CN114437203A - 一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的用途 - Google Patents

一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的用途 Download PDF

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Abstract

本申请公开一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的用途，氧氟沙星抗原的合成包括：以碳二亚胺为催化剂，氧氟沙星与甘氨酸合成半抗原；以碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰为催化剂，半抗原与牛血清白蛋白偶联合成全抗原。合成的全抗原通过免疫小鼠、细胞融合、单克隆和无抗细胞培养技术成功研制出杂交瘤细胞株，其中一个细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C202112；该细胞株在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性抗氧氟沙星的单克隆抗体，该抗体对氧氟沙星反应灵敏度高且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低。本申请的单克隆抗体可用于检测动物源性农产品中残留的氧氟沙星。

Description

一种氧氟沙星抗原的合成方法及其在制备单克隆抗体中的 用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途。
背景技术
喹诺酮类(QuinoIones，QNs)是一类化学合成的抗菌药，多年来被广泛应用于养殖领域，其中的氧氟沙星曾经是人畜共用药。根据农业部2292号公告要求，为了人体健康和环境安全，从2016年12月30日后，停止在食用动物的养殖过程中使用氧氟沙星，因此，在动物源性农产品中不得检出氧氟沙星。从2017年以来，在动物源农产品中经常检出氧氟沙星，其中检出率最高的是恩诺沙星和氧氟沙星，但这2种药物的残留限量不同，前者是兽医专用药，在畜禽、水产品的肌肉中的限量为100μg·kg-1(以恩诺沙星+环丙沙星计)；后者为不得检出。
目前，快检试剂盒开发存在的主要问题是抗氧氟沙星抗体特异性、灵敏度不够，而且抗体质量不稳定。喹诺酮类药物具有相同的母核结构，即不同品种的药物结构相似，以前开发的抗体对同类药物的交叉反应率较高，因此，需要开发一种对氧氟沙星反应灵敏度高，且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低的抗体。
发明内容
本申请合成一种氧氟沙星抗原，并通过免疫小鼠、细胞融合、单克隆和无抗细胞培养技术成功研制出杂交瘤细胞株，其在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性抗氧氟沙星的单克隆抗体，该抗体对氧氟沙星反应灵敏度高且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低。
本申请提供一种氧氟沙星抗原的合成方法，包括：
以碳二亚胺为催化剂，氧氟沙星(Oflx)与甘氨酸(Gly)合成半抗原；
以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰为催化剂，所述半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联合成全抗原。
反应过程如下：
Figure BDA0003480916730000011
可选的，所述氧氟沙星(Oflx)与甘氨酸(Gly)的投料摩尔比为1：2～5(Oflx:Gly)。
进一步地，氧氟沙星(Oflx)与甘氨酸(Gly)合成半抗原的步骤包括为：
氧氟沙星(Oflx)与碳二亚胺混合，20～25℃反应10mins；然后加入甘氨酸(Gly)，继续在20～25℃反应30mins。
可选的，所述半抗原与牛血清白蛋白的投料摩尔比为20～60:1(Oflx:BSA)。
本申请还提供一种如所述合成方法合成得到的氧氟沙星抗原。
本申请还提供一种如所述氧氟沙星抗原在制备分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株中的用途。
本申请还提供一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括：
用所述的全抗原免疫BALB/c小鼠，再将免疫后小鼠的脾脏细胞与1581骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得分泌抗氧氟沙星抗体的杂交瘤细胞株。
其中一个细胞株命名为杂交瘤细胞株Ofl16，保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO.C202112；保藏日期为：2021年12月29日，中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。
本申请还提供一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株Ofl 16，保藏编号为CCTCC NO.C202112。
本申请还提供一种抗氧氟沙星的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO.C202112的杂交瘤细胞株产生。该单克隆抗体特异性好、灵敏度高、稳定性强，且与恩诺沙星和环丙沙星交叉反应率较低。
可选的，所述单克隆抗体的亚型为IgG1λchain(λ链)。
可选的，所述单克隆抗体通过体外培养的方式获得。
本申请还提供一种如所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在检测动物源性农产品中氧氟沙星残留的用途。
本申请还提供一种如所述的杂交瘤细胞株或所述的单克隆抗体在制备氧氟沙星检测产品中的用途。
可选的，所述氧氟沙星检测产品为试剂盒或试纸条。
本申请还提供一种氧氟沙星残留快速检测的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的单克隆抗体。
具体地，所述的试剂盒中还含有酶标板、氧氟沙星标准品，酶标记物(酶标二抗)、底物和终止液，其中，酶标板上包被有人工合成的抗原(竞争物)。使用时，待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再加入酶标记物，若样品中含有氧氟沙星，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的氧氟沙星氧氟沙星量成反比。根据氧氟沙星标准品做出的标准曲线，计算出样品中的氧氟沙星的含量。
本申请提供一种氧氟沙星残留快速检测的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记或量子点标记的所述单克隆抗体。
相比现有技术，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)在半抗原合成时，通过在6-羧酸位置用甘氨酸加臂，突出氧氟沙星的特有结构，获得对氧氟沙星灵敏度高而对恩诺沙星和环丙沙星的交叉反应率较低的抗体，其中Ofl16细胞株产生的抗体对氧氟沙星IC50为0.443ng·mL-1，与恩诺沙星和环丙沙星的交叉反应率分别为2％和<1％。
(2)与ZL201510990139.X专利相比，后者用环丙沙星合成抗原，抗体可与16种氧氟沙星发生交叉反应，对环丙沙星的IC50为0.396ng·mL-1，对恩诺沙星反应灵敏度高于氧氟沙星。因些本申请涉及一种对氧氟沙星灵敏度和特异性更高的抗原合成方法及其在农产品质量安全检测中的应用。
附图说明
图1为本申请杂交瘤细胞株的染色体标本图；
图2为本申请单克隆抗体间接竞争ELISA的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
实施例1 21#免疫抗原合成
(1)称取氧氟沙星(Ofloxacin，简写Oflx，CAS号：82419-36-1)49.1mg；加1mol·L-1盐酸0.5ml，再加去离子水5ml溶解，用调节1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH到5.25，得A21溶液。
(2)称取碳二亚胺(Carbodiimide，EDC)258mg加入A21溶液中，25℃反应10mins，得B21溶液。
(3)称取甘氨酸(Glycine，缩写Gly，CAS号56-40-6)20.4mg，加入B21溶液中，25℃反应30mins，得C21溶液。
(4)称取牛血清白蛋白(BSA)442mg于具塞试管，用12ml 0.02mol·L-1pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)溶解，得D21溶液。
(5)边摇动试管边将C21溶液逐滴加入D21溶液；再加入78mg N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)，振荡使其溶解。
(6)将试管置于层析冷柜的摇床上低速振荡，4℃反应过夜(约16小时)，合成21#免疫抗原Oflx-Gly-BSA(Ag21)。
(7)收集反应液，用0.01mol·L-1pH7.4PB透析3天，每天更换2次缓冲液。
(8)考马斯亮蓝染色法测定抗原浓度为7.80mg/ml，小管分装后，-20℃保存。
实施例2 25#免疫抗原合成
(1)称取Oflx 51.1mg；加1mol·L-1盐酸0.5ml，再加去离子水5ml溶解，用调节1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH到5.60，得A25溶液。
(2)称取EDC 265mg加入A25溶液中，25℃反应10mins，得B25溶液。
(3)称取Gly 53.3mg，加入B25溶液中，25℃反应30mins，得C25溶液。
(4)称取BSA 153mg于具塞试管，用5ml 0.02mol·L-1pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)溶解，得D25溶液。
(5)边摇动试管边将C25溶液逐滴加入D25溶液；再加入65mg NHS，振荡使其溶解。
(6)将试管置于层析冷柜的摇床上低速振荡，4℃反应过夜(约16小时)，合成25#免疫抗原Oflx-Gly-BSA(Ag25)。
(7)收集反应液，用0.01mol·L-1PB(pH7.4)透析3天，每天更换2次缓冲液。
(8)考马斯亮蓝染色法测定抗原浓度为3.88mg/ml，小管分装后，-20℃保存。
实施例3 10#免疫抗原合成
(1)称取Oflx 50.1mg；加1mol·L-1盐酸0.5ml，再加去离子水5ml溶解，用调节1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH到5.46，得A10溶液。
(2)称取EDC 268mg加入A10溶液中，25℃反应10mins，得B10溶液。
(3)称取BSA 155mg于具塞试管，用5ml 0.02mol·L-1pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)溶解，得C10溶液。
(4)边摇动试管边将B10溶液逐滴加入C10溶液；再加入64mg NHS，振荡使其溶解。
(5)将试管置于层析冷柜的摇床上低速振荡，4℃反应过夜(约16小时)，合成10#免疫抗原Oflx-BSA(Ag10)。
(6)收集反应液，用0.01mol·L-1PB(pH7.4)透析3天，每天更换2次缓冲液。
(7)考马斯亮蓝染色法测定抗原浓度为3.22mg/ml，小管分装后，-20℃保存。
实施例4 31#包被抗原合成
(1)称取Oflx 98.6mg；加1mol·L-1盐酸0.8ml，再加去离子水溶解，用调节1mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH到5.03，定容至10ml，得A31溶液。
(2)称取EDC 503mg加入A25溶液中，25℃反应10mins，得B31溶液。
(3)称取OVA 121mg于具塞试管，用5ml 0.02mol·L-1pH7.4磷酸盐缓冲液(PB)溶解，得C31溶液。
(4)边摇动试管边将B31溶液逐滴加入C31溶液；再加入68mg NHS，振荡使其溶解。
(5)将试管置于层析冷柜的摇床上低速振荡，4℃反应过夜(约16小时)，合成31#免疫抗原Oflx-OVA(Ag31)。
(6)收集反应液，用0.01mol·L-1PB(pH7.4)透析3天，每天更换2次缓冲液。
(7)考马斯亮蓝染色法测定抗原浓度为2.93mg/ml，小管分装后，-20℃保存。
实施例5杂交瘤细胞株的制备
(1)免疫动物
每种免疫抗原免疫3只6周龄的Balb/c小鼠，首次免疫剂量约120μg/只，第2～5次免疫剂量约80μg/只，第6次免疫剂量约60μg/只，其中Ag21、Ag25、Ag10免疫信息见表1。例如实施例1制备的7.80mg·mL-1的Ag21，首次免疫取Oflx-Gly-BSA溶液60μL加0.02mol·L-1pH7.4的PBS至400μL，加400μL福氏完全佐剂，充分乳化后，腹腔注射200μL/只；15天后进行第2次免疫，取Ag21 40μL加PBS至300μL，加300μL福氏不完全佐剂乳化，剂量为150μL/只，皮下分4～5个点注射；第3次～第5次免疫每隔2周免疫1次，腹腔免疫与皮下免疫间隔实施，剂量为150μL/只；第5次免疫后3周，取Ag21 30μL加PBS至80μL，以20μL/只的剂量从尾静脉加免。
表1 Ag21、Ag25和Ag10免疫信息表
Figure BDA0003480916730000051
(2)血清抗体的检测
从第4次免疫开始，每次免疫后第10天从小鼠尾部或眼框少量采血，用间接ELISA法检测血清抗体效价和对Oflx的抑制率。
ELISA检测方法：以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释将Oflx-OVA(Ag31)稀释成200ng·mL-1的包被液，100μL/孔加入96孔板酶标板，4℃过夜，洗板后每孔加150μL 10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用；将血清用0.02mol·L-1pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)做103～109倍梯度稀释测定抗体效价；用竞争ELISA方法检测抑制率，即在对照孔中加50μL PBS，在竞争孔中加50μL 200ng·mL-1Oflx标准溶液，将血清稀释至适当浓度，对照孔和竞争孔各加入50μL血清稀释液，后续步骤按间接ELISA方法操作；选对照孔OD值为0.8～1.2稀释度的一组计算抑制率(％)。
Figure BDA0003480916730000052
本申请所涉及的杂交瘤细胞株来源于经Ag21免疫的Balb/c小鼠，Ag21、Ag25试验组第五次免疫后血清效价为105～7，对200ng·mL-1Oflx标准溶液的抑制率为65～79％；对照组Ag10效价高达108～9，对200ng·mL-1Oflx标准溶液的抑制率为41～68％，试验结果为效价Ag10>Ag25>Ag21；抑制率Ag21>Ag25>Ag10。第六次免疫后10天，选抑制率较高小鼠，从眼眶采血，血清效价和抑制率的ELISA检测结果与第五次相近。
(3)细胞融合
融合前2天1581细胞改用含2％8-AG培养基选择培养24小时，融合前1天换成1640培养基+15％胎牛血清培养，并取5～7周龄空白小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞作为饲养细胞，加1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT(选择培养基)制成细胞悬液，以100μl/孔加入96孔培养板中，每只小鼠铺8块板；融合当天，将Balb/c小鼠引椎处死，在无菌条件下取脾脏，将其与1581细胞以6：1的比例在50％PEG4000介导下融合；经2次800转/min低速离心12min去除PEG后，用40mL选择培养基制成细胞悬液，小心混匀后，100μl/孔加入铺有饲养细胞的96孔培养板。
(4)细胞培养
细胞融合后在37℃，5％CO2条件下培养；第6天，从每孔中小心吸出100μl上清液，加入100μl新配制的选择培养基(半换液)；第10天，每孔吸出100μl上清液用于抗体检测，加入新配制的过渡培养基(1640培养基+15％胎牛血清+1％HAT+1％HT)和105个/mL饲养细胞；第14天，再用1640培养基+15％胎牛血清+2％HT的过渡培养基；此后，每周2次用常规培养基(1640培养基+10％胎牛血清)半换液一次。为了提高细胞活力和分泌抗体的特异性，在细胞培养过程中不添加任何抗菌素。
(5)阳性孔筛选
细胞融合后第6天开始用显微镜观察杂交瘤细胞增殖情况，每次取出的培养基上清用于ELISA检测，先测效价，再将其适当稀释后，再检测Oflx标准溶液对ELISA反应的抑制率。
(6)单克隆细胞株的建立
选择抗体效价高(OD>0.6)、且抑制率较好(对200ng·mL-1Oflx抑制率>70％)的阳性孔进行单克隆，再经过2～3次亚克隆获得Ofl 9A5G8E9、Ofl 16H10E3E9D2(简称Ofl 16)等细胞株。
将Oflx 16分别用25cm2、75cm2、150cm2细胞瓶逐步扩大培养，F1代冻存20管，其中10管于2021年12月29日送达中国典型培养物保藏中心，该培养物的存活性由保藏中心于2022年1月17日检测完毕，结果为存活，保藏编号为CCTCC NO.C202112。
(7)染色体标本的制作
取一瓶处于对数生长期的Ofl16细胞，加入100μg·mL-1的秋水仙素，至终浓度为0.1μg/mL，在37℃，5％CO2条件下培养约30min后，刮下细胞，离心去上清，收集细胞；加入8mL 0.075mol·L-1的氯化钾，低渗处理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)进行预固定，用吸管轻轻吹打混匀细胞，200g离心6min，去上清；再加入8ml固定液，用吸管轻轻吹打混匀细胞，室温下静置30min后，200g离心6min，弃上清液，依法重复固定2次；弃上清液，视细胞数量余留适量固定液，轻轻吹散细胞制备成细胞悬液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的洁净载玻片上，在酒精灯上过火，室温下阴干。将阴干的玻片标本加入Giemsa染液，并进一步做G显带处理。选50个分裂象做众数分析，95～108条(图1)，平均染色体数为103条。
实施例6单克隆抗体的制备
(1)单克隆抗体的体外制备
将5×106的F2代Oflx 16细胞接入150cm2培养瓶，加50mL 1640培养基(含10％胎牛血清)；在37℃，5％CO2条件下培养约72小时后，当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置4小时，3220g离心30min；弃上清，沉淀用PBS复溶，加入PBS的1/2体积的饱和硫酸铵，振荡混匀，3220g离心30min，弃沉淀，取上清；加饱和硫酸铵至其占总体积的40％，4℃放置2小时后3220g离心30min，弃上清，沉淀PBS复溶，用30K的超滤离心管(Amicon Ultra-15)脱盐，获得初步纯化抗氧氟沙星单克隆抗体(MAbOfL)，小管分装，-20℃保存。
(2)灵敏度和特异性检测
将抗体用去离子水复溶，并稀释103倍，分别用0、0.25、0.5、1、2、4、8ng·mL-1氧氟沙星标准溶液做竞争ELISA，测得细胞培养基上清液中MAbOfL对氧氟沙星的50％抑制浓度(IC50)为0.443ng·mL-1(见图2)。经交叉反应检测与恩诺沙星和环丙沙星的交叉反应率分别为2％和<1％，与青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺嘧啶等其它类别的抗菌素无交叉反应。
(3)抗体亚型的确定
通过IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP检测，本发明细胞株所产抗体亚型为IgG1λchain(λ链)。
实施例7间接竞争ELISA方法检测鸡肉中氧氟沙星残留
(1)样本预处理：取经过LC-MS/MS检测的鸡肉留存样品10个，其中氧氟沙星阳性和恩诺沙星超标(>100μg·kg-1)样品各3个，阴性对照样品4个。称取2.0g匀质样本于50mL离心管中，每个样品称2管，加入4mL酸化乙腈，剧烈振荡3min后，室温下3220g离心5min，取上清提取液转移至10mL离心管，沉淀中加4mL酸化乙腈重复提取一次，合并提取液，用氮气吹干；向吹干的离心管中加入1mL正己烷和1mL PBS，振荡1min；静置分层后吸取下层溶液，高浓度的样本液用PBS稀释，待检；同时用对照样本做0.25、0.5、1.0、2.0μg·kg-1添加回收试验。
(2)测定：取出预先包被Oflx–OVA(Ag31)的96孔酶标板，将样本液和0、0.25、0.5、1、2、4、8ng·mL-1的Oflx系列标准溶液对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；加系列标准溶液和样本液50μL到对应微孔中；每孔加50μL抗体溶液，用盖板膜盖板后，37℃孵育2小时；加200μL洗涤缓冲液洗板3次；加入100μL酶标二抗，37℃孵育1小时；加200μL洗涤缓冲液洗板6次，用吸水纸拍干；加入100μL显色液，室温避光显色20min；加入100μL终止液；用酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。
(3)结果计算：用标准溶液或样本液的吸光度值(B)比空白对照(零标准)溶液的吸光度值(B0)计算相对吸光度值：
Figure BDA0003480916730000081
用相对吸光度值(％)对应Oflx标准溶液自然对数做半对数坐标系统曲线图；对应样本液中OfLx浓度从校正曲线算出鸡肉中OfLx的残留量(μg·kg-1)：
Figure BDA0003480916730000082
式中A为样本液的相对吸光度值对应的OfLx浓度，n为样本稀释倍数，m为样本质量。
(4)检测结果：氧氟沙星阳性和恩诺沙星超标样品均检出为阳性；加标试验表明方法最低定量限(LOQ)为0.25μg·kg-1，回收率58％～126％，样本变异系数小于30％。
实施例8胶体金标记抗体测试
(1)胶体金制备：在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入2mL1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存过夜。
(2)胶体金标记：取100mL胶体金溶液，用0.1mol·L-1碳酸钾溶液调pH到8.2。边搅拌边加入1mL 2.0mg·mL-1MAbOfLx，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol·L-1聚乙二醇20000(PEG)，搅拌15min。20,000转/分钟离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4 PBS缓冲液(含0.4mol·L-1PEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)溶解，过0.22μm无菌滤膜后，4℃保存备用。
(3)试剂条组装：用BIODOT XYZ3210点膜机的点喷头(BioJet)把OfLx-OVA(Ag31)及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线；用气喷头(AirJet)的胶体金标记抗体包被在结合垫上，37℃烘干。将PVC背衬平放在试验台上，在其上按顺序粘上样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条。
(4)试剂条测试：将氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氯霉素和磺胺二甲嘧啶标准品分别用PBS(pH 6.8)稀释至1～200ng·mL-1，各取100μL加在样品垫上，加样后开始计时，在3～8min读取结果，氧氟沙星≥4ng·mL-1和恩诺沙星≥100ng·mL-1出现抑制，判定为阳性；其它均为阴性。
实施例9量子点标记抗体测试
(1)标记：取50μL水溶性羧基CdSe/CdS/ZnS(5nm)量子点溶液和400μL 2.0mg·mL- 1MAbOfLx，摇匀制成混合液；称取4.2mg EDC，用300μL去离子水溶解，边摇边将其逐滴加入上述混合液中；在4～8℃层析冷柜中，避光，低速振荡过夜；将产物用0.01mol·L-1PB(pH7.4)避光透析3天，4℃避光保存备用。
(2)组装：除了结合垫上包被物改为量子点标记的抗体，试剂条的其它组件等同参照实施例8中试剂条的方法组装。
(3)测试：标准品配制和加样等同参照实施例8，3～8min内，在紫外灯下观察结果，氧氟沙星>3ng·mL-1和恩诺沙星>100ng·mL-1出现抑制，判定为阳性；其它均为阴性。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种氧氟沙星抗原的合成方法，其特征在于，包括：
以碳二亚胺为催化剂，氧氟沙星与甘氨酸合成半抗原；
以碳二亚胺和N-羟基琥珀酰为催化剂，所述半抗原与牛血清白蛋白偶联合成全抗原。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述氧氟沙星与甘氨酸的投料摩尔比为1：2～5；所述半抗原与牛血清白蛋白的投料摩尔比为20～60:1。
3.如权利要求1或2所述合成方法合成得到的氧氟沙星抗原。
4.如权利要求3所述氧氟沙星抗原在制备分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株中的用途。
5.一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括：
用如权利要求3所述的全抗原免疫BALB/c小鼠，再将免疫后小鼠的脾脏细胞与1581骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得分泌抗氧氟沙星抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株Ofl 16，保藏编号为CCTCCNO.C202112。
6.一种分泌抗氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株Ofl 16，保藏编号为CCTCC NO.C202112。
7.一种抗氧氟沙星的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC NO.C202112的杂交瘤细胞株产生。
8.如权利要求6所述的杂交瘤细胞株或如权利要求7所述的单克隆抗体在检测动物源性农产品中氧氟沙星残留中的用途。
9.如权利要求6所述的杂交瘤细胞株或如权利要求7所述的单克隆抗体在制备氧氟沙星检测产品中的用途。
10.一种氧氟沙星残留快速检测的试剂盒或试纸条，其特征在于，含有如权利要求7所述的单克隆抗体。
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于海峰等: "氧氟沙星完全抗原的合成鉴定及其单克隆抗体的制备纯化", 食品科学 *

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