CN113559239B

CN113559239B - 融合蛋白在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN113559239B
Application number: CN202110749034.0A
Authority: CN
Inventors: 姜世勃; 陆路; 蔡艳星; 徐巍; 王茜
Original assignee: Shanghai Xuhui Shangyi Zhongshan Immunotherapy Technology Transformation Research Center; Fudan University
Current assignee: Shanghai Xuhui Shangyi Zhongshan Immunotherapy Technology Transformation Research Center; Fudan University
Priority date: 2021-07-01
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2041-07-01
Also published as: CN113559239A

Abstract

本发明提供GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用，所述呼吸道疾病由冠状病毒感染导致，所述GL15E具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、所述GL25E具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、所述GL35E具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明提供了能够高效抑制冠状病毒感染的三种融合蛋白GL15E、GL25E和GL35E，其对由冠状病毒具有良好的抑制活性，可用于制备预防和/或治疗由冠状病毒感染导致的呼吸道疾病的药物。

Description

融合蛋白在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。

背景技术

冠状病毒嵌套式包膜病毒，其表面刺突(spike/S)蛋白在电镜下呈冠状，因此得名。冠状病毒可分为α、β、γ和δ四型，而β型又包括A、B、C和D四个亚型。迄今为止，全球范围已发生过三次高致病性冠状病毒感染的爆发：2002年的重症急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus，SARS-CoV)、2012年的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS)和2019年的新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2，SARS-CoV-2)。其中，SARS-CoV-2主要通过呼吸道和消化道感染人体，具有极强的传染性。到目前为止，SARS-CoV-2已扩散全球223个国家和地区，共造成约308万人死亡。随着SARS-CoV-2突变株的出现，SARS-CoV-2全球大流行的形势也在不断恶化。鉴于冠状病毒的高突变性，因此有必要研发高效且广谱的抗冠状病毒药物。

发明内容

本发明提供GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用。

本发明还提供一种预防和/或治疗呼吸道疾病的药物，该药物包括GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白中的一种。

本发明第一方面提供GL15E、GL25E和GL35E在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用，所述呼吸道疾病由冠状病毒感染导致，所述GL15E具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、所述GL25E具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、所述GL35E具有如SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述冠状病毒包括新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63和人冠状病毒OC43中的一种或多种。

进一步地，所述新型冠状病毒包括野生型冠状病毒及S蛋白发生突变的突变株，所述S蛋白发生突变的突变株包括V341I、R408I、G476S、V483A、N501Y中的一种或多种。

进一步地，所述呼吸道疾病包括新型冠状病毒肺炎、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征。

进一步地，所述预防和/或治疗呼吸道疾病的药物采用鼻腔给药方式。

进一步地，在冠状病毒感染前0.5小时或冠状病毒感染后0.5小时进行鼻腔给药。

进一步地，所述GL25E的给药剂量不低于0.4mg/kg。

进一步地，GL15E、GL25E和GL35E的CC50大于10000nM。

进一步地，GL15E、GL25E和GL35E通过抑制冠状病毒S蛋白介导的细胞融合以预防和/或治疗呼吸道疾病。

本发明第二方面提供一种预防和/或治疗呼吸道疾病的药物，所述呼吸道疾病由冠状病毒感染导致，所述药物包括GL15E、GL25E和GL35E中的一种，所述GL15E具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列、所述GL25E具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、所述GL35E具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了能够高效抑制冠状病毒感染的三种融合蛋白GL15E(griffithsin-L15-EK1)、GL25E(griffithsin-L25-EK1)和GL35E(griffithsin-L35-EK1)，其对由冠状病毒具有良好的抑制活性，可用于制备预防和/或治疗由冠状病毒感染导致的呼吸道疾病的药物。

附图说明

图1为本发明提供的GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白的SDS-PAGE和Westernblot鉴定图；

图2为本发明提供的GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白在HuH-7和Caco-2细胞上抑制SARS-CoV-2假病毒感染的效果图；

图3为本发明提供的GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白的体外安全性检测结果；

图4为本发明提供的GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2突变体V341I、R408I、G476S、V483A和N501Y感染的效果图；

图5为本发明提供的GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E和HCoV-OC43S假病毒感染的效果图；

图6为本发明提供的GL25E融合蛋白与SARS-CoV-2S1蛋白和RBD的结合；

图7为本发明提供的GL25E融合蛋白在甘露糖存在情况下与S1蛋白和RBD结合的检测结果图；

图8为本发明提供的GL25E融合蛋白抑制HR1P和HR2P形成的6HB结果图；

图9为本发明提供的GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E和HCoV-OC43介导的细胞-细胞融合的检测结果图；

图10为本发明提供的GL25E融合蛋白抑制HCoV-OC43和HCoV-229E活病毒感染的检测结果图；

图11为本发明提供的GL25E融合蛋白攻毒前给药和攻毒后给药抑制HCoV-OC43感染小鼠的检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白的表达、纯化与鉴定

1、将GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白的基因序列经密码子优化后，通过NdeⅠ和XhoⅠ双酶切构建到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，得到重组质粒，随后将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上。

2、挑选单个阳性克隆，接种于5mL的LB培养液(含有50μg/mL卡那霉素)中，37℃、220rpm的条件下预培养过夜；随后将预培养液按1：200的比例接种于1L的LB培养液(含有50μg/mL卡那霉素)中，37℃、220rpm的条件下培养，直至菌液的OD600值达到0.5左右；将菌液置于4℃条件下，放置半小时，加入1mM的IPTG，并于16℃、180rpm的条件下继续培养20小时。

3、将培养结束后的培养液在8000rpm离心3分钟，收集菌液，并用100mL的PBS重悬。将重悬的菌液用超声破碎后，10000rpm、4℃条件下离心30分钟，上清用0.45μm的滤膜过滤。取1mL经Binding buffer(10mM咪唑、20mM Na₂HPO₄、0.5M NaCl，pH7.4)平衡过的镍柱材加入培养上清中，室温结合2小时。

4、将步骤3中的液体过纯化柱，并用50倍体积的Washing buffer(20mM咪唑、20mMNa₂HPO₄、0.5M NaCl，pH7.4)进行洗杂。最后用5倍体积的Elution buffer(500mM咪唑、20mMNa₂HPO₄、0.5M NaCl，pH7.4)进行洗脱。将洗脱下的蛋白进行超滤5-6次，将buffer置换成PBS，得到纯化好的融合蛋白。

5、取纯化的蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，待电泳完毕，分别进行考马斯亮蓝染色和Western blot进行鉴定。

结果如图1所示，其中，图1中a为GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白的SDS-PAGE鉴定图，b为GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白的Western blot鉴定图，如图1所示，GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白均迁移到与预期条带大小相符的位置(GL15E：20kDa；GL25E：21kDa；GL35E：22kDa)。

实施例2抑制冠状病毒SARS-CoV-2的假病毒感染实验

本实施例以SASR-CoV-2假病毒系统为工具，分别在HuH-7和Caco-2细胞上检测GL15E、GL25E和GL35E抑制SARS-CoV-2假病毒感染的活性，具体步骤如下：

1、使用无血清DMEM培养基在96孔圆底板中梯度稀释GL15E、GL25E、GL35E、GRFT和EK1，共稀释8个浓度，每孔加药体积为100μL，每个梯度设置3个重复，GRFT和EK1作为阳性对照，EK1具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，由吉尔生化公司合成，GRFT具有如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列；

2、将100μL假病毒液(RLU:20000～100000)加入本实施例步骤(1)中的96孔板(加药物及病毒孔记为药物孔)，同时设置病毒感染的阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)及阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，病毒与药物37℃条件下孵育1h；

3、本实施例步骤(2)中的混合液200μL加入铺有HuH-7细胞(该细胞购于购自中科院细胞库，货号SCSP-526)或Caco-2细胞(该细胞购于购自中科院细胞库，货号TCHu146)的96孔板中。37℃、5％CO₂条件下培养12h，更换培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；

4、继续培养48h后，弃去培养上清并用PBS将细胞洗涤一次，加入50μL细胞裂解液(购于Promega公司，货号0000389797)常温裂解1h。吸取40μL裂解上清加入96孔检测板，加入40μL的底物(购于Promega公司，货号0000369690)后，马上检测荧光值；

5.计算假病毒感染的抑制率，计算公式为：抑制率＝(病毒孔-药物孔)/(病毒孔-无药物孔)×100％。

结果如图2所示，图2中a为本发明提供的GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白对HuH-7细胞的效果图，b为本发明提供的GL15E、GL25E和GL35E三种融合蛋白对Caco-2细胞的效果图，如图2所示，GL15E、GL25E和GL35E能够高效地抑制SARS-CoV-2假病毒的感染，且其抑制效果要强于单独使用GRFT和EK1：在HuH-7细胞上的半抑制浓度(IC50)分别为67.0nM、19.8nM和24.3nM，抑制效果要优于EK1(IC50为2459.2nM)和GRFT(griffithsin)(IC50为510.8nM)；在Caco-2细胞上的IC50分别为26.9nM、8.7nM和9.0nM，抑制效果要优于EK1(IC50为656.1nM)和GRFT(IC50为885.7nM)。

实施例3GL15E、GL25E和GL35E的体外安全性检测

1、使用含有10％FBS的DMEM培养基在96孔圆底板中梯度稀释GL15E、GL25E和GL35E，共稀释6个浓度，每孔加药体积为200μL，每个梯度设置3个重复；同时含有等体积PBS的DMEM培养基(含有10％FBS)作为细胞对照孔。

2、本实施例步骤(1)中的混合液200μL加入铺有HuH-7细胞(该细胞购于购自中科院细胞库，货号SCSP-526)的培养孔中。37℃、5％CO₂条件下培养48h。

3、弃去培养上清，并加入用无血清DMEM 20倍稀释的CCK-8(购于MCE公司，货号HY-K0301)，继续培养1-2小时后，检测其OD450的吸光度。

4、计算细胞活力，计算公式为：抑制率＝药物孔/细胞孔×100％。

结果如图3所示，在10000nM的浓度下，GL15E、GL25E和GL35E处理的细胞的活力值都在80％以上，显示其半数细胞毒性浓度(CC50)要大于10000nM。

实施例4GL25E抑制SARS-CoV-2突变体(V341I、R408I、G476S、V483A和N501Y)感染的效果图

本申请构建S蛋白突变(V341I、R408I、G476S、V483A和N501Y)的SARS-CoV-2假病毒，检测GL25E对SARS-CoV-2突变株的抑制效果，具体步骤如下：

1、使用无血清DMEM培养基在96孔圆底板中梯度稀释GL25E、GRFT和EK1，共稀释8个浓度，每孔加药体积为100μL，每个梯度设置3个重复；

3、本实施例步骤(2)中的混合液200μL加入铺有HuH-7细胞(该细胞购于购自中科院细胞库，货号SCSP-526)的96孔板中。37℃、5％CO₂条件下培养12h，更换培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；

结果如图4所示，图4中a为本发明提供的GL25E融合蛋白抑制V341I感染的效果图，b为GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2突变体R408I感染的效果图，c为GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2突变体G476S感染的效果图，d为GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2突变体V483A感染的效果图，e为GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2突变体N501Y感染的效果图，如图4所示，结果表明GL25E抑制突变株感染的效果要显著优于EK1和GRFT。

实施例5GL25E抑制SARS-CoV(a)、MERS-CoV(b)、HCoV-NL63(c)、HCoV-229E(d)和 HCoV-OC43(e)假病毒感染的检测结果图

本实施例以SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-229E和HCoV-OC43活病毒感染模型为工具，体外检测GL25E抑制活病毒感染的效果，具体步骤如下：

3、本实施例步骤(2)中的混合液200μL加入铺有靶细胞(RD细胞为HCoV-OC43的靶细胞，该细胞购于购自ATCC，货号CCL-136TM；HuH-7为除HCoV-OC43外的四个假病毒的靶细胞，该细胞购于购自中科院细胞库，货号SCSP-526)的96孔板中。37℃、5％CO₂条件下培养12h，更换培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；

结果如图5所示，a为GL25E抑制SARS-CoV假病毒感染，b为GL25E抑制MERS-CoV假病毒感染，c为GL25E抑制HCoV-NL63假病毒感染，d为GL25E抑制HCoV-229E假病毒感染，e为GL25E抑制HCoV-OC43假病毒感染，如图5所示，GL25E可有效抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、和人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)的假病毒感染，且其抑制效果要优于EK1和GRFT。

实施例6GL25E能够识别S1亚单位和RBD

1、50μL的S1亚单位(2μg/ml)或RBD(2μg/ml)加入96孔酶标板(Corning公司)，37℃条件下反应2h；

2、用PBST洗2次，每次5分钟，加入2％明胶的PBST，37℃条件下反应2h；

3、用PBST洗2次，每次5分钟，分别加入梯度稀释的GL25E或BSA，每孔50μl，两者的起始浓度都为100nM，37℃条件下反应1h；

4、用PBST洗3次，每次5分钟。加入50μl的HRP标记的二抗(1：5000，购于ProteinTtech公司，货号HRP-66005)，37℃条件下反应1h；

5、用PBST洗4次，每次5分钟。加入50μl的TMB，待显色后用50μl的终止液终止反应，在酶标仪OD 450下测定各孔的吸光度度值。

结果如图6所示，其中，a为GL25E与SARS-CoV-2S1蛋白的结合，b为GL25E与和RBD的结合，如图6所示，GL25E能够以浓度依赖性的方式结合S1亚单位和RBD，但无关蛋白BSA不能结合S1亚单位和RBD，表明GL25E能够识别并结合S1亚单位和RBD。

实施例7甘露糖能够抑制GL25E与S1亚单位和RBD的结合

1、50μl的S1亚单位(2μg/ml，购于Kactus Biosystems公司，货号COV-VM5S1)或RBD(2μg/ml，购于Kactus Biosystems公司，货号COV-VM5BD)加入酶标板(Corning公司)，37℃条件下反应2h；

2、用PBST洗2次，每次5分钟。加入2％明胶的PBST，37℃条件下反应2h；

3、提前1h将甘露糖加入2μg/ml的GL25E中，甘露糖的终浓度分别为4、16、64mM，加入等体积PBS的GL25E作为对照组，37℃条件下反应1h；

4、酶标板用PBST洗2次，每次5分钟。将(3)中的混合物50μl加入孔中，37℃条件下反应1h；

5、用PBST洗3次，每次5分钟。加入50μl的HRP标记的二抗(1：5000，购于ProteinTtech公司，货号HRP-66005)，37℃条件下反应1h；

6、用PBST洗4次，每次5分钟。加入50μl的TMB，待显色后用50μl的终止液终止反应，在酶标仪OD 450下测定各孔的吸光度度值。

结果如图7所示，其中，a为甘露糖抑制GL25E与S1蛋白结合的检测结果图，b为甘露糖抑制GL25E与RBD结合的检测结果图，如图7所示，甘露糖能够抑制GL25E与S1亚单位和RBD的结合，随着甘露糖浓度的增加，GL25E与S1亚单位和RBD的结合则逐渐减少，表明GL25E以一种糖基依赖性的方式结合S1亚单位和RBD。

实施例8GL25E抑制6-HB形成的检测

本实施例以Native-PAGE为研究手段，检测GL25E是否同时保持GRFT和EK1的生物学活性。检测显示GL25E能够以浓度依赖性的方式。

1、20μmol的HR1P溶解于PBS中，加入不同浓度的GL25E，在25℃条件下反应30分钟，HR1P具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

2、加入10μmol的HR2P，在25℃条件下反应30分钟，加入高pH值非变性loadingbuffer，HR2P具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

3、将上述混合物加入10％的native-PAGE中，在4℃、120V条件下进行电泳。待溴酚蓝电泳出PAGE胶后，停止电泳。

4、将Native-PAGE胶切下，置于考马斯亮蓝染色液中染色过夜。将染好的PAGE胶置于脱色液中脱色后拍照。

结果如图8所示，GL25E能够以浓度依赖性的方式结合S1蛋白和RBD上的糖基，同时抑制HR1P和HR2P形成的6HB，提示GL25E融合蛋白具有EK1的活性。

实施例9抑制冠状病毒的S蛋白介导的细胞融合的抑制活性检测

本实施例以冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-OC43)S蛋白构建的假病毒和细胞-细胞融合模型为工具，检测GL25E是否具有广谱抗冠状病毒感染的活性，具体步骤如下：

1、使用无血清DMEM在96孔圆底板中梯度稀释GL15E、GL25E、GL35E、EK1和GRFT，共稀释8个浓度，每孔加药体积为100μL，每个梯度设置3个重复；

2、将100μL转染了表达冠状病毒S蛋白表达质粒的HEK293T细胞(293T/S/GFP，1*10⁵/ml)加入本实施例步骤(1)中的96孔板(加药物及细胞孔记为药物孔)，同时设置阳性对照组(有细胞无药物)及阴性对照组(无细胞无药物，即无药物孔)，细胞与药物37℃条件下孵育1h；

3、将本实施例步骤(2)中的混合液200μL加入铺有HuH-7细胞(购自中科院细胞库，货号SCSP-526)的96孔板中，37℃、5％CO₂条件下培养，待细胞发生融合后用4％多聚甲醛固定；

4、根据每孔的融合情况计算抑制率，计算公式为：抑制率＝(未加药物处理组-药物孔)/未加药物处理组×100％。

结果如图9所示，其中，a为GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV-2介导的细胞-细胞融合的检测结果图，b为GL25E融合蛋白抑制SARS-CoV介导的细胞-细胞融合的检测结果图，c为GL25E融合蛋白抑制MERS-CoV介导的细胞-细胞融合的检测结果图，d为GL25E融合蛋白抑制HCoV-NL63介导的细胞-细胞融合的检测结果图，e为GL25E融合蛋白抑制HCoV-229E介导的细胞-细胞融合的检测结果图；f为GL25E融合蛋白抑制HCoV-OC43S介导的细胞-细胞融合的检测结果图；如图9所示，与EK1和GRFT相比，GL25E能够更高效地抑制冠状病毒S蛋白介导的细胞融合，从而抑制冠状病毒感染靶细胞。

实施例10GL25E抑制HCoV-OC43和HCoV-229E活病毒感染实验

经过上述假病毒进行体外抑制试验后，本实施例使用HCoV-OC43和HCoV-229E活病毒对GL25E进行体外抑制试验，具体步骤如下：

2、将100μL的HCoV-OC43(购于ATCC，货号VR-1558，100TCID50)或HCoV-229E(购于ATCC，货号VR-740，100TCID50)活病毒加入本实施例步骤(1)中的96孔板(加药物及病毒孔记为药物孔)，同时设置病毒感染的阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)及阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，病毒与药物37℃条件下孵育1h；

3、本实施例步骤(2)中的混合液200μL加入铺有靶细胞(RD细胞为HCoV-OC43的靶细胞，该细胞购于购自ATCC，货号CCL-136TM；HuH-7为HCoV-229E的靶细胞，该细胞购于购自中科院细胞库，货号SCSP-526)的96孔板中。37℃、5％CO₂条件下培养12h，更换培养基为含有10％FBS的DMEM培养基；

4、继续培养72h后，弃去培养上清，并加入用无血清DMEM 20倍稀释的CCK-8(购于MCE公司，货号HY-K0301)，继续培养1～2小时后，检测其OD450的吸光度。

5、计算假病毒感染的抑制率，计算公式为：抑制率＝(病毒孔-药物孔)/(病毒孔-无药物孔)×100％。

结果如图10所示，其中，a为GL25E抑制HCoV-OC43活病毒感染的检测结果图，b为GL25E抑制HCoV-229E活病毒感染的检测结果图，如图10所示，GL25E能够更高效地抑制HCoV-229E和HCoV-OC43的活病毒的感染，其抑制效果要强于单独使用GRFT和EK1。

实施例11GL25E体内抑制HCoV-OC43活毒感染小鼠的检测

1、预防性实验：新出生的5天龄的BABL/c小鼠分为三组，每组6只；其中一组鼻腔给与2mg/kg的GL25E(高剂量组)，一组给与0.4mg/kg的GL25E(低剂量组)，一组给与等体积的PBS作为对照；给药后半小时鼻腔给与HCoV-C43活毒(100TCID50)。

2、治疗性实验：新出生的5天龄的BABL/c小鼠分为三组，每组6只，鼻腔给与HCoV-C43活毒(100TCID50)；攻毒后半小时，其中一组鼻腔给与4mg/kg的GL25E(高剂量组)，一组给与0.8mg/kg的GL25E(低剂量组)，一组给与等体积的PBS作为对照。

3、持续监测小鼠的体重和生存率，2周后停止记录。

结果如图11所示，a为GL25E攻毒前给药HCoV-OC43感染小鼠的体重变化结果，b为GL25E攻毒前给药HCoV-OC43感染小鼠的生存率测试结果，c为GL25E攻毒后给药HCoV-OC43感染小鼠的体重变化结果，d为GL25E攻毒后给药HCoV-OC43感染小鼠的生存率测试结果，如图11所示，GL25E处理能够有效缓解HCoV-OC43感染导致的体重降低和病死率，提示GL25E在体内也具有抗HCoV-OC43感染的效果；并且在冠状病毒感染前0.5小时或冠状病毒感染后0.5小时进行鼻腔给药GL25E，能够有效保护小鼠免受HCoV-OC43感染。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 复旦大学、上海徐汇上医中山免疫治疗技术转化研究中心

<120> 融合蛋白在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agcctgaccc atcgcaaatt tggcggcagc ggcggtagcc cttttagcgg tttaagcagc 60

attgcggttc gtagcggcag ctatctggat gcgattatta ttgatggcgt gcatcatggc 120

ggcagcggcg gtaatttaag ccctaccttt acctttggca gcggcgaata tattagcaac 180

atgaccattc gcagcggcga ttatattgat aacattagct ttgagaccaa catgggccgc 240

cgctttggcc cgtatggtgg tagcggtggt agcgcgaata ccttaagcaa tgttaaagtg 300

attcagatta acggcagcgc gggcgattat ctggatagcc tggatattta ttatgagcag 360

tatggcggcg gcggcagcgg cggtggtggt tcaggtggtg gtggtagctc attagatcaa 420

attaacgtga cctttctgga cctggaatat gaaatgaaaa agctggaaga ggcgatcaag 480

aagctggaag aaagctatat cgatctgaaa gagctg 516

<210> 2

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

agcctgaccc atcgcaaatt tggcggcagc ggcggtagcc cgtttagcgg tttatcaagc 60

attgcggtgc gcagcggtag ctatctggat gcgattatta ttgatggcgt gcatcatggc 120

ggcagcggcg gtaatttaag cccgaccttt acctttggca gcggcgaata tattagcaac 180

atgaccattc gcagcggcga ttatattgat aacattagct ttgagaccaa catgggccgc 240

cgctttggcc cgtatggtgg tagcggcggt tcagcgaata ctttaagcaa tgttaaagtg 300

atccagatta acggcagcgc gggcgattat ctggatagcc tggatattta ttatgagcag 360

tacggcggcg gcggcagcgg cggtggtggt agcggtggtg gtggttcagg tggtggtggt 420

agcggtggtg gtggtagcag cttagatcaa attaatgtga cctttctgga tctggagtac 480

gaaatgaaaa agctggagga agcgatcaag aaactggaag aaagctatat cgacctgaaa 540

gagctg 546

<210> 3

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agcctgaccc atcgcaaatt tggcggcagc ggcggtagcc cttttagcgg tctgagcagc 60

attgcggtgc gcagcggtag ctatttggat gcgattatta ttgacggcgt gcaccatggc 120

ggcagcggcg gtaatttaag cccgaccttt acctttggca gcggcgaata tattagcaac 180

atgaccattc gcagcggcga ttatattgat aacattagct ttgagaccaa catgggccgc 240

cgctttggcc cgtatggtgg tagcggtggt agcgcgaata ccttaagcaa tgtgaaagtg 300

attcagatca acggcagcgc gggcgattat ctggatagcc tggatattta ttatgagcag 360

tatggcggcg gcggcagcgg cggtggtggt agcggtggtg gtggctcagg tggtggtggt 420

tcaggtggtg gtggtagcgg tggcggtggt tcaggtggtg gtggtagcag cttagatcaa 480

attaatgtga cctttctgga cctggaatat gagatgaaaa agctggaaga ggcgatcaaa 540

aagctggaag aaagctatat tgatctgaag gagctg 576

<210> 4

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Ser Leu Asp Gln Ile Asn Val Thr Phe Leu Asp Leu Glu Tyr Glu Met

1 5 10 15

Lys Lys Leu Glu Glu Ala Ile Lys Lys Leu Glu Glu Ser Tyr Ile Asp

20 25 30

Leu Lys Glu Leu

35

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Ser Leu Thr His Arg Lys Phe Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Phe Ser

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ser Ile Ala Val Arg Ser Gly Ser Tyr Leu Asp Ala Ile

20 25 30

Ile Ile Asp Gly Val His His Gly Gly Ser Gly Gly Asn Leu Ser Pro

35 40 45

Thr Phe Thr Phe Gly Ser Gly Glu Tyr Ile Ser Asn Met Thr Ile Arg

50 55 60

Ser Gly Asp Tyr Ile Asp Asn Ile Ser Phe Glu Thr Asn Met Gly Arg

65 70 75 80

Arg Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Asn Thr Leu Ser

85 90 95

Asn Val Lys Val Ile Gln Ile Asn Gly Ser Ala Gly Asp Tyr Leu Asp

100 105 110

Ser Leu Asp Ile Tyr Tyr Glu Gln Tyr

115 120

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

20 25 30

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln

35 40

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1 5 10 15

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35

Claims

1.融合蛋白GL25E在制备预防和/或治疗呼吸道疾病的药物中的应用，其特征在于，所述呼吸道疾病由冠状病毒感染导致，编码所述融合蛋白GL25E的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63和人冠状病毒OC43中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒为野生型冠状病毒及S蛋白发生突变的突变株，所述S蛋白发生突变的突变株包括V341I、R408I、G476S、V483A、N501Y中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述呼吸道疾病包括新型冠状病毒肺炎、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗呼吸道疾病的药物采用鼻腔给药方式。

6.一种预防和/或治疗呼吸道疾病的药物，其特征在于，所述呼吸道疾病由冠状病毒感染导致，所述药物包括融合蛋白GL25E，编码所述融合蛋白GL25E的基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。