CN114437954A - 一种降解磺化钻井液的弯曲芽孢杆菌、混合菌及其应用 - Google Patents

一种降解磺化钻井液的弯曲芽孢杆菌、混合菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种降解磺化钻井液的弯曲芽孢杆菌、混合菌及其应用，本发明的降解磺化钻井液的弯曲芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M 2018812，混合菌包括该弯曲芽孢杆菌，还包括赫氏埃希氏菌、变形假单胞菌、恶臭假单胞菌和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌中的一种或多种。CCTCC NO：M 2018812及混合菌对于聚磺钻井液污染物具有良好的降解能力，能以聚磺钻井液作为唯一碳源，具有广泛的温度、pH和盐浓度适应能力，在消除磺化钻井液污染方面具有良好的应用前景。

Description

一种降解磺化钻井液的弯曲芽孢杆菌、混合菌及其应用
技术领域
本发明是关于一种降解聚磺钻井液的混合菌及其应用，属微生物降解聚磺钻井液污染物技术领域。
背景技术
油气开发过程产生的钻井废水是石油有关行业难处理的工业废水之一。当今为实现优质快速钻井，深井钻井工程常采用复杂的聚磺类钻井液体系，该体系包含磺化褐煤、磺化酚醛树脂、磺化沥青以及耐温抗盐类等组成的混合物，但该体系水溶性有机物含量高，降解难度大，如果不经处理或者处理的程度不够就直接进行排放，会对土壤和生态环境造成一系列的危害，给污染地区的生态、作物以及人类健康带来负面影响。
传统的物理化学处理方法常常需要建设固定的处理设施，投加化学药剂，在处理运行过程中还需要温度、压力、电力供应等条件，处理成本高，同时还会造成二次污染。中国很多油田以往对井场废弃泥浆、落地原油、油泥等污染源的处理主要是采取风干、挖坑掩埋的方法或是将这些废弃物堆放在以防渗布为衬的泥池中，这些方法都很难使污染物从环境中降解除去，而且物理和化学方法费用较高。
微生物修复工艺与物理、化学方法相比，因投资成本低和无二次污染等特点，已成当今生态环境保护领域最具有价值和最具生命力的污染治理首选工程技术。但是，钻井泥浆成分复杂，单独使用一种或两种微生物不能对钻井泥浆中的化学需氧量COD含量达到良好的修复效果。因此，筛选出对磺化钻井液降解效果好的混合菌群是解决磺化钻井液污染土壤的有效途径。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种适于修复磺化钻井液污染土壤的微生物。
一方面，本发明提供了一株对磺化钻井液降解效果好、且与磺化钻井液污染土壤中其他菌配伍好的微生物，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No.1所示，通过16S rRNA基因序列比对分析，与弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus 16S rRNA基因序列的同源性最高，相似性为99％，因此，本发明中将所提供的上述对磺化钻井液降解效果好的菌株定义为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，本发明中亦将其命名为H8，该菌株已于2018年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018812，分类命名为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。
本发明的弯曲芽孢杆菌CCTCC NO：M 2018812，能以磺化钻井液为唯一碳源的无机盐培养基上生长，弯曲芽孢杆菌CCTCC NO：M 2018812的适宜生长条件为：pH为7.5-10，盐浓度为3％-7％，温度25-45℃。
本发明的弯曲芽孢杆菌H8，能够降解磺化钻井液，可应用于磺化钻井液污染土壤的生物修复。在本发明的一些具体实施方案中，该菌株在pH9.5、盐浓度4.5％、转速150r/min、温度35℃、接种量10％、N源蛋白胨、P源K2HPO4的条件下培养7天后对磺化钻井液化学需氧量(COD)的降解率达到22.9％。
另一方面，本发明还提供了一种混合菌，其包括弯曲芽孢杆菌CCTCC NO：M2018812，还进一步包括赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌(Atlantibacter hermannii)。
本发明的混合菌中，弯曲芽孢杆菌CCTCC NO：M 2018812与赫氏埃希氏菌、变形假单胞菌、恶臭假单胞菌和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌的配伍性良好。
根据本发明的具体实施方案，本发明的混合菌中，赫氏埃希氏菌、变形假单胞菌、恶臭假单胞菌、赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌在混合菌中的量，以活菌数计，与其中弯曲芽孢杆菌的比例各自独立地为(1～4):(4～1)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的混合菌中，优选包括弯曲芽孢杆菌，还包括变形假单胞菌、恶臭假单胞菌和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌。
根据本发明的具体实施方案，本发明的混合菌中，变形假单胞菌与弯曲芽孢杆菌的比例为25～35：30～40。
根据本发明的具体实施方案，本发明的混合菌中，恶臭假单胞菌与弯曲芽孢杆菌的比例为15～25：30～40。
根据本发明的具体实施方案，本发明的混合菌中，赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌与弯曲芽孢杆菌的比例为20～30：30～40。
在本发明的一些具体实施方案，本发明的混合菌由弯曲芽孢杆菌，还包括变形假单胞菌、恶臭假单胞菌和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌四种菌组成。所述的四种菌的混合比例(活菌数之比)为变形假单胞菌:恶臭假单胞菌:赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌:弯曲芽孢杆菌＝(2.5～3.5):(1.5～2.5):(2～3):(3～4)。更优选地，变形假单胞菌:恶臭假单胞菌:赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌:弯曲芽孢杆菌＝3:2:2.5:3.5。
本发明的混合菌，能在以聚磺钻井液为唯一碳源的无机盐培养基上生长，混合菌群的适宜生长条件为：pH 8.5～9.5，盐浓度4.5％～5.5％，温度25-45℃。
另一方面，本发明还提供了一种菌制剂，其包含：本发明所述的弯曲芽孢杆菌，或所述的混合菌。所述菌制剂可以为液态菌制剂，也可以为固态菌制剂。
根据本发明的具体实施方案，本发明还提供了按照以下方法制备得到所述菌制剂的方法：
将本发明所述的弯曲芽孢杆菌或所述的混合菌的种子液，接入培养基，总接种量为8～15％，培养温度为25-45℃，培养1d～3d，所得培养产物制备液态和/或固体菌剂。
根据本发明的具体实施方案，各菌种子液的制备可以参照现有技术的常规操作进行。本发明中，优选将各菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上活化后，接入牛肉膏液体培养基，在30～40℃、80～300r/min摇床中培养16～48h后，6000r/min离心5min，除去上清液，重复两次，然后将菌体调制OD420＝1作为种子液。
根据本发明的具体实施方案，在制备菌制剂时，混合菌培养过程中，培养系统的pH8.5～9.5、盐浓度4.5％～5.5％、转速80～300r/min。优选地，培养体系中的N源为蛋白胨，P源为K2HPO4。
根据本发明的具体实施方案，在制备菌制剂时，混合菌的种子液接入的培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，也可以是营养辅料培养基。在本发明的一些具体实施方案中，所述的营养辅料培养基为锯末、麸皮、豆粕按照锯末：麸皮：豆粕＝1～2:1～2:1～2的质量比混合灭菌制备而成。
另一方面，本发明还提供了所述的弯曲芽孢杆菌、所述的混合菌或所述的菌制剂在降解磺化钻井液中的应用。
另一方面，本发明还提供了所述的弯曲芽孢杆菌、所述的混合菌或所述的菌制剂在改善磺化钻井液泥浆和/或污染土壤中的应用。
根据本发明的具体实施方案，上述降解磺化钻井液或改善磺化钻井液泥浆和/或污染土壤的应用中，将所述的弯曲芽孢杆菌、所述的混合菌或所述的菌制剂与待降解的磺化钻井液或磺化钻井液污染的土壤混合，使菌在混合体系中培养生长，从而降解磺化钻井液。
根据本发明的具体实施方案，上述降解磺化钻井液或改善磺化钻井液泥浆和/或污染土壤的应用中，混合体系中还含有N源和P源；优选地，所述N源为蛋白胨，P源为K2HPO4。
根据本发明的具体实施方案，上述降解磺化钻井液或改善磺化钻井液泥浆和/或污染土壤的应用中，所述培养条件为：pH为7.5-10，盐浓度为3％-7％，温度25-45℃。
另一方面，本发明还提供了一种磺化钻井废液泥浆制品，其是按照以下方法制备得到的：
将本发明所述的弯曲芽孢杆菌、所述的混合菌或所述的菌制剂与磺化钻井废液泥浆混合，使菌在混合体系中培养生长从而降解磺化钻井液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的磺化钻井废液泥浆制品在制备时，优选地，混合体系中还添加包括无机盐类的营养物质。所述根据本发明的具体实施方案，磺化钻井废液泥浆制品在制备时，所添加的无机盐类营养物质为无机盐培养基(g/L)：2～4gNaNO3，0.5～1.5gK2HPO4，0.3～1gKCl，0.3～1gMgSO4·7H2O，0.001～0.003g CaCl2，0.0008～0.002g FeSO4，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。
根据本发明的具体实施方案，本发明的磺化钻井废液泥浆制品在制备时，所述的菌制剂以占泥浆总重量0.1～2％的重量添加到泥浆中。
根据本发明的具体实施方案，本发明的磺化钻井废液泥浆制品在制备时，所述的包括无机盐类的营养物质以占泥浆总重量0.1～2％的重量添加到泥浆中。
另一方面，本发明还提供了所述的磺化钻井废液泥浆制品在促进植物生长中的应用。根据本发明的具体实施方案，所述的磺化钻井废液泥浆制品可以按照1～2:1～2的比例与普通土壤掺混后培育植物。在本发明的一些具体实施方案中，本发明研究了所述的磺化钻井废液泥浆制品在促进小麦生长中的应用，发现所述的磺化钻井废液泥浆有利于促进小麦的侧生根生长及成活率。
综上所述，本发明提供了一种弯曲芽孢杆菌CCTCC NO：M 2018812及混合菌，其对聚磺钻井液污染物具有良好的降解能力，能够以聚磺钻井液作为唯一碳源，具有广泛的温度、pH和盐浓度适应能力，能显著降低聚磺钻井液中COD的含量，同时，微生物修复后的钻井泥浆与土壤适当的混合比例是适合作物生长需求的，而且添加微生物和营养物质共同修复的泥浆会产生促进种子生长的物质。此外，微生物修复后的钻井泥浆与土壤混合后小麦的侧生根及成活率比普通土壤好，侧生根可为植物生殖生长和开花结果提供充足的养分，其生长和发育受植物内部遗传因素和外部环境矿物质营养的影响，表明钻井泥浆被微生物降解后产生许多利于植物生长的营养物质。因此，该混合菌群在消除聚磺钻井液污染方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为基于16S rRNA的弯曲芽孢杆菌CCTCC NO：M 2018812的进化树。
图2为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆温度的变化图。
图3为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆水分的变化图。
图4为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆碱解氮的变化图。
图5为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆速效磷的变化图。
图6为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆有机质的变化图。
图7为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆pH的变化图。
图8为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中废液泥浆COD的变化图。
图9为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中第一组试验14kg聚磺钻井废液泥浆处理60d后脱水情况对照。
图10为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中第二组试验14kg聚磺钻井废液泥浆处理60d后脱水情况对照。
图11为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中第三组试验14kg聚磺钻井废液泥浆处理60d后脱水情况对照。
图12为聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验中第四组试验14kg聚磺钻井废液泥浆处理60d后脱水情况对照。
图13为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中对照自然修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦生长情况。图中，JH-1-0：纯泥浆；JH-1-1：泥浆和土壤各1份；JH-1-2：泥浆1份，土壤2份；JH-1-4：泥浆1份，土壤4份；JH-1-6：泥浆1份，土壤6份；JH-1-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-1：纯土壤，对照。
图14为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中添加营养物质修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦生长情况。图中，JH-2-0：纯泥浆；JH-2-1：泥浆和土壤各1份；JH-2-2：泥浆1份，土壤2份；JH-2-4：泥浆1份，土壤4份；JH-2-6：泥浆1份，土壤6份；JH-2-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-2：纯土壤，对照。
图15为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中添加高效混合菌剂修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦生长情况。图中，JH-3-0：纯泥浆；JH-3-1：泥浆和土壤各1份；JH-3-2：泥浆1份，土壤2份；JH-3-4：泥浆1份，土壤4份；JH-3-6：泥浆1份，土壤6份；JH-3-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-3：纯土壤，对照。
图16为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中添加营养物质和高效混合菌剂修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦生长情况。图中，JH-4-0：纯泥浆；JH-4-1：泥浆和土壤各1份；JH-4-2：泥浆1份，土壤2份；JH-4-4：泥浆1份，土壤4份；JH-4-6：泥浆1份，土壤6份；JH-4-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-4：纯土壤，对照。
图17为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中对照自然修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦根部生长情况。图中，JH-1-1：泥浆和土壤各1份；JH-1-2：泥浆1份，土壤2份；JH-1-4：泥浆1份，土壤4份；JH-1-6：泥浆1份，土壤6份；JH-1-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-1：纯土壤，对照。
图18为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中添加营养物质修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦根部生长情况。图中，JH-2-1：泥浆和土壤各1份；JH-2-2：泥浆1份，土壤2份；JH-2-4：泥浆1份，土壤4份；JH-2-6：泥浆1份，土壤6份；JH-2-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-2：纯土壤，对照。
图19为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中添加高效混合菌剂修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦根部生长情况。图中，JH-3-1：泥浆和土壤各1份；JH-3-2：泥浆1份，土壤2份；JH-3-4：泥浆1份，土壤4份；JH-3-6：泥浆1份，土壤6份；JH-3-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-3：纯土壤，对照。
图20为修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响实验中添加营养物质和高效混合菌剂修复60d泥浆与土壤不同比例混合小麦根部生长情况。图中，JH-4-1：泥浆和土壤各1份；JH-4-2：泥浆1份，土壤2份；JH-4-4：泥浆1份，土壤4份；JH-4-6：泥浆1份，土壤6份；JH-4-8：泥浆1份，土壤8份；JH-0-4：纯土壤，对照。
用于专利程序的微生物保存：
本发明的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)H8：
保藏日期：2018年11月22日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学
保藏编号：CCTCC NO：M 2018812；
分类命名：弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。实施例中未详细注明的方法，按照所属领域中的常规操作进行。
实施例1
本发明通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时检测菌株各项性能，具体内容如下：
1材料与方法
1.1磺化钻井液污染样品的采集
钻井废弃物样品取自新疆克拉玛依石油场地，取回的样品放置于实验室4℃冰箱保存。
磺化钻井液：褐煤树脂(SPNH 2％)、磺甲基酚醛树脂(SMP 2％)、复合离子大分子聚合物(FA-367 0.5％)，由重庆大方提供。
1.2培养基
无机盐培养基(g/L)：3gNaNO3，1gK2HPO4，0.5gKCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.002gCaCl2，0.001g FeSO4，蒸馏水1L，pH7.0-7.2。
磺化钻井液富集驯化液体培养基(g/L)：无机盐培养基，钻井液的浓度按0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％(质量比)递增。
磺化钻井液固体筛选培养基(g/L)：无机盐培养基，0.2％的磺化钻井液，1.8％琼脂。
磺化钻井液液体培养基(聚磺钻井混合液HH液体培养基)(g/L)：无机盐培养基(3gNaNO3，1g K2HPO4，0.5g KCl，0.5g MgSO4·7H2O，0.002g CaCl2，0.001g FeSO4)+0.2％HH母液(2％磺甲基酚醛树脂(SMP-2)+2％褐煤树脂(SPNH)+0.5％两性离子聚合物(FA-367))，加蒸馏水至1L，pH 7.0～7.2。
牛肉膏蛋白胨液体富集培养基(g/L)：10g蛋白胨、5g牛肉膏、5g NaCl、蒸馏水1L，pH7.0-7.2。
牛肉膏蛋白胨固体培养基(g/L)：牛肉膏蛋白胨液体富集培养基，1.8％琼脂。
1.3磺化钻井液降解菌的分离筛选和形态观察
磺化钻井液降解菌的分离筛选步骤如下：
(1)原始混合菌的逐级驯化：筛选分离前称取10g样品，加入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，35℃150r/min摇床振荡30min后，静置5min，取上清液作为菌源。取20mL样品菌液加入到80mL0.1％磺化钻井液富集驯化液体培养基，温度设为35℃，转速为150r/min，恒温培养7d，此为一个周期。摇瓶振荡培养7天后，取10mL培养液，再加入到新鲜的0.5％磺化钻井液富集驯化液体培养基中培养7天，后期磺化钻井液浓度按1％、1.5％、2％递增，连续富集驯化5个周期，获得驯化混合菌群液。将驯化液进行离心(8000r/min)去上清液，用生理盐水进行冲洗，再次离心(8000r/min)去上清液，然后加入生理盐水，配制成菌液，放置于冰箱保存备用。
(2)菌株的分离纯化：将菌液稀释到适当的浓度，取0.2mL菌液涂布于磺化钻井液固体筛选培养基中，置于恒温培养箱，35℃培养3天，根据菌落的大小、形状、透明度、颜色、隆起程度、边缘特征等特征，对各个平板中生长出的单个菌落进行初步筛选。
(3)菌株的纯化：将形态不同的菌落，进行划线分离纯化，直至无杂菌生长。将所得的单菌株接到牛肉膏蛋白胨固体斜面上，35℃培养2天，采用20％甘油冻管法保存于-80℃的冰箱中，以上实验均在无菌条件下进行。
本实施例中，按照上述方法，筛选得到得到多株菌，其中1株自命名为H8。
1.4菌株的形态和生理鉴定
1.4.1使用正置显微镜观察对分离菌株进行形态观察
观察菌株形态前，先进行革兰氏染色：(1)涂片：取灭菌1.5mL离心管(管中装有1mL左右无菌水)，用灭菌竹签挑取少量菌体放入离心管，用1mL移液枪反复吹打，使菌体混合均匀，取洁净载玻片，用10μL移液枪吸取6μL放在载玻片上，用接种环制成涂面；(2)晾干：将涂片放入37℃培养箱，让其烘干。(3)固定：手执载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定；(4)结晶紫染色：将固定的涂片放在废弃缸的搁架上，加适量(以盖满菌体为宜)结晶紫染色1min；(5)水洗：倒去染色液，用水轻轻冲洗；(6)媒染：滴加卢哥式染液，媒染1min；(7)脱色：将载玻片倾斜，连续点滴95％乙醇脱色20-30s；(8)复染：滴加番红复染2-3min；(9)水洗：用水轻轻冲洗番红染色液；(10)晾干：将涂片放入37℃培养箱，让其烘干；(11)镜检：镜检时先用低倍镜观察，再用高倍镜，最后用油镜观察。
1.4.2菌株的分子生物学鉴定
(1)DNA的提取
将接种于牛肉膏固体培养基平板的菌株在35℃下培养2天，用无菌牙签挑取少量菌体，置于1.5mL离心管中，加入30μL去离子水，震荡使菌体分散，盖紧离心管并用封口膜密封，置于微波炉中中火加热2min，加热后立即将离心管冰浴2min，然后12000r/min，离心1min，吸上清液置于-20℃备用。
(2)PCR扩增
以提取待鉴定微生物的H8菌DNA为模板，通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID No.2)和1492R：5’-GGTTACCTTGTTACTT-3’(SEQ IDNo.3))扩增16S rRNA基因，PCR反应体系为(50μL)：2×Taq PCR Master Mix 25μL，引物27F/1492R(10μmoL)各2μL，模板DNA 3μL，ddH20 18μL。PCR反应程序为：94℃4min；94℃1min，55℃1min，72℃90S，30个循环，72℃10min。
(3)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测
操作步骤如下：
(1)配制琼脂糖凝胶：称取0.25g琼脂糖加入25mL TAE(1×)，放在微波炉上煮沸，使琼脂糖充分熔化。
(2)倒胶：将煮沸的琼脂糖液体放置冷却至45℃左右时，加入2μLGeneGreen核酸染料，摇匀后，倒入制胶板中。
(3)点样：将8μL H8菌株扩增产物点入胶孔。
(4)PCR产物测序：PCR产物经电泳检测后，委托武汉生工测序公司对H8菌株产物进行测序。利用NCBI网站将H8菌株的16S rRNA的序列与GenBank数据库中己知的序列进行比较，分析H8菌株的16S rRNA基因序列测序结果，并通过MEGA 5.0构建H8菌株系统发育树。
1.5菌株H8最适降解条件
将活化后的菌株H8接种于装有50mL，含磺化钻井液液体培养基的100mL锥形瓶中，采用单因素试验，在其他条件因素相同的情况下，分别改变pH、盐浓度、转速、温度、接种量、N源、P源进行培养，培养7d，每组实验3个平行。单因素实验采用菌落计数法测定培养基中生物量来反应降解菌利用磺化钻井液液体培养基的强弱程度。正交实验采用重铬酸钾法测定磺化钻井液液体培养基COD含量，计算降解率η(％)：
η＝(A0-A1)/A0×100％
η：磺化钻井液液体培养基COD降解率；A0：空白组磺化钻井液液体培养基COD含量mg/L；A1：添加降解菌磺化钻井液液体培养基COD含量mg/L。
pH、盐浓度、转速、温度、接种量、N源和P源实验分别设定以下梯度：
(1)pH：7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12；
(2)盐浓度：3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％；
(3)转速：90、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min、240r/min；
(4)温度：25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃；
(5)接种量：2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％；
(6)氮源：NaNO3、(NH4)2NO3、NH4Cl、蛋白胨、牛肉膏；
(7)磷源：K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4。
单因素实验结果表明，当pH 9.5，盐浓度4％，转速150r/min，温度为35℃、接种量10％、N源蛋白胨、P源K2HPO4时降解菌利用磺化钻井液液体培养基的程度最好。
k:代表极差，即每个因素下对应水平的实验结果的和，k1在pH这一列中代表9.3实验结果总和的平均值，在盐浓度这一列中代表盐浓度3.5实验结果总和的平均值，在转速这一列中代表120r/min实验结果的总和，在温度这一列代表32℃实验结果总和的平均值，极差越大，说明该因素对所在水平的实验结果影响越大。
R：代表方差，即每个因素下k的最大值减去最小值，R值越大，则对应列的因素对实验结果影响越大。
2结果与讨论
2.1菌株H8的分离和形态
本发明的菌株H8的菌落特征和生理生化特征为：呈弯曲状(图1)，菌体宽0.3-0.8um，长1.0-4.2um，革兰氏阳性，菌落米黄色不透明，边缘光滑，湿润且扁平，过氧化氢酶、明胶液化试验、氧化酶、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验阳性，MR甲基红、V.P试验、吲哚产生试验、产硫化氢、苯丙氨酸脱氢酶阴性。
2.2菌株H8的16s rRNA基因序列长度为1454bp，将得到的基因序列与GenBank数据库中的序列进行比较，获得序列的同源信息见表1。
表1菌株的BLAST比对结果
Figure BDA0002758157520000111
经鉴定，该菌株H8属于弯曲芽孢杆菌属(Bacillus flexus)，与菌株Bacillusflexus strain IMAUB1007相似性最高，相似度为99％。
本发明所筛选到的H8菌株已于2018年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2018812，分类命名为弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。
2.3菌株H8的最适降解条件
通过单因素的初步探究结果表明：当pH9.5，盐浓度4％，转速150r/min，温度为35℃、接种量10％、N源蛋白胨、P源K2HPO4时微生物量最大，说明降解菌对磺化钻井液的利用程度最好。通过进一步的正交试验结果表明：该菌株在pH9.5、盐浓度4.5％、转速150r/min、温度35℃，接种量10％、N源蛋白胨、P源K2HPO4条件下，对磺化钻井液化学需氧量(COD)的降解率最好。
实施例2
本实施例中所用菌株：实施例筛选获得的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)H8(即保藏编号CCTCC NO：M 2018812的菌株)；
赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)M4，变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)P7，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F9，赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌(Atlantibacter hermannii)H2。这些菌株均由长江大学生命科学学院微生物学实验室提供。这些菌株的原始来源均来自于新疆克拉玛依石油场地磺化钻井液污染土壤，按照传统方法筛选获得，且经分析鉴定，这些菌种属于新疆克拉玛依石油场地钻井废弃物中的常见菌种，从不同时间和地点采集的多个样品中均可重复筛选获得。各菌株的形态和鉴定结果如下：
聚磺钻井液各成分降解菌镜检结果：
M4镜检呈革兰氏阳性，短杆状，细胞宽0.1-0.3μm，长0.2-1.0μm；P7镜检呈革兰氏阴性，杆状，细胞宽0.1-0.3μm，长0.5-1.4μm；F9镜检呈革兰氏阴性，杆状，细胞宽0.1-0.3μm，长0.5-1.2μm；H2镜检呈革兰氏阳性，杆状，细胞宽0.1-0.3μm，长0.3-1.1μm；菌株16srRNA基因测序及BLAST比对分析结果见表2：
表2菌株的基因片段大小BLAST比对结果
Figure BDA0002758157520000121
经单因素和正交试验，各菌株单菌的最适降解条件见表3。
表3菌株最适降解条件
Figure BDA0002758157520000122
注：HH：为聚磺钻井混合液(HH)，其成分为2％SMP-2+2％SPNH+0.5％FA-367三者混合物。
经初步分析，菌株M4、P7、F9、H2，与各自所属菌种中常见其他菌在降解磺化钻井液COD能力方面无显著差异。
1、混合菌群降解钻井液COD
1.1混合菌培养方法与降解钻井液COD测定方法
培养的方法：将菌株M4、P7、F9、H2或H8分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上活化后，接入牛肉膏液体培养基，在35℃、150r/min摇床中培养24h后，6000r/min离心5min，除去上清液，重复两次，然后将菌体调制OD420＝1作为种子液。各菌株种子液中活菌数浓度数量级相同。将单一菌株种子液按比例混合得到混合菌液(下述各实验中，除明确各菌株种子液的混合比例外，各菌株种子液是按照等比例混合)。
培养条件：各实验中，除明确注明外，混合菌的培养条件：pH 9、盐浓度5％、温度35℃，转速150r/min，N源蛋白胨，P源K2HPO4。
钻井液COD降解效果的测定方法：采用DR1010 COD仪器测定聚磺钻井混合液COD降解率。将菌株培养基液体放入50mL离心管6000r/min离心5min，留取离心管中的上清液并用定量滤纸过滤，再将待检测液稀释10倍混匀，然后用移液管吸取2mL样品加入消解管中，轻轻上下颠倒几次使其混合均匀，采用同样的方法用等量去离子水作为空白，以未接种的磺化钻井液液体培养基为对照，两次重复。再将消解管插入预先加热的DR1010仪器中，关上仪器盖子待其反应2h。反应完成后待消解管冷却至120℃以下，取出消解管并轻轻晃动几次，待消解管冷却至室温后，将空白消解管插入DR1010 COD测定仪中归零，再插入其他待测定的消解管读取数据，读取数值。
C＝(D0-Dx)/D0×100％
式中：
C为COD降解率，％；
D0为对照组磺化钻井液液体培养基中COD的浓度，mg/L；
Dx为接菌组磺化钻井液液体培养基中COD的浓度，mg/L。
1.2混合不同菌对钻井液COD的降解
将弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)H8(即保藏编号CCTCC NO：M 2018812的菌株)、赫氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)M4、变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)P7、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F9、赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌(Atlantibacter hermannii)H2按照两株菌组合、三株菌组合、四株菌组合、五株菌组合进行搭配分组，接入等量的单一菌株种子液组成的混合菌液，总接种量为10％，将混合菌液接入前述磺化钻井液液体培养基，然后摇瓶恒温振荡培养器中振荡培养7d后测定磺化钻井液液体培养基COD含量。混合菌的组建见表4。
表4不同组合各菌株的接种量(mL)
Figure BDA0002758157520000141
通过混菌的组建实验研究，发现组合菌群P7、F9、H2和H8的组合对钻井液COD的降解效果优于单一菌株，其降解率能达到29.15％。
1.3不同比例混合菌降解钻井液COD
按照表5所列投加量，将P7、F9、H2和H8种子液进行混合，分别投加到90mL磺化钻井液液体培养基中，35℃，150r/min振荡培养7d后测定钻井液COD含量。混合菌接种量分配见表5。
表5菌种投加量正交实验结果
Figure BDA0002758157520000142
Figure BDA0002758157520000151
2、聚磺钻井废液泥浆微生物修复
2.1试验材料
聚磺钻井废液泥浆：川庆钻探三磺泥浆。
2.2试验主要试剂
试验主要的药品如下：
NaOH；H3BO3；甲基红；溴甲酚绿；乙醇；H2SO4；酒石酸锑钾；钼酸铵；抗坏血酸；NaHCO3；K2Cr2O7；KH2PO4；FeSO4˙7H2O；邻菲罗啉。
2.3培养基
辅料固体培养基：锯末：麸皮：豆粕＝1:1:1，除去杂质，添加40％左右水润湿，121℃，灭菌45min，备用。
2.4试验方法
2.4.1固体菌剂的制备
培养方法：将培养后各单一菌株种子液按P7为30、F9为20、H2为25、H8为35的体积比例混合，接入辅料固体培养基，总接种量为10％，培养温度为35℃，培养48h，干燥后即为生产用固体菌剂。
2.4.2聚磺钻井废液泥浆模拟修复实验
将聚磺钻井废液泥浆，分别装入4个51cm×39cm×28cm的聚乙烯盒中，每组废液泥浆的质量为14kg。第一组是对照，没有添加任何物质；第二组按比例添加70g无机盐培养基，并充分搅拌均匀，考察营养物质对废液泥浆修复的效果；第三组添加前述2.4.1制备的固体混合菌剂70g，考察接种高效混合菌剂对废液泥浆修复的效果；第四组同时添加第二组和第三组的材料，考察营养物和混合菌剂的共同作用对废液泥浆修复的效果。实验周期为两个月，分别在第0、3、5、7、10、15、25、40、60d天取样，测定废液泥浆样品的温度、水分、碱解氮、速效磷、有机质、pH和COD含量。样品放置实验室自然条件下，定期翻动，保证废液泥浆的含氧量。
(1)废液泥浆温度的测定：将温度计插入废液泥浆中层，待温度持续不变，继续3-5min后读取数值并记录。
(2)废液泥浆水分的测定：废液泥浆水分采用重量法(HJ613-2011)测定。(HJ613-2011土壤干物质和水分的测定重量法[S].北京:中国标准出版社,2011.)
(3)废液泥浆碱解氮的测定：废液泥浆碱解氮采用1.0mol/L NaOH扩散法测定。(鲍士旦.土壤农化分析[M].北京:中国农业出版社,2000:25-86.)
(4)废液泥浆速效磷的测定：废液泥浆速效磷采用0.5mol/L NaHCO3-钼锑抗比色法(鲍士旦.土壤农化分析[M].北京:中国农业出版社,2000:25-86)测定。将不同浓度的速效磷标准样品溶液用紫外分光光度计测定700nm下的吸光度Abs值。OD值随着P浓度的增加而增加，将所得数据进行线性回归，得到标准曲线方程为y＝0.0498x+0.0003，R2＝0.9992。
(5)废液泥浆有机质的测定：废液泥浆有机质采用重铬酸钾容量法(稀释热法，水合热法)测定。(鲍士旦.土壤农化分析[M].北京:中国农业出版社,2000:25-86)
(6)pH测定：泥浆pH采用电位法(NY/T1377-2007)测定。(NY-T1377-2007土壤pH的测定[S].北京:中国标准出版社,2007.)
(7)污染物COD的测定：称取10.0g各处理的新鲜聚磺钻井废液泥浆样品放入250mL的三角瓶，再加90mL蒸馏水(泥浆与水比为1:10)，将其振荡8h(室温，110r/min)后，关闭摇床静置16h，将液体倒入50mL离心管中，6000r/min离心5min后，将离心管中的上清液用定量滤纸进行过滤，此为钻井废液浸提液，每个样品两次重复。
2.5结果与分析
2.5.1聚磺钻井废液泥浆实验室模拟效果
(1)废液泥浆温度的变化
温度可表示物体冷热程度，其变化可间接反映微生物发酵进行的阶段。从图2可看出，在修复过程中，培养初期0-3d，微生物处于适应期，其繁殖和呼吸作用较慢，因而产生热量较少。与第一组和第二组试验相比，其他2组试验温度变化较小。菌体在5-15d时，微生物适应环境后繁殖迅速，呼吸作用激烈，因而产生热量较多，第三组和第四组试验温度逐渐升高，第二组试验没有添加微生物，因而温度没有大幅度变化。培养15-60d时，第三组和第四组试验菌体基本停止繁殖，说明钻井泥浆中的可被利用的营养物质消耗殆尽，主要靠微生物体内的酶系进行代谢，产生热量很少，温度变化小，且逐渐减弱。
(2)废液泥浆水分的变化
发酵过程中水分是物质转运、吸收和消化等反应的必要物质，其含量的高低直接影响微生物新成代谢的进行。由图3可知，第一组试验和第二组试验含水量呈下降的趋势，说明在自然环境中水分蒸发会带走大量的水。第三组试验和第四组试验含水量整体呈现出先降低后上升最后趋于稳定，说明微生物发酵前期会消耗聚磺钻井废液泥浆中的水分，发酵中期微生物利用大量营养物质产生了大量的热，为满足自身生长所需的温度，微生物会从空气中吸收大量的水分维持自己适合生长的温度，发酵后期营养物质较少微生物数量达到饱和状态，温度趋于稳定，加上固体菌剂中辅料可以保存大量水分，因而后期第三组试验和第四组试验水分变化较小。
(3)废液泥浆碱解氮的变化
碱解氮是土壤供氮能力的重要指标。由图4可知，不同试验组经修复后废液泥浆中碱解氮的含量均高出第一组处理，且第四组试验处理碱解氮含量明显高于其他3个处理，主要是微生物发酵过程中利用提供的营养物质为废液泥浆带来了外源氮肥，从而增加了氮元素的含量。第三组碱解氮含量也处于较高值，可能是因固体菌剂中辅料被微生物继续利用后带来了新的氮肥所致。
(4)废液泥浆速效磷的变化
速效磷的含量能反映土壤中磷素的贮存量和供应能力。从图5可知，4组试验的速效磷呈不规则变化。第二组试验和第四组试验速效磷趋于较高值，是因为营养物质中的某些物质与废液泥浆中难溶性磷酸盐金属离子发生反应后释放了其中的磷，再加上微生物代谢作用产生的有机酸与污染物中难溶性磷酸盐的金属离子产生络合反应释放的磷，因而第四组试验中的速效磷比第二组试验中的速效磷含量高。第三组试验速效磷前期快速上升可能是固体菌剂中辅料未完全被微生物利用完从而增加有机质含量，有机质被分解后产生的有机酸能与废液泥浆中难溶性磷酸盐的金属离子发生反应，释放出其中的磷，中期速效磷下降可能是微生物快速利用有机类物质，有机质的减少及微生物的利用致使有效磷的合成降低，后期微生物数量趋于稳定，可利用营养物质有限，微生物代谢可能利用初级代谢产物产生了次级代谢产物，从而释放污染物中的磷。
(5)废液泥浆有机质的变化
有机质是土壤肥力的重要指标，不仅影响土壤的结构，而且也为土壤中异养微生物提供能源。从图6可知，第二组、第三组、和第四组试验废液泥浆有机质含量明显高于处理前，4组试验的有机质整体呈波动状态。第三组和第四组试验有机质出现波动的原因可能是修复初期微生物不适应环境的变化，造成部分微生物死亡，导致泥浆中有机质的含量增加，同时存活的微生物分解泥浆中的营养物质转化为有机质；随修复时间的延长，微生物逐渐适应环境后大量繁殖，不断地利用泥浆中的有机质，从而导致有机质含量下降，后期大分子物质不能被微生物利用，部分微生物死亡和代谢产物的积累，使得有机质含量有所回升，因而呈现出波动状态。第二组试验有机质含量一直处于较高值，说明营养物质的添加与聚磺钻井废液泥浆中的物质发生化学反应，产生新的物质从而使有机质含量变高，第一组有机质的降低说明自然发酵会促使聚磺钻井废液泥浆的各种物质含量的降低
(6)废液泥浆pH的变化
pH是土壤肥力的重要因素，直接影响土壤营养的有效性。从图7可知，第三组和第四组试验处理的废液泥浆酸碱度的趋势与试验前相比略有上升，但pH值都比对照组第一组试验低，说明微生物分解废液泥浆及辅料产生的代谢产物会促使pH上升。第一组和第二组试验处理的废液泥浆pH与试验前相比略有下降，说明自然发酵会促使聚磺钻井废液泥浆的各种物质的降解，从而pH会有所降低。
(7)废液泥浆COD的变化
COD是衡量水质有机物污染的综合指标，其大小可反映水体受有机质污染的程度。从图8可看出，第三组和第四组浸出液COD含量均随修复时间的延长慢慢降低，这是由于土壤中的有机物通过微生物分解逐渐转化为无机物质。但第一组和第二组的COD含量却是上升的，第一组试验说明自然发酵水分挥发后，污染物的浓度提高导致浸出液COD含量直线上升，第二组试验COD含量上升幅度较第一组试验低，可能是因为营养物质与废液泥浆发生反应，再加上第二组试验水分挥发速度较第一组慢，因而COD含量低于第一组。
2.6结论
聚磺钻井液废液的实验室模拟修复中，经过60d修复，对照组中聚磺钻井液废液COD含量上升99.08％，添加营养物质对聚磺钻井液废液COD含量上升23.30％，接种高效混合菌剂对聚磺钻井液废液COD含量下降了8.28％，以及同时添加营养物质和高效混合菌剂对聚磺钻井液废液COD含量下降了11.94％。
3、修复后泥浆的浓度对供试植物生长的影响
3.1试验材料
3.1.1小麦种子：购自种子公司。
3.1.2废弃物及泥土：
上述“2、聚磺钻井废液泥浆微生物修复”实验中修复的聚磺钻井液废弃泥浆。
泥土从长江大学农学院实验基地内挖取，风干磨碎后过20目筛，备用。
3.1.3试验主要仪器设备
主要试验仪器如下：恒温鼓风干燥箱OHG-907385-III，上海新苗医疗器械制造有限公司；生化培养箱SPx-250上海博迅实业有限公司医疗设备厂；塑料杯AGW-4609。
3.2试验方法
3.2.1泥浆的预处理
将烘箱温度调至35-38℃，将修复处理60d后的样品废液泥浆放入36cm×27cm×9cm聚乙烯托盘中烘干水分，中途每隔一段时间进行翻动，加速废液泥浆水分的蒸发。待废液泥浆水分挥发完全后，磨碎过20目筛，除去大颗粒杂物，然后充分拌均，得到聚磺钻井废液泥浆的干物质，备用。
3.2.2混合土样种子生长实验
(1)种子的预处理
为避免高浓度聚磺钻井废液泥浆对小麦发芽有抑制作用，本试验选出优质的无病小麦种子若干，表面灭菌后，用自来水浸泡24h，放在无菌的湿润的滤纸上，22℃培养至微露白芽后，播种至处理后的干物质样品中。
(2)干物质与土壤的配比
因聚磺钻井废液泥浆大都是化学添加剂，土壤含量极少且不易储水，遂与土壤进行混合。废液泥浆干物质与土壤的比例分别为：1:0、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、0:1，分别命名为JH-1-0、JH-1-1、JH-1-2、JH-1-4、JH-1-6、JH-1-8、JH-0-1，后面命名依此类推(详细命名见表6)，在不同处理样品混合比例的土壤样中，进行种子生长实验，观察废液泥浆毒性对种子生长的影响。
(3)播种
采用盆栽方法，将直径8cm的塑料杯底部1cm处打一圈小孔用于排水透气，在塑料杯底部铺约3cm厚的鹅卵石，鹅卵石上铺约8cm土样，将50粒微露白芽的小麦种子均匀撒于土层上，并盖上薄层土壤，刚好盖上麦芽为好，约1cm厚，再用喷雾均匀洒水，将表层土湿润，将盆栽放在培养箱培养，培养条件为22℃、光照10h，10℃、黑暗14h，试验进行3周，观察种子成活率和测量种子根长、茎长、鲜重。
(4)测量与分析
种子种植3周后，用剪刀将植物分成地上部分和根部。用水洗净根系后，杀青30min(105℃)，恒温(80℃)烘干根系表面水，然后测量根上部鲜重和植株根长和茎长，以此来评价微生物修复后的泥浆对植物生长的影响程度。
3.3结果与分析
为了更全面的考察经微生物降解处理钻井废液泥浆的的效果.本发明采用微生物修复60d后的废液泥浆种植小麦，以植株的根长及根茎为指标，评估降解处理后钻井废液泥浆对小麦生长的影响。经过处理后的废液泥浆所栽种的小麦，在3周观察期内均生长良好。从表6和图9～图16可看出，第四组修复泥浆与土壤不同比例混合小麦的生长情况比其他3组小麦生长情况好且成活率高，说明添加营养物质和高效混合菌剂修复后的泥浆COD含量较低，毒性更小，还有可能是微生物利用营养物质和泥浆时，产生的代谢物有促进种子的发芽和生长的作用，其他3组小麦成活率相对较低，可能是土壤COD含量较高的原因所致。其中JH-1-2成活率为86％，比JH-1-4、JH-1-6等成活率高，可能是泥浆与土壤没有混合均匀，导致混合物上部毒性小，因而成活率比后面试验组高。从不添加钻井泥浆的土壤到不添加土壤的钻井泥浆，可发现钻井泥浆处理后的干物质浓度对小麦成活率有着明显的不利影响，随着掺入土壤量的增加，小麦成活率、平均根长、平均茎长、平均鲜重明显提高，尤其是在第三组和第四组试验中，当土壤量增加到泥浆干物质的2倍时，小麦的成活率基本没有影响，而且小麦的平均根长、平均茎长、平均鲜重明显比未被微生物修复的泥浆生长的好，表明泥浆被微生物修复后会产生利于小麦生长的营养物质，只要土壤掺入量合适，废弃泥浆干物质是可以用作土壤的。
表6修复后泥浆干物质与土壤不同配比小麦生长情况统计表
Figure BDA0002758157520000201
Figure BDA0002758157520000211
根是植物的营养器官，大多数的成分都是经根的吸收送到植物各个器官，根是对外界毒害作用第一个发生反应的部位，因而根的生长快慢决定了对各种因素的敏感性。从图17～图20可看出，废弃泥浆干物质与土壤比例达到1:1时，第四组修复后的泥浆与土壤不同比例混合后小麦根部生长状况更好，且侧生根多，说明添加营养物质和高效混合菌剂修复后的泥浆的毒性比其他3组处理小，其次微生物分解营养物质产生的中间产物可能给小麦带来额外的营养成分因而侧生根较多。
结论：
本发明修复后的钻井泥浆与土壤不同比例混合后，当修复后废弃泥浆干物质与土壤比例达到1:1时，第三组和第四组土壤种子的成活率大于60％，是第一组和第二组成活率的2倍，且第四组优于第三组成活率，说明微生物修复后的钻井泥浆与土壤适当的混合比例是适合作物生长需求的，而且添加微生物和营养物质共同修复的泥浆会产生促进种子生长的物质。此外，微生物修复后的钻井泥浆与土壤混合后小麦的侧生根及成活率比普通土壤好，侧生根可为植物生殖生长和开花结果提供充足的养分，其生长和发育受植物内部遗传因素和外部环境矿物质营养的影响，表明钻井泥浆被微生物降解后产生许多利于植物生长的营养物质。
序列表
<110> 中国石油天然气集团有限公司；中国石油集团安全环保技术研究院有限公司
<120> 一种降解磺化钻井液的弯曲芽孢杆菌、混合菌及其应用
<130> GAI19CN0771
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 弯曲芽孢杆菌H8（Bacillus flexus）
<400> 1
agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggca acctgcctgt aagactggga taactccggg 60
aaaccggagc taataccgga taacattttc tcttgcataa gagaaaattg aaagatggtt 120
tcggctatca cttacagatg ggcccgcggt gcattagcta gttggtgagg taacggctca 180
ccaaggcaac gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 240
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 300
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag 360
aacaagtaca agagtaactg cttgtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 420
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg 480
taaagcgcgc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag 540
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagagaaaa gcggaattcc acgtgtagcg 600
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcggcttttt ggtctgtaac 660
tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 720
cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agctaacgca 780
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 840
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 900
cttgacatcc tctgacaact ctagagatag agcgttcccc ttcgggggac agagtgacag 960
gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1020
gcaacccttg atcttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1080
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1140
acgtgctaca atggatggta caaagggctg caagaccgcg aggtcaagcc aatcccataa 1200
aaccattctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt 1260
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320
caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtggggtaac ctttatggag ccagccgcgt 1380
aaggtgacag gttt 1394
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 3
ggttaccttg ttactt 16

Claims (10)

1.保藏编号为CCTCC NO：M 2018812的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)。
2.一种混合菌，其包括权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌，还包括赫氏埃希氏菌、变形假单胞菌、恶臭假单胞菌和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌中的一种或多种，优选包括变形假单胞菌、恶臭假单胞菌和赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌。
3.根据权利要求2所述的混合菌，其中，赫氏埃希氏菌、变形假单胞菌、恶臭假单胞菌、赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌在混合菌中的量，以活菌数计，与其中弯曲芽孢杆菌的比例各自独立地为(1～4):(4～1)；
优选地，变形假单胞菌与弯曲芽孢杆菌的比例为25～35：30～40；恶臭假单胞菌与弯曲芽孢杆菌的比例为15～25：30～40；赫尔曼尼亚特兰蒂斯杆菌与弯曲芽孢杆菌的比例为20～30：30～40。
4.一种菌制剂，其包含：权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌，或权利要求2或3所述的混合菌；所述菌制剂为液态或固态菌制剂；
优选地，所述菌制剂是按照以下方法制备得到的：
将权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌或权利要求2或3所述的混合菌的种子液，接入培养基，总接种量为8～15％，培养温度为25-45℃，培养1d～3d，所得培养产物制备液态和/或固体菌剂；更优选地，培养系统的pH 8.5～9.5、盐浓度4.5％～5.5％、转速80～300r/min。
5.权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌、权利要求2或3所述的混合菌或权利要求4所述的菌制剂在降解磺化钻井液中的应用。
6.权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌、权利要求2或3所述的混合菌或权利要求4所述的菌制剂在改善磺化钻井液泥浆和/或污染土壤中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其中，将权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌、权利要求2或3所述的混合菌或权利要求4所述的菌制剂与待降解的磺化钻井液或磺化钻井液污染的土壤混合，使菌在混合体系中培养生长，从而降解磺化钻井液。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，混合体系中还含有N源和P源；优选地，所述N源为蛋白胨，P源为K2HPO4；优选地，所述培养条件为：pH为7.5-10，盐浓度为3％-7％，温度25-45℃。
9.一种磺化钻井废液泥浆制品，其是按照以下方法制备得到的：
将权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌、权利要求2或3所述的混合菌或权利要求4所述的菌制剂与磺化钻井废液泥浆混合，使菌在混合体系中培养生长从而降解磺化钻井液；
优选地，混合体系中还添加包括无机盐类的营养物质。
10.权利要求9所述的磺化钻井废液泥浆制品在促进植物生长中的应用；
优选地，所述植物为小麦。
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