞，其中所述生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的人类SM细胞，其中所述人类平滑肌细胞是在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中的从静脉组织分离的平滑肌细胞。
14.人类内皮(EC)细胞，所述人类内皮(EC)细胞被预调节用于用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，其中所述预调节包括：
(a)用包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基从静脉组织中分离所述EC细胞；
(b)用包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的EC培养基培养所述分离的EC细胞，以及
(c)用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖预调节所述人类血管内皮细胞，
其中与(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基相比，所述EC细胞的特征在于转导后转导率提高和增殖提高中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的EC细胞，其中所述逆转录病毒构建体包含SEQ ID NO:1中列出的核酸序列。
16.根据权利要求14所述的EC细胞，其中所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
17.根据权利要求14所述的EC细胞，其中所述人类内皮细胞在步骤(a)中在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的EC细胞，其中所述人类内皮细胞在步骤(b)中在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和5％-25％胎牛血清的生长培养基中培养。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的EC细胞，其中步骤(b)的所述生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
20.根据权利要求14-16中任一项所述的EC细胞，其中所述生长培养基还包含10％胎牛血清(FBS)。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的EC细胞，其中所述接触在包含M199培养基的转导培养基中进行。
22.根据权利要求21所述的EC细胞，其中所述转导培养基还包含1mM-10mM谷氨酰胺。
23.根据权利要求21所述的EC细胞，其中所述转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的EC细胞，其中所述转导培养基是无血清培养基。
25.一种用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，所述方法包括：
(a)用0.125mg/ml和0.9mg/ml之间的DEAE-葡聚糖预调节所述人类平滑肌细胞，以及
(b)使人类平滑肌细胞与所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含所述核酸构建体的转导培养基中接触。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述预调节用0.125mg/ml-0.5mg/ml DEAE-葡聚糖进行。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述预调节用0.125mg/ml DEAE-葡聚糖进行。
29.根据权利要求25-28所述的方法，其中所述预调节进行1分钟和4分钟之间。
30.根据权利要求25-27所述的方法，其中所述预调节进行2分钟和3分钟之间。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述预调节进行1分钟。
32.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基和20％胎牛血清的分离培养基中分离。
34.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的平滑肌细胞。
35.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞在转导之前被培养。
36.根据权利要求25-35中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述接触在1ml转导培养基的体积中进行。
37.根据权利要求25-36中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞在所述转导之前和之后被培养在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2 Bullet Kit培养基的培养基中。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述生长培养基还包含5％-25％胎牛血清(FBS)。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
41.一种用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，所述方法包括：
(a)用1.0mg/ml DEAE-葡聚糖预调节所述人类血管内皮细胞，以及
(b)使所述人类内皮细胞与所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体在包含所述核酸构建体的转导培养基中接触至少2.5个连续的小时且不超过3.5个连续的小时的持续时间。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述核酸构建体包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续时间是2.8-3.2个连续的小时。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续时间是2.5-3.0个连续的小时。
45.根据权利要求41所述的方法，其中所述持续时间是2.5个连续的小时。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述人类内皮细胞在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的分离培养基中分离。
48.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞是冷冻保存并解冻的来自静脉组织的内皮细胞。
49.根据权利要求41-48中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞在转导之前被培养。
50.根据权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞在所述转导之前和之后在包含内皮生长(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基的生长培养基中培养。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述生长培养基还包含5％-25％胎牛血清(FBS)。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述生长培养基还包含10％-20％胎牛血清(FBS)。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述生长培养基还包含10％胎牛血清(FBS)。
54.根据权利要求41-51中任一项所述的方法，其中所述转导培养基包含M199培养基。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述转导培养基还包含1mM-10mM谷氨酰胺。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述转导培养基还包含2mM-8mM谷氨酰胺。
57.根据权利要求54所述的方法，其中所述转导培养基还包含2mM谷氨酰胺。
58.根据权利要求52-57中任一项所述的方法，其中所述转导培养基是无血清培养基。
59.一种低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在细胞内型低温保存溶液中孵育所述转导的人类平滑肌细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。
61.权利要求59或60所述的方法，其中所述细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液和能量底物。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述低温保存溶液还包含Trolox、Na离子、K离子、钙离子和Mg离子。
63.根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述能量底物包含腺苷和谷胱甘肽。
64.根据权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐-40、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液、Trolox、Na离子、K离子、钙离子、Mg离子、腺苷和谷胱甘肽。
65.根据权利要求59所述的方法，其中所述低温保存溶液是
Figure FDA0003347657350000071
FRS。
66.根据权利要求59-65中任一项所述的方法，其中所述人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
67.根据权利要求59-66中任一项所述的方法，其中所述转导的人类平滑肌细胞在所述低温保存之前在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2Bullet Kit培养基的培养基中培养。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
69.根据权利要求59-68中任一项所述的方法，其中与保存在等渗多电解质溶液中的相同的转导的平滑肌细胞相比，所述转导的平滑肌细胞的特征在于低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或低温保存后转基因表达增强中的至少一种。
70.一种低温保存用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞的方法，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列，所述方法包括在2℃和8℃之间在包含等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中孵育所述转导的人类内皮细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含SEQ ID NO:2的核酸序列。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述等渗多电解质溶液补充有右旋糖、肝素和白蛋白。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述等渗多电解质溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子和葡萄糖酸根离子。
74.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其中用碳酸氢钠将所述等渗型低温保存溶液的pH调节至7.4-7.7。
75.根据权利要求70-74中任一项所述的方法，其中所述等渗低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子、葡萄糖酸根离子、右旋糖、肝素。
76.根据权利要求70所述的方法，其中所述低温保存溶液包含补充有0.1％右旋糖、100U/ml肝素和1％人类白蛋白的
Figure FDA0003347657350000081
并用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
77.根据权利要求70-76中任一项所述的方法，其中所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
78.根据权利要求70-77中任一项所述的方法，其中所述转导的人类内皮细胞在所述低温保存之前在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的培养基中培养。
79.根据权利要求70-77中任一项所述的方法，其中与保存在细胞内型低温保存溶液中的相同的转导的内皮细胞相比，所述转导的内皮细胞的特征在于低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或低温保存后转基因表达增强中的至少一种。
80.根据权利要求59-79中任一项所述的方法，其中所述孵育进行最多96小时。
81.根据权利要求59-79中任一项所述的方法，其中所述孵育进行12-72小时。
82.根据权利要求59-79中任一项所述的方法，其中所述孵育进行24-48小时。
83.根据权利要求59-82中任一项所述的方法，其中所述孵育在4℃和6℃之间进行。
84.根据权利要求59-83中任一项所述的方法，其中所述孵育在4℃进行。
85.一种可注射组合物，所述可注射组合物包含悬浮在细胞内型低温保存溶液中的用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类平滑肌(SM)细胞，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码VEGF165多肽的多核苷酸序列。
86.根据权利要求85所述的可注射组合物，其中编码VEGF165多肽的所述多核苷酸序列在SEQ ID NO:1中列出。
87.权利要求85或86所述的可注射组合物，其中所述细胞内型低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液和能量底物。
88.根据权利要求87所述的可注射组合物，其中所述低温保存溶液还包含Trolox、Na离子、K离子、钙离子和Mg离子。
89.根据权利要求86至88中任一项所述的可注射组合物，其中所述能量底物包含腺苷和谷胱甘肽。
90.根据权利要求85-89中任一项所述的可注射组合物，其中所述低温保存溶液包含乳糖酸盐、蔗糖、右旋糖酐-40、葡萄糖、甘露醇、HEPES缓冲液、Trolox、Na离子、K离子、钙离子、Mg离子、腺苷和谷胱甘肽。
91.根据权利要求85所述的可注射组合物，其中所述低温保存溶液是
Figure FDA0003347657350000091
FRS。
92.根据权利要求85-90中任一项所述的可注射组合物，其中所述人类平滑肌细胞是新鲜分离的来自静脉组织的平滑肌细胞。
93.根据权利要求85-92中任一项所述的可注射组合物，其中所述转导的人类平滑肌细胞在悬浮于所述低温保存溶液中之前在包含平滑肌生长培养基(SmGM)-2Bullet Kit培养基的培养基中培养。
94.根据权利要求93所述的可注射组合物，其中所述生长培养基还包含15％胎牛血清(FBS)。
95.一种可注射组合物，所述可注射组合物包含悬浮在包含等渗多电解质溶液的等渗型低温保存溶液中的用逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体转导的人类内皮细胞，所述逆转录病毒核酸构建体或慢病毒核酸构建体包含编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的多核苷酸序列。
96.根据权利要求95所述的可注射组合物，其中编码血管生成素-1(Ang-1)多肽的所述多核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出。
97.根据权利要求95或96所述的可注射组合物，其中所述等渗型低温保存溶液还补充有右旋糖、肝素和白蛋白。
98.根据权利要求95至97中任一项所述的可注射组合物，其中所述等渗多电解质溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子和葡萄糖酸根离子。
99.根据权利要求95-98中任一项所述的可注射组合物，其中用碳酸氢钠将所述等渗型低温保存溶液的pH调节至7.4-7.7。
100.根据权利要求95-99中任一项所述的可注射组合物，其中所述等渗低温保存溶液包含Na离子、K离子、Mg离子、乙酸根离子、葡萄糖酸根离子、右旋糖、肝素和人类白蛋白，并用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
101.根据权利要求95所述的可注射组合物，其中所述低温保存溶液包含补充有0.1％右旋糖、100U/ml肝素和1％人类白蛋白的
Figure FDA0003347657350000101
并用碳酸氢钠调节至pH 7.4-7.7。
102.根据权利要求95-101中任一项所述的可注射组合物，其中所述人类内皮细胞是新鲜分离的来自静脉组织的内皮细胞。
103.根据权利要求95-102中任一项所述的可注射组合物，其中所述转导的人类内皮细胞在所述低温保存之前在包含内皮生长培养基(EGM)TM-2 Bullet Kit培养基和10％胎牛血清的培养基中培养。
104.一种低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含在2℃和8℃之间的权利要求85-94中任一项所述的可注射组合物。
105.根据权利要求104所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含特征在于以下中的至少一种的转导的平滑肌细胞：与低温保存在等渗多电解质溶液中的相同的转导的平滑肌细胞相比，所述转导的平滑肌细胞在低温保存后活力增强、在低温保存后细胞增殖增强或在低温保存后转基因表达增强。
106.一种低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含在2℃和8℃之间的权利要求95-103中任一项所述的可注射组合物。
107.根据权利要求106所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，其包含特征在于以下中的至少一种的转导的内皮细胞：与保存在细胞内型低温保存溶液中的相同的转导的内皮细胞相比，所述转导的内皮细胞在低温保存后活力增强、低温保存后细胞增殖增强或低温保存后转基因表达增强。
108.一种试剂盒，所述试剂盒包含含有权利要求85-94中任一项所述的可注射组合物的第一容器和含有权利要求95-103中任一项所述的可注射组合物的单独的第二容器。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述试剂盒在2℃和8℃之间。
110.根据权利要求104-107中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，或根据权利要求108-109中任一项所述的试剂盒，其中所述可注射组合物在2℃和4℃之间。
111.根据权利要求104-107中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，或根据权利要求108或109所述的试剂盒，遵循在所述温度低温保存6小时和96小时之间。
112.根据权利要求104-107中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，或根据权利要求108或109所述的试剂盒，遵循在所述温度低温保存12小时和48小时之间。
113.根据权利要求104-107中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物，或根据权利要求108或109所述的试剂盒，遵循所述温度低温保存24小时或48小时。
114.根据权利要求85-103中任一项所述的可注射组合物或根据权利要求104-107和110-113中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或根据权利要求108或109所述的试剂盒，用于血管生成细胞治疗。
115.根据权利要求85-103中任一项所述的可注射组合物或根据权利要求104-107和110-113中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或根据权利要求108或109所述的试剂盒，用于治疗有相应需要的受试者的血管状况或疾病。
116.根据权利要求115所述的可注射组合物、低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或试剂盒，其中所述血管状况或疾病选自由动脉粥样硬化、外周动脉疾病、糖尿病的血管并发症、缺血和慢性肾衰竭组成的组。
117.根据权利要求85-103中任一项所述的可注射组合物或根据权利要求104-107和110-111中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或根据权利要求108或109所述的试剂盒，用于有相应需要的受试者的新血管形成。
118.一种血管生成细胞治疗的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用权利要求85-101中任一项所述的可注射组合物或权利要求104-107和110-113中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或权利要求108或109所述的试剂盒。
119.一种治疗有相应需要的受试者的血管状况或疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求85-103中任一项所述的可注射组合物或权利要求104-107和110-113中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或权利要求108或109所述的试剂盒。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述血管状况或疾病选自由动脉粥样硬化、外周动脉疾病、糖尿病的血管并发症、缺血和慢性肾衰竭组成的组。
121.一种影响有相应需要的受试者的新血管形成的方法，所述方法包括施用权利要求85-103中任一项所述的可注射组合物、权利要求104-107和110-113中任一项所述的低温保存的可注射的转导的人类血管细胞组合物或权利要求108或109所述的试剂盒。
122.根据权利要求118-121中任一项所述的方法，其中所述新血管形成因所述可注射组合物直接施用至所述受试者的受影响的血管而受到影响。
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