CN114452370A - 马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途 - Google Patents

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CN114452370A CN202111398054.4A CN202111398054A CN114452370A CN 114452370 A CN114452370 A CN 114452370A CN 202111398054 A CN202111398054 A CN 202111398054A CN 114452370 A CN114452370 A CN 114452370A
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Abstract

本申请旨在提供一种马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，所述马骨髓酶解肽采用马骨髓蛋白为原料，采用特定酶解的最适温度、pH值条件下进行筛选，多肽得率高达41.3％。通过电泳分析得到原蛋白及其酶解产物分子量主要集中在4.1～9.5kDa。制备获的得多肽验证具有较强的清除自由基的能力和防治摘除卵巢的雌性大鼠的骨质疏松的作用，可有效缓解绝经后骨质疏松症的发生。马骨髓胶原肽的开发为预防骨质疏松症保健食品和天然药物的研发提供原料基础，具有广阔的应用前景和临床价值。

Description

马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途
技术领域
本发明属于药物研制领域，涉及制备用于预防骨质疏松的药物，进一步的涉 及动物骨髓的酶解肽及其相关用途的技术领域。
背景技术
骨质疏松(osteoprorsis,OP)是最常见的骨骼疾病之一，骨量低、骨组织微 结构破坏，导致骨骼脆性增加，易发生骨折是其特征。而女性绝经之后，由于雌 激素水平的逐渐降低，会导致骨质分解增加。最新调查结果显示我国50岁以上 人群骨质疏松症患病率为19.2％，其中男性患病率为6.0％，女性患病率则高达 32.1％。显然骨质疏松症已经成为中老年人群继糖尿病、高血压后又一重要健康 问题。
目前治疗OP的药物有抗骨吸收药物和促进骨形成药物，普遍具有一定副作 用，因此越来越多的人倾向于选择替代疗法，如通过膳食补充剂钙、胶原蛋白肽 等预防和治疗OP。胶原蛋白肽也称胶原蛋白水解物或明胶水解物，采用胶原蛋 白、明胶或富含胶原蛋白的物质制备而来，分子量较小，可完全溶解于水，容易 被吸收利用，无副作用，具有多种生理活性和保健功能，如促进骨骼关节健康、 促进伤口愈合，并具有显著的美容作用，因此胶原蛋白肽被广泛地用作保健食品。 研究显示，摄食胶原蛋白肽不仅对机体无副作用，还可提高骨骼强度，促进矿物 质吸收，对OP有一定的预防和治疗作用。
胶原蛋白肽可以减轻骨关节炎症状，并能修复骨关节损伤或减缓退行性变， 无副作用。其作用机制：(1)作为软骨和滑液的基本成分，激发软骨的合成代 谢；(2)延迟软骨炎症诱导的分解代谢，减缓软骨破坏进程，有助于关节软骨 的再生，从而减少关节疼痛和增加受累关节的活动性。骨胶原蛋白肽具有显著的 美容、促进骨骼关节健康(促进骨细胞生成、加速骨骼发育、提高骨骼坚固性、 缓解关节疼痛、改善关节软骨内蛋白多糖的耗损等)、控制体重等功效。因此骨 胶原蛋白肽被称为“皮肤的软黄金”、“肤中之肤、骨中之骨”，从动物源中回收的 胶原蛋白可以有效地用于许多领域，如生物医学、生物材料、化妆品、纺织品、 环境友好材料的开发及医药中。
胶原蛋白是主要的细胞外间质成分，其主要与糖蛋白、蛋白多糖等结合形成 不溶性生物大分子的形式存在。酶法制备的各种类型胶原蛋白具有较低的抗原 性，可做为良好的生物医学材料。骨质疏松主要是由于人体的胶原蛋白质结构、 含量及稳定性出现了异常而引起的，也即合成了骨胶原的速度低、老化或者流失 的速度造成的骨量、骨密度不足而造成的，因此补钙的同时应先补充一些活性的 胶原蛋白。
来源于动物及其不同部位的药材在中国传统医药中具有举足轻重的价值，除 了虎、熊、犀牛、梅花鹿等珍稀野生动物的骨骼作为名贵中药在传统中医药具有 疗效显著的药用价值外，牦牛、骆驼、牛、马等畜牧动物的骨骼及其髓质在地方 特色的传统民族医药中也有悠久的药用历史。根据有关数据记载，全疆马牲蓄栏 89.42万头(只)，占全国总量的14.8％，饲养为72.95万头(只)，马畜产品产 量为5万吨于2016年少于1.17万吨，马肉总产量为61669吨。按副产物约25％ 计算，2018年从其中可获得马的副产物总量为2466.76吨。按马重量占上述副 产物约20-25％计算，马骨98.7-123.3吨，1kg马骨中约含有80-100g骨髓，资 源较为丰富；但，由于骨骼的不充分利用导致了该资源的浪费。动物的骨头中含 有多种对人体有营养、滋补和保健功能的物质，具有添骨髓、增血液、减缓衰老、 延年益寿的保健功效。动物骨髓中富含有利于智力发育的磷脂质、磷蛋白等，骨 头中含有丰富的钙质。动物骨髓是高蛋白、低脂肪及含优质有机钙的富营养原料， 很多壮骨粉、补钙产品所用原料就是来自骨髓。骨髓的食用功效在于其具有较好 的治疗精髓亏虚，肢体痿弱，肌肉瘦削，腰膝酸软的作用。作为具有较好的药用 和食用价值的骨髓，动物骨髓通常被丢弃或变成动物食品并未开发利用。从经济 和环境的角度来看，将这些副产物转化为增值的功能成分是有利的，这与创造更 多的循环经济是一致的。
氧化应激作为骨质疏松的一个危险因子已越来越受到重视。有研究表明，氧 化应激状态能够抑制骨髓中成骨细胞的分化，同时刺激破骨细胞分化，促进了骨 质疏松的发生发展。人体在代谢过程中不断有活性氧族产生，主要包括超氧负离 子、过氧化氢、羟自由基等。氧化应激对成骨细胞、破骨细胞、骨基质都有明显 的影响，能够促进骨质疏松发生发展。而抗氧化剂具有对抗氧化应激的潜力，当 体内抗氧化系统失调时适当补充外源性抗氧化剂，可以预防或缓解骨质疏松的发 生发展。因此有必要进行深入的基础和临床研究来阐明氧化应激和抗氧化剂在骨 质疏松发生发展中的作用，为骨质疏松的防治提供更新更好的方法。
现有技术中关于骨髓蛋白进行骨强度和骨结构相关指标的提升中，多为采用 相关蛋白直接治疗，部分采用堕胎的技术方案中分子量较大，吸收效果并不理想， 加之绝经后妇女由于卵巢功能衰退，雌激素水平下降，继发甲状旁腺功能亢进， 降钙素分泌不足，从而导致破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨形成，出现以低 骨量和骨组织的显微结构退行性变为其特征，骨脆性和骨折易感性增加，现有技 术中相关的治疗方案大部分存在不良反应的副作用。如何确定防治绝经后骨质疏 松的最佳方案非常重要，进一步开展多元素、前瞻性及临床远期疗效的研究观察， 才能筛查出防治骨质疏松安全有效、廉价、方便、疗程短的最佳治疗方法。本申 请提供马骨髓胶原蛋白肽预防和治疗绝经后OP的用途，为骨髓蛋白胶原蛋白肽 的开发提供新思路。
发明内容
针对现有技术中，尚无关于采用马骨髓蛋白酶解肽用于制备预防骨质疏松制 剂中的用途，特别是用于缓解绝经后骨质疏松症，本申请旨在提供一种采用特定 马骨髓酶解肽的最佳制备方法制备获得的马骨髓酶解肽，酶解后多肽的得率高达 41.3％。同时该多肽部位被验证具有较强的清除自由基的能力和防治去卵巢大鼠 骨质疏松作用。抗氧化活性为蛋白最为广泛的活性之一，体内自由基的失控将会 导致生物体的受损伤。从天然动物中寻找新抗氧化剂，是现代医药和食品行业发 展的新方向；研究骨髓蛋白及其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂， 为抗氧化性动物骨髓蛋白的开发利用提供依据，具有重要的现实意义。
本申请提供马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途。
进一步的，本申请提供马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，用 于缓解绝经后骨质疏松症的发生。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述改善 选自如下症状中的一项或多项：预防骨质疏松症、促进骨生长。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述改善 选自如下指标中的一项或多项：股骨密度、腰椎骨、股骨骨小梁数目、骨小梁三 维网状结构、骨骼强度。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述的马 骨髓酶解肽用量为0.133g/mL-0.53g/mL。
优选的，本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中， 所述的马骨髓酶解肽用量为0.53g/mL。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，通过选自 如下的方式向受试者提供马骨髓酶解肽：静脉内、直肠内、鼻腔内、肺部内、眼 部、肌肉组织、皮肤组织或口服。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述马骨 髓酶解肽还可与载体联用，可接受的载体选自：稀释剂、缓冲液、赋形剂、防腐 剂、抑菌剂、抗氧化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、稳定 剂、矫味剂中的一种或几种。
更进一步的，本申请提供的用于制备预防骨质疏松制剂的马骨髓酶解肽，采 用以下特定制备方式获得：
a、马骨使用小型锯骨机切骨取骨髓，骨髓样品用蒸馏水冲洗3次，去除碎 骨头，加1:5比例液氮粉碎成粉末，骨髓粉末存于-40℃度冰箱，备用；
b、将步骤a中得到的粉末按料液比为1:20g/mL加入水，45℃磁力搅拌回 流提取2小时，提取2次，按体积比1：5加入石油醚脱脂3-4次，收集提取物， 浓缩至1/4，透析48h冷冻干燥得到骨髓蛋白粉；
c、将步骤b中得到的骨髓蛋白粉末，加入0.1％-2.0％蛋白酶，在温度 35℃-55℃、pH 7.5-11.5及料液比1:10-30g/mL条件下进行酶解，待酶解完毕于 90℃加热10min灭酶、冷却、离心、得到酶解液、冷冻干燥得到马骨髓蛋白酶 解物。
优选的，蛋白酶选用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。
更优选的，蛋白酶选用碱性蛋白酶。
优选的，蛋白酶的添加量为0.9％。
优选的，酶解采用pH 9.5进行。
优选的，酶解采用料液比1:16g/mL进行。
更进一步的，本申请还提供所述方法获得的骨髓蛋白酶解肽在制备抗氧化保 健食品中的用途。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：
本发明所述的一种基于响应面法优化酶解提取的骨髓蛋白酶解肽的制备方 法，其优点是多肽得率高、操作简单、易于放大中试，而其在保留多肽原有的物 理和化学性质以及营养成分基础上，通过利用低温或真空或冷冻干燥干技术，避 免了传统烘干而有些化合物失去活性的缺点。该多肽部位被验证具有抗氧化活 性，总还原能力及对DPPH、ABTS、羟自由基的清除能力较强，经动物实验其 具有较强清除自由基的能力和防治摘除卵巢的雌性大鼠的骨质疏松的作用。本发 明所述的马骨髓酶解肽对摘除卵巢的雌性SD大鼠有预防骨质疏松症、促进骨生 长的作用，其中马骨髓蛋白高剂量组(HBMP-H)改善股骨密度略高于中剂量组 (HBMP-M)和低剂量组(HBMP-L)；腰椎骨、左侧股骨骨组织形态学观察结 果进一步表明，高剂量组骨髓蛋白肽能有效提高骨小梁数目，恢复骨小梁三维网 状结构，进而提高去卵巢大鼠骨骼强度，降低激素分泌减少导致的骨质疏松性骨 折发生率。高剂量组骨髓蛋白肽可有效缓解绝经后骨质疏松症的发生，马骨髓胶 原肽的开发为预防骨质疏松症保健食品和天然药物的研发提供原料基础，具有广 阔的应用前景和临床价值。
附图说明
图1为四种酶酶解对马骨髓蛋白的影响；
图2为加酶量对马骨髓蛋白水解度和DPPH自由基的影响；
图3为pH对马骨髓蛋白水解度和DPPH自由基的影响；
图4为提取温度对马骨髓蛋白对水解度和DPPH自由基的影响；
图5为料液比对马骨髓蛋白对水解度和DPPH自由基的影响；
图6为加酶量与pH对马骨髓蛋白酶解物DPPH自由基清除率的响应面图；
其中图A所示为加酶量与pH对马骨髓蛋白酶解物DPPH自由基清除率影响 的曲面图；图B所示为加酶量与pH对马骨髓蛋白酶解物DPPH自由基清除率影 响的等高线图；图C所示为加酶量与温度对马骨髓蛋白酶解物DPPH自由基清 除率影响的曲面图；图D所示为为加酶量与温度对马骨髓蛋白酶解物DPPH自 由基清除率影响的等高线图。
图7为加酶量与pH对马骨髓蛋白酶解物水解度的响应面图；
其中图A所示为加酶量与pH对马骨髓蛋白酶解物水解度影响的曲面图；图B 所示为加酶量与pH对马骨髓蛋白酶解物水解度影响的等高线图；图C所示为加酶 量与温度对马骨髓蛋白酶解物水解度影响的曲面图；图D所示为加酶量与温度对 马骨髓蛋白酶解物水解度影响的等高线图。图8为马骨髓蛋白及其酶解物 SDS-PAGE图；
图9为马骨髓蛋白及其酶解物SEM-EDX图；
其中图A所示为水处理200倍放大图；图B所示为水处理500倍放大图； 图C所示为中性蛋白酶处理200倍放大图；图D所示为中性蛋白酶处理500倍 放大图；图E所示为碱性白酶处理200倍放大图；图F所示为碱性白酶处理500 倍放大图；图G所示为胃蛋白酶处理200倍放大图；图H所示胃蛋白酶处理500 倍放大图；图I所示为木瓜蛋白酶处理200倍放大图；图J所示为木瓜蛋白酶处 理500倍放大图，图K所示为水处理元素测定图；图L所示为中性蛋白酶处理 元素测定图；图M所示为碱性白酶处理元素测定图；图N所示为胃蛋白酶处理 元素测定图；图O所示为木瓜蛋白酶处理元素测定图。
图10为马骨髓蛋白及其酶解物红外光谱图；
图11为马骨髓蛋白酶解物呈味氨基酸含量图；
图12为马骨髓蛋白酶解物药用氨基酸含量图；
图13为马骨髓蛋白酶解物聚类分析图；
图14为马骨髓蛋白碱性蛋白酶酶解物CD分析图
其中图A所示为水提蛋白圆二色谱图；图B所示为碱性蛋白酶酶解物圆二 色谱图。
图15为马骨髓蛋白碱性蛋白酶酶解物MALDI-TOF-MS图；
图16为马骨髓蛋白酶解物清除DPPH自由基能力图；
图17为马骨髓蛋白酶解物清除ABTS自由基能力图；
图18为马骨髓蛋白酶解物清除羟自由基能力图；
图19为马骨髓蛋白酶解物清除超氧离子自由基能力图；
图20为马骨髓蛋白酶解物总还原能力图；
图21为马骨髓蛋白对去卵巢大鼠左侧股骨股骨密度的影响；
图22为马骨髓蛋白对去卵巢大鼠腰椎骨股骨密度的影响；
图23为马骨髓酶解蛋白对取卵大鼠左侧股骨的影响；
图24为马骨髓蛋白对去卵巢大鼠矿物质Ca、Mg、P，TP含量的影响；
其中图A所示为Mg含量测定结果图；图B所示为Ca含量测定结果图；图 C所示为P含量测定结果图；图D所示为TP含量测定结果图。
图25为马骨髓蛋白对去卵巢大鼠血清SOD，MDA，GSH-PX，CAT体内抗 氧化活性的影响；
其中图A所示为SOD测定结果图；图B所示为MDA测定结果图；图C所 示为GSH-PX测定结果图；图D所示为CAT测定结果图。
图26为马骨髓蛋白对去卵巢大鼠血清肌酐体内抗氧化活性的影响；
图27为马骨髓蛋白对去卵巢大鼠BUN，UA等肾功能的影响；
其中图A所示为UA测定结果图；图B所示为BUN测定结果图；
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明 中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发 明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。
本发明中使用的原料和试剂∶中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋 白酶、分离胶、浓缩胶、盐酸、2,2,2-三氟乙醇(TFE)、乙腈、超纯水、DPPH 甲醇溶液、ABTS自由基溶液、FeSO4.7H2O、水杨酸-乙醇溶液、Tris-HCl缓冲液、 邻苯三酚-HCl溶液、VC、PBS、三氯乙酸、三氯化铁、青霉素、生理盐水均为 市场常见原料。
本发明中使用的仪器∶恒温水浴锅、电泳槽、超低温冰柜、分光光度仪、红 外光谱分析仪、电子显微镜均为本领域常规使用仪器。
本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限 制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施 方式的实施。
实施例一：马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途
本申请提供马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途。
进一步的，本申请提供马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，用 于缓解绝经后骨质疏松症的发生。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述改善 选自如下症状中的一项或多项：预防骨质疏松症、促进骨生长。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述改善 选自如下指标中的一项或多项：股骨密度、腰椎骨、股骨骨小梁数目、骨小梁三 维网状结构、骨骼强度。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述的马 骨髓酶解肽用量为0.133g/mL-0.53g/mL。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，通过选自 如下的方式向受试者提供马骨髓酶解肽：静脉内、直肠内、鼻腔内、肺部内、眼 部、肌肉组织、皮肤组织或口服。
本申请提供的马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途中，所述马骨 髓酶解肽还可与载体联用，可接受的载体选自：稀释剂、缓冲液、赋形剂、防腐 剂、抑菌剂、抗氧化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、稳定 剂、矫味剂中的一种或几种。
更进一步的，本申请提供的用于制备预防骨质疏松制剂的马骨髓酶解肽，采 用以下特定制备方式获得：
a、马骨使用小型锯骨机切骨取骨髓，骨髓样品用蒸馏水冲洗3次，去除碎 骨头，加1:5比例液氮粉碎成粉末，骨髓粉末存于-40℃度冰箱，备用；
b、将步骤a中得到的粉末按料液比为1:20g/mL加入水，45℃磁力搅拌回 流提取2小时，提取2次，按体积比1：5加入石油醚脱脂3-4次，收集提取物， 浓缩至1/4，透析48h冷冻干燥得到骨髓蛋白粉；
c、将步骤b中得到的骨髓蛋白粉末，加入0.1％-2.0％蛋白酶，在温度35℃ -55℃、pH 7.5-11.5及料液比1:10-30g/mL条件下进行酶解，待酶解完毕于90℃ 加热10min灭酶、冷却、离心、得到酶解液、冷冻干燥得到马骨髓蛋白酶解物。
更进一步的，本申请还提供所述方法获得的骨髓蛋白酶解肽在制备抗氧化保 健食品中的用途。
实施例二：马骨髓酶解肽的制备
分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶在其各自的最适 温度、pH值条件下，统一料液比为1:10，加酶量为1.0％对马骨髓蛋白进行水解， 酶解时间为2h/1次，每个试验结果均做3个平行实验，测定水解度及DPPH·清 除能力，通过比较确定最适用酶。不同蛋白酶的酶解条件见表1。
表1：不同蛋白酶的酶解条件
酶种类/活力 温度/℃ pH值
中性蛋白酶/(100U/mg) 45 7.0
碱性蛋白酶/(400U/mg) 50 9.5
木瓜蛋白酶/(1000U/mg) 55 6.5
胃蛋白酶/(300U/mg) 37 2.8
1.单因素试验
取5g马骨髓蛋白，选取碱性蛋白酶，以加酶量(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0％)、 pH(7.5、8.5、9.5、10.5、11.5)、温度(35、40、45、50、55℃)、料液比(1:10、 1:15、1:20、1:25、1:30g/mL)等四个主要影响因素进行单因素试验，分别考察 各因素对对马骨髓蛋白酶解物水解度及酶解液DPPH·清除能力的影响。
2.响应面试验设计
单因素试验的基础上，根据设计Box-Benhnken原理，以加酶量(A)、pH 值(B)、温度(C)及料液比(D)等4个因素为自变量，马骨髓蛋白DH和 DPPH·清除率为响应值(Y)，进行四因素三水平的响应面试验分析，得到最佳 提取条件。响应面试验中各因素的水平见表2。
表2：响应面试验的因素及水平设计
水平 A加酶量(％) BpH C温度(℃) D料液比(g/mL)
-1 0.5 8.5 45 1:10
0 1.0 9.5 50 1:15
1 1.5 10.5 55 1:20
3.四种酶的筛选结果
中性蛋白酶、碱性白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等4种蛋白酶的酶解产物 均有一定的水解效果和DPPH·清除能力。然而由于不同蛋白酶具有不同的特异 酶切位点，可水解蛋白质长肽链上不同的部位，所以酶解产物的抗氧化活性就有 所不同。其中，碱性蛋白酶的酶解产物具有DPPH·清除能力，且水解效果最好， 其次是中性蛋白酶、木瓜蛋白酶，胃蛋白酶酶解产物的DPPH·清除能力最低， 且水解效果最差。
4.单因素试验结果
A.加酶量
如附图2所示，随着加酶量的增加，水解度和DPPH·清除率呈现先升高后 降低的趋势，且在加酶量1.0％时取得最大值，分别为37.21％和50.55％。在加酶 量为1.5％时，水解度只有14.02％这时底物的水解程度已经完全饱和，不会随着 酶添加量的增加而增加，水解度和DPPH·清除能力下降。因而马骨髓蛋白的最 佳酶解加酶量选择为1.0％比较合适，并按此添加量来进行最佳酶解pH的确定 实验。
B.pH
如附图3所示，随着pH值的升高，水解度、DPPH·清除率开始逐渐增大 后减小，当pH值为9.5时，水解度、DPPH·清除率均达到最大值，分别为26.29％、 39.29％。此后，随着pH值升高，水解度及DPPH·清除率均开始迅速减小。所 以pH值对酶解反应影响很大。由此，酶解马骨髓蛋白的pH值以9.5为宜。
C.温度
如附图4所示，在一定温度范围内，随着酶解温度的升高，水解度、DPPH·清 除率呈现先升高后降低的趋势，当酶解温度为50℃时水解度、DPPH·清除率均 达到最大值，分别为35.66％、31.26％。马骨髓蛋白的酶解温度以50℃为宜。
D.料液比
如附图5所示，随着料液比的增加，水解度、DPPH·清除率呈先增大后减小， 在料液比为1:15g/mL时，达到最大值，分别为44.38％、41.72％，当料液比继续 增大时，水解度和DPPH·清除率开始减小。因此，酶解马骨髓蛋白的料液比以1： 15g/mL为宜。
5.响应面优化结果
表3：Box-Behnken试验设计及结果
Figure BDA0003370846880000101
Figure BDA0003370846880000111
Box-Behnken试验设计和马骨髓蛋白的DPPH·清除率数据如表3所示。将 各数据采用Design-Expert软件进行多元回归和二项式分析，建立马骨髓蛋白酶 解工艺DPPH·清除率(Y1)对4个因素(A、B、C、D)的二次回归模型。 Y＝53.84-6.52A-5.74B-1.45C-1.30D-1.55AB+1.52AC-2.62AD+1.27BC-0.19BD+1.6 6CD-9.62A2-8.47B2-7.54C2-2.53D2。方差分析显示，该模型回归极显著 (P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，R2＝0.9923，说明该模型与试验拟合 较好，试验方法可靠，可准确预测试验响应值。该模型中，一次项A，B，C，D， 交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次项A2、B2、C2、D2的P值均小于 0.01，说明上述因素均对响应值有极显著的影响。在试验范围内各因素对响应值 的影响大小分别为：A>B>C>D，即加酶量>pH>提取温度>料液比。方差分析结 果如表4、附图6、附图7所示。
表4：DPPH·清除率回归模型方差分析
Figure BDA0003370846880000112
Figure BDA0003370846880000121
注:R2＝0.9901；校正决定系数R2 Adj＝0.9803。
表5：水解度回归模型方差分析
方差来源 平方和 自由度(df) 均方 F值 P值
模型 2106.05 14 150.43 134.36 <0.0001
A-加酶量 463.02 1 463.02 413.55 <0.0001
B-pH 262.17 1 262.17 234.17 <0.0001
C-提取温度 14.99 1 14.99 13.38 0.0026
D-料液比 24.48 1 24.48 21.87 0.0004
AB 5.55 1 5.55 4.95 0.0430
AC 14.63 1 14.63 13.07 0.0028
AD 20.43 1 20.43 18.25 0.0008
BC 16.56 1 16.56 14.80 0.0018
BD 0.23 1 0.23 0.21 0.6570
CD 6.05 1 6.05 5.41 0.0356
A<sup>2</sup> 591.29 1 591.29 528.13 <0.0001
B<sup>2</sup> 679.02 1 679.02 606.48 <0.0001
C<sup>2</sup> 484.37 1 484.37 432.63 <0.0001
D<sup>2</sup> 115.80 1 115.80 103.43 <0.0001
残差 15.67 14 1.12
失拟性 12.80 10 1.28 1.78 0.3040
纯误差 2.88 4 0.72
总差 2121.73 28
注:R2＝0.9926；校正决定系数R2 Adj＝0.9852。
将各水解度数据采用Design-Expert软件进行多元回归和二项式分析，建立 马骨髓蛋白酶解工艺水解度(Y2)对4个因素(A、B、C、D)的二次回归模型 Y2＝39.58-6.21A-4.67B-1.12C-1.43D-1.18AB+1.91AC-2.26AD+2.03BC-0.24BD+1.2 3CD-9.552A2-10.23B2-8.64C2-4.23D2。方差分析显示，该模型回归极显著 (P<0.0001)，失拟项不显著(P>0.05)，R2＝0.9923，说明该模型与试验拟合 较好，试验方法可靠，可准确预测试验响应值。该模型中，一次项A，B，C，D， 交互项AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次项A2、B2、C2、D2的P值均小于 0.01，说明上述因素均对响应值有极显著的影响。在试验范围内各因素对响应值 的影响大小分别为：A>B>D>C，即加酶量>pH>料液比>酶解温度。方差分析结 果如表5所示。
6.验证试验
根据Box-Behnken试验所得出的结果以及二次多项式回归方程，再使用 Design-Expert软件获得最佳酶解条件，各因素组合为加酶量0.87％、pH 9.29、 酶解温度50.36℃、料液比1:16g/mL，此时预测的水解度为40.35％，DPPH自 由基清除能力为55.14％。为检验模型预测的准确性，做3组平行实验进行验证， 得到的水解度达39.89±0.23％，DPPH自由基清除率达55.73±0.31％，该结果与 在最佳理论条件下获得的结果之间的误差均在1％以内。由此可见，以水解度及 抗氧化活性为指标，采用响应面法对碱性蛋白酶酶解马骨髓蛋白工艺条件进行优 化是行之有效的。
实施例三：马骨髓酶解肽SDS-PAGE分析
马骨髓蛋白酶解液SDS-PAGE图如附图8所示，标准蛋白分子量为4.1-66 kDa，分离胶及浓缩胶浓度分别为15、5％。配制一定浓度的马骨髓蛋白及其酶 解物溶液，准确量取5μL标准蛋白及蛋白样品加入点样孔，75V下运行30～60 min，待指示前沿到达分离胶上沿时，将电压调至120V，待指示前沿至分离胶 3/4处停止电泳。结果显示，马骨髓蛋白在66、45、27、20及9.5-14.4kDa处出 现了多种条带。酶解之后马骨髓蛋白分子量发生了较大的变化，四种酶酶解产物 均在9.5-14.4kDa处显出了条带，木瓜蛋白酶酶解物在66kDa处出现了较为明 显的条带；碱性蛋白酶酶解物在4.1kDa左右显出了明显的条带，此结果表明碱 性蛋白酶效果较好，马骨髓蛋白通过碱性蛋白酶酶解可得到分子量较小的肽。
实施例四：马骨髓酶解肽SEM分析
用SEM观察骨髓蛋白及其酶解产物的表面结构形态，结果如附图9所示， 取适量干燥样品，用电子显微镜分析系统在加速电压20kV条件下检测，放大倍 数100-500×。用EDX检测蛋白样品的元素分布。结果表明，水提骨髓蛋白以球 状为主，酶解蛋白产物以片状结构为主表面均较光滑。由此可得出，不同的提取 方法将会影响骨髓蛋白的结构，导致不同的微观结构。
实施例五：马骨髓酶解肽FT-IR分析
马骨髓蛋白酶解物如附图10所示，取适量干燥样品，采用直接涂抹法，进 行红外光谱分析，扫描区间为4000-400cm-1，先采集空白背景后再采集样品，观 察红外谱峰情况。结果显示，五种样本的经典红外图谱，其特征吸收与其它胶原 蛋白的图谱相似。在3400cm-1附近的吸收峰对应于N-H的伸缩振动。2920cm-1 附近的吸收峰为C-N伸缩振动吸收峰。1640cm-1附近的强吸收峰是酰胺Ⅰ带特 征峰，由多肽骨架的C＝O伸缩振动产生；1540cm-1附近的吸收峰为酰胺II的 特征吸收，因N-H弯曲振动和C-N伸缩振动产生的。1380～1240cm-1处的峰为 马骨髓蛋白样品的酰胺III带吸收峰，该吸收峰因C-N伸缩振动和N-H变形振动 产生的。
实施例六：马骨髓酶解肽氨基酸序列的测定
氨基酸标准使用液的配制：准确量取0.40mL上述混合氨基酸标准溶液 (2.5μmol/mL)于10mL容量瓶中，加0.02moL/L稀盐酸稀释至刻度，混匀， 浓度为0.1μmol/mL。测定结果如附图11、附图12、附图13所示，结果可知， 检测出马骨髓酶解蛋白中含有16种氨基酸，除色氨酸外7种必需氨基酸(苏氨 酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸)和9种非必需氨 基酸(天门冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸和脯氨酸)。水、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶提取骨髓 蛋白的氨基酸含量也有一定的差异，分别为17.93、31.412、15.01、21.412、16.549 g/100g。与FAO/WHO必需氨基酸标准模式谱比较，5种蛋白产物的EAA/TAA 均在33.58％～63.03％，属于理想范围，其中胃蛋白酶的EAA/TAA最接近40％。 除了水、中性蛋白酶骨髓蛋白EAA/NEAA低于60％，其他均高于60％。5种 产物中味觉氨基酸和药用氨基酸的含量丰富，比例介于53.29％～64.06％，鲜味 氨基酸比例介于43.38～49.47％、甜味氨基酸介于20.61～21.27％、苦味氨基酸介 于22.03～25.28％、芳香氨基酸比例介于7.06～12.08％，其中中性蛋白酶解物鲜 味和甜味氨基酸含量均高于其他三种酶解产物，木瓜蛋白酶酶解物苦味氨基酸含 量较高，确定中性蛋白酶是马骨髓蛋白呈味物质的制备最佳酶种。马骨髓中还含有儿童生长发育所必需的组氨酸和精氨酸，同时组氨酸也能有效地促进铁的吸 收，防治贫血，而精氨酸能够有效地促进胶原蛋白的合成，促进伤口愈合，有助 于缓解骨质疏松。马骨髓中含量最高的为谷氨酸，谷氨酸作为一种鲜味氨基酸， 有效的增加了马骨髓的鲜美程度，而且谷氨酸能在人体内和血氨结合形成对机体 无害的谷氨酰胺，接触组织代谢过程中产生的氨毒害作用，并参与脑组织代谢， 活跃脑功能，马骨髓中含量较高的还有天冬氨酸，亮氨酸和赖氨酸，其中天冬氨 酸能够增强肝脏功能，缓解疲劳，亮氨酸能够促进睡眠，缓解情绪，赖氨酸有促 进人体发育、增强免疫的功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。说明骨髓蛋 白酶解液具有较高的营养价值，风味良好，可作为优质蛋白来源或特医食品与其它食品风味改良剂。
实施例七：马骨髓酶解肽CD分析
将一定量的马骨髓蛋白及其碱性蛋白酶酶解产物溶于50％2,2,2-三氟乙醇(TFE)溶液中，待完全溶解后，室温放置1h，注入到厚度1mm的石英皿中。 用圆二色谱仪对样品进行分析，各参数如下：波长扫面范围180-260nm，响应 时间2s，宽带1.0nm，扫描速度100nm/min，分辨率0.1nm，反复扫描3次， 绘制色谱图，结果如附图14所示。180～260nm紫外波段的CD图谱能够映射出 生物大分子(如蛋白质等)的主链结构特征，能反应出包括α-螺旋、β-折叠、 β-转角和无规则卷曲等二级结构的光谱叠加特性。从图可知，马骨髓蛋白在217 nm处有负峰并在195nm处有较小的正峰具有α-螺旋；而骨髓蛋白通过碱性蛋白 酶酶解之后，其酶解物具有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等二级结构的 光谱叠加特性。
实施例八：马骨髓酶解肽MALDI-TOF-MS分析
如附图14所示，配制乙腈/超纯水(1:1，0.1％TFA)作为溶剂待用，将CHCA 溶于上述溶剂，制成饱和溶液，离心，取上清液得到基质溶液。将标准混合多肽 和样品分别与基质溶液按1:1的比例混合均匀，取1μL点在MALDI靶板上， 于室温自然干燥后，将样品板放进离子源中进行测定，累计10次单次扫描信号 为最终质谱图，结果如附图15所示。马骨髓蛋白碱性蛋白酶酶解液组分分子量 最大的片段为12664Da，最强的片段为8447Da，此结果与SDS-PAGE结果基本 一致。
实施例九：马骨髓酶解肽抗氧化活性研究
1)DPPH·清除能力的测定
不同浓度的样品溶液各准确吸取1mL于具塞试管中分别加入1mL已配制 好的DPPH甲醇溶液(2mg/mL)，摇匀，置于37℃的恒温箱中恒温30min， 以蒸馏水为参比，并用酶标仪测量517nm处的吸光度。样品溶液空白组由1mL 的蒸馏水代替，1mLDPPH-甲醇溶液代替作为对照组，测量三次取平均值，以 VC为阳性对照。马骨髓样品对DPPH自由基的清除率计算公式如(1)：
Figure BDA0003370846880000161
上式中，A0为空白组吸光度；A1为样品组吸光度；A2为对照品组吸光度 测定结果如附图16所示。
2)ABTS+·清除能力的测定
将不同浓度的样品溶液在塞式试管中各准确吸收0.4mL，加入3.6mLABTS 自由基溶液。将溶液充分混合，避光放置6min，在734nm下测量吸光度。用1 mL蒸馏水代替样品溶液作为空白，取平均值三次，以VC作为阳性对照。样品 中ABTS自由基清除率的计算公式如(2)：
Figure BDA0003370846880000162
上式中，A0空白组吸光度；A1为样品组吸光度
测定结果如附图17所示。
3)·OH清除能力的测定
准确吸取不同浓度的样品溶液各1mL于具塞试管中，分别加入已1mL配 制好的FeSO4.7H2O溶液(6mmoL/L)和1mL水杨酸-乙醇溶液(6mmoL/L)， 混合均匀，加入1mL质量浓度为0.1％的过氧化氢溶液使反应启动，置于37℃ 的恒温箱中恒温30min，以蒸馏水为参照进行对比，在510nm处测量吸光度。 空白组用1mL水代替，测量三次取平均值，以VC为阳性对照。蛋白样品中对 羟基自由基的清除率计算公式如(1)。
测定结果如附图18所示
4)O2 －·清除能力的测定
1mL样品加入2mLTris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH＝8.2)混匀，25℃放 置15min，加入1mL领苯三酚-HCl溶液(6mmoL/L，用10mmoL/L稀盐酸配 制)25℃放置4min，加入0.1mL10moL/L浓盐酸终止反应，在320nm下测 量吸光度。以VC为阳性对照。空白组用1mL水代替，测量三次取平均值。蛋 白样品中对超氧离子自由基的清除率计算公式上式(1)。
测定结果如附图19所示
5)总还原能力的测定
不同浓度的样品溶液各准确吸取0.8mL于具塞试管中，分别加入0.4mL的 PBS溶液，再加入1％的铁氰化钾水溶液0.4mL，在50℃下放置20min，降温， 加入10％的三氯乙酸水溶液0.4mL，再加入蒸馏水1.6mL和0.4mL 0.1％的三氯 化铁水溶液，室温放置10min，700nm处测量吸光度。取三个测量值的平均值， 以VC作为阳性对照。
测定结果如附图20所示。
实施例十：小鼠预防骨质疏松症效果测定
3月龄未经产SPF级Wistar雌性大鼠，体重(200±15g)，将大鼠麻醉，依 次切开皮肤、皮下组织，腹膜，进入腹腔，拨开周围脂肪组织，将宫卵巢牵出， 在卵巢与子宫交界处结扎，摘除卵巢，检查止血是否完全，然后将子宫回腹腔中， 缝合腹膜，再缝合皮肤。假手术组仅暴露卵巢后，切除卵巢周围似卵巢大小的脂 肪组织，在卵巢与子宫角交界处不结扎，不切除卵巢，其余手术操作与摘除双侧 卵巢手术操作相同。术后注射3天IU/kg(体重)的青霉素预防感染。将去卵巢 手术组随机分为3组：去卵巢模型组(Ovariectomized,OVX)、阳性对照组和马 骨髓酶解肽治疗组每组10只，分笼喂养。自由摄食饮水，观察生存状态。术后 一周基本恢复，进行灌胃给药治疗，各组灌胃药物及相应剂量：①sham组(假 手术组)：同体积生理盐水；②OVX组：同体积生理盐水；③对照组Y；④HBMP 组：每天给予马骨髓酶解肽高、中、低剂量mg/kg。连续灌胃1月，每周称量体 重一次。进行马骨髓酶解肽对取卵大鼠的骨质疏松作用预实验。
表6：每组灌胃方案及灌胃剂量
方案 A组 B组 C组 D组 E组 F组
手术 假手术 取卵 取卵 取卵 取卵 取卵
灌胃方案 生理盐水 生理盐水 阳性 低 中 高
灌胃剂量 -- -- 0.00035g/100g 0.133g/mL 0.267g/mL 0.53g/mL
表7：每组大鼠在一个月之内体重变化
分组 HBMP-H HBMP-M HBMP-L Y OVX SHAM
造模第一天 215.22±2.52<sup>a</sup> 211.67±1.53<sup>a</sup> 206.00±3.61<sup>a</sup> 227.33±2.52<sup>a</sup> 201.00±6.56<sup>a</sup> 233.33±3.51<sup>a</sup>
给药一周 232.33±2.52<sup>b</sup> 222.67±2.52<sup>b</sup> 212.67±2.52<sup>b</sup> 245.67±2.52<sup>b</sup> 255.67±2.08<sup>b</sup> 246.00±2.65<sup>b</sup>
给药二周 244.67±2.52<sup>c</sup> 233.33±2.52<sup>c</sup> 216.33±2.52<sup>bc</sup> 247.67±1.53<sup>b</sup> 247.33±1.53<sup>c</sup> 236.67±2.08<sup>a</sup>
给药三周 269.33±1.53<sup>d</sup> 245.67±0.58<sup>d</sup> 221.33±0.58<sup>d</sup> 268.33±3.51<sup>c</sup> 252.67±2.08<sup>cd</sup> 242.33±2.08<sup>b</sup>
给药四周 280.00±2.65<sup>e</sup> 245.67±0.58<sup>d</sup> 218.33±1.53<sup>cd</sup> 280.33±0.58<sup>d</sup> 255.00±2.00<sup>de</sup> 257.33±2.52<sup>d</sup>
给药五周 284.33±3.06<sup>f</sup> 243.67±0.58<sup>d</sup> 216.33±1.53<sup>bc</sup> 280.33±0.58<sup>d</sup> 260.00±3.00<sup>e</sup> 251.33±1.53<sup>c</sup>
给药六周 294.33±2.08<sup>g</sup> 251.67±3.06<sup>e</sup> 219.67±1.53<sup>cd</sup> 287.33±2.52<sup>e</sup> 271.00±1.73<sup>f</sup> 254.33±3.06<sup>cd</sup>
表8：每组大鼠给药后对左侧股骨各部分(前,中,后)大小影响
分组 重(g) 长 前 中 后
HBMP-H 0.81±0.02<sup>c</sup> 37.67±0.58<sup>c</sup> 3.90±0.17<sup>b</sup> 3.50±0.10<sup>c</sup> 4.03±0.31<sup>b</sup>
HBMP-M 0.64±0.04<sup>c</sup> 34.67±0.76<sup>ab</sup> 3.47±0.15<sup>a</sup> 3.07±0.21ab 3.47±0.21<sup>a</sup>
HBMP-L 0.72±0.03<sup>b</sup> 34.27±0.29<sup>a</sup> 3.23±0.21<sup>a</sup> 2.77±0.15<sup>a</sup> 3.33±0.12<sup>a</sup>
Y 0.70±0.01<sup>b</sup> 34.87±0.15<sup>ab</sup> 4.63±0.12<sup>c</sup> 3.40±0.20<sup>bc</sup> 4.20±0.17<sup>b</sup>
OVX 0.74±0.04<sup>b</sup> 34.70±0.17<sup>ab</sup> 5.13±0.25<sup>d</sup> 2.93±0.31<sup>a</sup> 4.27±0.15<sup>b</sup>
SHAM 0.69±0.02<sup>ab</sup> 35.30±0.40<sup>b</sup> 4.47±0.06<sup>c</sup> 2.93±0.01<sup>a</sup> 3.67±0.06<sup>a</sup>
表9：每组大鼠给药后对左侧胫骨各部分(前,中,后)大小影响
Figure BDA0003370846880000181
表10：每组大鼠给药后对右侧骨骨各部分(前,中,后)大小影响
分组 重(g) 长 前 中 后
HBMP-H 0.71±0.01<sup>b</sup> 33.63±0.12<sup>a</sup> 4.70±0.17<sup>c</sup> 3.43±0.21<sup>b</sup> 3.80±0.10<sup>c</sup>
HBMP-M 0.68±0.02<sup>a</sup> 33.50±0.10<sup>a</sup> 3.30±0.17<sup>a</sup> 3.07±0.06<sup>a</sup> 3.57±0.06<sup>b</sup>
HBMP-L 0.71±0.01<sup>b</sup> 33.93±0.06<sup>b</sup> 3.53±0.06<sup>a</sup> 3.13±0.15<sup>a</sup> 3.33±0.06<sup>a</sup>
Y 0.73±0.01<sup>c</sup> 33.60±0.10<sup>a</sup> 5.13±0.21<sup>d</sup> 3.03±0.15<sup>a</sup> 4.33±0.15<sup>c</sup>
OVX 0.74±0.01<sup>c</sup> 34.17±0.06<sup>c</sup> 4.60±0.10<sup>c</sup> 3.10±0.10<sup>a</sup> 4.23±0.15<sup>c</sup>
SHAM 0.73±0.01<sup>c</sup> 34.33±0.06<sup>d</sup> 4.10±0.10<sup>b</sup> 2.97±0.15<sup>a</sup> 3.57±0.15<sup>b</sup>
表11：每组大鼠给药后对右侧胫骨各部分(前,中,后)大小影响
分组 重(g) 长 前 中 后
HBMP-H 0.72±0.02<sup>d</sup> 43.43±1.69<sup>c</sup> 3.93±0.06<sup>c</sup> 3.17±0.21<sup>b</sup> 2.60±0.10<sup>b</sup>
HBMP-M 0.64±0.01<sup>a</sup> 39.39±0.90<sup>b</sup> 3.57±0.15<sup>a</sup> 3.30±0.20<sup>b</sup> 2.37±0.06<sup>a</sup>
HBMP-L 0.62±0.01<sup>a</sup> 37.63±0.45<sup>a</sup> 3.53±0.12<sub>a</sub> 3.20±0.20<sup>b</sup> 2.47±0.12<sup>ab</sup>
Y 0.70±0.02<sup>c</sup> 37.53±0.31<sup>a</sup> 3.77±0.15<sup>bc</sup> 2.87±0.06<sup>a</sup> 2.53±0.06<sup>ab</sup>
OVX 0.67±0.01<sup>b</sup> 38.77±0.40<sup>ab</sup> 3.70±0.00<sup>ab</sup> 2.77±0.06<sup>a</sup> 3.07±0.12<sup>c</sup>
SHAM 0.62±0.02<sup>a</sup> 37.53±0.12<sup>a</sup> 3.83±0.06<sup>bc</sup> 2.73±0.15<sup>a</sup> 2.67±0.15<sup>b</sup>
表12：每组大鼠给药后对腰椎骨各部分大小影响
分组 重(g) 长 宽
HBMP-H 0.73±0.02<sup>c</sup> 42.33±1.53<sup>c</sup> 13.37±0.32<sup>c</sup>
HBMP-M 0.93±0.02<sup>d</sup> 18.87±0.35<sup>ab</sup> 12.53±0.15<sup>c</sup>
HBMP-L 0.63±0.02<sup>c</sup> 37.30±0.26<sup>c</sup> 13.53±0.12<sup>a</sup>
Y 0.98±0.01<sup>d</sup> 20.83±0.32<sup>ab</sup> 13.00±0.26<sup>c</sup>
OVX 0.27±0.02<sup>a</sup> 13.53±0.25<sup>a</sup> 6.40±0.30<sup>ab</sup>
SHAM 0.33±0.02<sup>b</sup> 18.43±0.25<sup>b</sup> 10.90±0.30<sup>b</sup>
如表7、表8、表9、表10、表11、表12测定结果所示，对骨质疏松大鼠 一般状态,体重及各股骨，腰椎骨的影响与假手术组比较，模型组、马骨髓酶解 肽高、中、低剂量组及阳性对照组大鼠皮毛欠光滑，其他一般状况如精神状态、 活动、饮食饮水、大小便均未见明显异常。与模型组比较，阳性对照组及马骨髓 酶解肽高、中、低剂量组精神状态、活动、饮食饮水、大小便均无差异。与假手 术组比较，模型组及给药组大鼠体重较假手术组略显升高，但是均无显著差异。
表13：每组大鼠给药后对脏器系数的影响
分组 G S P X SSX Z N
HBMP-H 3.11±0.08<sup>b</sup> 0.31±0.01<sup>a</sup> 0.23±0.02<sup>bc</sup> 0.47±0.03<sup>c</sup> 0.03±0.01<sup>a</sup> 0.02±0.01<sup>a</sup> 0.37±0.04<sup>a</sup>
HBMP-M 3.61±0.17<sup>c</sup> 0.39±0.01<sup>cd</sup> 0.29±0.02<sup>d</sup> 0.41±0.02<sup>b</sup> 0.05±0.01<sup>b</sup> 0.03±0.0<sup>b</sup> 0.73±0.05<sup>b</sup>
HBMP-L 3.42±0.13<sup>c</sup> 0.41±0.02<sup>d</sup> 0.19±0.01<sup>a</sup> 0.43±0.03<sup>b</sup> 0.03±0.00<sup>a</sup> 0.06±0.01<sup>a</sup> 0.87±0.03<sup>c</sup>
Y 2.96±0.14<sup>a</sup> 0.33±0.05<sup>ab</sup> 0.21±0.02<sup>ab</sup> 0.37±0.01<sup>a</sup> 0.03±0.01<sup>a</sup> 0.01±0.01<sup>a</sup> 0.74±0.12<sup>b</sup>
OVX 3.19±0.16<sup>b</sup> 0.33±0.22<sup>ab</sup> 0.28±0.62<sup>d</sup> 0.37±0.02<sup>a</sup> 0.03±0.01<sup>a</sup> 0.03±0.01<sup>a</sup> 0.72±0.06<sup>b</sup>
SHAM 2.81±0.07<sup>a</sup> 0.36±0.02<sup>bc</sup> 0.25±0.01<sup>c</sup> 0.41±0.01<sup>b</sup> 0.03±0.00<sup>a</sup> 0.05±0.00<sup>c</sup> 0.80±0.06<sup>c</sup>
注：G-肝脏,S-肾脏,P-脾脏,X-心脏,SSX-肾上腺,Z-子宫,N-脑
结果见表13，与假手术组比较，模型对照组大鼠的体重显著的增加，子宫 及脑系数显著降低，肝脏系数由增加趋势，但不明显。与模型对照组比较，马骨 髓酶解肽各剂量组均无明显差异。与模型对照组比较，马骨髓酶解肽各剂量组均 无明显的差异变化。
表14：马骨髓酶解肽对去卵巢大鼠(左侧股骨，腰椎骨)骨密度的影响
分组 左侧股骨 腰椎骨
HBMP-H 1.7285±0.0010<sup>ab</sup> 1.6480±0.0020<sup>b</sup>
HBMP-M 1.7255±0.0028<sup>a</sup> 1.7275±0.0024<sup>d</sup>
HBMP-L 1.7473±0.0039<sup>d</sup> 1.7250±0.0047<sup>d</sup>
Y 1.7321±0.0018<sup>bc</sup> 1.6555±0.0048<sup>c</sup>
OVX 1.7426±0.0002<sup>d</sup> 1.6567±0.0013<sup>c</sup>
SHAM 1.7352±0.0044<sup>c</sup> 1.6247±0.0042<sup>a</sup>
目前骨质疏松非损伤性诊断的主要定量指标是骨密度(BMD)。由表9， 附图21、附图22、附图23测定结果可见，OVX大鼠股骨密度显著低于SHAM(假 手术组)，证明大鼠去卵巢后股骨密度具有降低趋势，去卵巢大鼠骨质疏松模型 建立成功。马骨髓酶解肽各剂量组及Y组大鼠股骨密度略高于OVX(除 HBMP-M)，但均略低于SHAM，其中HBMP-H股骨密度略高于HBMP-M和 HBMP-L，表明马骨髓酶解肽可以抑制去卵巢大鼠股骨密度的降低。
表15：马骨髓酶解肽对去卵巢大鼠矿物质(Ca、Mg、P、TP)含量的影响
分组 Ca浓度(mmol/L) Mg浓度(mmol/L) P浓度(mmoL/L) TP(g/L)
HBMP-H 2.90±0.13<sup>c</sup> 1.15±0.05<sup>d</sup> 2.07±0.05<sup>c</sup> 50.46±0.27
HBMP-M 2.64±0.01<sup>b</sup> 1.01±0.01<sup>c</sup> 1.81±0.04<sup>ab</sup> 51.71±0.11<sup>c</sup>
HBMP-L 2.52±0.01<sup>a</sup> 0.74±0.02<sup>a</sup> 1.81±0.05<sup>ab</sup> 50.57±0.07<sup>b</sup>
Y 2.58±0.01<sup>ab</sup> 0.85±0.02<sup>b</sup> 1.84±0.08<sup>b</sup> 50.32±0.21<sup>ab</sup>
OVX 2.52±0.01<sup>a</sup> 0.74±0.01<sup>a</sup> 1.79±0.01<sup>ab</sup> 49.01±0.02<sup>a</sup>
SHAM 2.54±0.00<sup>ab</sup> 0.99±0.01<sup>c</sup> 1.74±0.02<sup>a</sup> 51.59±0.08<sup>c</sup>
由表15、附图24测定结果可以看出，与空白组比较，模型组血清Mg均有 显著下降，血清P、Ca(除了高剂量组)有升高的趋势，说明造模成功。与模型组 比，马骨髓酶解肽各组及阳性对照组均可显著升高血Ca、Mg、降低血P水平； 而马骨髓酶解肽各剂量组与阳性对照组大鼠骨矿物质含量略高于OVX组，因 此马骨髓酶解肽可以有效抑制去卵巢大鼠骨矿物质的流失。
表16：马骨髓酶解肽对去卵巢大鼠血清(SOD、MDA、GSH-PX、CAT、肌酐) 体内抗氧化活性的影响
Figure BDA0003370846880000201
由表16、附图25测定结果可知，OVX组大鼠血清中的SOD和CAT含量均 显著高于SHAM组；MDA、GSH-PX、肌酐均高于SHAM组，但是无明显的差 异，说明造模成功。马骨髓酶解肽与阳性对照组大鼠血清中的SOD和CAT含量 均显著低于OVX组且HBMP-L组与SHAM组差异不明显。因此马骨髓酶解肽 可以有效降低去卵巢大鼠血清中SOD和CAT含量。具有较好的体内抗氧化活性。
由表17测定结果可知，OVX组BUN和UA量显著低于SHAM组，马骨髓 酶解肽各剂量组与阳性对照组大鼠血清中的BUN和UA含量显著高于OVX组， 马骨髓酶解肽各剂量组中HBMP-H组的BUN和UA含量最高，说明造模成功。 马骨髓酶解肽可以有效抑制肾功能的衰竭。
表17：马骨髓酶解肽对去卵巢大鼠(BUN、UA)等肾功能的的影响
分组 BUN(mg/dL) UA(Umol/L)
HBMP-H 19.79±0.20<sup>b</sup> 93.57±0.60<sup>b</sup>
HBMP-M 22.22±0.57<sup>d</sup> 115.41±0.46<sup>d</sup>
HBMP-L 19.84±0.16<sup>b</sup> 90.97±0.13<sup>a</sup>
Y 20.37±0.04<sup>c</sup> 97.55±0.40<sup>c</sup>
OVX 18.22±0.11<sup>a</sup> 90.51±0.23<sup>a</sup>
SHAM 19.50±0.17<sup>b</sup> 91.78±2.97<sup>ab</sup>
本发明涉及的马骨髓酶解肽体外抗氧化活性分析表明当浓度为2mg/mL时， 其清除DPPH·、·OH、O2 －·及ABTS自由基的半抑制浓度(IC50)分别为0.097、 0.62、0.45、0.0414mg/mL。因此该酶解蛋白可以当成一个潜在的抗氧化剂，在 食品、医药及保健品领域有广阔的应用前景；本研究可为马骨髓酶解肽在抗氧化 和抗骨质疏松功能性食品中的应用开发提供参考。
如上所述，即可较好地实现本试验，上述的实施例仅仅是对本试验的优选实 施方式进行描述，并非对本试验的范围进行限定，在不脱离本试验设计精神的前 提下，本领域普通技术人员对本试验的技术方案作出的各种变形和改进，均应落 入本试验确定的保护范围内。

Claims (7)

1.马骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，所述的用途，用于缓解绝经后骨质疏松症的发生。
2.根据权利要求1所述的骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，所述改善选自如下症状中的一项或多项：预防骨质疏松症、促进骨生长。
3.根据权利要求1所述的骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，所述改善选自如下指标中的一项或多项：股骨密度、腰椎骨、股骨骨小梁数目、骨小梁三维网状结构、骨骼强度。
4.如权利要求1所述的骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，所述的马骨髓酶解肽用量为0.133g/mL-0.53g/mL。
5.如权利要求1所述的骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，所述的马骨髓酶解肽用量为0.53g/mL。
6.根据权利要求1中所述的骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，通过选自如下的方式向受试者提供马骨髓酶解肽：静脉内、直肠内、鼻腔内、肺部内、眼部、肌肉组织、皮肤组织或口服。
7.根据权利要求1中所述的骨髓酶解肽在制备预防骨质疏松制剂中的用途，其特征在于，所述马骨髓酶解肽还可与载体联用，可接受的载体选自：稀释剂、缓冲液、赋形剂、防腐剂、抑菌剂、抗氧化剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、稳定剂、矫味剂中的一种或几种。
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