CN114426579A - 一种抗人cd34抗体、抗人cd34嵌合抗体及应用 - Google Patents

一种抗人cd34抗体、抗人cd34嵌合抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗人CD34抗体、抗人CD34嵌合抗体及应用，小鼠抗人CD34抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的抗人CD34嵌合抗体对于血液病的诊断治疗、实体瘤的治疗、鉴别肿瘤良恶性及起源有着重要意义，在器官移植、造血干细胞移植等领域具有广阔的应用前景；小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达载体，两者重组后表达产生的抗CD34嵌合抗体，能够特异性结合人CD34分子并能够降低鼠源性抗人CD34抗体的背景及免疫源性。

Description

一种抗人CD34抗体、抗人CD34嵌合抗体及应用
技术领域
本发明属于体外诊断领域，尤其是涉及一种抗人CD34抗体、抗人CD34嵌合抗体及应用。
背景技术
白血病是威胁人类生命健康的主要几种疾病之一，在我国发病率大约为2.76/100000人。其中急性淋巴细胞白血病多见于儿童，急性髓系白血病多见于成年人，而慢性白血病多发于40岁以上人群。它是一类起源于造血 (或淋巴) 干细胞的恶性疾病。由于干细胞受损，白血病细胞失去进一步分化成熟的能力，或者增殖与分化能力不平衡，而停滞在细胞发育的不同阶段，具体表现为细胞在体内无限增殖，而其分化成熟和凋亡受阻。白血病与其它癌症一样，一直因为没有特应性的标志导致无法用常规药物准确杀伤白血病细胞。白血病细胞与正常细胞的区别目前认为主要在于某些生物分子的表达量不同，利用这些特征，特别是与造血干/祖细胞的区别可以在一定程度上杀伤白血病细胞而不影响造血的重建。特异性识别某种细胞膜表面分子的抗体正是实现这一目的的最好工具，目前利用抗体治疗白血病主要是通过以下三种途径：抗体结合白血病细胞后通过补体依赖的细胞毒和抗体依赖细胞介导的细胞毒直接杀伤白血病细胞；抗体结合白血病细胞表面分子，通过所引发的下游信号诱导白血病细胞分化或凋亡；通过抗体的靶向作用将杀伤性药物或效应物带入白血病细胞内达到局部杀伤的目的等。
CD34分子于1984年被美国科学家civin发现，属于钙黏蛋白家族，其结构包括胞外区、跨膜区、胞浆区3部分。作为一种黏附分子，CD34分子选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞（hematopieticstem/ progenitor cell，hsc/hpc）表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。细胞间的黏附是由多种机制和因素参与的复杂过程，在多细胞生物个体的演化过程、细胞调节、组织生理学以及疾病发生中都有着至关重要的作用。黏附分子以受体－配体结合的形式发挥作用，参与细胞的识别、活化和信号转导、细胞的增殖与分化、伸展与移动，是免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理病理过程的分子基础。在造血干细胞移植过程中，CD34分子起到运输造血干细胞(hematopietic,hsc)的作用，在动员剂的作用下，促使hsc迁离骨髓进入外周血完成动员过程，并介导其与骨髓微环境的结合增强hsc定植。
随着对CD34分子介导细胞间黏附作用机制探讨的广泛深入，已有愈来愈多的研究结果表明除造血干/祖细胞外，还有许多其他类型的细胞也表达CD34分子，如某些类型的白血病细胞、实体瘤细胞、血管内皮细胞及纤维母细胞等。迄今为止，CD34分子介导黏附作用的机制尚未完全阐明，对CD34分子特异配体/受体的鉴定和细胞内蛋白分子的相互作用激活黏附分子（尤其是选择素家族）的作用机制亦尚待进一步明确。由于细胞间黏附作用密切参与体内免疫应答、炎症发生、凝血、肿瘤转移以及创伤愈合等一系列重要生理病理过程，对CD34分子作用机制的明确以及进一步加以应用，在临床上对于血液病的诊断治疗、实体瘤的治疗、鉴别肿瘤良恶性及起源有着重要意义，在器官移植、造血干细胞移植等领域具有广阔的应用前景。
以上这些事实均表明 CD34 分子可应用于白血病诊断治疗、器官移植、造血干细胞移植领域，CD34分子的抗体具有巨大的潜在药用价值。
目前白血病治疗主要采用控制增殖、诱导凋亡的化疗药物，包括烷化剂、抗代谢药物等。这些药物在杀死白血病细胞的同时，对正常造血细胞也有严重损伤，故对机体存在严重的毒副作用。此外，白血病细胞常会对化疗药物产生耐药，同时化疗后复发率较高，严重影响临床化疗药物治疗的有效性。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种抗人CD34抗体、抗人CD34嵌合抗体及应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种小鼠抗人CD34抗体，该小鼠抗人CD34抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，所述的小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.4所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步，所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
一种抗人CD34嵌合抗体，该抗人CD34嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列包含所述的小鼠抗人CD34抗体的重链可变区的氨基酸序列，该抗人CD34嵌合抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含所述的小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
一种核苷酸分子，该核苷酸分子编码所述的抗人CD34嵌合抗体。
进一步，所述的核苷酸分子编码所述的抗人CD34嵌合抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码所述的抗人CD34嵌合抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
一种表达载体，该表达载体包含所述的核苷酸分子。
所述的小鼠抗人CD34抗体的应用，所述的小鼠抗人CD34抗体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用。
所述的小鼠抗人CD34抗体的应用，所述的小鼠抗人CD34抗体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
所述的表达载体的应用，所述的表达载体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用。
所述的表达载体的应用，所述的表达载体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
所述的抗人CD34嵌合抗体的应用，所述的抗人CD34嵌合抗体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用；所述的抗人CD34嵌合抗体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的抗人CD34嵌合抗体对于血液病的诊断治疗、实体瘤的治疗、鉴别肿瘤良恶性及起源有着重要意义，在器官移植、造血干细胞移植等领域具有广阔的应用前景；小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因及人抗体轻链恒定区基因和重链恒定区基因重组后表达产生的抗CD34嵌合抗体，能够特异性结合人CD34分子并能够降低鼠源性抗人CD34抗体的背景及免疫源性。
流式中需要根据使用的抗体的亚型来选择不同种类的同型对照，将鼠源性单克隆抗体改为本发明所述的嵌合抗体后，恒定区为人IgG1，只要使用人IgG1的同型对照即可，大大减少实验的复杂性。
附图说明
图1为本发明实施例3所述的抗人CD34嵌合抗体纯化图：其中泳道M为maker，泳道1为抗人CD34嵌合抗体非还原电泳，泳道2为抗人CD34嵌合抗体还原电泳；
图2为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源CD34-PE的阴性对照流式细胞散点图；
图3为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源CD34-PE的阴性对照流式细胞直方图；
图4为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源CD34-PE的流式细胞散点图；
图5为本发明实施例5中细胞系检测的鼠源CD34-PE的流式细胞直方图；
图6为本发明实施例5中细胞系检测的抗人CD34-PE嵌合抗体的阴性对照流式细胞散点图；
图7为本发明实施例5中细胞系检测的抗人CD34-PE嵌合抗体的阴性对照流式细胞直方图；
图8为本发明实施例5中细胞系检测的抗人CD34-PE嵌合抗体的流式细胞散点图；
图9为本发明实施例5中细胞系检测的抗人CD34-PE嵌合抗体的流式细胞直方图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 小鼠抗人CD34抗体的轻重链可变区基因克隆
(1)RNA提取 ：采用Trizol一步法，1)取杂交瘤细胞约1×106个，加入1ml Trizol，吹打混匀，室温静置 10 分钟；2) 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温静置 2-3 分钟；3)12000rpm，4℃，离心 15 分钟；4) 取上清，加入 0.5ml 异丙醇室温静置 15 分钟；5)12000rpm，4℃，离心15 分钟；6) 弃上清，加入 1ml 75％的乙醇洗，7500rpm，4℃，离心 5分钟；7) 弃上清，沉淀晾干，加入 30μLDEPC 水溶解；
(2) 逆转录为 cDNA(40μl) ：使用TransScript All-in-one First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行ni转录反应，取总RNA 1.0 μg，TransScriptAll-in-one SuperMix for qPCR 4μl，gDNA remover 4μl，DEPC水补充至20μl，反应42℃，15min后，85℃孵育5min，于20℃保存；
(3)PCR 扩增CD34抗体的轻重链可变区基因
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：设计通用简并引物：上游引物5’-GACATT GTG CTC ACC CAG WCT SMH-3’，下游引物5’-CCG TTAGAT CTC CAR BTT KGT SCS-3’；以cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，55℃ 30秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
重链可变区基因 PCR 扩增反应体系 (50μl) ：上游引物 5’-CAG GTS MARCTGCAGSAG TCW GG-3’；下游引物 5’-TGA GGA GAC KGT GAC HGT GGT SCC-3’；以 cDNA 为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃，30 秒，55℃，30秒，72℃，30 秒，共 35 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
(4) 测序载体的构建 ：pClone007 Blunt Simple Vector Kit购白擎科生物；将轻重链可变区基因PCR 产物回收，与 pClone007 Blunt Simple Vector载体连接后，按常规方法氯化钙转化，以 100μg/ml 氨苄浓度筛选阳性克隆，送测序，该基因完全符合蛋白数据库中抗体所具有的若干保守的框架氨基酸的特点，该序列为抗体基因序列。分别命名为pClone007-VH及pClone007-VL。
实施例2 嵌合抗体表达载体pcDNA3.4-H和pcDNA3.4-L的构建
根据轻、重链可变区序列及构建载体pcDNA3.4的序列，设计并合成了用于扩增重链可变区的引物（PDH-F和PDH-R）、用于扩增轻链可变区的引物（PDL-F和PDL-R）和用于扩增载体的引物（ZT-F和ZT-R）。
PDH-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTG-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示）
PDH-R：
5’-GATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTT-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示）
PDL-F：
5’-TTCCAGGTTCCACTGGTGACGATGTTGTGATGACCCAAACTCC-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示）
PDL-R：
5’-ACAGATGGTGCAGCCACCGTCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTC-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示）
ZTH-F：
5’-GCTAGCACCAAGGGCCCA-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示）
ZTH-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示）
ZTL-F：
5’-ACGGTGGCTGCACCATCTG-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示）
ZTL-R：
5’-GTCACCAGTGGAACCTGGAACC-3’
（ 核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示）
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDL-F；下游引物PDL-R；以pClone007-VL为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
重链可变区基因PCR扩增反应体系(50μl) ：上游引物PDH-F；下游引物PDH-R；以pClone007-VH为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5 分钟 ；94℃30 秒，58℃ 60秒，72℃ 30 秒，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟。
线性化载体的扩增：上游引物ZT-F；下游引物ZT-R；以pcDNA-CD52-H(合成序列，含人IgG1恒定区核苷酸序列)为模板，高保真 pfu DNA 聚合酶扩增；PCR 循环程序为 94℃ 5分钟 ；94℃ 30 秒，58℃ 60秒，72℃ 4 min，共 30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 分钟；
将PCR产物分别回收，将回收轻链可变区PCR产物和重链可变区PCR产物分别与回收线性化载体产物使用重组酶进行重组，重组后转化DH5α克隆菌株，并挑取单菌落扩大培养，送样测序，测序正确的克隆用于转染CHO细胞。
实施例3 抗人CD34嵌合抗体的表达、纯化
(1) 嵌合抗体 CD34抗体的表达：将准备好的CHO细胞从培养箱中取出，准备两支15ml 无菌离心管，在其中一支中加入 5ml SPM培养基 和 100μg 无菌质粒 DNA(含轻链表达载体和重链表达载体)，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入 5ml SPM 和 320μl转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置5分钟制备出质粒-载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回 CO2恒温摇床中震荡培养；第1天和第5天补加辅料，第12天收获细胞上清；
(2) 抗人CD34嵌合抗体的纯化：将上步收集的细胞上清先使用G25将培养上清置换为PBS，再是使用Protein A亲和柱进行纯化，PBS平衡柱子后，上样，使用pH3.0的甘氨酸进行洗脱，洗脱纯抗使用G25柱置换溶液，将溶液置换为PBS，取样进行电泳测试，结果如图1所示，然后分装后于-20℃冻存；
(3)Western blot 鉴定：主要参考分子克隆方法进行 Western 印迹，结果证明条带为抗体；
实施例 4 抗人CD34嵌合抗体的PE标记
将抗人CD34嵌合抗体使用还原剂进行还原，将其与经过活化的PE混合均匀，25℃搅拌，反应1小时；再使用S200 increase纯化柱纯化，得到PE标记CD34嵌合抗体。
实施例 5 抗人CD34嵌合抗体的活性测定
(1) 细胞系检测：取 CD34 表达阳性细胞KG1a细胞系，制成 1×106 细胞悬液；分别加入不同量的嵌合抗体CD34-PE和鼠源CD34-PE，室温避光孵育 30 分钟；加入 2ml 冷PBS 缓冲液，重悬，1000 转 / 分钟离心5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS 缓冲液，流式细胞仪检测；
如图2-9所示，结果显示嵌合抗体CD34-PE与鼠源CD34-PE的反应性一致。
(2) 竞争性免疫荧光抑制试验：
细胞系检测：取 CD34 表达阳性细胞KG1a细胞系，制成 1×106 细胞悬液；加入不同量的抗人CD34嵌合抗体，室温避光孵育 1 小时；再加入 0.5μg PE标记的鼠源CD34-PE（来源于小鼠腹水纯抗），室温避光孵育 20 分钟；加入 2ml 冷 PBS 缓冲液，重悬，1000 转/ 分钟离心 5 分钟，弃上清；加入 250μl PBS 缓冲液，流式细胞仪检测；
经抗人CD34嵌合抗体竞争后，鼠源CD34-PE与KG1a细胞系结合的阳性率基本降低为0，与外周血白细胞反应时荧光强度明显下降，证明抗人CD34嵌合抗体可竞争性抑制鼠源CD34-PE与KG1a细胞系的结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津旷博同生生物技术有限公司
<120> 一种抗人CD34抗体、抗人CD34嵌合抗体及应用
<130> 2022.4.1
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Ile Asp Pro Phe Lys Val Asn Thr Gly Tyr Asn His Asn Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Tyr Ser Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Ser Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Phe Ile Asp Pro Phe Lys Val Asn Thr Gly Tyr Asn His Asn Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Arg Tyr Tyr Ser Asp Tyr Asp Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser
20 25
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Val Lys Gln Ser His Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met His
1 5 10 15
Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys
20
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 17
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagatccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctgatgaagc ctggggcttc actgaagata 60
tcctgcaaga cttctggtta ctcattcact agttactaca tgcactgggt gaagcagagc 120
catggacaga gccttgagtg gattggattt attgaccctt tcaaagttaa tactggctac 180
aaccacaatt tcaggggcaa ggccacattg actgtagacc gatcttccac cacagcctac 240
atgcatctca gaagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagacgctac 300
tactctgatt acgacggcta tgctttggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
attttttgta gatctagtca gagccttgta cacagtgatg gaagcaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttcct 300
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac gg 342
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttccaggttc cactggtgac gagatccagc tgcagcagtc tg 42
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gatgggccct tggtgctagc tgaggagacg gtgactgagg tt 42
<210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttccaggttc cactggtgac gatgttgtga tgacccaaac tcc 43
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acagatggtg cagccaccgt ccgttttatt tccagcttgg tc 42
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctagcacca agggccca 18
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gtcaccagtg gaacctggaa cc 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acggtggctg caccatctg 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtcaccagtg gaacctggaa cc 22

Claims (10)

1.一种小鼠抗人CD34抗体，其特征在于：该小鼠抗人CD34抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
2.根据权利要求1所述的小鼠抗人CD34抗体，其特征在于：所述的重链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的重链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述的重链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的重链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的重链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的重链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述的重链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述的轻链可变区的互补决定区包括CDR1、CDR2与CDR3；所述的轻链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述的轻链可变区的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述的轻链可变区的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述的轻链可变区的骨架区包括FR1、FR2、FR3和FR4；所述的轻链可变区的FR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述的轻链可变区的FR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述的轻链可变区的FR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述的轻链可变区的FR4的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
3.一种抗人CD34嵌合抗体，其特征在于：该抗人CD34嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列包含权利要求1或2所述的小鼠抗人CD34抗体的重链可变区的氨基酸序列，该抗人CD34嵌合抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含权利要求1或2所述的小鼠抗人CD34抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
4.一种核苷酸分子，其特征在于：该核苷酸分子编码权利要求3所述的抗人CD34嵌合抗体。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于：所述的核苷酸分子编码所述的抗人CD34嵌合抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
6.一种表达载体，其特征在于：该表达载体包含权利要求4或5所述的核苷酸分子。
7.权利要求1或2所述的小鼠抗人CD34抗体的应用，其特征在于：所述的小鼠抗人CD34抗体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用。
8.权利要求1或2所述的小鼠抗人CD34抗体的应用，其特征在于：所述的小鼠抗人CD34抗体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
9.权利要求6所述的表达载体的应用，其特征在于：所述的表达载体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用。
10.权利要求3所述的抗人CD34嵌合抗体的应用，其特征在于：所述的抗人CD34嵌合抗体在制备用于诊断血液病的试剂中的应用或在制备用于治疗血液病、实体瘤的药物中的应用或在制备免疫抑制类药物中的应用或在鉴别肿瘤的方法中的应用；所述的抗人CD34嵌合抗体在器官移植领域或造血干细胞移植领域中的应用。
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EP3733707A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Celyad S.A. Car t-cells targeting bcma and uses thereof

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