CN114432298A

CN114432298A - 野马追倍半萜内酯在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用

Info

Publication number: CN114432298A
Application number: CN202210081704.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋小岗; 张健; 朱媚; 陈喜华; 孙雄华
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114432298B

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及野马追倍半萜内酯在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用。通过转化生长因子诱导肺成纤维细胞分化的肺纤维化模型与气管内滴注博来霉素复制小鼠肺纤维化模型，首次使用野马追倍半萜内酯作为治疗药物，观察肺纤维化细胞模型和小鼠模型中的相关关键生化指标及病理学变化，阐述野马追倍半萜内酯对肺纤维化细胞与动物模型的治疗作用及其机制，从而为野马追倍半萜内酯用于治疗肺纤维化疾病提供依据。所述药物为含有野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K的野马追倍半萜内酯可与药学上可接受的载体结合制备药物。

Description

野马追倍半萜内酯在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及野马追倍半萜内酯在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用。

背景技术

肺纤维化一种间质性肺脏疾病，是一种原因不明以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱，导致肺泡、肺间质纤维化，最终可引起呼吸衰竭的疾病。目前其发病机制仍不明确。其病理特征是肺泡上皮细胞损伤和不正常的组织修复，从而导致肺部正常组织结构的破坏，代之以异常增生的肺成纤维细胞及大量由肺成纤维细胞转化而来的肺肌成纤维细胞，即形成所谓的成纤维细胞灶。这些细胞分泌大量细胞外基质及合成胶原纤维，最终导致肺纤维化的形成。由于成纤维细胞灶是肺纤维化疾病进展和预后不良的重要因素，因此成纤维细胞灶的源头——肺成纤维细胞异常转化是肺纤维化疾病发病关键驱动因素，也是目前治疗肺纤维化疾病的唯一药物靶点，最终通过抑制肺成纤维细胞的异常转化达到阻止肺纤维化病理进程的目的。(参见： Araya J,Nishimura SL.Fibrogenic reactions in lungdisease.Annu Rev Pathol 2010；5:77-98. Miao H,Wu XQ,Zhang DD,WangYN,Guo Y,LiP,et al.Deciphering the cellular mechanisms underlying fibrosis-associateddiseases and therapeutic avenues.Pharmacol Res 2021；163: 105316.Freeberg MAT,Perelas A,Rebman JK,Phipps RP,Thatcher TH,Sime PJ.Mechanical Feed-ForwardLoops Contribute to Idiopathic Pulmonary Fibrosis.Am J Pathol 2021；191:18-25.)

胶原纤维是细胞外基质的重要组成部分，其生化成份是胶原蛋白(collagen，简称胶原)，羟脯氨酸(hydroxproline，HYP)是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占其氨基酸总量的13.4％，组织中HYP含量可作为胶原组织代谢、衡量胶原含量及反映间质胶原纤维沉积的重要指标。

目前临床仅有两种治疗药物---尼达尼布(nintedanib)和吡非尼酮(pirfenidone)，它们通过抑制肺成纤维细胞激活与转化进而延迟肺纤维化进展，然而它们具有较多的不良反应以及只能在较短周期内减缓肺纤维化进程，这使得发现新的抗肺纤维化的药物成为迫切需求。(参见： Chen H,Wang J,Li R,Lv C,Xu P,WangY,Song X,Zhang J.Astaxanthin attenuates pulmonary fibrosis through lncITPF andmitochondria-mediated signal pathways.J.Cell.Mol.Med.2020；24: 10245-10250.Miao H,Wu XQ,Zhang DD,Wang YN,Guo Y,Li P,Xiong Q,Zhao YY. Decipheringthe cellular mechanisms underlying fibrosis-associated diseases andtherapeutic avenues.Pharmacol.Res.2021；163:105316.)

众多研究结果证实，与其他器官纤维化一样，肺纤维化(PF)是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积的过程，其中主要涉及炎症因子、脂质过氧化、自由基损伤、细胞间胶原沉积及成纤维细胞增生等因素的共同作用。此外，信号分子途径之间可能相互影响，存在多条旁路途径参与PF的形成与发展。总之，PF的发病机制是多种因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程，目前尚无可作用于多途径、多环节的特异有效的药物防治肺纤维化。

中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，在慢性肺纤维化疾病的治疗中显示了一定优势。中药野马追为菊科植物轮叶泽兰Eupatorium lindleyanum DC.地上干燥部分，分布于东北、华北、华东、中南等地区，其中江苏盱眙是主要产地之一。目前认为野马追的化学成分有黄酮、倍半萜、二萜、三萜、甾体等类的化合物，其中黄酮、倍半萜、二萜类化合物是其主要成分。(参见：国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：中国医药科技出版社2020:326.)。

中药野马追的粗提物已被制成片剂、颗粒剂、糖浆剂等用于呼吸系统疾病的治疗。此外，它还具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性。然而至今为止，关于中药野马追药理作用的研究大多集中在野马追粗提物上，而对其活性成分的药理活性尚缺乏系统研究，到底有哪些化学成分是野马追药效物质基础仍待阐明。倍半萜成分被认为是中药野马追中潜在的最具活性的化学成分。张健等报道野马追倍半萜部位具有抗炎及保护急性肺损伤的作用(参见： Chu C,Ren H,Xu N,Xia L,Chen D,Zhang J.Eupatorium lindleyanumDC.sesquiterpenes fraction attenuates LPS-induced acute lung injury inmice.J.Ethnopharmacol.2016；185: 263-271.)，然而其是否具有抗肺纤维化活性，尚不清楚。

目前临床应用的均为制药公司直接提供的野马追粗提物，野马追对肺纤维化保护作用的活性成分尚未阐释。张健等从野马追中分离得到的eupalinolide F(野马追内酯F)、eupalinolide G(野马追内酯G)、eupalinolide H(野马追内酯H)、eupalinolide I(野马追内酯I)、eupalinolide K(野马追内酯K)均为倍半萜内酯类化合物，(参见：Shuang-Qing Wu,Nai-Yu Xu,Qun Sun, Hai-Yan Han,and Jian Zhang*.Six New Sesquiterpenesfrom Eupatorium lindleyanum.Helvetica Chimica Acta,2012,95:1637)。目前关于此五个倍半萜化合物是否具有防治肺纤维化作用，未见报道。本发明发现其组成的倍半萜内酯具有防治肺纤维化的活性。

发明内容

本发明提供野马追倍半萜内酯在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用。

优选的，所述野马追倍半萜内酯包括野马追中倍半萜内酯类化合物或其药学上可接受的盐。

优选的，所述野马追中倍半萜内酯类化合物为野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯 H、野马追内酯I和野马追内酯K。

优选的，所述野马追倍半萜内酯的总倍半萜内酯含量≥90％。

优选的，所述药学上可接受的盐为野马追倍半萜钠盐和/或野马追倍半萜磺酸盐。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的载体。

优选的，所述制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用是指制备预防或治疗肺纤维化的药物，所述药物为含有治疗有效量的野马追倍半萜内酯和药学上可接受的载体。可以按照工作中已知的方法将本发明的药物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、膏剂及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适用于胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适用于口服给药的胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素作为载体或赋形剂。

此外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲液(PBS) 作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型中还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。

进一步地，所述药物用于抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞转化。

进一步地，所述药物用于降低肺成纤维细胞中细胞肌丝的形成水平。

进一步地，所述药物用于增大肺成纤维细胞胶原的凝胶面积。

进一步地，所述药物用于降低肺成纤维细胞中的I型胶原蛋白的表达水平。

进一步地，所述药物用于降低肺组织中羟脯氨酸的含量。

进一步地，所述药物用于降低肺组织炎症和胶原的沉积。

本发明还提供一种预防或治疗肺纤维化药物的药物组合物，包括上述的野马追倍半萜内酯。

进一步地，所述药物的给药剂量为1-100mg/kg/d。

然而，更确切的用药剂量应根据待治疗的疾病或病例状况性质、严重程度、病人的年龄、体重、待治疗病人所用药的敏感性及给药方式等因素由临床医生决定。

进一步地，所述药物组合物的给药方式为口服、腹腔注射、皮下注射、静脉注射和肌肉注射中的一种或多种。

本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：

1、本发明首次将传统中药野马追的有效部位——野马追倍半萜内酯应用于经典而被广泛应用的肺纤维化细胞与动物模型，进行防治肺纤维化的实验研究，实验结果提示野马追倍半萜内酯具有一定的抗肺纤维化作用。

2、本发明发现野马追倍半萜内酯防治肺纤维化作用机制与其显著抑制肺成纤维细胞转化有关。

3、野马追药材丰富，价格低廉，野马追倍半萜内酯提取工艺成熟，疗效确切，服用方便，可长期服用。

本发明基于中药野马追提取物野马追倍半萜内酯组成的药物，成分单一，疗效确切，使用方便，可广泛应用于制备防治肺纤维化及相关疾病的药物中。

附图说明

图1为野马追倍半萜内酯对转化生长因子诱导的肺成纤维细胞分化的影响图。

图2为野马追倍半萜对转化生长因子诱导的肺成纤维细胞中细胞肌丝形成的影响图。

图3野马追倍半萜内酯对转化生长因子诱导肺成纤维细胞胶原胶收缩的影响图。

图4野马追倍半萜内酯、野马追内酯G、野马追内酯I对转化生长因子诱导肺成纤维细胞中I型胶原生成的影响图。

图5野马追倍半萜对博来霉素小鼠肺组织形态学的影响图(HE染色)。

图6野马追倍半萜对博来霉素小鼠肺组织形态学的影响图(Masson染色)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1.1实验目的

观察野马追倍半萜内酯对转化生长因子诱导肺成纤维细胞转化的影响

1.2实验材料

实验细胞：人肺成纤维细胞MRC-5，由美国ATCC菌种保藏中心提供。

实验药物：野马追倍半萜内酯(总倍半萜内酯含量≥90％)，批号：210515，4℃冰箱保存备用，由苏州大学药学院中药化学教研室张健教授提供；转化生长因子，由美国R&D生物技术公司提供。

试剂与仪器：α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(ab124694)，GAPDH(ab181602)购自Abcam(Cambridge,UK)；电泳与转膜装置，购自美国Bio-rad公司；化学发光成像仪，购自上海天能生物技术公司。

1.3实验方法

细胞培养与给药人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株，置于10％FBS的MEM培养基中在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养。取对数生长期的MRC-5细胞，制备单细胞悬液，按细胞密度每毫升2×10⁴个接种于6孔板中，每孔加2mL单细胞悬液，隔天用含有0.5％FBS 的MEM培养基饥饿。饥饿24h后，给予不同处理，溶剂对照组、模型组(TGF-β12ng·mL^-1) 以及不同剂量野马追倍半萜内酯组(2.5、5、10μg·L^-1)，在指定时间收取细胞。

1.4蛋白质免疫印迹分析

细胞培养结束后，置于冰盒上收取细胞至离心管，然后在冰水中用细胞超声破碎仪进行超声裂解，离心后取上清。蛋白粗提物在95.0℃金属浴中加热5min使蛋白质变性，即为蛋白样本。样本使用10％SDS-PAGE电泳进行分离，然后转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。 PVDF膜使用5％牛奶封闭1h，后用相应一抗孵育过夜。次日，二抗孵育1h，使用Odyssey近红外双色激光成像系统扫描、拍照成像。Western blot图采用Image J进行蛋白条带灰度的相对定量分析。

1.5实验结果

α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)是肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的关键标志之一，本发明用Western blot检测不同方式处理的肺成纤维细胞中α-SMA的表达水平。如图1所示，与对照组相比，转化生长因子诱导的肺成纤维细胞分化的肺纤维化细胞模型中，α-SMA的表达水平显著上升。野马追倍半萜内酯各剂量组肺成纤维细胞中的 α-SMA的表达水平显著低于模型组。野马追内酯G各剂量组肺成纤维细胞中的α-SMA的表达水平显著低于模型组。野马追内酯I各剂量组肺成纤维细胞中的α-SMA的表达水平显著低于模型组。这些实验结果表明野马追倍半萜内酯、野马追内酯G、野马追内酯I均能抑制 TGF-β1诱导的肺成纤维细胞转化，它们均具有抗肺纤维化活性。

实施例2

2.1实验目的

观察野马追倍半萜内酯对转化生长因子诱导肺成纤维细胞中细胞肌丝形成的影响

2.2实验材料

试剂与仪器：罗丹明鬼笔环肽(PHDR1)购自Cytoskeleton(Denver,CO)；OlympusX-51荧光倒置显微镜购自日本奥林巴斯显微镜公司。

2.3实验方法

细胞培养与给药人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株，置于10％FBS的MEM培养基中在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养。取对数生长期的MRC-5细胞，制备单细胞悬液，按细胞密度每毫升2×10⁴个接种于6孔板中，每孔加2mL单细胞悬液，隔天用含有0.5％FBS 的MEM培养基饥饿。饥饿24h后，给予不同处理，溶剂对照组、模型组(TGF-β12ng·mL^-1) 以及野马追倍半萜内酯组(10μg·L^-1)，TGF-β1(2ng/mL)诱导的MRC-5细胞48h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞后，用4％多聚甲醛溶液固定细胞，然后用0.1％Triton-100透化后与100 nM工作液浓度的罗丹明鬼笔环肽一起温育，并在室温下放置在黑暗中30min，之后使用100 nM浓度的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将细胞复染30s，最后，细胞用PBS冲洗3次，应用Olympus X-51显微镜拍照。

2.4实验结果

细胞肌丝形成是肺成纤维细胞向肺肌成纤维细胞转化的重要细胞表型。如图2所示，与对照组相比，转化生长因子诱导的肺成纤维细胞分化的肺纤维化细胞模型中，细胞肌丝形成显著增加(F-肌动蛋白；红色)。野马追倍半萜内酯组肺成纤维细胞中的细胞肌丝形成水平显著低于模型组。这些实验结果表明野马追倍半萜内酯具有抗肺纤维化活性。

实施例3

3.1实验目的

观察野马追倍半萜内酯对转化生长因子诱导肺成纤维细胞胶原胶收缩能力的影响

3.2实验材料

试剂与仪器：鼠尾胶原(sc-136157)购自Santa Cruz(Dallas,TA)；Olympus显微镜购自日本奥林巴斯显微镜公司。

3.3实验方法

细胞培养与给药人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株，置于10％FBS的MEM培养基中在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养。取对数生长期的MRC-5细胞，制备单细胞悬液，首先将10×10⁴/mL密度的MRC-5细胞混悬液和鼠尾胶原以2:1(细胞悬浮液：胶原蛋白)的比例混合，接着将细胞悬液接种到24孔细胞培养板中，室温下固化30min后，用灭菌的吸头从板上将凝胶解离下来并使其能够在孔内轻松转动，从而确认它没有粘附到孔底，然后加入500μL含0.5％FBS的MEM培养基，放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中继续培养，第二天，用2.5ng/mL的TGF-β1和野马追倍半萜内酯组(10μg·L^-1)联合刺激凝胶48h，最后，观察凝胶变化并拍下凝胶图像，使用Image J软件测量每个凝胶的表面积。

3.4实验结果

肺纤维化中肺成纤维细胞转化为肺肌成纤维细胞后，收缩能力明显提高。本实例本发明应用含有MRC-5细胞的胶原凝胶收缩检测野马追倍半萜内酯的抗肺纤维化活性。如图3所示，与对照组相比，转化生长因子处理后，含肺成纤维细胞的胶原凝胶表面积明显减少。而野马追倍半萜内酯组肺成纤维细胞胶原胶面积显著大于模型组这些实验结果表明野马追倍半萜内酯具有抗肺纤维化活性。

实施例4

4.1实验目的

观察野马追倍半萜内酯、野马追内酯G、野马追内酯I对转化生长因子诱导肺成纤维细胞中I型胶原生成的影响。

4.2实验材料

试剂与仪器：collagen I(ab138492)、GAPDH(ab181602)购自Abcam(Cambridge,UK)；电泳与转膜装置，购自美国Bio-rad公司；化学发光成像仪，购自上海天能生物技术公司。

4.3实验方法

细胞培养与给药人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞株，置于10％FBS的MEM培养基中在37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中培养。取对数生长期的MRC-5细胞，制备单细胞悬液，按细胞密度每毫升2×10⁴个接种于6孔板中，每孔加2mL单细胞悬液，隔天用含有0.5％FBS 的MEM培养基饥饿。饥饿24h后，给予不同处理，溶剂对照组、模型组(TGF-β12ng·mL^-1) 以及野马追倍半萜内酯组(10μg·L^-1)，在指定时间收取细胞。

蛋白质免疫印迹分析细胞培养结束后，置于冰盒上收取细胞至离心管，然后在冰水中用细胞超声破碎仪进行超声裂解，离心后取上清。蛋白粗提物在95.0℃金属浴中加热5min 使蛋白质变性，即为蛋白样本。样本使用10％SDS-PAGE电泳进行分离，然后转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。PVDF膜使用5％牛奶封闭1h，后用相应一抗孵育过夜。次日，二抗孵育1h，使用Odyssey近红外双色激光成像系统扫描、拍照成像。Western blot图采用Image J 进行蛋白条带灰度的相对定量分析。

4.5实验结果

胶原蛋白是纤维化病变组织中新合成细胞外基质的主要成分，且I型胶原蛋白约占胶原蛋白总产物的80％，因此，本发明用Western blot检测I型胶原蛋白的表达水平以进一步阐释野马追倍半萜内酯抗肺纤维化活性。如图4所示，与对照组相比，转化生长因子诱导的肺成纤维细胞分化的肺纤维化细胞模型中，I型胶原蛋白的表达水平显著上升。野马追倍半萜内酯各剂量组肺成纤维细胞中的I型胶原蛋白的表达水平显著低于模型组。这些实验结果表明野马追倍半萜内酯能抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞细胞外基质蛋白的生成，它们均具有抗肺纤维化活性。

实施例5

5.1实验目的

观察野马追倍半萜内酯对博来霉素诱发肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸含量的影响。

5.2实验材料

实验动物：C57小鼠30只，雌雄兼有，体重18-22克，SPF级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2021-0007，实验动物使用许可证号： SYXK(苏)2021-0035。

实验药物：野马追倍半萜内酯(总倍半萜内酯含量≥90％)，批号：210515，4℃冰箱保存备用，由苏州大学药学院中药化学教研室张健教授提供；博莱霉素，白色冻干粉末，15mg/ 支，由日本化药株式会社生产；4％水合氯醛；吡非尼酮，北京索莱宝生物技术有限公司。

试剂与仪器：羟脯氨酸(HYP)试剂盒(批号：20211019)购买于南京建成生物技术研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，为北京普析通用仪器有限责任公司生产；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海荣丰科学仪器有限公司出品。

5.3实验方法

动物分组：C57小鼠30只，雌雄兼有，称重、编号、随机分为5组，即正常组、模型组、吡非尼酮组(400mg/kg)、大剂量组(100mg/kg)、小剂量组(50mg/kg)，每组小鼠6只。

模型制备：模型组与各治疗组小鼠采用博来霉素复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，经气管高压喷雾给药，博来霉素(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下给予等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3min，使药液均匀分布于两侧肺内，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。

给药方案：各组动物经博莱霉素造模后，第七天天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予吡非尼酮，各治疗组分别给予不同剂量的野马追倍半萜内酯。连续给药21天。

羟脯氨酸测定：动物处死当日，取右肺中叶约25mg置于带刻度的10ml玻璃离心管中， -20℃冰箱保存，以备测定各实验组小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量；测定方法具体如下：将0.5 mL水解液准确加入冷冻保存小块肺组织的刻度玻璃试管内，混匀，加盖后沸水浴水解20min，其中10min混匀一次。之后将试管液体pH值调至6.5左右，加适量活性炭，混匀，转移至 1.5mL离心管中，3500r/min离心10min，取上清0.5mL，依次加入三种反应试剂，混匀， 60℃水浴15min，冷却后3500r/min离心10min，取上清于550nm，1cm条件下测定各管的吸光度，按说明书公式计算肺组织中羟脯氨酸含量。

5.5实验结果

与正常对照组相比，模型组小鼠体重显著减轻，肺组织中羟脯氨酸含量显著增加，肺系数显著高于正常组；野马追各剂量组小鼠体重显著增加，小鼠肺组织中羟脯氨酸含量明显低于模型组，肺系数均明显低于模型组。阳性对照药吡非尼酮组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量与模型组相比显著降低，肺系数明显下降，见表1。

表1野马追倍半萜内酯对肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸的影响(n＝6)

5.6结论

造模28天后，模型组小鼠肺组织中羟脯氨酸含量显著升高，肺系数显著增加。给药21 天后，野马追倍半萜内酯，可显著降低小鼠肺组织中羟脯氨酸含量。阳性对照药吡非尼酮亦可减少肺纤维化小鼠肺组织羟脯氨酸含量。提示野马追倍半萜内酯提取物可通过降低肺组织中羟脯氨酸的含量而减少肺泡间质胶原的生成，从而发挥抗纤维化作用。

实施例6

6.1实验目的

观察野马追倍半萜内酯对博来霉素诱发肺纤维化小鼠肺组织病理形态的影响。

6.2实验材料

实验仪器：光学显微镜，OLYMPUS CX31。

6.3实验方法

模型准备：模型组与各治疗组小鼠采用博来霉素复制动物肺纤维化模型。具体操作步骤如下：实验时，小鼠用4％的水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉，仰卧手术台，固定头部及四肢，经气管高压喷雾给药，博来霉素(5mg/kg)，正常对照组在相同条件下给予等体积生理盐水。注药后立即将小鼠直立，沿身体纵轴左右旋转3min，使药液均匀分布于两侧肺内，待小鼠清醒后送清洁级观察室常规饲养。

6.4给药方案

各组动物经博莱霉素造模后，第七天天开始小鼠每隔一天称重一次，按照相应的体重灌胃给药，正常组及模型组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予吡非尼酮，各治疗组分别给予不同剂量的野马追倍半萜内酯。连续给药21天。

肺组织病理切片染色：取右肺，按常规病理学方法进行固定、包埋、切片。将病理切片进行HE染色，然后参照Szaopiel等方法略加改良将肺泡炎和肺纤维化的程度分为四级：0级，无病理明显改变，肺泡结构清晰，肺泡透亮，肺泡间隔正常；极少量炎性细胞浸润，极少量成纤维细胞生成；无胶原纤维生成；1级，轻度病理改变，肺泡结构略有紊乱，肺泡间隔因炎性细胞浸润和成纤维细胞增生而增宽；较少量炎性细胞浸润，较少量成纤维细胞增生；较少量胶原纤维生成，病变范围小于全肺的20％；2级，中度病理改变，肺泡结构紊乱，肺泡间隔明显增宽；少量炎性细胞浸润，少量成纤维细胞增生，少量胶原纤维生成，病变范围占全肺的20％～50％；3级，重度病理改变，肺泡结构紊乱，肺泡融合，肺泡间隔显著增宽；大量炎性细胞浸润，大量成纤维细胞增生，大量胶原纤维沉积，可见明显的肺纤维化病灶，病变范围占全肺的50％以上。

6.5实验结果

造模28天后，与正常对照组相比，模型组小鼠肺组织中肺泡炎程度和肺纤维化程度显著加重，呈肺纤维化实质病变；与模型组相比，野马追倍半萜内酯各剂量组小鼠肺组织肺泡结构，肺泡间隔炎细胞浸润，胶原沉积及成纤维细胞增生，均有不同程度的改善，肺泡炎和肺纤维化程度均显著减轻；阳性对照药吡非尼酮组小鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度均较模型组小鼠明显减轻，见图5、图6。

6.6结论

造模28天，模型组小鼠肺组织肺泡炎和肺纤维化程度显著加重，呈典型的肺纤维化实质病变。给药21天，野马追倍半萜内酯各剂量组小鼠肺系数明显降低，肺组织肺泡炎及肺纤维化程度明显减轻。提示在本实验条件下，成功复制了小鼠肺纤维化模型。野马追倍半萜内酯可明显降低肺纤维化小鼠的肺泡炎和肺纤维化程度，具有防治肺纤维化疾病的作用。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.野马追倍半萜内酯在制备预防或治疗肺纤维化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述野马追倍半萜内酯包括野马追中倍半萜内酯类化合物或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述野马追中倍半萜内酯类化合物为野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐为野马追倍半萜钠盐和/或野马追倍半萜磺酸盐。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述载体选自片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、膏剂及溶液剂和悬浮剂的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胶囊剂、片剂、丸剂和粉末剂选自蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素和羧甲基纤维素中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述溶液剂和悬浮剂选自水、氯化钠溶液、葡萄糖溶液和磷酸盐缓冲液中的一种或多种。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括添加剂；所述添加剂为抗氧化剂、防腐剂、增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂和表面活性剂中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量为1-100mg/kg/d。