CN114437196A

CN114437196A - 一种抑制SARS-CoV-2感染的蛋白及其用途

Info

Publication number: CN114437196A
Application number: CN202210141491.6A
Authority: CN
Inventors: 姜世勃; 刘叔文; 邢立晓; 许鑫锋; 徐巍; 陆路; 杨霞
Original assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd; Fudan University; Southern Medical University
Current assignee: Shanxi Jinbo Bio Pharmaceutical Co ltd; Fudan University; Southern Medical University
Priority date: 2022-02-16
Filing date: 2022-02-16
Publication date: 2022-05-06

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制SARS‑CoV‑2感染的蛋白及其用途，所述蛋白包含n个重复单元1和n‑1个重复单元2，n为大于等于2的整数，重复单元1和重复单元2间隔排列，各重复单元之间通过柔性连接子连接，其中，所述重复单元1为SARS‑CoV‑2刺突蛋白HR1中连续的至少42个氨基酸，所述重复单元2为SARS‑CoV‑2刺突蛋白HR2中连续的至少36个氨基酸，所述柔性连接子在所述蛋白中各自独立的包含2至5个氨基酸残基。本发明的蛋白能够以HR2为靶点抑制病毒感染进程，同时对目前出现的VOC和VOI变异株也具有较好的抑制活性，本发明的蛋白作为抑制剂，具有较高的安全性和较好的成药潜力。

Description

一种抑制SARS-CoV-2感染的蛋白及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抑制SARS-CoV-2感染的蛋白及其用途。

背景技术

2019年底出现的冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情由严重急性呼吸道综合征冠状病毒 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起。该病毒与2002年出现的严重急性呼吸道综合征冠状病毒利用相同的细胞受体——ACE2，但其传播能力更强。随着病毒的传播、感染时间和感染人群的增加，该病毒在原始毒株的基础上，产生了许多变异毒株。在这些毒株中，B.1.1.7(首次发现于英国，α)的 D614G突变可以增加病毒传播能力，N501Y突变可以增加病毒对啮齿类动物的感染能力。此外，B.1.351(首次发现于南非，β)、P.1(首次发现于巴西，γ)、B.1.617(首次发现于印度，δ)3种变异也出现了逃逸中和抗体的突变，因此上述4个突变株被WHO列为需要关切的变异株(variants of concern，VOC)。C.37(首次发现于秘鲁，λ)同样降低对中和抗体的敏感性，被WHO列为需要关注的变异株(variants of interest，VOI)。变异毒株的不断出现，对于疫苗的保护效果形成新的挑战，为人类的生存与健康带来了严重的威胁，给全球的经济发展带来了严重的影响。基于上述现状，迫切需要开发一种根据病毒保守靶点设计的广谱高效抗病毒制剂。

SARS-CoV-2通过刺突蛋白(Spike，S)感染靶细胞，其组成为同源三聚体，每个单体包含S1和S2两个亚基。S1亚基中的受体结合域(receptor binding domain，RBD)与细胞受体ACE2发挥作用，加之宿主蛋白酶切割，S1亚基脱落，S2亚基N末端的融合肽插入靶细胞膜中，N末端七肽重复区(NHR或HR1)三聚体暴露。随后，三分子C末端七肽重复区(CHR或HR2)以反向平行的方式插入HR1三聚体的疏水性沟槽中形成六螺旋束 (6-Helix Bundle，6-HB)，将病毒包膜与靶细胞膜拉近，介导膜融合，病毒的基因物质通过融合孔进入靶细胞内复制产生新的病毒颗粒。

在广谱冠状病毒进入抑制剂研发方面，S2蛋白中的螺旋区是重要靶点。S2P6是靶向 SARS-CoV-2 S2蛋白中茎螺旋区的抗体，对于MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-OC43、229E等均具有广谱的中和活性，但是它的IC₅₀(半数抑制浓度)较高，活性不佳。公开号为CN107022008A、发明名称为广谱地抑制人类冠状病毒感染的多肽及其应用的专利申请公开了本发明的发明人在之前研究改造的一种来源于HCoV-OC43 HR2的EK1多肽，它是一种广谱且高效的冠状病毒进入抑制剂。它可以结合冠状病毒经受体刺激后暴露的 HR1三聚体，从而竞争性抑制病毒自身HR2的结合，进而抑制融合孔的形成阻止病毒进入靶细胞。

HR1和HR2在病毒融合过程中均发挥重要作用，因此二者均具备作为病毒进入抑制剂靶点的可行性。但是，目前研发成功的冠状病毒抑制剂均是来源于HR2或其衍生物，它们靶向HR1靶点。针对单一靶点的药物长期使用，往往容易引起病毒的耐药性突变，因此迫切需要研发一种与靶向HR1的抑制剂交替或联合使用的药物。然而HR1由于长度长于HR2，且其α-螺旋构象不稳定，因此很难分离到有良好活性的抑制剂，导致开发来源于HR1或其衍生物、靶向HR2的病毒抑制剂存在困难。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的是提供对于SARS-CoV-2感染具有抑制作用的蛋白类进入抑制剂，该蛋白类抑制剂可以结合病毒S2蛋白中的HR2，并形成稳定的复合物，从而阻止病毒自身六螺旋束的形成，抑制病毒感染进程。

用于解决问题的方案

本发明的第一方面提供一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白。具体来说，本发明将SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的至少42个氨基酸和SARS-CoV-2刺突蛋白HR2 中连续的至少36个氨基酸分别作为重复单元1和重复单元2，对两种重复单元进行间隔排列使所述蛋白具有n个重复单元1和n-1个重复单元2，n为大于等于2的整数，并且各个重复单元之间通过柔性连接子连接。

进一步，其中，所述n可以为3；所述重复单元1为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的42或44个氨基酸；所述重复单元2为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的36或40个氨基酸；所述柔性连接子在所述蛋白中各自独立的包含2至5个氨基酸残基；所述蛋白的C末端可以任选地包含蛋白标签，该蛋白标签与所述蛋白C端最后一个重复单元1之间通过所述柔性连接子连接；所述蛋白的N末端可以任选地包含柔性连接子；从而可以获得氨基酸序列为SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示序列的抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，并分别命名为5-Helix-1和5-Helix-2。

上述序列中双下划线部分为5-Helix-1蛋白中的重复单元1，其为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的44个氨基酸，具体序列为SEQ ID NO.5：LIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ。上述序列中单下划线部分为5-Helix-1蛋白中的重复单元2，其为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的40个氨基酸，具体序列为SEQ ID NO.6：DLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELG。上述序列中粗体部分为5-He lix-1蛋白中的各自独立的柔性连接子。

上述序列中斜体双下划线部分为5-Helix-2蛋白中的重复单元1，其为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的42个氨基酸，具体序列为SEQ ID NO.7：ANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQ。上述序列中斜体单下划线部分为5-Helix-2蛋白中的重复单元2，其为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的36个氨基酸，具体序列为SEQ ID NO.8：DISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQEL。上述序列中粗体波浪下划线部分为5-Helix-2蛋白中的各自独立的柔性连接子。

本发明还提供了以上述蛋白为核心区域的能够抑制SARS-CoV-2活性的蛋白。

本发明的第二方面提供本发明第一方面中所述一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为以SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的序列，或其根据人工设计和密码子优化后的衍生物。

TTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTC TTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAA GCTTTAAACACGCTTGTTAAACAAGGAGGATCTGGAGGAGATTTAGGTGACATCT CTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAG GTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAGGATCTTC TGGAGGATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCAC TTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCA CAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAAGGAGGATCTGGAGGAGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAAT GAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAGGATC TTCTGGAGGATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACT CACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAAGGAGGACATCACCATCATCACCAT (SEQ ID NO.3)。

AGTGGTGGCGGCGCAAATCAGTTTAATAGCGCGATTGGCAAAATCCAGGATA GCCTGAGTAGTACCGCATCTGCACTGGGTAAACTGCAAGATGTTGTTAACCAGAA CGCACAGGCACTGAATACCCTGGTTAAACAGGGTTCTAGCGGCGGCGATATTAGC GGTATTAACGCGAGCGTTGTCAACATCCAGAAAGAGATCGATCGCCTGAACGAGGTTGCGAAAAACCTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAAGAACTGGGCGGTTCTGG CGGCGCAAATCAGTTTAATAGCGCGATTGGCAAAATTCAGGATAGCCTGAGCAGT ACCGCATCTGCACTGGGTAAACTGCAGGACGTTGTTAATCAGAACGCACAGGCAC TGAACACCCTGGTTAAACAAGGTAGCTCTGGCGGCGATATTAGCGGTATTAACGC GAGCGTCGTCAACATCCAGAAAGAGATCGACCGCCTGAACGAAGTTGCGAAAAAC CTGAACGAGAGCCTGATCGATCTGCAAGAACTGGGCGGTTCTGGCGGCGCAAACC AGTTTAACAGCGCGATCGGCAAAATTCAGGATAGCCTGAGCAGTACCGCATCTGC ACTGGGTAAACTGCAGGACGTTGTTAACCAGAATGCGCAAGCACTGAATACCCTG GTTAAACAG(SEQ ID NO.4)。

本发明的第三方面提供一系列包含本发明第二方面中所述核苷酸序列的重组表达载体。本发明选择的表达载体可以在原核或真核细胞的各种宿主中稳定存在并可自主复制，如本领域中的常规质粒(pET系列)、穿梭载体PNV 18.1、噬菌体或病毒载体等。在载体上通过酶切、连接等分子生物学操作，将本发明第二方面中所述核苷酸序列克隆到载体中，构建得到重组表达载体。

本发明的第四方面提供一系列包含本发明第三方面中所述重组表达载体的重组宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞、酵母或真核细胞，进一步可以选自大肠杆菌、赤红球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌。将本发明第三方面中所述的重组表达载体转化至宿主细胞中，获得相应的基因工程菌。

本发明的第五方面提供一种药物组合物，其包含本发明第一方面中所述抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、本发明第二方面中所述基因、本发明第三方面中所述重组表达载体和/或本发明第四方面中所述重组宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。对于所述药物组合物的制剂形态，本发明不做任何限定，本领域技术人员可根据实际需要确定。

本发明的第六方面提供本发明第一方面中所述抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、本发明第二方面中所述基因、本发明第三方面中所述重组表达载体、本发明第四方面中所述重组宿主细胞和/或本发明第五方面中所述药物组合物在制备用于抗 SARS-CoV-2及其突变株感染的药物中的用途。

本发明第一方面中所述抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、本发明第二方面中所述基因、本发明第三方面中所述重组表达载体、本发明第四方面中所述重组宿主细胞和/或本发明第五方面中所述药物组合物可以用于预防和/或治疗SARS-CoV-2及其突变株感染。

本发明的第七方面提供一种预防和/或治疗SARS-CoV-2及其突变株感染的方法，其包括向受试者施用预防和/或治疗有效量的本发明第一方面中所述抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、本发明第二方面中所述基因、本发明第三方面中所述重组表达载体、本发明第四方面中所述重组宿主细胞和/或本发明第五方面所述药物组合物。

具体而言，本发明如下所述：

[1].一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含n个重复单元1和n-1个重复单元2，n为大于等于2的整数，重复单元1和重复单元2间隔排列，各重复单元之间通过柔性连接子连接，其中，所述重复单元1为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1 中连续的至少42个氨基酸，所述重复单元2为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的至少36 个氨基酸。

[2].根据[1]所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述n 为3，所述重复单元1为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的42或44个氨基酸，所述重复单元2为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的36或40个氨基酸，所述柔性连接子在所述蛋白中各自独立的包含2至5个氨基酸残基；优选地，所述n为3，所述重复单元1为以SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的序列，所述重复单元2为以SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的序列。

[3].根据[1]或[2]所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白的C末端任选地包含蛋白标签，所述蛋白标签与所述重复单元1之间通过所述柔性连接子连接；优选地，所述蛋白标签为6×His标签。

[4].根据[1]至[3]中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白的N末端任选地包含柔性连接子。

[5].根据[1]至[4]中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为以SEQ ID NO.1所示的序列、或为以SEQ ID NO.2 所示的序列、或为与SEQ ID NO.1具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列、或为与SEQ ID NO.2具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列。

所述蛋白还可以是在以SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列的基础上经过取代、缺失、添加或修饰一个或多个氨基酸并且具有抑制SARS-CoV-2及其突变株感染活性的由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。

[6].一种编码[1]至[5]中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为以SEQ ID NO.3所示的序列、或为以SEQID NO.4所示的序列、或为与SEQ ID NO.3具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列、或为与SEQ ID NO.4具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列。

所述编码抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白的基因还可以是在严格条件下与 SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的基因序列杂交且编码具有抑制SARS-CoV-2及其突变株感染活性的蛋白质的DNA分子。

[7].一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含[6]所述的基因；优选的，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体。

[8].一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含[7]所述的重组表达载体；优选的，所述宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞。

[9].一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含[1至[5]中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、[6]所述的基因、[7]所述的重组表达载体和/或 [8]所述的重组宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。

[10].[1]至[5]中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、[6]所述的基因、[7]所述的重组表达载体、[8]所述的重组宿主细胞和/或[9]所述的药物组合物在制备用于抗SARS-CoV-2及其突变株感染的药物中的用途。

发明的效果

通过以上技术方案的实施，本发明取得了以下有益效果：本发明的蛋白能够以SARS-CoV-2刺突蛋白S2亚基中的HR2为靶点抑制病毒感染进程，同时对目前出现的VOC 和VOI变异株也具有较好的抑制活性，另外本发明的蛋白作为抑制剂，具有较高的安全性和较好的成药潜力。

附图说明

图1为SARS-CoV-2 S蛋白及5-Helix-1蛋白组成示意图。

图2a和图2b分别为5-Helix-1蛋白原核表达的Western blotting和考马斯亮蓝染色鉴定结果以及5-Helix-2蛋白原核表达的考马斯亮蓝染色鉴定结果。

图3a和图3b分别为5-Helix-1和5-Helix-2蛋白对SARS-CoV-2 S蛋白所介导的细胞-细胞融合的抑制活性的检测结果；图3c为5-Helix-1蛋白对SARS-CoV-2 S蛋白所介导的细胞- 细胞融合的抑制活性的分析结果。

图4为5-Helix-1和5-Helix-2蛋白对SARS-CoV-2和/或4种VOC及1种VOI假病毒的抑制活性检测结果。

图5a和图5b分别为5-Helix-1蛋白对SARS-CoV-2及B.1.617.2活病毒的抑制活性检测结果。

图6a和图6b分别为5-Helix-1蛋白与SARS-CoV-2 HR2多肽结合能力的正反向ELISA 检测结果。

图7为5-Helix-1蛋白对SARS-CoV-2的HR2多肽的结合动力学曲线。

图8a和图8b分别为5-Helix-1和5-Helix-2蛋白及其与SARS-CoV-2的HR2多肽结合后的α-螺旋度检测结果。

图9为5-Helix-1蛋白抑制HR1P与HR2P复合物的形成的Native-PAGE检测结果。

图10为5-Helix-1蛋白对SARS-CoV-2六螺旋形成的抑制活性检测结果。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。

在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。

在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。

在本发明中，氨基酸缺失可指从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。

在本发明中，氨基酸添加可指在氨基酸序列的C端、N端或C端与N端中间的任意位置处添加1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。

在本发明中，氨基酸修饰可以包括对天然序列的修饰，例如官能团的修饰、分子内共价键合(例如，侧链之间成环)、甲基化、酰基化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化等。

在本发明中，氨基酸取代可指在氨基酸序列的某个位置的氨基酸被其他氨基酸替代，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，指与原有氨基酸序列相比，若干个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所取代而形成肽(保守性变异肽)。示例性的，这些保守性变异肽可以根据下列氨基酸取代而产生：Val、Leu或Ile对Ala的取代，Lys、Gln、Asn或His对Arg的取代，Gln、His、Lys或Arg 对Asn的取代，Glu或Asn对Asp的取代，Ser或Ala对Cys的取代，Asn或Glu对Gln的取代， Asp或Gln对Glu的取代，Ala对Gly的取代，Asn、Lys、Gln或Arg对His的取代，Leu、Met、 Ala、Val或Phe对Ile的取代，Ile、Met、Ala、Val或Phe对Leu的取代，Asn、Gln或Arg对 Lys的取代，Ile、Leu或Phe对Met的取代，Leu、Val、Ile、Ala或Tyr对Phe的取代，Ala对 Pro的取代，Thr对Ser的取代，Ser或Val对Thr的取代，Phe或Tyr对Trp的取代，Trp、Phe、Thr或Ser对Tyr的取代，及Phe、Ala、Met、Ile或Leu对Val的取代。氨基酸取代也可以是非保守氨基酸取代。

在本发明中，“柔性连接子”包括但不限于烃连接子和肽连接子，所述肽连接子由通过肽键连接的直链或支链氨基酸组成，例如包含小的非极性(例如Gly)和/或极性(例如Ser或Thr)氨基酸残基的肽连接子，具体可以为Gly-Gly、Ser-Gly-Gly、Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly、Gly-Ser-Ser-Gly-Gly等。

在本发明中，“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与大体互补的序列结合的能力，而在这些条件下不发生与非互补对象之间的非特异性结合。对此，所述序列优选为90～100％互补的。将能够互相特异性结合的互补序列的特性应用于例如Northern 或Southern印迹技术中，或是PCR或RT-PCR的引物结合中。根据本发明，杂交在中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件条件下发生。此类杂交条件描述于描述于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

在本发明中，合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。本领域普通技术人员应理解，在本发明中，“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核苷酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、 EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。

在本发明中，宿主细胞可以是真核细胞，例如真菌和酵母，原核细胞，例如肠杆菌科细菌。

在本发明中，任选的药学上可接受的辅料包括但不限于稀释剂、渗透压调节剂、稳定剂、抑菌剂、崩解剂、黏合剂、填充剂、润滑剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、着色剂等。

应当理解的是，在实际应用中，可以将本发明的蛋白或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物作为药物直接给予患者、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予患者。

在本发明中，对所提供的药物组合物的给药形式不做任何限定，例如包括注射(动脉内、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)、粘膜、口服(口服固体制剂、口服液体制剂)、直肠、吸入、植入、局部(例如眼部)给药等。口服固体制剂的非限制性实例包括但不限于散剂、胶囊剂、锭剂、颗粒剂、片剂等。口服或粘膜给药的液体制剂的非限制性实例包括但不限于混悬剂、酊剂、酏剂、溶液剂等。局部给药制剂的非限制性实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药制剂的非限制性实例包括但不限于注射用溶液剂、注射用干粉剂、注射用悬浮液、注射用乳剂等。本发明的组合物还可以制成控制释放或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。

本发明主要基于如下见解而完成：

本申请的发明人等对课题进行了深入研究，前期发明人对SARS-CoV-2膜融合过程中六螺旋(6-HB)晶体结构进行了解析并对HR1与HR2相互作用的位点进行了鉴定，HR1 和HR2区域具有典型的α螺旋特征，在螺旋中，每七个氨基酸组成上升的一圈，这七个氨基酸分别命名为a～g，6-HB由中心的HR1三聚体和插入HR1沟槽中的三分子HR2组成，3 个HR1分子通过a,d位点相互作用形成三聚体，HR1与HR2通过e，g位点相互作用形成6-HB。由此发现可以选取参与形成6-HB融合核心的HR1和HR2多肽，借助于柔性连接子将三分子HR1多肽和两分子HR2多肽串联表达，创造性的设计SARS-CoV-2五螺旋蛋白(5-Helix 蛋白)。其利用HR1三聚体自身的内部相互作用以及HR2多肽的外部作用来稳定HR1的α- 螺旋构象，从而创造出一种靶向HR2靶点的进入抑制剂。所述抑制剂借助于五螺旋中空余的HR2多肽结合位点与HR2之间的强亲和力，可以结合病毒S2蛋白中暴露的HR2，形成稳定的复合物，从而阻止病毒自身六螺旋束的形成，抑制病毒感染进程。5-Helix蛋白的组成及来源示意图如图1所示。

在本发明中，发明人首先通过Western blotting和蛋白质考马斯亮蓝染色鉴定了原核表达的5-Helix蛋白的正确性及其纯度。其次，发明人通过建立的由SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合系统了检测5-Helix蛋白对病毒融合过程的抑制活性。发明人在前期通过将病毒的S蛋白与GFP共表达的方法构建了关于MERS-CoV的细胞-细胞融合系统，并在此系统上，成功地设计并评估了一系列活性较好的MERS-CoV多肽类进入抑制剂(详细方法参考Lu Lu et al.Structure-based discovery of Middle East respiratory syndromecoronavirus fusion inhibitor.[J].Nature communications,2014,5(Jan.):3067.)。在本发明中，发明人采用相同的方法检测了所发明的5-Helix蛋白对SARS-CoV-2的融合抑制效果。结果显示，相比于未改造的SARS-CoV-2 HR1多肽(无显著抑制活性)，5-Helix显示出了较好的抑制效果，IC₅₀为127.87nM。

为了进一步探索本发明中的5-Helix蛋白对SARS-CoV-2原始毒株及WHO公布的VOC及VOI毒株抑制作用的有效性。本发明检测了5-Helix蛋白对SARS-CoV-2原始毒株、4种 VOC毒株和1种VOI毒株假病毒的抑制活性。结果显示5-Helix蛋白对6种不同类型的假病毒的IC₅₀均在500nM以下，表明病毒变异并未对5-Helix蛋白的抑制活性造成显著影响。该结果与之前对SARS-CoV-2 S蛋白介导细胞-细胞融合抑制活性的结果较为一致。虽然含有 SARS-CoV-2包膜蛋白的假病毒可以很好的模拟活病毒感染的结合受体及膜融合过程，药物的可靠抑制活性仍然需要真实的活病毒的进一步检测。因此，本发明依托于复旦大学 P3实验室进行了5-Helix蛋白对SARS-CoV-2和目前国内阳性病例检出率高的B.1.617.2活病毒的感染抑制活性检测。结果显示5-Helix蛋白对两种活病毒的IC₅₀均低于300nM，与假病毒感染抑制活性基本相符。

本发明中5-Helix蛋白不仅显示出对于SARS-CoV-2及VOC毒株的假病毒感染、SARS-CoV-2介导细胞-细胞融合及活病毒感染的良好抑制活性，而且该蛋白的抗病毒机制也得到了明确阐释。结果显示，无论将5-Helix蛋白作为固相载体还是结合配体，该蛋白均显示出与SARS-CoV-2 HR2多肽的强结合能力(半数有效结合浓度EC₅₀低于20nM)。在生物膜干涉实验中，5-Helix蛋白展现出与SARS-CoV-2 HR2多肽的强亲和力，而且结合后几乎无解离(解离常数KD为17.3nM)，表明该蛋白可以迅速高效结合到病毒暴露的 HR2上，且该结合十分稳定不易解离。而在蛋白的二级结构检测中发现5-Helix蛋白本身具有极高的α-螺旋含量，并且其含量与SARS-CoV-2 HR1P和SARS-CoV-2 HR2P混合后形成的6-HB类似结构的螺旋度相当，该结果符合5-Helix五螺旋结构的特征。在Native PAGE 实验中，HR1P和HR2P混合后产生了一条新的条带，为疑似6-HB条带，而5-Helix蛋白的加入可以显著抑制该条带的含量，并且这种抑制作用随着蛋白浓度升高而增强。在竞争 ELISA实验中，5-Helix蛋白可以显著抑制游离的HR2P与包被的HR1P的结合从而阻止显色，抑制6-HB形成的IC₅₀为511.10nM。通过上述机制探索可见，5-Helix蛋白可以强亲和力结合SARS-CoV-2 HR2，形成稳定复合物，竞争性抑制病毒自身HR1与其结合，从而阻止病毒融合抑制感染。

综上所述，5-Helix是一种以SARS-CoV-2 HR2为靶点的新型进入抑制剂，具有高效的病毒感染抑制效果，并且其抑制活性不受病毒变异的影响，对于SARS-CoV-2、VOC和 VOI均表现出较好的抑制效果。此外，其清晰的抗病毒机制也保证了其应用的安全性及优化途径的明确性，便于后期进一步开发研究。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。

实施例中所使用的蛋白材料是发明人基于SARS-CoV-2 6-HB的晶体结构分析以及HR1和HR2相互作用氨基酸位点，设计的衍生于6-HB的“仿生”五螺旋，通过选择不同的连接子，设计了两种5-Helix蛋白(即5-Helix-1和5-Helix-2)。然后借助Western blotting 和/或考马斯亮蓝染色确定了蛋白的正确性及纯度。

实施例1：5-Helix蛋白的鉴定

(一)、实验方法：

取5×蛋白上样缓冲液，与四倍体积的纯化得到的5-Helix蛋白混合，100℃煮沸10分钟。然后点样(每孔20微升)于15％的聚丙烯酰胺凝胶中，80V恒压电泳20分钟，切换为120V恒压电泳45分钟。一份样品用于考马斯亮蓝染色。另一份样品转移至硝酸纤维素膜上，经5％脱脂乳封闭后，孵育HRP偶连抗6×His抗体，然后用底物发光液进行显影。

(二)、结果与分析：

通过Western blotting和/或蛋白质考马斯亮蓝染色鉴定原核表达的5-Helix蛋白的正确性及其纯度，结果如图2所示。图2a中左图显示转移至硝酸纤维素膜上的蛋白可被抗6× His抗体识别，结合底物后显影产生条带。该条带单一且特异，分子量约25kDa，与预测的5-Helix-1蛋白分子量相符，表明该蛋白表达正确。图2a右图显示经考马斯亮蓝染色后，聚丙烯酰胺凝胶中产生单一的条带，该条带位置与Western blotting中的一致，表明经蛋白纯化后获得纯净的产物。图2b中5-Helix-2蛋白经凝胶分离后也产生单一的条带，表明该蛋白较为纯净，且该条带位置处的分子量与预期一致。

实施例2：5-Helix蛋白对SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合抑制活性测定

(一)、实验方法：

1、将编码SARS-CoV-2 S蛋白与eGFP的表达质粒转染293T细胞，转染后继续培养24～36小时，作为效应细胞，称之为293T/S/eGFP。同时将转染空载体的293T细胞作为阴性对照细胞。

2、将上述细胞用0.02％EDTA胰酶消化后，离心，用含有10％胎牛血清的细胞培养基重悬细胞。将浓度为2×10⁵个/毫升的细胞(50微升)加到相同体积的梯度稀释好的药物板中。37℃孵育30分钟。

3、将上述效应细胞/药物混合物取100微升加至靶细胞(Huh7细胞)上。37℃细胞培养箱中培养2～3小时，用荧光显微镜中的GFP通道观察并记录细胞融合情况。

(二)、结果与分析：

1、如图3a所示，随着5-Helix-1蛋白浓度的降低，效应细胞与靶细胞融合形成的合胞体数目不断增多。相同条件下。10000nM和3333nM的5-Helix-1蛋白几乎可以100％抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的融合。而未用蛋白处理的阴性对照孔，效应细胞与靶细胞几乎完全融合。

2、如图3b所示，5-Helix-2具有类似的抑制效应细胞与靶细胞融合的作用，10000nM 和5000nM的5-Helix-2蛋白几乎100％抑制合胞体形成。

3、如图3c所示，经数据分析发现，5-Helix-1具有良好的抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合的活性，其IC₅₀约127nM，而未经改造的HR1多肽则无显著活性。

实施例3：5-Helix蛋白对SARS-CoV-2和/或VOC及VOI假病毒的抑制活性测定

(一)、实验方法：

1、将表达纯化的5-Helix-1和2蛋白分别用Nanodrop分光光度计准确测定浓度，并根据分子量(25.37kDa和22.69kDa)计算其摩尔浓度。

2、将表达ACE2受体的人结肠癌细胞(Caco-2)和过表达ACE2的293T细胞 (ACE2/293T)分别按10⁴个/毫升接种96孔板(每孔0.1毫升)。

3、在96孔板中将5-Helix蛋白倍比稀释，每孔50微升。

4、5-Helix-1蛋白抑制活性在Caco-2细胞上检测，5-Helix-2蛋白抑制活性在ACE2/293T 细胞上检测。将各种假病毒按照等体积加入倍比稀释的蛋白孔中。37℃作用30分钟。取 100微升蛋白/假病毒混合物加至去除上清的靶细胞上。37℃培养12h后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基。72h后测定荧光素酶(luciferase)表达水平，计算制作抑制率曲线，并计算药物的半数有效剂量(IC₅₀)。

(二)、结果与分析：

以目前正在流行的SARS-CoV-2以及当下普遍关注的VOC和VOI变异株作为检测对象，在假病毒系统上检测5-Helix蛋白的抗病毒活性。如图4左图所示，5-Helix-1蛋白对于SARS-CoV-2及各突变株的假病毒均有较好的感染抑制效果，其IC₅₀值均小于400nM，表1 进一步系统的显示了5-Helix-1蛋白在6种不同的假病毒上的IC₅₀、半数细胞毒性浓度(CC₅₀)及选择指数(SI)。图4右图所示，5-Helix-2蛋白对于SARS-CoV-2假病毒也有较好感染抑制效果(IC₅₀约1nM)。

表1 5-Helix-1蛋白对SARS-CoV-2、VOC和VOI假病毒的抑制活性及选择指数

由此可见，基于保守靶点6-HB设计的5-Helix蛋白的活性并不会由于病毒变异产生显著下降。

实施例4：5-Helix-1蛋白对SARS-CoV-2及B.1.617.2活病毒的抑制活性测定

(一)、实验方法：

1.活病毒抑制活性检测中，蛋白稀释及病毒孵育方法与实施例3中假病毒实验相同。

2.将蛋白/病毒混合物，加到细胞上。37℃培养1h后更换含10％FBS的新鲜DMEM培养基。48h后收取细胞上清，提取RNA。通过荧光定量PCR，检测各孔病毒核衣壳蛋白基因(N基因)的拷贝数，计算制作抑制率曲线，并计算药物的半数有效剂量(IC₅₀)。

(二)、结果与分析：

假病毒拥有完整的SARS-CoV-2 S蛋白包膜，可以在一定程度上模拟病毒感染的进入环节，但无法替代活病毒在药物活性检测中的作用。

图5统计结果显示，5-Helix-1对于SARS-CoV-2原型毒株以及目前国内新增病例检出率高的B.1.617.2变异株均有良好的感染抑制活性，IC₅₀均小于300nM。活病毒感染模型上的验证结果与假病毒基本一致。此外将表1中5-Helix-1蛋白对于各种假病毒的IC₅₀及CC₅₀综合比较，发现其安全指数均大于100，表明该蛋白具有较高的安全性和较好的成药潜力。

实施例5：5-Helix蛋白抗病毒作用机制研究

(一)、实验方法：

1、ELISA检测5-Helix-1蛋白与SARS-CoV-2 HR2多肽的结合。将5-Helix-1蛋白按照 100ng/孔(50μL)加入ELISA板中，4℃包被过夜。以3％脱脂乳封闭后，加入倍比稀释的生物素标记的HR2多肽，室温孵育1小时。随后加入辣根过氧化物酶偶连的链霉亲和素用于检测结合的多肽。加入TMB底物显色并终止后，通过酶标仪检测405nm的吸光度。

2、生物膜干涉实验检测5-Helix-1蛋白与SARS-CoV-2 HR2多肽的结合动力学曲线。将生物素标记的SARS-CoV-2 HR2多肽浓度调为500ng/mL，按照每孔200微升，载到链霉亲和素生物传感器中，然后以PBST倍比稀释5-Helix-1蛋白，加入待检测配体孔中。结合和解离时间均设为1200s。通过1:1结合模型，计算平衡解离常数(K_D)。

3、圆二色谱测定蛋白二级结构。用50mmol/L，pH7.2的磷酸缓冲液将游离多肽或多肽混合物稀释到终浓度为10μmol/L。使用分光偏振仪(J-815型，Jasco Inc，Japan)测定圆二色谱。检测温度4℃，带宽5.0nm，解析度0.1nm，光径0.1cm，反应时间4.0s，扫描速度50nm/min。减去缓冲溶液的空白对照来校正谱值。

4、丙稀酰胺凝胶电泳(N-PAGE)。将5-Helix-1蛋白与HR2多肽预先孵育1小时，然后与HR1多肽混合，37℃孵育30分钟。取5×高PH值上样缓冲液，与4倍体积的多肽蛋白混合物混匀。然后点样(每孔25μL)于18％非变性胶中(北京天恩泽)，于室温下125V 恒压电泳2小时。考马斯亮蓝染色。

5、6-HB形成抑制活性检测。将50微升的5-Helix-1蛋白与生物素标记的HR2多肽(3μM)，37℃孵育30分钟。然后将上述混合物添加至包被有HR1三聚体的96孔板中， 37℃孵育1小时。随后加入辣根过氧化物酶偶连的链霉亲和素用于检测结合的多肽。加入 TMB底物显色并终止后，通过酶标仪检测405nm的吸光度。

(二)、结果与分析：

1、如图6a、6b中所示，正反向ELISA均能够检测到5-Helix-1蛋白与SARS-CoV-2HR2 多肽的结合，其半数有效结合浓度均小于20nM。表明在极微量的情况下，5-Helix-1蛋白即可与HR2靶点强效结合。

2、生物膜干涉可以检测蛋白与其结合靶点的动力学变化。从图7中可看出，5-Helix-1 蛋白可快速与SARS-CoV-2 HR2多肽结合，且结合后几乎不解离。表明5-Helix-1蛋白不仅可以强效结合靶点，结合后形成的复合物稳定性强，不会发生解离，即完全阻断病毒自身HR1结合HR2。

3、从图8a所示的圆二色谱结果可知，5-Helix-1蛋白在208nm和222nm有两个特征性的负光吸收峰，表明其α-螺旋含量较高。并且5-Helix-1蛋白能够与HR1多肽和HR2多肽结合后形成的6-HB较好拟合，表明二者结构或构象相似，这也与从6-HB中去除一分子HR2 形成5-Helix的假设相符。另外，如图8b所示，5-Helix-2蛋白也展现出较高的α-螺旋含量。它可以和HR2多肽结合形成螺旋度更高的复合物，这种复合物的含量与5-Helix-2蛋白的添加量呈正相关，表明5-Helix-2蛋白可以剂量依赖性与HR2多肽形成6-HB。

4、如图9所示，SARS-CoV-2 HR1多肽与HR2多肽混合后，可以产生一条分子量较大的可能是6-HB的新条带(HR1P/HR2P复合物)。而随着5-Helix-1蛋白量的提高，可以显著降低该复合物的含量。当5-Helix-1蛋白达到32μM时，6-HB几乎消失。表明5-Helix-1蛋白对于6-HB形成具有显著抑制作用。

5、如图10所示，5-Helix-1蛋白可以通过竞争HR2多肽直接抑制6-HB的形成，并且该抑制作用明显强于单一的HR1多肽。该实验结果表明，5-Helix-1蛋白是一种强效的6-HB形成抑制剂。

综上所述，本发明提供的5-Helix蛋白具有高效的抗SARS-CoV-2病毒活性，并且可对目前出现的VOC和VOI变异株同样展现较好的抑制活性。5-Helix蛋白抗病毒的主要机制是通过结合病毒的HR2靶点，形成稳定牢固的异源6-HB，阻止病毒自身HR2与HR1三聚体的结合，使其难以形成同源6-HB，进而打破了病毒与细胞膜融合的主要驱动力，阻止了病毒感染。

序列表

<110> 复旦大学

南方医科大学

山西锦波生物医药股份有限公司

<120> 一种抑制SARS-CoV-2感染的蛋白及其用途

<130> 6C39-2128644IP

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-1蛋白氨基酸序列

<400> 1

Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn

20 25 30

Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Gly Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile

50 55 60

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

65 70 75 80

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Leu Ile

85 90 95

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

100 105 110

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

115 120 125

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Gly Gly Ser Gly Gly Asp

130 135 140

Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys

145 150 155 160

Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu

165 170 175

Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gly Leu Ile Ala Asn

180 185 190

Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr

195 200 205

Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

210 215 220

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Gly Gly His His His His His His

225 230 235 240

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-2蛋白氨基酸序列

<400> 2

Ser Gly Gly Gly Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln

1 5 10 15

Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

20 25 30

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Gly Ser

35 40 45

Ser Gly Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln

50 55 60

Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser

65 70 75 80

Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asn Gln Phe

85 90 95

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

100 105 110

Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu

115 120 125

Asn Thr Leu Val Lys Gln Gly Ser Ser Gly Gly Asp Ile Ser Gly Ile

130 135 140

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

145 150 155 160

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

165 170 175

Gly Ser Gly Gly Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln

180 185 190

Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

195 200 205

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln

210 215 220

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-1蛋白编码基因核苷酸序列

<400> 3

ttgattgcca accaatttaa tagtgctatt ggcaaaattc aagactcact ttcttccaca 60

gcaagtgcac ttggaaaact tcaagatgtg gtcaaccaaa atgcacaagc tttaaacacg 120

cttgttaaac aaggaggatc tggaggagat ttaggtgaca tctctggcat taatgcttca 180

gttgtaaaca ttcaaaaaga aattgaccgc ctcaatgagg ttgccaagaa tttaaatgaa 240

tctctcatcg atctccaaga acttggagga tcttctggag gattgattgc caaccaattt 300

aatagtgcta ttggcaaaat tcaagactca ctttcttcca cagcaagtgc acttggaaaa 360

cttcaagatg tggtcaacca aaatgcacaa gctttaaaca cgcttgttaa acaaggagga 420

tctggaggag atttaggtga catctctggc attaatgctt cagttgtaaa cattcaaaaa 480

gaaattgacc gcctcaatga ggttgccaag aatttaaatg aatctctcat cgatctccaa 540

gaacttggag gatcttctgg aggattgatt gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa 600

attcaagact cactttcttc cacagcaagt gcacttggaa aacttcaaga tgtggtcaac 660

caaaatgcac aagctttaaa cacgcttgtt aaacaaggag gacatcacca tcatcaccat 720

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-2蛋白编码基因核苷酸序列

<400> 4

agtggtggcg gcgcaaatca gtttaatagc gcgattggca aaatccagga tagcctgagt 60

agtaccgcat ctgcactggg taaactgcaa gatgttgtta accagaacgc acaggcactg 120

aataccctgg ttaaacaggg ttctagcggc ggcgatatta gcggtattaa cgcgagcgtt 180

gtcaacatcc agaaagagat cgatcgcctg aacgaggttg cgaaaaacct gaacgagagc 240

ctgatcgatc tgcaagaact gggcggttct ggcggcgcaa atcagtttaa tagcgcgatt 300

ggcaaaattc aggatagcct gagcagtacc gcatctgcac tgggtaaact gcaggacgtt 360

gttaatcaga acgcacaggc actgaacacc ctggttaaac aaggtagctc tggcggcgat 420

attagcggta ttaacgcgag cgtcgtcaac atccagaaag agatcgaccg cctgaacgaa 480

gttgcgaaaa acctgaacga gagcctgatc gatctgcaag aactgggcgg ttctggcggc 540

gcaaaccagt ttaacagcgc gatcggcaaa attcaggata gcctgagcag taccgcatct 600

gcactgggta aactgcagga cgttgttaac cagaatgcgc aagcactgaa taccctggtt 660

aaacag 666

<210> 5

<211> 44

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-1蛋白氨基酸序列中的重复单元1

<400> 5

Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn

20 25 30

Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln

35 40

<210> 6

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-1蛋白氨基酸序列中的重复单元2

<400> 6

Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln

1 5 10 15

Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser

20 25 30

Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

35 40

<210> 7

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-2蛋白氨基酸序列中的重复单元1

<400> 7

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

20 25 30

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln

35 40

<210> 8

<211> 36

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5-Helix-2蛋白氨基酸序列中的重复单元2

<400> 8

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1 5 10 15

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35

Claims

1.一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含n个重复单元1和n-1个重复单元2，n为大于等于2的整数，重复单元1和重复单元2间隔排列，各重复单元之间通过柔性连接子连接，其中，所述重复单元1为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的至少42个氨基酸，所述重复单元2为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的至少36个氨基酸。

2.根据权利要求1所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述重复单元1为SARS-CoV-2刺突蛋白HR1中连续的42或44个氨基酸，所述重复单元2为SARS-CoV-2刺突蛋白HR2中连续的36或40个氨基酸，所述柔性连接子在所述蛋白中各自独立的包含2至5个氨基酸残基；

优选地，所述n为3，所述重复单元1为以SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的序列，所述重复单元2为以SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的序列。

3.根据权利要求1或2所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白的C末端任选地包含蛋白标签，所述蛋白标签与所述重复单元1之间通过所述柔性连接子连接；优选地，所述蛋白标签为6×His标签。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白的N末端任选地包含柔性连接子。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为以SEQ ID NO.1所示的序列、或为以SEQ ID NO.2所示的序列、或为与SEQ ID NO.1具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列、或为与SEQ ID NO.2具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列。

6.一种编码权利要求1至5中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为以SEQ ID NO.3所示的序列、或为以SEQID NO.4所示的序列、或为与SEQ ID NO.3具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列、或为与SEQ ID NO.4具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性的序列。

7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求6所述的基因；优选的，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体。

8.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达载体；优选的，所述宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1至5中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、权利要求6所述的基因、权利要求7所述的重组表达载体和/或权利要求8所述的重组宿主细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。

10.权利要求1至5中任一项所述的一种抑制SARS-CoV-2及其突变株感染的蛋白、权利要求6所述的基因、权利要求7所述的重组表达载体、权利要求8所述的重组宿主细胞和/或权利要求9所述的药物组合物在制备用于抗SARS-CoV-2及其突变株感染的药物中的用途。