CN114423284A - T细胞调节多肽及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了T细胞调节多肽(TMP)，其包含免疫调节多肽、I类HLA多肽(I类HLA重链多肽和β2微球蛋白多肽)和向T细胞受体呈递表位的KRAS肽(例如，包含癌症相关突变的KRAS肽)。TMP可用于调节T细胞的活性，以及用于调节个体的免疫反应。
Description
交叉引用
本申请要求2019年9月20日提交的美国临时专利申请第62/903,441号、2020年3月17日提交的美国临时专利申请第62/990,693号和2020年7月6日提交的美国临时专利申请第63/048,561号的权益，所述临时专利申请中的每一者通过引用整体并入本文。
引言
适应性免疫反应涉及存在于T细胞表面上的T细胞受体(TCR)与由主要组织相容性复合物(MHC；在人类中也称为人类白细胞抗原(HLA)复合物)在抗原呈递细胞(APC)表面上非共价呈递的小肽抗原的接合。此接合代表免疫系统的靶向机制并且是T细胞调节(活化或抑制)和效应功能所必需的分子相互作用。在表位特异性细胞靶向之后，经由在APC上发现的共刺激蛋白与T细胞的对应共刺激蛋白接合来激活所靶向的T细胞。两种信号—表位/TCR结合和APC共刺激蛋白与T细胞共刺激蛋白接合—是驱动T细胞特异性和活化或抑制所必需的。APC上的共刺激蛋白也称为“免疫调节”蛋白，这是因为当所述共刺激蛋白结合T细胞上的共刺激蛋白时将调节T细胞的活性，其中特异性调节取决于APC上的哪种免疫调节蛋白结合至T细胞上的哪种共刺激蛋白。TCR对给定表位具有特异性；然而，T细胞的共刺激蛋白并非表位特异性的，而通常在所有T细胞上或大T细胞亚群上表达。
发明内容
本公开提供了异二聚和单链T细胞调节多肽(TMP)及其二聚体，所述TMP及其二聚体包含免疫调节多肽、I类HLA多肽(I类HLA重链多肽和β2微球蛋白多肽)和向T细胞受体呈递表位的KRAS肽(例如，包含癌症相关突变的KRAS肽)。TMP可用于调节T细胞的活性，以及用于调节个体的免疫反应。
附图说明
图1A-1F是本公开的各种示例性TMP的示意图。
图2A-2F是本公开的各种二硫键连接的TMP的示意图。
图3A-3G提供免疫球蛋白Fc多肽的氨基酸序列。所述序列以SEQ ID NO 19-30列出。
图4提供来自智人(Homo sapiens)(NP_004039.1；SEQ ID NO:31)、黑猩猩(Pantroglodytes)(NP_001009066.1；SEQ ID NO:31)、恒河猴(Macaca mulatta)(NP_001040602.1；SEQ ID NO:32)、黄牛(Bos taurus)(NP_776318.1；SEQ ID NO:33)和小家鼠(Mus musculus)(NP_033865.2；SEQ ID NO:34)的β-2微球蛋白(β2M)前体(即，包括前导序列)的多个氨基酸序列比对。氨基酸1-20是信号肽。
图5A-5C提供等位基因A*0101(SEQ ID NO:35)、A*1101(SEQ ID NO:36)、A*2402(SEQ ID NO:37)和A*3303(SEQ ID NO:38)的全长人类HLA重链的氨基酸序列(图7A)；等位基因B*0702的全长人类HLA重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)(图7B)；和全长人类HLA-C重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)(图7C)。
图6提供无前导序列、跨膜结构域和细胞内结构域的十一个成熟I类MHC重链氨基酸序列的比对。所述序列从上到下列出如下：SEQ ID NO:41-51。
图7A-7B提供HLA-A重链氨基酸序列(图7A；分别为SEQ ID NO:52-60)与共有序列(图7B；SEQ ID NO:61)的比对。
图8A-8B提供HLA-B重链氨基酸序列(图8A；分别为SEQ ID NO:62-68)与共有序列(图8B；SEQ ID NO:69)的比对。
图9A-9B提供HLA-C重链氨基酸序列(图9A；分别为SEQ ID NO:70-78)与共有序列(图9B；SEQ ID NO:79)的比对。
图10提供HLA-E、HLA-F和HLA-G重链中的每一者的共有氨基酸序列(分别为SEQ IDNO:80-82)。可变氨基酸(aa)位置以依序编号的“X”残基指示；氨基酸84、139和236的位置加双下划线。
图11提供HLA-A(SEQ ID No:83)、HLA-B(SEQ ID NO:84)、HLA-C(SEQ ID NO:85)、HLA-E(SEQ ID NO:86)、HLA-F(SEQ ID NO:87)和HLA-G(SEQ ID NO:88)的共有氨基酸序列的比对。
图12A-12D提供本公开的多个二硫键连接的TMP的示意图。
图13A-13L提供适合包含于本公开的TMP中的多肽的实例的氨基酸序列。图13A-13F中的序列以SEQ ID NO:255-260列出。图13G-13L中的序列以SEQ ID NO:339-344列出。
图14A-14JJ提供适合包含于本公开的TMP中的多肽的实例的氨基酸序列。所述序列以SEQ ID NO:261-296列出。
图15A-15JJ提供适合包含于本公开的TMP中的多肽的实例的氨基酸序列。所述序列以SEQ ID NO:297-332列出。
图16A-16C提供本公开的二硫键连接的TMP的构型的实例的示意图。
图17提供本公开的“分裂链”TMP中的免疫调节多肽的位置的实例的示意图。
图18提供本公开的“单链”TMP中的免疫调节多肽的位置的实例的示意图。
图19A-19P提供本公开的单链TMP的一些实例的氨基酸序列。所述序列以SEQ IDNO:333-338和593-602列出。
图20描绘KRAS G12V(7-16)HLA-A11 TMP对体外KRAS G12V(7-16)特异性CD8+T细胞扩增的影响。
图21A-21JJ提供本公开的TMP的HLA-A重链氨基酸序列和β2M氨基酸序列的氨基酸序列。
图22A-22BB提供本公开的TMP的HLA-A重链氨基酸序列的氨基酸序列。
定义
本文中可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。因此，此术语包括但不限于单股、双股或多股DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤和嘧啶碱基或者其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有经修饰的肽骨架的多肽。此外，如本文所用，“多肽”是指包括对原生序列的修饰，例如缺失、添加和取代(如本领域技术人员所知，性质上通常是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可为故意的，如经由定点诱变，或可为偶然的，例如经由产生蛋白质的宿主突变或由于聚合酶链反应(PCR)扩增或其他重组DNA方法引起的错误。本文中对已知多肽中的特定残基或残基编号的提及应理解为是指野生型多肽中该位置处的氨基酸。就通过一个或多个氨基酸的添加或缺失而改变野生型多肽的序列来说，本领域的普通技术人员将了解，对特定残基或残基编号的提及将相应地改变以指代所改变的多肽中相同的特定氨基酸，所述特定氨基酸应理解为位于所改变的位置编号处。例如，如果通过在N末端处添加一个氨基酸而改变I类MHC多肽，则对位置84或位置84处的特定残基的提及应理解为指示在所改变的多肽上的位置85处的氨基酸。同样地，本文中对特定位置处的特定氨基酸的取代(例如Y84)的提及应理解为是指用氨基酸取代野生型多肽中位置84处的氨基酸。因此，Y84C取代应理解为用Cys残基取代存在于野生型序列中的Tyr残基。如果例如改变野生型多肽以将位置84处的氨基酸从其野生型氨基酸变为替代性氨基酸，则对位置84处氨基酸的取代应理解为是指对替代性氨基酸的取代。如果在此种情况下，也通过一个或多个氨基酸的添加或缺失而改变多肽，则对取代的提及应理解为是指对所改变的位置编号处的替代性氨基酸的取代。对多肽，例如I类MHC多肽中的“非天然存在的Cys残基”的提及意指所述多肽在相应野生型多肽中无Cys的位置处包含Cys残基。这可经由常规蛋白质工程化来实现，其中用半胱氨酸取代野生型序列中出现的氨基酸。
多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这意谓着，当比较两个序列时，在比对时所述百分比的碱基或氨基酸是相同的并且处于相同的相对位置处。序列同一性可用许多不同方式确定。为确定序列同一性，可使用各种适宜方法和计算机程序(例如BLAST、T-COFFEE、MUSCLE、MAFFT等)对序列进行比对，所述计算机程序在万维网的包括以下的网站上可得：ncbi.nlm.nili.gov/BLAST、ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/、ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/、mafft.cbrc.jp/alignment/software/。参见例如Altschul等人,(1990),J.Mol.Bioi.215:403-10。除非另有规定，否则如Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403中所述，通过BLAST(基本局部比对搜索工具)确定如本文所提及的“序列同一性”。
术语“保守氨基酸取代”是指蛋白质中具有相似侧链的氨基酸残基的可互换性。例如，一组具有脂族侧链的氨基酸由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成；一组具有脂族-羟基侧链的氨基酸由丝氨酸和苏氨酸组成；一组具有含酰胺侧链的氨基酸由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；一组具有芳族侧链的氨基酸由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成；一组具有碱性侧链的氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成；一组具有酸性侧链的氨基酸由谷氨酸和天冬氨酸组成；并且一组具有含硫侧链的氨基酸由半胱氨酸和甲硫氨酸组成。示例性保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸-甘氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所用，术语“免疫学突触”或“免疫突触”通常是指适应性免疫反应的两个相互作用免疫细胞之间的天然界面，包括例如抗原呈递细胞(APC)或靶细胞与效应细胞之间的界面，所述效应细胞是例如淋巴细胞、效应T细胞、天然杀伤细胞等。APC与T细胞之间的免疫学突触通常由T细胞抗原受体与主要组织相容性复合物分子的相互作用来起始，例如，如Bromley等人,Annu Rev Immunol.2001；19:375-96中所述；其公开内容通过引用整体并入本文。
“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、T调控细胞(Treg)和NK-T细胞。
如本文所用，术语“免疫调节多肽”(本文中也称为“MOD”)意指特异性地结合T细胞上的同源共刺激多肽从而提供信号的多肽，所述信号加上由例如TCR/CD3复合物与负载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)多肽的结合提供的初级信号，介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。如本文所论述，免疫调节多肽可包括但不限于野生型或野生型多肽的变体，例如细胞因子(例如IL-2)、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、Fas配体(FasL)、可诱导性共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体，以及与B7-H3特异性结合的配体。本公开的TMP的免疫调节结构域或“MOD”可结合存在于靶T细胞上的同源共刺激多肽。
如本文使用，术语“体内”是指在体内发生的任何过程或程序。
如本文所用，“体外”是指在体外发生的任何过程或程序。
如本文所用，“异源”意指分别在原生核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽。
如本文所用，“重组”意指特定核酸(DNA或RNA)是克隆、限制、聚合酶链反应(PCR)和/或接合步骤的各种组合的产物，产生具有与天然系统中发现的内源核酸可区分的结构编码或非编码序列的构建体。可从cDNA片段或从一系列合成寡核苷酸组装编码多肽的DNA序列，以提供能够从细胞中或无细胞转录和翻译系统中所含的重组转录单元表达的合成核酸。
术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可互换使用以指代包含载体和至少一个插入物的DNA分子。通常产生重组表达载体用于表达和/或增殖一个或多个插入物的目的，或用于构建其他重组核苷酸序列。一个或多个插入物可能或可能不操作性地连接至启动子序列，并且可能或可能不操作性地连接至DNA调控序列。
如本文所用，术语“亲和力”是指两种剂(例如抗体与抗原)的可逆结合的平衡常数并且以解离常数(KD)表示。亲和力可比抗体对无关氨基酸序列的亲和力高至少1倍、高至少2倍、高至少3倍、高至少4倍、高至少5倍、高至少6倍、高至少7倍、高至少8倍、高至少9倍、高至少10倍、高至少20倍、高至少30倍、高至少40倍、高至少50倍、高至少60倍、高至少70倍、高至少80倍、高至少90倍、高至少100倍或高至少1,000倍或更多倍。抗体对靶蛋白的亲和力可为例如约100纳摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔(pM)，或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更大。如本文所用，术语“亲合力”是指两种或更多种剂的复合物在稀释后对解离的抗性。关于抗体和/或抗原结合片段，术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中可互换使用。
如本文所用(例如，关于TMP与T细胞上的多肽(例如T细胞受体)的结合)，术语“结合”是指两个分子之间的非共价相互作用。非共价结合是指两个分子之间的直接缔合，这是归因于例如静电、疏水、离子和/或氢键相互作用，包括例如盐桥和水桥的相互作用。非共价结合相互作用的特征通常在于解离常数(KD)小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M、小于10-11M、小于10-12M、小于10-13M、小于10-14M或小于10-15M。“亲和力”是指非共价结合的强度，增加的结合亲和力与较低的KD相关联。“特异性结合”通常是指以至少约10-7M或更高，例如5×10-7M、10-8M、5×10-8M、10-9M和更高的亲和力结合。“非特异性结合”通常是指以小于约10-7M的亲和力结合(例如，以10-6M、10-5M、10-4M的亲和力结合)(例如，配体与除其指定结合位点或受体以外的部分的结合)。然而，在一些情形中，例如，TCR与肽/MHC复合物之间的结合，“特异性结合”可在1μM至100μM或100μM至1mM的范围内。如本文所用，“共价结合”或“共价键”是指在两个不同分子之间形成一个或多个共价化学结合。
如本文所用，“磷酸盐缓冲盐水”或“PBS”意指水基缓冲溶液，典型地以浓溶液可得。除非另有规定，否则本公开中使用的PBS溶液含有氯化钠(500mM)、磷酸氢二钠(10mM)、磷酸二氢钾(2mM)、氯化钾(2.7mM)并且其余是水。PBS的pH值是7.5±0.15。用18.2兆欧DNA酶和不含RNA酶的水制备缓冲液，并且经0.22微米过滤器过滤。
本文所用的术语“治疗(名词)”、“治疗(动词)”等通常意指获得所需药理和/或生理作用。就完全或部分预防疾病或其症状来说，作用可为预防性的；和/或就部分或完全治愈疾病和/或由所述疾病引起的不良影响来说，作用可为治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物的疾病或症状的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病或症状在可能易患所述疾病或症状但尚未诊断为患有所述疾病或症状的受试者中出现；(b)抑制疾病或症状，即，遏制其发展；和/或(c)缓解疾病，即，使疾病消退。可在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用治疗剂。对进行中的疾病的治疗尤其引人关注，其中所述治疗稳定或减轻患者的不良临床症状。期望在受影响组织中的功能完全丧失之前进行此种治疗。期望在疾病的症状阶段期间和在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用主题疗法。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者。哺乳动物包括例如人类、非人类灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠)、兔类动物(例如兔)、有蹄类动物(例如乳牛、绵羊、猪、马、山羊等)等。
除非另有指示，否则术语“基本上”旨在涵盖“完全”和“在很大程度上但并非完全”。例如，“基本上不诱导细胞溶解”的Ig Fc意指完全不诱导细胞溶解或在很大程度上不诱导细胞溶解的Ig Fc。
如本文所用，与量结合使用的术语“约”指示所述量可在规定量的10％之间变化。例如，“约100”意指90-110的量。在范围的情形中使用约时，关于范围的较低量使用的“约”意指所述较低量包括比所述范围的较低量低10％的量，并且关于范围的较高量使用的“约”意指所述较高量包括比所述范围的较高量高10％的量。例如，约100至约1000意谓范围从90延伸至1100。
如本文所用，术语“MHC重链多肽”统指存在于TMP中的MHC重链多肽的结构域。例如，如图17和图18中所说明，MHC重链多肽可包含α1、α2和α3结构域。
在进一步描述本公开之前，应了解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可有所变化。也应了解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在具有限制性，这是因为本公开的范围将仅受所附权利要求限制。
在提供值的范围的情况下，应了解，在所述范围的上限与下限之间的每个中间值(除非上下文另有明确指示，否则直至下限单位的十分之一)和在所述规定范围内的任何其他规定值或中间值都涵盖于本公开中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括于较小范围内并且也涵盖于本公开中，受规定范围内任何明确排除的界限所限制。在规定范围包括界限中的一者或两者的情况下，排除那些所包括的界限中的任一者或两者的范围也包括于本公开中。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管类似于或等效于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料都可用于本公开的实践或测试中，但现在描述优选方法和材料。本文中提及的所有出版物都通过引用并入本文，以公开和描述与所引用的出版物相关联的方法和/或材料。
必须注意，除非上下文另有明确指示，否则如本文中和所附权利要求中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“T细胞调节多肽”的提及包括多个此类多肽，并且对“免疫调节多肽”的提及包括对本领域技术人员已知的一个或多个免疫调节多肽及其等效物的提及，等等。进一步应注意，权利要求可草拟为排除任何任选的要素。因而，这种陈述旨在作为与权利要求要素的叙述结合使用“唯一”、“仅”等的排他性术语，或使用“否定”限制的先行基础。
应了解，为清楚起见在独立实施方案的情形中描述的本公开的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。反之，为简洁起见在单个实施方案的情形中描述的本公开的各种特征也可独立地或以任何合适的子组合提供。与本公开有关的实施方案的所有组合都由本公开明确涵盖并且在本文中公开，正如各个和每个组合个别地且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也由本公开明确涵盖并且在本文中公开，正如各个和每个此种子组合在本文中个别地且明确地公开一样。
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具体实施方式
本公开提供了包含免疫调节多肽并且包含表位呈递肽的T细胞调节多肽。TMP可用于调节T细胞的活性，以及用于调节个体的免疫反应。
T细胞调节多肽
本公开提供了一种T细胞调节多肽(TMP)，其包含：a)第一多肽；和b)第二多肽，其中所述TMP包含：i)KRAS肽，所述KRAS肽当结合至主要组织相容性复合物(MHC)多肽时，向T细胞受体(TCR)呈递表位；ii)第一MHC多肽；iii)第二MHC多肽；和iv)一个或多个免疫调节多肽；和任选地免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架。包含第一多肽和第二多肽的TMP在本文中也可称为“分裂链TMP”或“异二聚TMP”。如本文所论述，此类TMP的第一多肽和第二多肽通常将由一个或多个二硫键彼此共价连接，这可为TMP提供稳定性和/或改善的表达。
然而，在一些情况下，本公开的TMP可包含连接在一起以形成单个多肽链的多个不同多肽。此种单链TMP可包含例如i)KRAS肽，所述KRAS肽当结合至主要组织相容性复合物(MHC)多肽时，向T细胞受体(TCR)呈递表位；ii)第一MHC多肽和第二MHC多肽；和iii)一个或多个免疫调节多肽；以及任选地免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架。如下文所论述，异二聚TMP和单链TMP可自组装成二聚体，例如，当TMP包含Ig Fc，例如IgG1 Fc时。在此类情况下，二硫键将自发形成以键结两个TMP。
如本文所用，术语“KRAS肽”意指长度为至少4个氨基酸的肽，例如，4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa，包括长度在4至20个氨基酸、6至18个氨基酸、8至15个氨基酸、8至12个氨基酸、5至10个氨基酸、10至20个氨基酸和15至25个氨基酸的范围内)，当所述KRAS肽结合至MHC复合物时，向TCR呈递KRAS表位。如本文所用，术语“KRAS表位”是指在KRAS蛋白上发现的表位。如本文所用，术语“KRAS”和“KRAS蛋白”是同义的，并且意指具有在以下各项之一中存在的氨基酸序列的蛋白质：(i)KRAS4A多肽；(ii)KRAS4B；和(iii)在人类癌症中出现的(i)和(ii)的变体，包括例如突变形式。如本文所用，术语“KRAS多肽”意指具有在KRAS蛋白的全部或一部分中发现的氨基酸序列的多肽，或在指定情况下，与在人类癌症中出现的KRAS蛋白或变体的全部或一部分中发现的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的多肽，包括例如突变形式。
KRAS(也称为“KRAS原癌基因，GTPase”、“克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)”和“K-Ras P21蛋白”)是控制细胞增殖的GTPase。当突变时，KRAS可能无法控制细胞增殖，从而导致癌症。
野生型(正常；非癌症相关)KRAS多肽可具有以下氨基酸序列：
野生型(正常；非癌症相关)KRAS多肽可具有以下氨基酸序列：
KRAS的突变形式与某些癌症相关；并且KRAS突变形式的至少一部分存在于某些癌细胞的表面上。参见例如Prior等人,(2012)Cancer Res.72:2457；和Warren与Holt(2010)Human Immunology71:245。在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中，氨基酸G12、G13、T35、I36、E49、Q61、K127和A156是粗体且加下划线；这些残基中的一者或多者的取代可以KRAS多肽的癌症相关形式存在。癌症相关的KRAS多肽可包括以下一项或多项：i)G12的取代(例如G12C、G12V、G125、G12A、G12R、G12F或G12D)；ii)G13的取代(例如G13C、G13D、G13R、G13V、G13S或G13A)；iii)T35的取代(例如T35I)；iv)I36的取代(例如I36L或I36M)；v)E49的取代(例如E49K)；vi)Q61的取代(例如Q61H、Q61R、Q61P、Q61E、Q61K、Q61L或Q61K)；vii)K117的取代(例如K117N)；和viii)A146的取代(例如A146T或A146V)；其中氨基酸编号以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2列出。参见例如U.S.2019/0194192。
例如，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽的癌症相关突变形式可具有一个或多个氨基酸取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽的癌症相关突变形式仅具有单个氨基酸取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽的癌症相关突变形式仅具有两个氨基酸取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽的癌症相关突变形式仅具有三个氨基酸取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽的癌症相关突变形式仅具有四个氨基酸取代。在一些情况下，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽的癌症相关突变形式仅具有五个氨基酸取代。
例如，KRAS(G12D)(基于SEQ ID NO:1中列出的氨基酸编号，在氨基酸位置12处具有G至D取代的KRAS多肽)与胰管腺癌(PDAC)相关。KRAS(G12V)(基于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中列出的氨基酸编号，在氨基酸位置12处具有G至V取代的KRAS多肽)也与胰腺癌相关。KRAS(G12R)(基于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸编号，在氨基酸位置12处具有G至R取代的KRAS多肽)也与胰腺癌相关。参见例如Waters和Der(2018)Cold SpringHarb.Perspect.Med.8:(9).pii:a031435.doi:10.1101/cshperspect.a031435。作为另一个实例，KRAS(G12C)(基于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸编号，在氨基酸位置12处具有G至C取代的KRAS多肽)与肺癌，例如非小细胞肺癌相关。参见例如Román等人,(2018)Mol.Cancer 17:33。KRAS的其他突变形式(例如G12A；G12C；G12D；G12R；G12S；G12V；G13A；G13C；G13D；G13R；G13S；G13V)与各种癌症相关；其中此类癌症包括例如胆管癌、胆囊癌、腺癌、直肠腺癌、子宫内膜癌、造血组织肿瘤和肺癌。参见例如Prior等人,(20120CancerRes.72:2457。
作为另一个实例，KRAS多肽的癌症相关突变形式可在KRAS多肽(例如，具有SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列的KRAS多肽)的氨基酸61处具有氨基酸取代。例如，KRAS多肽的癌症相关突变形式可具有氨基酸取代，例如Q61H、Q61L、Q61E、Q61R或Q61K。
如上文所论述，在一些情况下，本公开提供了一种包含异二聚体的TMP，其中所述异二聚体包含：a)包含第一MHC多肽的第一多肽；和b)包含第二MHC多肽的第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含KRAS肽(例如，包含癌症相关突变的KRAS肽；其中KRAS肽的长度为至少4个氨基酸(例如，4个氨基酸至约25个氨基酸)；其中KRAS肽当结合至MHC复合物时，向T细胞受体呈递表位)；其中第一多肽和/或第二多肽包含一个或多个彼此可相同或不同的免疫调节多肽；和任选地Ig Fc多肽或非Ig支架。在一些情况下，一个或多个免疫调节多肽中的至少一者是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽展现降低的亲和力。
存在于本公开的TMP中的KRAS肽/MHC复合物以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)的亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)。一般来说，本公开的TMP结合至具有同源共刺激多肽和TCR的T细胞，所述TCR结合TMP的KRAS肽/MHC复合物的亲和力比相同TMP结合具有相同同源共刺激多肽但具有基本上不结合KRAS肽/MHC复合物的TCR(例如，KRAS肽/MHC复合物以小于10-7M的亲和力结合至TCR)的第二T细胞的亲和力更高，例如高25％。
本公开提供了一种TMP，其中所述TMP是异二聚体，其包含：a)包含第一MHC多肽的第一多肽；和b)包含第二MHC多肽的第二多肽，其中第一多肽或第二多肽包含KRAS肽；其中第一多肽和/或第二多肽包含一个或多个可相同或不同的免疫调节多肽，并且其中一个或多个免疫调节多肽中的至少一者可为野生型免疫调节多肽或野生型免疫调节多肽的变体，其中与相应野生型免疫调节多肽的氨基酸序列相比，变体免疫调节多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代；并且其中第一多肽或第二多肽任选地包含Ig Fc多肽或非Ig支架。在一些情况下，一个或多个免疫调节结构域中的至少一者是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽展现降低的亲和力，例如，当通过生物层干涉术测量时，(i)野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的结合亲和力与(ii)野生型免疫调节多肽的变体对同源共刺激多肽的结合亲和力的比率在1.5:1至106:1的范围内；并且其中与相应野生型免疫调节多肽的氨基酸序列相比，变体免疫调节多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代；并且其中第一多肽或第二多肽任选地包含Ig Fc多肽或非Ig支架。
在一些情况下，本公开的异二聚TMP可包含：a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)第二MHC多肽；和ii)任选地免疫球蛋白(Ig)Fc多肽或非Ig支架，其中TMP包含一个或多个可相同或不同的免疫调节结构域，其中一个或多个免疫调节结构域中的至少一者：A)在第一多肽的C末端；B)在第二多肽的N末端；C)在第二多肽的C末端；或D)在第一多肽的C末端和第二多肽的N末端，并且其中一个或多个免疫调节结构域中的至少一者可为野生型免疫调节多肽或野生型免疫调节多肽的变体，其中与相应野生型免疫调节多肽的氨基酸序列相比，变体免疫调节多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
本公开提供了一种TMP，所述TMP包含以下各物作为基本支架：a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)第二MHC多肽；和ii)任选地Ig Fc多肽或非Ig支架。本公开的TMP还包含一个或多个免疫调节多肽，其中一个或多个免疫调节多肽中的至少一者：A)在第一多肽的C末端；B)在第二多肽的N末端；C)在第二多肽的C末端；或D)在第一多肽的C末端和第二多肽的N末端。在一些情况下，一个或多个免疫调节多肽中的至少一者是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽展现降低的亲和力。
存在于本公开的TMP中的KRAS肽/MHC复合物以至少100μM(例如，至少10μM、至少1μM、至少100nM、至少10nM或至少1nM)的亲和力结合至T细胞上的T细胞受体(TCR)。
如上文所提及，在一些情况下，本公开的TMP包含单个多肽链。本公开的此类单链TMP包含：i)第一MHC多肽；ii)第二MHC多肽；iii)KRAS肽，所述KRAS肽当结合至MHC多肽时，向TCR呈递表位；和iv)一个或多个免疫调节多肽；以及任选地Ig Fc多肽或非Ig支架。
在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；iii)第二MHC多肽；iv)一个或多个免疫调节多肽；和v)Ig Fc多肽。在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；iv)一个或多个免疫调节多肽；和v)Ig Fc多肽。组分的此排列在图18中称为MOD位置2。
在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；iii)第二MHC多肽；iv)Ig Fc多肽；和v)一个或多个免疫调节多肽。在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；iv)Ig Fc多肽；和v)一个或多个免疫调节多肽。组分的此排列在图18中称为MOD位置3。
在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)一个或多个免疫调节多肽；ii)KRAS肽；iii)第一MHC多肽；iv)第二MHC多肽；和v)Ig Fc多肽。在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)一个或多个免疫调节多肽；ii)KRAS肽；iii)第一I类MHC多肽；iv)第二I类MHC多肽；和v)Ig Fc多肽。在一些情况下，本公开的单链TMP从N末端至C末端依次包含：i)一个或多个免疫调节多肽；ii)KRAS肽；iii)β2M多肽；iv)I类MHC重链多肽；和v)Ig Fc多肽。组分的此排列在图18中称为MOD位置4。
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的KRAS肽/MHC复合物以约10-4M至约5x10- 4M、约5x10-4M至约10-5M、约10-5M至5x10-5M、约5x10-5M至10-6M、约10-6M至约5x10-6M、约5x10- 6M至约10-7M、约10-7M至约5x10-7M、约5x10-7M至约10-8M或约10-8M至约10-9M的亲和力结合至T细胞上的TCR。以另一种方式表述，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的KRAS肽/MHC复合物以约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM、约0.1μM至约0.5μM、约0.5μM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、约75μM至约100μM的亲和力结合至T细胞上的TCR。
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的免疫调节多肽结合至其同源共刺激多肽的亲和力比相应野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的亲和力低至少10％、低至少15％、低至少20％、低至少25％、低至少30％、低至少35％、低至少40％、低至少45％、低至少50％、低至少55％、低至少60％、低至少65％、低至少70％、低至少75％、低至少80％、低至少85％、低至少90％、低至少95％或低95％以上。
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽的结合亲和力为1nM至100nM或100nM至100μM。例如，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽的结合亲和力为约100nM至150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽的结合亲和力为约1nM至约5nM、约5nM至约10nM、约10nM至约50nM、约50nM至约100nM。
免疫调节多肽对其同源共刺激多肽降低的亲和力与KRAS肽对TCR的亲和力的组合为本公开的TMP提供增强的选择性。例如，与结合至展示i)对除存在于TMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽的第二T细胞相比，本公开的TMP选择性地结合至展示以下两者的第一T细胞：i)对存在于TMP中的KRAS肽具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽。例如，本公开的TMP结合至第一T细胞的亲和力比其结合第二T细胞的亲和力高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少2倍、至少2.5倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或100倍以上。
在一些情况下，本公开的TMP当向有需要的个体施用时，诱导表位特异性T细胞反应和表位非特异性T细胞反应。换句话说，在一些情况下，本公开的TMP当向有需要的个体施用时，通过调节展示以下两者的第一T细胞的活性来诱导表位特异性T细胞反应：i)对存在于TMP中的KRAS表位具有特异性的TCR；ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽；并且通过调节展示以下的第二T细胞的活性来诱导表位非特异性T细胞反应：i)对除存在于TMP中的KRAS表位以外的表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1或至少100:1。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为约2:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约20:1至约25:1、约25:1至约50:1、或约50:1至约100:1、或大于100:1。“调节T细胞的活性”可包括以下一项或多项：i)激活细胞毒性(例如CD8+)T细胞；ii)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞的细胞毒性活性；iii)诱导由细胞毒性(例如CD8+)T细胞产生和释放细胞毒素(例如穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)；iv)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞的增殖；v)抑制自身反应性T细胞的活性；等。
免疫调节多肽对其同源共刺激多肽降低的亲和力与KRAS表位对TCR的亲和力的组合为本公开的TMP提供增强的选择性。因此，例如，与结合至展示i)对除存在于TMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽的第二T细胞的亲合力相比，本公开的TMP以更高亲合力结合至展示以下两者的第一T细胞：i)对存在于TMP中的KRAS表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽。
免疫调节多肽与其同源共刺激多肽之间的结合亲和力可通过生物层干涉术(BLI)使用经纯化的免疫调节多肽和经纯化的同源共刺激多肽来确定。TMP与其同源共刺激多肽之间的结合亲和力可通过BLI使用经纯化的TMP和同源共刺激多肽来确定。BLI方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如Lad等人,(2015)J.Biomol.Screen.20(4):498-507；和Shah与Duncan(2014)J.Vis.Exp.18:e51383。
可使用Octet RED 96(Pal FortéBio)仪器或类似仪器如下进行BLI测定。将TMP(例如，本公开的TMP；对照TMP(其中对照TMP包含野生型免疫调节多肽))固定至不溶性支撑物(“生物传感器”)上。经固定的TMP是“靶标”。可通过将捕获抗体固定至不溶性支撑物上来实现固定，其中捕获抗体固定TMP。例如，可通过将抗Fc(例如抗人IgG Fc)抗体固定至不溶性支撑物上来实现固定，其中经固定的抗Fc抗体结合并固定TMP(其中TMP包含Ig Fc多肽)。将共刺激多肽以若干不同浓度施加至经固定的TMP，并且记录仪器的反应。在包含25mMHEPES pH 6.8、5％聚(乙二醇)6000、50mM KCl、0.1％牛血清白蛋白和0.02％Tween 20非离子洗涤剂的液体介质中进行测定。在30℃下进行共刺激多肽与经固定的TMP的结合。作为结合亲和力的阳性对照，可使用抗I类MHC单克隆抗体。例如，可使用抗I类HLA单克隆抗体W6/32(美国典型培养物保藏中心编号HB-95；Parham等人,(1979)J.Immunol.123:342)，其具有7nM的KD。可使用抗I类MHC单克隆抗体的连续稀释液生成标准曲线。共刺激多肽或抗I类MHCmAb是“分析物”。BLI分析从两个表面反射的白光的干涉图案：i)来自经固定的多肽(“靶标”)；和ii)内部参考层。结合至生物传感器尖端的分子(“分析物”；例如，共刺激多肽；抗HLA抗体)的数目变化会引起干涉图案的位移；可实时测量干涉图案的此位移。描述靶标/分析物相互作用的亲和力的两个动力学术语是缔合常数(ka)和解离常数(kd)。这两个术语的比率(kd/a)得到亲和常数KD。
在多孔板中进行BLI测定。为进行测定，定义板布局，定义测定步骤，并且在Octet数据撷取软件中指定生物传感器。使生物传感器组合件水合。在Octet仪器上使经水合的生物传感器组合件和测定板平衡10分钟。一旦撷取数据，就将所撷取的数据加载至Octet数据分析软件中。通过指定用于参考扣除、y轴对齐、步间校正和Savitzky-Golay滤波的方法，在处理窗口中处理数据。通过指定分析步骤(缔合和解离)，选择曲线拟合模型(1:1)、拟合方法(全局)和目标窗口(以秒为单位)，在分析窗口中分析数据。评估拟合质量。如果在3倍范围内，则可取每个数据迹线(分析物浓度)的KD值的平均值。KD误差值应在亲和常数值的一个数量级内；R2值应高于0.95。参见例如Abdiche等人,(2008)J.Anal.Biochem.377:209。
除非本文另有规定，否则如上文所述，使用BLI确定本公开的TMP对同源共刺激多肽的亲和力，或对照TMP(其中对照TMP包含野生型免疫调节多肽)对同源共刺激多肽的亲和力。
在一些情况下，当通过BLI(如上文所述)测量时，i)对照TMP(其中对照包含野生型免疫调节多肽)对同源共刺激多肽的结合亲和力与ii)包含野生型免疫调节多肽变体的本公开的TMP对同源共刺激多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。在一些情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP(其中对照包含野生型免疫调节多肽)对同源共刺激多肽的结合亲和力与ii)包含野生型免疫调节多肽变体的本公开的TMP对同源共刺激多肽的结合亲和力的比率在1.5:1至106:1，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1或105:1至106:1的范围内。
作为一个实例，在对照TMP包含野生型IL-2多肽的情况下，以及在本公开的TMP包含变体IL-2多肽(相对于野生型IL-2多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)，例如包含本文所述的H16A和F42A取代的IL-2变体作为免疫调节多肽的情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP对IL-2受体(即，同源共刺激多肽)的结合亲和力与ii)本公开的TMP对IL-2受体的结合亲和力的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。在一些情况下，在对照TMP包含野生型IL-2多肽的情况下，以及在本公开的TMP包含变体IL-2多肽(相对于野生型IL-2多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽的情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP对IL-2受体(即，同源共刺激多肽)的结合亲和力与ii)本公开的TMP对IL-2受体的结合亲和力的比率在1.5:1至106:1，例如1.5:1至10:1、10:1至50:1、50:1至102:1、102:1至103:1、103:1至104:1、104:1至105:1或105:1至106:1的范围内。
作为另一个实例，在对照TMP包含野生型CD80多肽的情况下，以及在本公开的TMP包含变体CD80多肽(相对于野生型CD80多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽的情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP对CTLA4多肽(即，同源共刺激多肽)的结合亲和力与ii)本公开的TMP对CTLA4多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。
作为另一个实例，在对照TMP包含野生型CD80多肽的情况下，以及在本公开的TMP包含变体CD80多肽(相对于野生型CD80多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽的情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP对CD28多肽(即，同源共刺激多肽)的结合亲和力与ii)本公开的TMP对CD28多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。
作为另一个实例，在对照TMP包含野生型4-1BBL多肽的情况下，以及在本公开的TMP包含变体4-1BBL多肽(相对于野生型4-1BBL多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽的情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP对4-1BB多肽(即，同源共刺激多肽)的结合亲和力与ii)本公开的TMP对4-1BB多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。
作为另一个实例，在对照TMP包含野生型CD86多肽的情况下，以及在本公开的TMP包含变体CD86多肽(相对于野生型CD86多肽的氨基酸序列包含1至10个氨基酸取代)作为免疫调节多肽的情况下，当通过BLI测量时，i)对照TMP对CD28多肽(即，同源共刺激多肽)的结合亲和力与ii)本公开的TMP对CD28多肽的结合亲和力的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。
本公开的TMP对靶T细胞的结合亲和力可用以下方式测量：A)使本公开的TMP与靶T细胞接触，所述靶T细胞在其表面上表达：i)结合亲本野生型免疫调节多肽的同源共刺激多肽；和ii)基本上结合至表位的T细胞受体，其中TMP包含表位标签，使得TMP结合至靶T细胞；B)使结合靶T细胞的TMP与结合至表位标签的荧光标记结合剂(例如，荧光标记抗体)接触，产生TMP/靶T细胞/结合剂复合物；C)使用流式细胞术测量TMP/靶T细胞/结合剂复合物的平均荧光强度(MFI)。表位标签可为例如FLAG标签、血球凝集素标签、c-myc标签、聚(组氨酸)标签等。在一定范围的TMP浓度下测量的MFI提供亲和力的量度。在一定范围的TMP浓度下测量的MFI提供TMP的半最大有效浓度(EC50)。在一些情况下，本公开的TMP对靶T细胞的EC50在nM范围内；并且TMP对对照T细胞(其中对照T细胞在其表面上表达：i)结合亲本野生型免疫调节多肽的同源共刺激多肽；和ii)不结合至存在于TMP中的表位的T细胞受体)的EC50在μM范围内。在一些情况下，本公开的TMP对对照T细胞的EC50与TMP对靶T细胞的EC50的比率为至少1.5:1、至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、至少100:1、至少500:1、至少102:1、至少5x102:1、至少103:1、至少5x103:1、至少104:1、至少105:1或至少106:1。本公开的TMP对对照T细胞的EC50与TMP对靶T细胞的EC50的比率表现TMP的选择性。
在一些情况下，当如前段中所述进行测量时，与TMP与包含i)结合亲本野生型MOD的同源共刺激多肽；和ii)基本上结合至除存在于TMP中的表位以外的表位的T细胞受体的对照T细胞的结合相比，包含亲和力降低MOD的本公开的TMP对靶T细胞展现选择性结合。
KRAS肽
如上文所论述，本公开的TMP包含KRAS肽，所述KRAS肽的长度典型地为至少约4个氨基酸，并且当呈MHC/肽复合物(例如，HLA/肽复合物)时向T细胞呈递KRAS表位。
存在于本公开的TMP中的KRAS肽的长度可为至少4个氨基酸，例如，长度为4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa，包括长度在9-10个氨基酸、4至20个氨基酸、6至18个氨基酸、8至15个氨基酸、8至12个氨基酸、5至10个氨基酸、10至20个氨基酸和15至25个氨基酸的范围内)。在一些情况下，KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸。
存在于本公开的TMP中的KRAS表位是由T细胞特异性结合的肽，即，所述表位由表位特异性T细胞，即，具有对KRAS表位具有特异性的TCR的T细胞特异性结合。表位特异性T细胞结合具有参考氨基酸序列的表位，但基本上不结合与参考氨基酸序列不同的表位。例如，表位特异性T细胞结合具有参考氨基酸序列的表位，并且以小于10-6M、小于10-5M或小于10- 4M的亲和力结合与参考氨基酸序列不同的表位(如果发生结合)。表位特异性T细胞以至少10-7M、至少10-8M、至少10-9M或至少10-10M的亲和力可结合特异性针对的表位。
在一些情况下，合适的KRAS肽是长度为至少4个氨基酸的肽，例如，4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa，包括长度在9-10个氨基酸、4至20个氨基酸、6至18个氨基酸、8至15个氨基酸、8至12个氨基酸、5至10个氨基酸、10至20个氨基酸和15至25个氨基酸的范围内)的KRAS多肽包含与以下KRAS氨基酸序列中的一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
(A)MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLWDILDTAGQEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL PSRTVDTKQAQDLARSYGIP FIETSAKTRQ GVDDAFYTLV REIRKHKEKM SKDGKKKKKK SKTKCVIM(SEQ ID NO:1)，其中与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽包含一个或多个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代，并且其中一个或多个氨基酸取代可包括与癌症相关的取代；例如，在癌细胞中的KRAS多肽中发现的取代；
(B)MTEYKLVVVG AGGVGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSY RKQVVIDGET CLLDILDTAGQEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVP MVLVGNKCDL PSRTVDTKQAQDLARSYGIP FIETSAKTRQ RVEDAFYTLV REIRQYRLKK ISKEEKTPGC VKIKKCIIM(SEQ ID NO:2)，其中与SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列相比，KRAS多肽包含一个或多个(例如1、2、3、4或5个)氨基酸取代，并且其中一个或多个氨基酸取代可包括与癌症相关的取代；例如，在癌细胞中的KRAS多肽中发现的取代；和
(C)MTEY(X1)L(X2)(X3)(X4)GA(X5)(X6)VGKSALT IQLIQNHFVD EYDPTIEDSYRKQVVIDGET CLWDILDTAG QEEYSAMRDQ YMRTGEGFLC VFAINNTKSF EDIHHYREQI KRVKDSEDVPMVLVGNKCDL PSRTVDTKQA QDLARSYGIP FIETSAKTRQ GVDDAFYTLV REIRKHKEKM SKDGKKKKKKSKTKCVIM(SEQ ID NO:89)，其中X1是Lys、Phe或Leu；X2是Val或Leu；X3是Val或Thr；X4是Val或Thr；X5是Gly、Asp、Cys、Val或Ser；并且X6是Gly、Cys或Asp；其中X5和X6中的一者或两者不是Cys。
合适的KRAS肽的非限制性实例包括包含选自由以下组成的组的序列的肽：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)、VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)、VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)、VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)、VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)、VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)、VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)、VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)和VTVGACGVGK(SEQ IDNO:187)；其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
合适的KRAS肽的额外非限制性实例包括包含选自由以下组成的组的序列的肽：VVVGAGDVGK(SEQ ID NO:188)；VVGAGDVGK(SEQ ID NO:189)；VVVGARGVGK(SEQ ID NO:190)；和VVGARGVGK(SEQ ID NO:191)；其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
合适的KRAS肽的非限制性实例包括包含选自由以下组成的组的序列的肽：LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)、KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)、KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)、LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)、LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)、LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)、FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)、FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)和FLVVVGACGV(SEQ IDNO:203)；其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
合适的KRAS肽的额外非限制性实例包括包含选自由以下组成的组的序列的肽：KLVVVGAGDV(SEQ ID NO:204)；和KLVVVGARGV(SEQ ID NO:205)；其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
合适的KRAS肽的额外非限制性实例包括包含选自由以下组成的组的序列的肽：GAGDVGKSAL(SEQ ID NO:206)；AGDVGKSAL(SEQ ID NO:207)；DVGKSALTI(SEQ ID NO:208)；GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)；AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)；YKLVVVGAV(SEQ ID NO:211)；ARGVGKSAL(SEQ ID NO:212)；GARGVGKSAL(SEQ ID NO:213)；EYKLVVVGAR(SEQ ID NO:214)；RGVGKSALTI(SEQ ID NO:215)；LVVVGARGV(SEQ ID NO:216)；GADGVGKSAL(SEQ ID NO:217)；ACGVGKSAL(SEQ ID NO:218)；和GACGVGKSAL(SEQ ID NO:219)；其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸；或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
在一些情况下，如上文所述，本公开的TMP调节包含对KRAS多肽的G12V形式具有特异性的TCR的T细胞的活性。在此类情况下，存在于本公开的TMP中的KRAS肽可包含例如以下氨基酸序列中的一者：VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VGAVGVGKS(SEQ ID NO:222)、VGAVGVGKSA(SEQ ID NO:223)、AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)、AVGVGKSALT(SEQ ID NO:225)、GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)、GAVGVGKSA(SEQ ID NO:227)、LVVVGAVGVG(SEQ ID NO:228)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)和KLVVVGAVG(SEQ ID NO:231)；其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的KRAS肽呈递对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G等位基因具有特异性的表位。在一个实施方案中，存在于TMP中的KRAS肽呈递限于HLA-A*0101、A*0201、A*0203、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3101、A*3303、A*3401和/或A*6801的表位。在一个实施方案中，存在于TMP中的KRAS表位肽呈递限于HLA-B*0702、B*0801、B*1502、B*2705、B*3802、B*3802、B*3901、B*3902、B*4001、B*4601、B*5101和/或B*5301的表位。在一个实施方案中，存在于TMP中的KRAS表位肽呈递限于C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*702、C*0801和/或C*1502的表位。
作为非限制性实例，KRAS肽包含选自由以下组成的组的肽：VVGADGVGK(SEQ IDNO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)、VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)、VVVGADGVGK(SEQ IDNO:179)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)、VTGADGVGK(SEQ IDNO:182)、VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)、VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)、VTVGADGVGK(SEQ IDNO:185)、VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)、VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)、VVVGAGDVGK(SEQ IDNO:188)、VVGAGDVGK(SEQ ID NO:189)、VVVGARGVGK(SEQ ID NO:190)和VVGARGVGK(SEQ IDNO:191)，其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸，所述KRAS肽当结合至包含β2M多肽和A*1101HLA-A重链的HLA复合物时呈递表位。此类肽也可与包含β2M多肽和A*6801HLA-A重链的HLA复合物复合存在。
作为非限制性实例，KRAS肽包含选自由以下组成的组的肽：LVVVGADGV(SEQ IDNO:192)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)、KLVVVGADGV(SEQ IDNO:195)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)、KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)、LLVVGADGV(SEQ IDNO:198)、LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)、LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)、FLVVVGADGV(SEQ IDNO:201)、FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)和FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)，其中KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸，所述KRAS肽当结合至包含β2M多肽和A*0201HLA-A重链的HLA复合物时呈递表位。
作为额外实例，以下KRAS肽当结合至包含β2M多肽和如下HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位：GAGDVGKSAL(SEQ ID NO:206)，其当结合至包含β2M多肽和B*3801HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；AGDVGKSAL(SEQ ID NO:207)，其当结合至包含β2M多肽和B0702、B*3801或B*3901HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；DVGKSALTI(SEQ ID NO:208)，其当结合至包含β2M多肽和B*5101HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)，其当结合至包含β2M多肽和B*0702或B*3801HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)，其当结合至包含β2M多肽和B*0702HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；YKLVVVGAV(SEQ ID NO:211)，其当结合至包含β2M多肽和A*0203或B*3902HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；ARGVGKSAL(SEQ ID NO:212)，其当结合至包含β2M多肽和B*0702、B*2705或B*3901HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；GARGVGKSAL(SEQID NO:213)，其当结合至包含β2M多肽和B*0702HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；EYKLVVVGAR(SEQ ID NO:214)，其当结合至包含β2M多肽和A*3101HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；RGVGKSALTI(SEQ ID NO:215)，其当结合至包含β2M多肽和B*0702HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；LVVVGARGV(SEQ ID NO:216)，其当结合至包含β2M多肽和A*0203HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；GADGVGKSAL(SEQ ID NO:217)，其当结合至包含β2M多肽和B*3801HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；ACGVGKSAL(SEQ ID NO:218)，其当结合至包含β2M多肽和B*0702HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位；和GACGVGKSAL(SEQ IDNO:219)，其当结合至包含β2M多肽和B*3801HLA-A重链的HLA复合物时可呈递表位。
MHC多肽
如上文所提及，本公开的TMP包括MHC多肽。出于本公开的目的，术语“主要组织相容性复合物(MHC)多肽”意在包括各种物种的MHC多肽，包括人类MHC(也称为人类白细胞抗原(HLA))多肽、啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)MHC多肽，和其他哺乳动物物种(例如兔类动物、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、有蹄类动物(例如马、牛、绵羊、山羊等)的MHC多肽等。术语“MHC多肽”意在包括I类MHC多肽(例如，β-2微球蛋白和I类MHC重链)。
在一些情况下，第一MHC多肽是I类MHCβ2M(β2M)多肽，并且第二MHC多肽是I类MHC重链(H链)(“MHC-H”))。在其他情况下，第一MHC多肽是I类MHC重链多肽；并且第二MHC多肽是β2M多肽。在一些情况下，β2M和MHC-H链都来源于人类；即，MHC-H链是HLA重链或其变体。除非另有明确规定，否则本公开的TMP不包括I类MHC重链的膜锚定结构域(跨膜区)，或足以将所得TMP锚定至表达其的细胞(例如真核细胞，例如哺乳动物细胞)的I类MHC重链部分。在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链不包括与原生I类MHC重链相关的信号肽、跨膜结构域或细胞内结构域(胞质尾)。因此，例如，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链仅包括I类MHC重链的α1、α2和α3结构域。在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链的长度为约270个氨基酸(aa)至约290aa。在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链的长度为270aa、271aa、272aa、273aa、274aa、275aa、276aa、277aa、278aa、279aa、280aa、281aa、282aa、283aa、284aa、285aa、286aa、287aa、288aa、289aa或290aa。
在一些情况下，TMP的MHC多肽是人类MHC多肽，其中人类MHC多肽也称为“人类白细胞抗原”(“HLA”)多肽。在一些情况下，TMP的MHC多肽是I类HLA多肽，例如，β2-微球蛋白多肽或I类HLA重链多肽。I类HLA重链多肽包括HLA-A重链多肽、HLA-B重链多肽、HLA-C重链多肽、HLA-E重链多肽、HLA-F重链多肽和HLA-G重链多肽。
I类MHC重链
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链多肽包含与图7-13中所描绘的人类HLA重链多肽中的任一者的氨基酸序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，I类MHC重链的长度为270aa、271aa、272aa、273aa、274aa、275aa、276aa、277aa、278aa、279aa、280aa、281aa、282aa、283aa、284aa、285aa、286aa、287aa、288aa、289aa或290aa。在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链多肽包含图7-13中所描绘的氨基酸序列中的任一者的1-30、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代(除指示为在重链共有序列中可变的那些位置以外)。在一些情况下，I类MHC重链不包括跨膜或胞质结构域。作为一个实例，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与图5A、图5B和图5C中的任一者中所描绘的人类HLA-A重链多肽的氨基酸25-300(缺少所有或基本上所有前导序列、跨膜序列和胞质序列)或氨基酸25-365(缺少前导序列)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
图5A、图5B和图5C提供I类人类白细胞抗原(HLA)重链多肽的氨基酸序列。信号序列(氨基酸1-24)是粗体且加下划线。图5A条目：3A.1是HLA-A重链(HLA-A*01:01:01:01或A*0101)(NCBI登录号NP_001229687.1)，SEQ ID NO:35；条目3A.2来自HLA-A*1101 SEQ IDNO:36；条目3A.3来自HLA-A*2402 SEQ ID NO:37；并且条目3A.4来自HLA-A*3303 SEQ IDNO:38。图5B提供序列HLA-B*07:02:01(HLA-B*0702)NCBI GenBank登录号NP_005505.2(也参见GenBank登录号AUV50118.1.)。图5C提供序列HLA-C*0701(GenBank登录号NP_001229971.1)(HLA-C*07:01:01:01或HLA-Cw*070101、HLA-Cw*07，参见GenBank登录号CAO78194.1)。
如上文所提及，异二聚TMP的第一多肽和第二多肽典型地将包含一个或多个二硫键以提供具有改善的稳定性和/或改善的表达的TMP。可在同一多肽中提供的Cys残基之间形成一个或多个二硫键，即，链内二硫键。替代地或除此类链内二硫键以外，可在第一多肽和第二多肽中提供的Cys残基之间形成一个或多个链间二硫键，例如，(i)可在I类MHC多肽中的两者，即，β2M多肽和I类MHC重链多肽中提供非天然存在的Cys残基，和/或(ii)可在第一多肽和第二多肽两者中提供包含Cys残基的接头，和/或(iii)可在第一多肽和第二多肽中的一者中(例如，在第一多肽中的表位与β2M之间)提供包含Cys残基的接头，并且可在另一个I类MHC多肽中(例如，在I类MHC重链多肽中)提供非天然存在的Cys残基。下文论述示例性构型。
图6提供无前导序列或跨膜结构域或细胞内结构域的十一个成熟I类MHC重链氨基酸序列的比对。所比对的序列是人类HLA-A、HLA-B和HLA-C、小鼠H2K蛋白序列、HLA-A的三个变体(变体1、变体2C和变体2CP)和3个人类HLA-A变体(HLA-A*1101；HLA-A*2402；和HLA-A*3303)。在比对中指示位置(成熟蛋白的84和139)，在所述位置处可引入半胱氨酸残基(例如，通过取代)用于形成二硫键以稳定MHC H链-β2M复合物。在比对中也显示可由半胱氨酸残基取代的位置236(成熟多肽的位置236)，所述半胱氨酸残基可与β2M(例如，在aa 12处)形成链间二硫键。箭头出现在那些位置中的每一者上方并且残基是粗体。比对中所示的第七个HLA-A序列(变体2c)显示在位置84、139和236处经C残基取代的变体2的序列。在残基84、139和236两侧的框显示由五个残基组成的所述六个组的任一侧上的五个氨基酸的组，表示为aac1(对于“氨基酸簇1”)、aac2(对于“氨基酸簇2”)、aac3(对于“氨基酸簇3”)、aac4(对于“氨基酸簇4”)、aac5(对于“氨基酸簇5”)和aac6(对于“氨基酸簇6”)，其可由独立地选自以下的1至5个氨基酸代替：(i)任何天然存在的氨基酸，或(ii)除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
关于图6，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列GTLRG(SEQ ID NO:98)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，L由I、V、A或F代替)的该序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:99)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，N由Q代替，Q由N代替，和/或E由D代替)的该序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADM(SEQ ID NO:100)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，T由S代替，A由G代替，D由E代替，和/或M由L、V或I代替)的该序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQTTK(SEQ ID NO:101)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，A由G代替，Q由N代替，或T由S代替，和/或K由R或Q代替)的该序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:102)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，V由I或L代替，E由D代替，T由S代替，和/或R由K代替)的该序列；和/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDGTF(SEQ ID NO:103)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，D由E代替，T由S代替，或F由L、W或Y代替)的该序列。
图7-9提供成熟I类HLA重链氨基酸序列(无前导序列或跨膜结构域或细胞内结构域)的比对。图7A中比对的氨基酸序列是以下等位基因的I类HLA-A重链：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303和A*3401。图8A中比对的氨基酸序列是以下等位基因的I类HLA-B重链：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601和B*5301。图9A中比对的氨基酸序列是以下等位基因的I类HLA-C重链：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0801和C*1502。在比对中指示位置(成熟蛋白的84和139)，在所述位置处可引入半胱氨酸残基(例如，通过取代)用于形成二硫键以稳定HLA H链-β2M复合物。在比对中也显示可由半胱氨酸残基取代的位置236(成熟多肽的位置236)，所述半胱氨酸残基可与β2M(例如，在aa 12处)形成链间二硫键。在残基84、139和236两侧的框显示由五个残基组成的所述六个组的任一侧上的五个氨基酸的组，表示为aac1(对于“氨基酸簇1”)、aac2(对于“氨基酸簇2”)、aac3(对于“氨基酸簇3”)、aac4(对于“氨基酸簇4”)、aac5(对于“氨基酸簇5”)和aac6(对于“氨基酸簇6”)，其可由独立地选自以下的1至5个氨基酸代替：(i)任何天然存在的氨基酸，或(ii)除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
图7A、图8A和图9A分别提供成熟I类HLA-A、HLA-B和HLA-C重链的氨基酸序列的比对。提供成熟蛋白的细胞外部分的序列(无前导序列或跨膜结构域或细胞内结构域)。如图6中所述，也示出aa残基84、139和236的位置及其侧翼残基(aac1至aac6)，所述侧翼残基可由1至5个独立地选自以下的氨基酸代替：(i)任何天然存在的氨基酸，或(ii)除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。图7B、图8B和图9B提供图7A、图8A和图9A中分别提供的HLA-A、HLA-B和HLA-C序列的共有氨基酸序列。共有序列以依序编号的“X”残基示出可变氨基酸位置并且氨基酸84、139和236的位置加双下划线。
关于图7A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列GTLRG(SEQ ID NO:98)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，L由I、V、A或F代替)的该序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:99)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，N由Q代替，Q由N代替，和/或E由D代替)的该序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADM(SEQ ID NO:100)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，T由S代替，A由G代替，D由E代替，和/或M由L、V或I代替)的该序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQTTK(SEQ ID NO:101)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，A由G代替，Q由N代替，或T由S代替，和或K由R或Q代替)的该序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:102)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，V由I或L代替，E由D代替，T由S代替，和/或R由K代替)的该序列；和/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDGTF(SEQ ID NO:103)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，D由E代替，T由S代替，或F由L、W或Y代替)的该序列。
关于图8A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列RNLRG(SEQ ID NO:104)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，N由T或I代替；和/或L由A代替；和/或第二个R由L代替；和/或G由R代替)的该序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:99)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，N由Q代替，Q由N代替，和/或E由D代替)的该序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADT(SEQ ID NO:105)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，第一个T由S代替；和/或A由G代替；和/或D由E代替；和/或第二个T由S代替)的该序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQITQ(SEQ ID NO:106)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，A由G代替；和/或第一个Q由N代替；和/或I由L或V代替；和/或T由S代替；和/或第二个Q由N代替)的该序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:102)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，V由I或L代替，E由D代替，T由S代替，和/或R由K代替)的该序列；和/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDRTF(SEQ ID NO:107)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，D由E代替；和/或T由S代替；和/或R由K或H代替；和/或F由L、W或Y代替)的该序列。
关于图9A，在一些情况下：i)aac1(氨基酸簇1)可为氨基酸序列RNLRG(SEQ ID NO:104)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，N由K代替；和/或L由A或I代替；和/或第二个R由H代替；和/或G由T或S代替)的该序列；ii)aac2(氨基酸簇2)可为氨基酸序列YNQSE(SEQ ID NO:99)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，N由Q代替，Q由N代替，和/或E由D代替)的该序列；iii)aac3(氨基酸簇3)可为氨基酸序列TAADT(SEQ ID NO:105)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，第一个T由S代替；和/或A由G代替；和/或D由E代替；和/或第二个T由S代替)的该序列；iv)aac4(氨基酸簇4)可为氨基酸序列AQITQ(SEQ ID NO:106)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，A由G代替；和/或第一个Q由N代替；和/或I由L代替；和/或第二个Q由N或K代替)的该序列；v)aac5(氨基酸簇5)可为氨基酸序列VETRP(SEQ ID NO:102)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，V由I或L代替，E由D代替，T由S代替，和/或R由K或H代替)的该序列；和/或vi)aac6(氨基酸簇6)可为氨基酸序列GDGTF(SEQ ID NO:103)或其中一个或两个氨基酸缺失或经其他天然存在的氨基酸取代(例如，D由E代替；和/或T由S代替；和/或F由L、W或Y代替)的该序列。
HLA-A
在一些情况下，本公开的TMP包含HLA-A重链多肽。可并入本公开的TMP中的HLA-A重链肽序列或其部分包括但不限于等位基因：A*0101、A*0201、A*0301、A*1101、A*2301、A*2402、A*2407、A*3303和A*3401，所述等位基因在图7A中在无所有或基本上所有前导序列、跨膜序列和胞质序列的情况下进行比对。那些等位基因中的任一者可在位置84、139和/或236(如图7A中所示)中的一者或多者处包含选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；和在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。另外，也可采用与那些HLA-A等位基因的序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的HLA-A序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。本公开的TMP可包含I类MHC重链，所述I类MHC重链包含图21A-21AA、21DD-21FF、21HH和22A-22BB中的任一者中所描绘的氨基酸序列。
在一些情况下，本公开的TMP包含HLA-A重链多肽，所述HLA-A重链多肽包含图21II(SEQ ID NO:61)中所示的HLA-A共有氨基酸序列，其中X1是F、Y、S或T；X2是K或R；X3是Q、G、E或R；X4是N或E；X5是R或G；X6是N或K；X7是M或V；X8是H或Q；X9是T或I；X10是D或H；X11是A、V或E；X12是N或D；X13是G或R；X14是T或I；X15是L或A；X16是R或L；X17是G或R；X18是A或D；X19是I、L或V；X20是I、R或M；X21是F或Y；X22是S或P；X23是W或G；X24是R、H或Q；X25是D或Y；X26是N或K；X27是T或I；X28是K或Q；X29是R或H；X30是A或T；X31是A或V；X32是H或R；X33是R、L、Q或W；X34是V或A；X35是D或E；X36是R或T；X37是D或E；X38是W或G；X39是P或A；X40是P或A；X41是V或I；X42是S或G；X43是A或S；X44是Q或E；并且X45是P或L。
作为一个实例，TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21A(SEQ ID NO:108)或21B(SEQID NO:109)中所示的人类HLA-A重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。图21B的HLA-A重链多肽也称为“HLA-A*0201”或简称“HLA-A02”。在一些情况下，C末端Pro不包括在本公开的TMP中。例如，在一些情况下，适合包含于本公开的TMP中的HLA-A02多肽与图21C(SEQ ID NO:110)中所示的氨基酸序列包含至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性。
HLA-A(Y84A；A236C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84A和A236C取代。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21D(SEQ ID NO:111)中所示的人类HLA-A重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
在一些情况下，适合包含于本公开的TMP中的HLA-A重链多肽是包含图21E(SEQ IDNO:112)中的氨基酸序列的HLA-A02(Y84A；A236C)多肽。在一些情况下，适合包含于本公开的TMP中的HLA-A重链多肽是包含图21F(SEQ ID NO:113)中所示的氨基酸序列的HLA-A02(Y84A；A236C)多肽。
HLA-A(Y84A；A139C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84C和A139C取代。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21G(SEQ ID NO:114)中所示的人类HLA-A重链(Y84C；A139C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸139是Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。
HLA-A(Y84C；A139C；A236C)
在一些情况下，适合包含于本公开的TMP中的I类MHC重链多肽包含与图21H(SEQID NO:120)中所示的人类HLA-A重链(Y84C；A139C；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys，氨基酸139是Cys，并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。在氨基酸236处的Cys可与第二多肽链中的Cys残基形成二硫键。例如，在氨基酸236处的Cys可与包含R12C取代的β2M多肽中的Cys-12残基形成二硫键。
在一些情况下，适合包含于本公开的TMP中的HLA-A重链多肽是包含图21I(SEQ IDNO:232)中所示的氨基酸序列的HLA-A02(Y84C；A139C；A236C)多肽。
HLA-A11(HLA-A*1101)
作为一个非限制性实例，TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21J(SEQ ID NO:115)中所示的人类HLA-A11重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此种I类MHC重链可主要处于亚洲人群(包括亚裔个体人群)中。
HLA-A11(Y84A；A236C)
作为一个非限制性实例，在一些情况下，I类MHC重链多肽是包含Y84A和A236C取代的HLA-A11等位基因。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21K(SEQ ID NO:116)中所示的人类HLA-AA11重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，如图21L(SEQ ID NO:233)中所示，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
HLA-A24(HLA-A*2402)
作为一个非限制性实例，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21M(SEQ IDNO:117)中所示的人类HLA-A24重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此种I类MHC重链可主要处于亚洲人群(包括亚裔个体人群)中。在一些情况下，氨基酸84是Ala。在一些情况下，氨基酸84是Cys。在一些情况下，氨基酸236是Cys。在一些情况下，氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
作为一个非限制性实例，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21N(SEQ IDNO:586)中所示的人类HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此种I类MHC重链可主要处于亚洲人群(包括亚裔个体人群)中。在一些情况下，在位置84处的氨基酸X1是Ala。在一些情况下，氨基酸84是Cys。在一些情况下，在位置236处的氨基酸X2是Cys。在一些情况下，氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
在一些情况下，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与以下附图中的一者所示的人类HLA-A24(也称为HLA-A*2402)重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
(i)图21O(SEQ ID NO:235)，其中氨基酸84是Tyr并且氨基酸236是Ala(氨基酸84和236是粗体且加下划线)；并且其中I类MHC重链的长度为约275个氨基酸；
(ii)TMP图21P(SEQ ID NO:236)，其中氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Ala(氨基酸84和236是粗体且加下划线)；并且其中I类MHC重链的长度为约275个氨基酸；
(iii)TMP图21Q(SEQ ID NO:237)，其中氨基酸84是Tyr并且氨基酸236是Cys(氨基酸84和236是粗体且加下划线)；并且其中I类MHC重链的长度为约275个氨基酸；
(iv)TMP图21R(SEQ ID NO:238)，其中氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys(氨基酸84和236是粗体且加下划线)；并且其中I类MHC重链的长度为约275个氨基酸；
(v)TMP图21S(SEQ ID NO:239)，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Ala(氨基酸84和236是粗体且加下划线)；并且其中I类MHC重链的长度为约275个氨基酸；和
(vi)TMP图21T(SEQ ID NO:240)，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys(氨基酸84和236是粗体且加下划线)；并且其中I类MHC重链的长度为约275个氨基酸。
HLA-A33(HLA-A*3303)
作为一个非限制性实例，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21U(SEQ IDNO:118)中所示的人类HLA-A33重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。此种I类MHC重链可主要处于亚洲人群(包括亚裔个体人群)中。在一些情况下，氨基酸84是Ala。在一些情况下，氨基酸84是Cys。在一些情况下，氨基酸236是Cys。在一些情况下，氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
HLA-B
在一些情况下，本公开的TMP包含HLA-B重链多肽。可并入本公开的TMP中的HLA-B重链肽序列或其部分包括但不限于等位基因：B*0702、B*0801、B*1502、B*3802、B*4001、B*4601和B*5301，所述等位基因在图8A中在无所有或基本上所有前导序列、跨膜序列和胞质序列的情况下进行比对。那些等位基因中的任一者可在位置84、139和/或236(如图8A中所示)中的一者或多者处包含选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；和在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。另外，也可采用包含与那些HLA-B等位基因的序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的HLA-B多肽(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
在一些情况下，本公开的TMP包含HLA-B重链多肽，所述HLA-B重链多肽包含图21JJ(SEQ ID NO:69)中所示的HLA-B共有氨基酸序列，其中X1是H、Y或D；X2是A或S；X3是M或V；X4是A、S或T；X5是Q或L；X6是A或T；X7是E、M K或T；X8是A或T；X9是E或N；X10是I或K；X11是Y、F、S或C；X12是N或Q；X13是A或T；X14是D或Y；X15是E或V；X16是S或N；X17是T、N或I；X18是A或L；X19是L或R；X20是R或G；X21是T或I；X22是L或I；X23是R或S；X24是R或S；X25是S或T；X26是L或W；X27是E或V；X28是R、D、L或W；X29是A或T；X30是L、E或T；X31是E或D；X32是K或T；X33是E或Q；并且X34是I或V。
作为一个实例，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21V(SEQ ID NO:119)中所示的人类HLA-B重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
HLA-B(Y84A；A236C)
作为一个非限制性实例，在一些情况下，I类MHC重链多肽是包含Y84A和A236C取代的HLA-B多肽。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21W(SEQ ID NO:121)中所示的人类HLA-B重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
HLA-B(Y84C；A139C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84C和A139C取代。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21X(SEQ ID NO:122)中所示的人类HLA-B重链(Y84C；A139C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸139是Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。
HLA-B*0702
作为一个实例，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链多肽包含图8A中的HLA-B*0702(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列，或与该序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些情况下，在本公开的TMP的HLA-B重链多肽与图6中标记为HLA-B或图8A中标记为“B*0702”的序列具有小于100％同一性的情况下，其可在位置84、139和/或236中的一者或多者处包含选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸取代(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸取代(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；和在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。在一些情况下，本公开的TMP的HLA-B重链多肽包含Y84A和A236C取代。在一些情况下，本公开的TMP的HLA-B*0702重链多肽包含Y84C和A139C取代。在一些情况下，本公开的TMP的HLA-B重链多肽包含Y84C、A139C和A236C取代。
HLA-C
在一些情况下，本公开的TMP包含HLA-C重链多肽。可并入本公开的TMP中的HLA-C重链多肽或其部分包括但不限于等位基因：C*0102、C*0303、C*0304、C*0401、C*0602、C*0701、C*0801和C*1502，所述等位基因在图9A中在无所有或基本上所有前导序列、跨膜序列和胞质序列的情况下进行比对。那些等位基因中的任一者可在位置84、139和/或236(如图9A中所示)中的一者或多者处包含选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸取代(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸取代(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸取代(A139C)；和在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。另外，也可采用包含与那些HLA-C等位基因的序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的HLA-C多肽(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
在一些情况下，本公开的TMP包含HLA-C重链多肽，所述HLA-C重链多肽包含以下HLA-C共有氨基酸序列：
其中X1是C或G；X2是R或K；X3是F、Y、S或D；X4是R或W；X5是H或R；X6是A或S；X7是Q或R；X8是A或E；X9是N或K；X10是T或A；X11是S或N；X12是N或K；X13是A或D；X14是G或R；X15是T或I；X16是L或I；X17是W或R；X18是C、Y、F或S；X19是L或V；X20是Y或H；X21是D或N；X22是Y、F、S或L；X23是L或W；X24是E、A或T；X25是R、L或W；X26是L或T；X27是E或K；X28是E或K；X29是H或P；X30是R或V；X31是W或R；X32是V或M；X33是E或Q；X34是M或V；X35是P或Q；X36是R或S；并且X37是P或G。
作为一个实例，本公开的TMP的I类MHC重链多肽可包含与图21Y(SEQ ID NO:123)中所示的人类HLA-C重链氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
HLA-C(Y84A；A236C)
作为一个非限制性实例，在一些情况下，I类MHC重链多肽是包含Y84A和A236C取代的HLA-C多肽。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21Z(SEQ ID NO:124)中所示的人类HLA-C重链(Y84A；A236C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Ala并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，Cys-236与包含R12C取代的变体β2M多肽的Cys-12形成链间二硫键。
HLA-C(Y84C；A139C)
在一些情况下，I类MHC重链多肽包含Y84C和A139C取代。例如，在一些情况下，I类MHC重链多肽包含与图21AA(SEQ ID NO:125)中所示的人类HLA-C重链(Y84C；A139C)氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸139是Cys。在一些情况下，Cys-84与Cys-139形成链内二硫键。
HLA-C*0701
在一些情况下，本公开的TMP的I类MHC重链多肽包含图9A的HLA-C*0701(图6中标记为HLA-C)的氨基酸序列，或与该序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些情况下，在本公开的TMP的HLA-C重链多肽与图9A中标记为HLA-C*0701的序列具有小于100％同一性的情况下，其可在位置84、139和/或236中的一者或多者处包含选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸取代(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸取代(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；和在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。在一些情况下，本公开的TMP的HLA-C重链多肽包含Y84A和A236C取代。在一些情况下，T细胞MMP的HLA-C*0701重链多肽或其表位缀合物包含Y84C和A139C取代。在一些情况下，本公开的TMP的HLA-C重链多肽包含Y84C、A139C和A236C取代。
非典型I类HLA-E、HLA-F和HLA-G MHC重链
在一些情况下，本公开的TMP包含非典型I类MHC重链多肽。在可并入本公开的TMP中的非典型HLA重链多肽或其部分当中包括但不限于HLA-E、HLA-F和HLA-G等位基因的那些。HLA-E、HLA-F和HLA-G重链多肽(以及HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因)的氨基酸序列可见于万维网hla.alleles.org/nomenclature/index.html、欧洲生物信息研究所(www.ebi.ac.uk)(其为欧洲分子生物学实验室(European Molecular BiologyLaboratory，EMBL)的一部分)和国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)。
合适的HLA-E等位基因的非限制性实例包括但不限于HLA-E*0101(HLA-E*01:01:01:01)、HLA-E*01:03(HLA-E*01:03:01:01)、HLA-E*01:04、HLA-E*01:05、HLA-E*01:06、HLA-E*01:07、HLA-E*01:09和HLA-E*01:10。合适的HLA-F等位基因的非限制性实例包括但不限于HLA-F*0101(HLA-F*01:01:01:01)、HLA-F*01:02、HLA-F*01:03(HLA-F*01:03:01:01)、HLA-F*01:04、HLA-F*01:05和HLA-F*01:06。合适的HLA-G等位基因的非限制性实例包括但不限于HLA-G*0101(HLA-G*01:01:01:01)、HLA-G*01:02、HLA-G*01:03(HLA-G*01:03:01:01)、HLA-G*01:04(HLA-G*01:04:01:01)、HLA-G*01:06、HLA-G*01:07、HLA-G*01:08、HLA-G*01:09:HLA-G*01:10、HLA-G*01:10、HLA-G*01:11、HLA-G*01:12、HLA-G*01:14、HLA-G*01:15、HLA-G*01:16、HLA-G*01:17、HLA-G*01:18:HLA-G*01:19、HLA-G*01:20和HLA-G*01:22。无所有或基本上所有前导序列、跨膜序列和胞质序列的那些HLA-E、HLA-F和HLA-G等位基因的共有序列在图10中提供，并且在图11中与上文所提及的HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因的共有序列进行比对。
图1-提供HLA-E、HLA-F和HLA-G中的每一者的共有序列，其中可变aa位置以依序编号的“X”残基指示并且aa 84、139和236的位置加双下划线。
图11提供图7-11中给出的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G的共有氨基酸序列的比对。每个序列中的可变残基以“X”列出，其中去除依序编号。如图6中所指示，也示出aa 84、139和236的位置以其侧翼五个氨基酸的簇指示，所述簇可由1至5个独立地选自以下的氨基酸代替：(i)任何天然存在的氨基酸，或(ii)除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
上文所提及的HLA-E、HLA-F和/或HLA-G等位基因中的任一者可在如图11中对于共有序列所示的位置84、139和/或236中的一者或多者处包含取代。在一些情况下，取代可选自：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)或半胱氨酸(Y84C)，或在HLA-F的情况下是R84A或R84C取代；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)，或在HLA-F的情况下是V139C；以及在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。另外，也可采用与图11中所列的共有序列中的任一者的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％)或100％氨基酸序列同一性的HLA-E、HLA-F和/或HLA-G序列(例如，除其中列出的可变残基的变化以外，序列可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。
小鼠H2K
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的I类MHC重链多肽包含小鼠H2K(SEQ IDNO:45)(图6中的小鼠H2K)的氨基酸序列，或与该序列的全部或部分(例如，50、75、100、150、200或250个邻接氨基酸)具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的序列(例如，其可包含1-25、1-5、5-10、10-15、15-20、20-25或25-30个氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些情况下，在本公开的TMP的小鼠H2K重链多肽与图6中标记为小鼠H2K的序列具有小于100％同一性的情况下，其可在位置84、139和/或236中的一者或多者处包含选自以下的突变：在位置84处酪氨酸至丙氨酸(Y84A)；在位置84处酪氨酸至半胱氨酸(Y84C)；在位置139处丙氨酸至半胱氨酸(A139C)；和在位置236处丙氨酸至半胱氨酸取代(A236C)。在一些情况下，本公开的TMP的小鼠H2K重链多肽包含Y84A和A236C取代。在一些情况下，本公开的TMP的小鼠H2K重链多肽包含Y84C和A139C取代。在一些情况下，本公开的TMP的小鼠H2K重链多肽包含Y84C、A139C和A236C取代。
示例性组合
下表1呈现可并入本公开的TMP中的I类MHC重链序列修饰的各种组合。
表1
β-2微球蛋白
本公开的TMP的β2-微球蛋白(β2M)多肽可为人类β2M多肽、非人类灵长类动物β2M多肽、鼠类β2M多肽等。在一些情况下，β2M多肽包含与图4中所描绘的β2M氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，β2M多肽包含与图4中所描绘的β2M氨基酸序列的氨基酸21至119具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，合适的β2M多肽包含图21CC(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列；并且I类HLA重链多肽包含图21HH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列，其中以{C}指示的半胱氨酸残基在α1与α2-1螺旋之间形成二硫键并且残基与位置12处的β2M多肽半胱氨酸形成二硫键。在上述序列中，“aa1”是“氨基酸簇1”；“aa2”是“氨基酸簇2”；“aa3”是“氨基酸簇3”；“aa4”是“氨基酸簇4”；“aa5”是“氨基酸簇5”；并且“aa6”是“氨基酸簇6”；参见例如图8。每次出现的aa1、aa2、aa3、aa4、aa5和aa6独立地选为1-5个氨基酸残基，其中所述氨基酸残基i)独立地选自任何天然存在(例如，经编码)的氨基酸，或ii)除脯氨酸或甘氨酸以外的任何天然存在的氨基酸。
在一些情况下，相对于参考MHC多肽(其中参考MHC多肽可为野生型MHC多肽)，MHC多肽包含单个氨基酸取代，其中所述单个氨基酸取代用半胱氨酸(Cys)残基取代氨基酸。当存在于本公开的异二聚TMP的第一多肽的MHC多肽中或单链TMP的MHC多肽中时，此类非天然存在的半胱氨酸残基可与存在于本公开的TMP的第二多肽链中或单链TMP的另一个MHC多肽中的半胱氨酸残基形成二硫键。
在一些情况下，本公开的异二聚TMP的第一多肽中的第一MHC多肽和/或本公开的异二聚TMP的第二多肽中的第二MHC多肽包括氨基酸取代以用半胱氨酸取代氨基酸，其中第一MHC多肽中的非天然存在的半胱氨酸与第二MHC多肽中的半胱氨酸形成二硫键，其中第一MHC多肽中的半胱氨酸与第二MHC多肽中的非天然存在的半胱氨酸形成二硫键，或者其中第一MHC多肽中的非天然存在的半胱氨酸与第二MHC多肽中的非天然存在的半胱氨酸形成二硫键。类似地，本公开的单链TMP中的MHC多肽中的一者包括氨基酸取代以用半胱氨酸取代氨基酸，其中MHC多肽中的非天然存在的半胱氨酸与TMP中的不同MHC多肽中的天然存在或非天然存在的半胱氨酸形成二硫键。
例如，在一些情况下，HLAβ2-微球蛋白和I类HLA重链中的以下残基对中的一者经半胱氨酸取代(其中残基编号是成熟多肽的那些残基编号)：1)β2M残基12、I类HLA重链残基236；2)β2M残基12、I类HLA重链残基237；3)β2M残基8、I类HLA重链残基234；4)β2M残基10、I类HLA重链残基235；5)β2M残基24、I类HLA重链残基236；6)β2M残基28、I类HLA重链残基232；7)β2M残基98、I类HLA重链残基192；8)β2M残基99、I类HLA重链残基234；9)β2M残基3、I类HLA重链残基120；10)β2M残基31、I类HLA重链残基96；11)β2M残基53、I类HLA重链残基35；12)β2M残基60、I类HLA重链残基96；13)β2M残基60、I类HLA重链残基122；14)β2M残基63、I类HLA重链残基27；15)β2M残基Arg3、I类HLA重链残基Gly120；16)β2M残基His31、I类HLA重链残基Gln96；17)β2M残基Asp53、I类HLA重链残基Arg35；18)β2M残基Trp60、I类HLA重链残基Gln96；19)β2M残基Trp60、I类HLA重链残基Asp122；20)β2M残基Tyr63、I类HLA重链残基Tyr27；21)β2M残基Lys6、I类HLA重链残基Glu232；22)β2M残基Gln8、I类HLA重链残基Arg234；23)β2M残基Tyr10、I类HLA重链残基Pro235；24)β2M残基Ser11、I类HLA重链残基Gln242；25)β2M残基Asn24、I类HLA重链残基Ala236；26)β2M残基Ser28、I类HLA重链残基Glu232；27)β2M残基Asp98、I类HLA重链残基His192；和28)β2M残基Met99、I类HLA重链残基Arg234。I类MHC/HLA重链的氨基酸编号是参考无信号肽的成熟I类MHC/HLA重链。例如，在一些情况下，成熟HLA-A氨基酸序列的残基236经Cys取代。在一些情况下，成熟HLA-B氨基酸序列的残基236经Cys取代。在一些情况下，成熟HLA-C氨基酸序列的残基236经Cys取代。在一些情况下，图4中所描绘的氨基酸序列的残基32(对应于成熟β2M的Arg-12)经Cys取代。
在一些情况下，β2M多肽包含图21BB(SEQ ID NO:128)或图21CC(SEQ ID NO:129)中所示的氨基酸序列。
在一些情况下，I类HLA重链多肽包含图21DD(SEQ ID NO:130)、21EE(SEQ ID NO:131)或21FF(SEQ ID NO:132)中所示的氨基酸序列。
在一些情况下，本公开的TMP的β2M多肽包含图21CC(SEQ ID NO:133)的氨基酸序列并且TMP的I类HLA重链多肽包含图21EE(SEQ ID NO:134)的氨基酸序列，其中加下划线且粗体的Cys残基在TMP中彼此形成二硫键。
在一些情况下，β2M多肽包含图21GG(SEQ ID NO:135)的氨基酸序列。
在一些情况下，本公开的异二聚或单链TMP中的MHC多肽经以下残基彼此二硫键连接：i)存在于连接肽表位与β2M多肽的接头中的Cys残基；和ii)存在于I类MHC重链中的Cys残基。在一些情况下，存在于I类MHC重链中的Cys残基是作为Y84C取代引入的Cys。在一些情况下，连接肽表位与β2M多肽的接头是GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:583)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9。例如，在一些情况下，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:137)。作为另一个实例，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:138)。本公开的异二聚TMP的二硫键连接的第一多肽和第二多肽的实例在图2A-2F中示意性地描绘。
多个二硫键键结的TMP
在一些情况下，本公开的异二聚TMP的第一多肽和第二多肽是由至少两个二硫键(即，两个链间二硫键)彼此连接。此种多个二硫键连接的TMP的实例在图12A和12B中以及图16C中示意性地描绘。另外，在本公开的异二聚或单链TMP包含Ig Fc多肽的情况下，异二聚TMP可二聚，使得二硫键连接两个异二聚TMP中的Ig Fc多肽。此种排列在图12C和图12D中示意性地描绘，其中二硫键由虚线表示。除非另有规定，否则此章节中多个二硫键连接的TMPP中所述的至少两个二硫键并非是指连接二聚TMP中的Ig Fc多肽的二硫键。
例如，在一些情况下，本公开的异二聚TMP的第一多肽和第二多肽是由2个链间二硫键彼此连接。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的TMP的第一多肽和第二多肽是由3个链间二硫键彼此连接。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的TMP的第一多肽和第二多肽是由4个链间二硫键彼此连接。
在一些情况下，在本公开的异二聚或单链TMP的肽表位是由包含Cys的接头连接至β2M多肽的情况下，至少两个二硫键中的至少一者将接头中的Cys键结至TMP中的I类MHC重链中的Cys。在一些情况下，在本公开的TMP的肽表位是由接头连接至I类MHC重链多肽的情况下，至少两个二硫键中的至少一者将接头中的Cys连接至存在于TMP中的β2M多肽中的Cys。
在一些情况下，与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)展现增加的稳定性和/或改善的表达。在一些情况下，与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)展现增加的体外稳定性。例如，在一些情况下，与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)展现高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的体外稳定性。
通过测量在指定温度下于溶液中指定时间后溶液中剩余的TMP百分比来确定稳定性。与在异二聚体的第一多肽与第二多肽之间缺少至少一个二硫键的对照TMMP相比，可体外经指定时间段和在指定温度下于含有500mM NaCl的PBS缓冲溶液(上文所述)中(例如，在37℃至42℃的温度下于溶液中保持1小时至28天的时间段；例如，在37℃下1小时；在37℃下1天；在37℃下5天；在42℃下1小时；在42℃下1天；在42℃下5天；在37℃下5天；在37℃下10天；在37℃下14天；在37℃下28天；等)测量稳定性。TMMP可以0.1mg/mL至10mg/mL的浓度存在于PBS缓冲溶液中，例如，约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、约6mL、约7mL、约8mL、约9mL或约10mL，并且缓冲溶液可在37℃或42℃下保持1小时、5天、10天、14天、21天或28天。
与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP是否展现增加的体外稳定性可通过测量存在于如上文所论述的样品中的每个TMP的量来确定，所述样品例如在37℃和/或42℃下保持1小时、5天、10天、14天、21天或28天。
例如，在一些情况下，当在37℃下将TMP储存一定时间段(例如，约1周至约2周、约2周至约4周、或约4周至约2个月的时间段)时，与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)展现高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的体外稳定性。例如，在一些情况下，与在37℃下将对照TMP(仅包含存在于多个二硫键连接的TMP中的至少两个二硫键中的一者的TMP)体外储存28天后剩余的二硫键连接的异二聚TMP的量相比，在37℃下将本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)体外储存28天后剩余的二硫键连接的异二聚TMP的量高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍。
在一些情况下，与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP展现增加的体内稳定性。例如，在一些情况下，与仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP相比，本公开的多个二硫键连接的TMP展现高至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少2倍、至少5倍或至少10倍的体内稳定性。
在一些情况下，与当TMP为仅包含至少两个二硫键中的一者的对照TMP时产生的二硫键连接的异二聚TMP的量相比，本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)中两个二硫键的存在提供增加的二硫键连接的异二聚或单链TMP产生。例如，可在体外细胞培养中在哺乳动物细胞中产生本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)，其中在液体细胞培养基中培养哺乳动物细胞。TMP可分泌至细胞培养基中。可使细胞溶解，产生细胞溶解产物，并且TMP可存在于细胞溶解产物中。可从细胞培养基和/或细胞溶解产物中纯化TMP。例如，在TMP包含IgG1 Fc多肽的情况下，可使细胞培养基和/或细胞溶解产物与经固定的蛋白A接触(例如，可将细胞培养基和/或细胞溶解产物施加至蛋白A柱，其中蛋白A固定至珠粒上)。存在于细胞培养基和/或细胞溶解产物中的TMP结合至经固定的蛋白A。在洗涤柱以去除未结合的物质后，使所结合的TMP洗脱，产生蛋白A洗脱物。与当TMP为仅包含存在于多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)中的至少两个二硫键中的一者的对照TMP时存在于蛋白A洗脱物中的二硫键连接的异二聚或单链TMP的量相比，存在于蛋白A洗脱物中的二硫键连接的异二聚或单链TMP的量高至少0.5％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％或至少10％。在一些情况下，洗脱物中作为非聚集的二硫键连接的异二聚或单链TMP的总TMP蛋白的百分比为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。可对蛋白A洗脱物进行尺寸排阻色谱法(SEC)和/或一个或多个其他额外纯化步骤。
在一些情况下，本公开的T细胞调节多肽包含至少一个异二聚体，所述至少一个异二聚体包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽，其中所述KRAS肽的长度为至少4个氨基酸，例如，4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa，和长度在4至20个氨基酸、6至18个氨基酸、8至15个氨基酸、8至12个氨基酸、5至10个氨基酸、10至20个氨基酸和15至25个氨基酸范围内的肽)；和ii)第一MHC多肽；b)包含第二MHC多肽的第二多肽；和c)至少一个免疫调节多肽，其中第一多肽和/或第二多肽包含免疫调节多肽，并且其中异二聚体在第一多肽与第二多肽之间包含至少两个二硫键(例如，两个二硫键)(例如，异二聚体包含：i)连接第一多肽与第二多肽的第一个二硫键；和ii)连接第一多肽与第二多肽的第二个二硫键)。以另一种方式表述，第一多肽包含与第二多肽中的第一Cys残基形成二硫键(第一个二硫键)的第一Cys残基；并且第一多肽包含与第二多肽中的第二Cys残基形成二硫键(第二个二硫键)的第二Cys残基。
在一些情况下，本公开的TMP包含：a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)肽接头；和iii)β2M多肽；和b)包含I类MHC重链多肽的第二多肽，其中第一多肽和第二多肽中的一者或两者包含至少一个免疫调节多肽，其中TMP包含：a)在以下两者之间的第一个二硫键：i)存在于KRAS肽与β2M多肽之间的接头中的Cys；和ii)引入I类MHC重链多肽中的第一Cys；和b)在第一多肽与第二多肽之间的至少第二个二硫键，其中至少第二个二硫键在以下两者之间：i)第一多肽中在存在于接头中的Cys的C末端的Cys；和ii)第二多肽中在引入I类MHC重链多肽的第一Cys的C末端的Cys。
一般来说，异二聚或单链TMP中二硫键的潜在位置是TMP的不同多肽中的残基间隔5埃或更短的距离处。此类位置代表Cys残基(如果不是天然存在)可取代存在于多肽中的残基的潜在位置。例如，异二聚TMP的第一多肽和第二多肽潜在地可经由两个Cys残基之间的二硫键连接，所述两个Cys残基在异二聚体中一般彼此相隔不超过约5埃。在一些情况下，Cys残基中的一者或两者是非天然存在的。异二聚或单链TMP的β2M和MHC重链中彼此之间不超过5埃的氨基酸代表当经Cys取代时可在本公开的TMP中形成二硫键的氨基酸。类似地，可在接头中的Cys残基与MHC重链中的天然存在或非天然存在的Cys残基之间形成二硫键，其中两个Cys残基彼此相隔不超过约5埃。然而，值得注意的是，并非所有间隔约5埃或更短的残基对都适合于形成二硫键或提供使所得TMP稳定或提供增强表达的二硫键。
本公开的多个二硫键连接的异二聚TMP(例如，双二硫键连接的TMP)可包含例如：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽(例如，长度为4个氨基酸至约25个氨基酸的KRAS肽，当所述肽与MHC多肽复合时由TCR结合)；和ii)第一MHC多肽，其中第一多肽在KRAS肽与第一MHC多肽之间包含肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，并且其中第一MHC多肽是包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；b)和包含第二MHC多肽的第二多肽，其中第二MHC多肽是基于HLA-A*0201的氨基酸编号(图7A中所描绘)或在另一个I类重链等位基因的相应位置处包含Y84C取代和A236C取代的I类重链，其中TMP在肽接头中的Cys残基与I类重链的氨基酸位置84或另一个I类重链等位基因的相应位置处的Cys残基之间包含二硫键，并且其中TMP在β2M多肽中引入的Cys残基与在I类重链的氨基酸位置236或另一个I类重链等位基因的相应位置处的Cys之间包含二硫键；和c)至少一个免疫调节多肽，其中第一多肽和/或第二多肽包含至少一个免疫调节多肽。实例在图12A和图12B中示意性地描绘。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:139)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；例如，1、2或3。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(SEQ ID NO:141)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；例如，1、2或3。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGCGS(SEQ ID NO:587)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGCGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:592)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如，1、2或3。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGCS(SEQ ID NO:588)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGCS(GGGGS)n(SEQ ID NO:589)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如，1、2或3。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGC(SEQ ID NO:590)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GGGGC(GGGGS)n(SEQ ID NO:591)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如，1、2或3。
以下是基于HLA-A*0201的氨基酸编号(图7A中所描绘)或在另一个I类重链等位基因中的相应位置处包含Y84C取代和A236C取代的I类MHC重链的非限制性实例。
HLA-A
在一些情况下，本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP(例如，双二硫键连接的TMP)包含：i)KRAS肽(例如，长度为4个氨基酸至25个氨基酸的KRAS肽，当所述肽与MHC多肽复合时由TCR结合；例如，其中KRAS肽包含癌症相关突变)；ii)第一MHC多肽；iii)在所述肽与第一MHC多肽之间的肽接头，其中所述肽接头包含Cys残基，并且其中第一MHC多肽是包含引入Cys残基的氨基酸取代的β2M多肽；和iv)包含I类HLA-A MHC重链的第二MHC多肽，所述I类HLA-A MHC重链包含与图22A(SEQ ID NO:143)中所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；并且其中TMP包含至少一个免疫调节多肽。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:139)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1至10的整数，例如，1、2或3。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。例如，β2M多肽可包含与图21CC(SEQ ID NO:144)的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸12是Cys。至少一个免疫调节多肽可为免疫调节多肽的野生型或变体，例如，选自由细胞因子(例如IL-2)、4-1BBL多肽、CD80多肽、CD86多肽或其组合组成的组。在一些情况下，至少一个免疫调节多肽是亲和力降低变体，例如IL-2的亲和力降低变体，如本文别处所述。在一些情况下，TMP包含Ig Fc多肽，例如，基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc，例如图3G中所示。
在一些情况下，本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP(例如，双二硫键连接的TMP)包含I类HLA-A重链多肽。在一些情况下，存在于本公开的多个二硫键连接的TMP中的HLA-A重链多肽(例如，双二硫键连接的TMP)包含与图7A中所描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401氨基酸序列具有至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中HLA-A重链多肽包含Y84C和A236C取代。
在一些情况下，存在于本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP中的HLA-A重链多肽(例如，双二硫键连接的TMP)包含与以下序列中的一者具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
(i)图22B(SEQ ID NO:145)中所示的HLA-A*0101(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(ii)图22C(SEQ ID NO:146)中所示的HLA-A*0201(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(iii)图22D(SEQ ID NO:147)中所示的HLA-A*0202(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(iv)图22E(SEQ ID NO:148)中所示的HLA-A*1101(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(v)图22F(SEQ ID NO:149)中所示的HLA-A*2301(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(vi)图22G(SEQ ID NO:150)中所示的HLA-A*2402(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(vii)图22H(SEQ ID NO:151)中所示的HLA-A*2407(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(viii)图22I(SEQ ID NO:152)中所示的HLA-A*3303(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(ix)图22J(SEQ ID NO:153)中所示的HLA-A*3401(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
HLA-B
在一些情况下，本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP(例如，双二硫键连接的TMP)包含i)KRAS肽，当所述肽与TMP的MHC多肽复合时由TCR结合，ii)包含非天然存在的Cys残基的β2M多肽，iii)在KRAS肽与β2M多肽之间的肽接头，和iv)I类HLA-BMHC重链多肽，其包含与图22K(SEQ ID NO:154)中所示的以下氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:139)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1至10的整数，例如，1、2或3。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。例如，β2M多肽可包含与图21CC(SEQ ID NO:155)的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸12是Cys。TMP的至少一个免疫调节多肽可为野生型或变体免疫调节多肽，例如，选自由细胞因子(例如IL-2)、4-1BBL、CD80、CD86及其组合组成的组。在一些情况下，至少一个免疫调节多肽是亲和力降低变体，例如IL-2变体，如本文别处所述。在一些情况下，TMP包含Ig Fc多肽，例如，基本上不诱导细胞溶解的变体人类IgG1 Fc多肽。
在一些情况下，本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP包含I类HLA-B重链多肽。在一些情况下，存在于本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)中的HLA-B重链多肽包含与图8A中所描绘的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301氨基酸序列具有至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中HLA-B重链多肽包含Y84C和A236C取代。
HLA-B*0702(Y84C；A236C)
在一些情况下，存在于本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP(例如，双二硫键连接的TMP)中的HLA-B重链多肽包含与以下序列中的一者具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
(i)图22L(SEQ ID NO:156)中所示的HLA-B*0702(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(ii)图22M(SEQ ID NO:157)中所示的HLA-B*0801(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(iii)图22N(SEQ ID NO:158)中所示的HLA-B*1502(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(iv)图22O(SEQ ID NO:159)中所示的HLA-B*3802(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(v)图22P(SEQ ID NO:160)中所示的HLA-B*4001(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(vi)图22Q(SEQ ID NO:161)中所示的HLA-B*4601(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(vii)图22R(SEQ ID NO:162)中所示的HLA-B*5301(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
HLA-C
在一些情况下，本公开的多个二硫键连接的异二聚或单链TMP(例如，双二硫键连接的TMP)包含i)KRAS肽，当所述肽与TMP的MHC多肽复合时由TCR结合，ii)包含非天然存在的Cys残基的β2M多肽，iii)在KRAS肽与β2M多肽之间的肽接头，和iv)I类HLA-CMHC重链，其包含与图22S(SEQ ID NO:163)中所示的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；和c)至少一个免疫调节多肽，其中第一多肽和/或第二多肽包含至少一个免疫调节多肽。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(SEQ ID NO:139)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1至10的整数，例如，1、2或3。在一些情况下，β2M多肽包含R12C取代。例如，β2M多肽可包含与图21CC(SEQ ID NO:164)中所示的以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中氨基酸12是Cys。至少一个免疫调节多肽可为野生型或变体多肽免疫调节多肽，例如，选自由细胞因子(例如IL-2)、4-1BBL多肽、CD80多肽、CD86多肽或其组合组成的组。在一些情况下，至少一个免疫调节多肽是亲和力降低变体，例如IL-2的亲和力降低变体，如本文别处所述。在一些情况下，TMP包含Ig Fc多肽，例如，基本上不诱导细胞溶解的变体人类IgG1 Fc多肽。
在一些情况下，本公开的多个二硫键连接的TMP(例如，双二硫键连接的TMP)包含I类HLA-C重链多肽。在一些情况下，存在于本公开的多个二硫键连接的TMP中的HLA-C重链多肽(例如，双二硫键连接的TMP)包含与图9A中所描绘的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502氨基酸序列具有至少95％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中HLA-C重链多肽包含Y84C和A236C取代。
在一些情况下，存在于本公开的多个二硫键连接的TMP中的HLA-C重链多肽(例如，双二硫键连接的TMP)包含与以下序列中的一者具有至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：
(i)图22T(SEQ ID NO:165)中所示的HLA-C*01:02(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(ii)图22U(SEQ ID NO:166)中所示的HLA-C*03:03(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(iii)图22V(SEQ ID NO:167)中所示的HLA-C*03:04(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(iv)图22W(SEQ ID NO:168)中所示的HLA-C*04:01(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(v)图22X(SEQ ID NO:169)中所示的HLA-C*06:02(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(vi)图22Y(SEQ ID NO:170)中所示的HLA-C*07:01(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(vii)图22Z(SEQ ID NO:171)中所示的HLA-C*07:02(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；
(viii)图22AA(SEQ ID NO:172)中所示的HLA-C*08:01(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys；和
(ix)图22BB(SEQ ID NO:173)中所示的HLA-C*15:02(Y84C；A236C)氨基酸序列，其中氨基酸84是Cys并且氨基酸236是Cys。
抗原呈递、二硫键连接的TMP(即，无MOD的TMP)
本公开提供了一种包含异二聚体或单链多肽(或两个此种多肽的同二聚体)的抗原呈递多肽(APP)，其中所述APP包含：i)KRAS肽，当所述肽与TMP的MHC多肽复合时由TCR结合，ii)β2M多肽，任选地包含非天然存在的Cys残基，iii)在KRAS肽与β2M多肽之间的肽接头，其中所述接头任选地包含Cys残基，和iv)I类HLA-C MHC重链，其包含与图21A-21AA、21DD-21FF、21HH-21JJ或22A-22BB中所示的氨基酸序列中的任一者具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。异二聚或单链APP可具有与上述单个或多个二硫键连接的异二聚或单链TMP中的任一者相同的构型并且可以相同方式经单个或多个二硫键连接；唯一差异在于，与上文所论述的TMP不同，APP不含MOD。如上文所论述，此处提及的二硫键连接不意指APP的Ig Fc多肽，例如基本上不诱导细胞溶解的Ig Fc多肽，例如图3G的人类IgG1 Fc多肽之间的二硫键。
异二聚APP的实例包括：a)包含以下的APP：i)图19O中所描绘的“4027”多肽；和ii)图14Q中所描绘的“4030”多肽；b)包含以下的APP：i)图19O中所描绘的“4027”多肽；和ii)图14K中所描绘的“4029”多肽。单链APP的实例包括称为“4238”(图19G)、“4241”(图19H)和“4334”(图19I)的多肽。
本公开的APP可用于诊断应用和治疗应用。如下文所论述，当用于诊断应用时，APP也可包含可检测标记，使得通过检测可检测标记来检测APP与靶T细胞的结合。
因此，本公开提供了一种检测抗原特异性T细胞的方法。所述方法包括使T细胞与本公开的APP接触；和检测APP与T细胞的结合。本公开提供了一种检测抗原特异性T细胞的方法，所述方法包括使T细胞与本公开的APP接触，其中APP与T细胞的结合指示所述T细胞对存在于APP中的表位具有特异性。
在一些情况下，APP包含可检测标记。合适的可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光多肽或产生荧光产物的酶和产生有色产物的酶。在APP包含可检测标记的情况下，通过检测可检测标记来检测APP与T细胞的结合。
在一些情况下，本公开的APP包含适用于体内成像的可检测标记，例如，适用于正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射断层摄影(SPECT)、近红外(NIR)光学成像、x射线成像、计算机辅助断层摄影(CAT)或磁共振成像(MRI)或其他体内成像方法。适用于体内成像的标记的实例包括钆螯合物(例如，与DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、DTPA-双甲酰胺(BMA)、DOTA(十二烷四乙酸)或HP-DO3A(1,4,7-三(羧甲基)-10-(2'-羟丙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷)的钆螯合物)、铁螯合物、镁螯合物、锰螯合物、铜螯合物、铬螯合物、基于碘的物质和放射性核素。合适的放射性核素包括但不限于123I、125I、130I、131I、133I、135I、47Sc、72As、72Se、90Y、88Y、97Ru、100Pd、101mRh、119Sb、128Ba、197Hg、211At、212Bi、212Pb、109Pd、111In、67Ga、68Ga、64Cu、67Cu、75Br、77Br、99mTc、14C、13N、15O、32P、33P和18F。在一些情况下，可检测标记为正电子发射同位素，例如11C、13N、15O、18F、64Cu、68Ga、78Br、82Rb、86Y、90Y、22Na、26Al、40K、83Sr、89Zr或124I。在一些情况下，可检测标记为64Cu。参见例如Woodham,Andrew等人,In vivo detection ofantigen-specific CD8+T cells by immuno-positron emission tomography,NatureMethods Articles(2020)https://doi.org/10.1038/s41592-020-0934-5。
合适的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)或其变体、GFP的蓝色荧光变体(BFP)、GFP的青色荧光变体(CFP)、GFP的黄色荧光变体(YFP)、增强型GFP(EGFP)、增强型CFP(ECFP)、增强型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Topaz(TYFP)、Venus、Citrine、mCitrine、GFPuv、去稳定化EGFP(dEGFP)、去稳定化ECFP(dECFP)、去稳定化EYFP(dEYFP)、mCFPm、Cerulean、T-Sapphire、CyPet、YPet、mKO、HcRed、t-HcRed、DsRed、DsRed2、DsRed单体、J-Red、dimer2、t-dimer2(12)、mRFP1、pocilloporin、Renilla GFP、Monster GFP、paGFP、Kaede蛋白和点燃蛋白、藻胆蛋白和藻胆蛋白缀合物，包括B-藻红蛋白、R-藻红蛋白和别藻蓝蛋白。荧光蛋白的其他实例包括mHoneydew、mBanana、mOrange、dTomato、tdTomato、mTangerine、mStrawberry、mCherry、mGrape1、mRaspberry、mGrape2、mPlum(Shaner等人,(2005)Nat.Methods 2:905-909)等。例如，如Matz等人,(1999)Nature Biotechnol.17:969-973中所述，来自珊瑚虫物种的多种荧光和有色蛋白中的任一者适合使用。
合适的酶包括但不限于辣根过氧化酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸去氢酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡萄醣醛酸苷酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶、葡萄糖氧化酶(GO)等。
在一些情况下，使用对APP具有特异性的经可检测标记的抗体来检测APP与T细胞的结合。对APP具有特异性的抗体可包含可检测标记，例如放射性同位素、荧光多肽或产生荧光产物的酶或产生有色产物的酶。
在一些情况下，所检测的T细胞存在于包含多个T细胞的样品中。例如，所检测的T细胞可存在于包含10至109个T细胞，例如10至102、102至104、104至106、106至107、107至108或108至109个或多于109个T细胞的样品中。
HLA/肽结合测定
给定的肽(例如，包含KRAS表位的KRAS肽)是否结合I类HLA(包含HLA重链和β2M多肽)并且当结合至HLA复合物时是否可有效地向TCR呈递表位可使用许多熟知方法中的任一者来确定。测定包括结合测定和T细胞活化测定，包括基于细胞的结合测定、生物化学结合测定、T细胞活化测定、ELISPOT测定、细胞毒性测定和用肽-HLA四聚体检测抗原特异性T细胞。此类测定在公开的科学文献中以及公开的PCT申请WO2020132138A1中描述，其关于特异性结合测定的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括段落[00217]-[00225]。
作为另一个实例，产生具有荧光或重金属标签的肽-HLA复合物的多聚体(例如，四聚体)。多聚体接着可用于经由流式细胞术(FACS)或大规模细胞术(CyTOF)鉴定和定量特异性T细胞。对表位特异性T细胞的检测提供结合肽的HLA分子能够结合至抗原特异性T细胞亚群上的特异性TCR的直接证据。参见例如Klenerman等人,(2002)Nature ReviewsImmunol.2:263。
免疫调节多肽
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的免疫调节多肽或“MOD”是野生型免疫调节多肽。在其他情况下，存在于本公开的TMP中的免疫调节多肽是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对共刺激多肽具有降低的亲和力。对共刺激结构域展现降低的亲和力的合适免疫调节结构域与野生型免疫调节结构域可具有1个氨基酸(aa)至20aa的差异。例如，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽与相应野生型免疫调节多肽就氨基酸序列而言相差1aa、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa或10aa。作为另一个实例，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽与相应野生型免疫调节多肽就氨基酸序列而言相差11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa或20aa。
免疫调节多肽及其同源共刺激多肽的示例对包括但不限于下表1中所列的那些：
表1
在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽具有100nM至100μM的结合亲和力。例如，在一些情况下，存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽的结合亲和力为约100nM至150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
存在于本公开的TMP中的变体免疫调节多肽对同源共刺激多肽展现降低的亲和力。类似地，包含变体免疫调节多肽的本公开的TMP对同源共刺激多肽展现降低的亲和力。因此，例如，包含变体免疫调节多肽的本公开的TMP对同源共刺激多肽具有100nM至100μM的结合亲和力。例如，在一些情况下，包含变体免疫调节多肽的本公开的TMP对同源共刺激多肽的结合亲和力为约100nM至150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、至约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
如图17中示意性地描绘，免疫调节多肽(即，一个或多个免疫调节多肽)可存在于本公开的异二聚TMP中的多个位置中的任一者处。图17描绘变体IL-2多肽的两个拷贝的位置；然而，如本文所述，免疫调节多肽可为任何数目的免疫调节多肽和多种免疫调节多肽中的任一者。如图17中所描绘，免疫调节多肽可：1)在I类MHC重链的N末端；2)在I类MHC重链的C末端和Ig Fc多肽的N末端；换句话说，在I类MHC重链与Ig Fc多肽之间；3)在Ig Fc多肽的C末端；4)在肽表位的N末端；或5)在β2M多肽的C末端。
如图18中示意性地描绘，免疫调节多肽(即，一个或多个免疫调节多肽)可存在于本公开的单链TMP中的多个位置中的任一者处。图18描绘变体IL-2多肽的两个拷贝的位置；然而，如本文所述，免疫调节多肽可为任何数目的免疫调节多肽和多种免疫调节多肽中的任一者。如图18中所描绘，免疫调节多肽可：1)在I类MHC重链的C末端和Ig Fc多肽的N末端；2)在Ig Fc多肽的C末端；或3)在肽表位的N末端。
免疫调节多肽和变体，包括亲和力降低变体，例如PD-L1、CD80、CD86、4-1BBL和IL-2，在公开的文献，例如公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091中描述，其关于PD-L1、CD80、CD86、4-1BBL、IL-2的免疫调节多肽和特异性变体免疫调节多肽的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括WO2020132138A1的段落[00260]-[00455]和WO2019/051091的段落[00157]-[00352]。
特别关注作为细胞因子IL-2变体的MOD。野生型IL-2结合至T细胞表面上的IL-2受体(IL-2R)。野生型IL-2对IL-2R具有强亲和力并且将结合以激活大多数或基本上所有CD8+T细胞。出于此原因，已知野生型Il-2的合成形式，例如药物阿地白介素(Aldesleukin)(商品名
)当向人类施用以治疗癌症时，由于IL-2不加区别地激活靶T细胞和非靶T细胞而具有严重副作用。
在一些情况下，IL-2受体是包含α链(IL-2Rα；也称为CD25)，β链(IL-2Rβ；也称为CD122)和γ链(IL-2Rγ；也称为CD132)的异三聚多肽。已知人类IL-2(SEQ ID NO:15)、人类IL-2Rα(SEQ ID NO:16)、IL2Rβ(SEQ ID NO:17)和IL-2Rγ(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列。参见例如公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091，如上文所论述。
在一些情况下，本公开的IL-2变体MOD对IL-2Rα展现基本上降低的结合或无结合，从而最小化或基本上减少IL-2变体对Tregs的活化。在一些情况下，本公开的IL-2变体MOD对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力，使得IL-2变体MOD对IL-2R展现总体降低的亲和力。在一些情况下，本公开的IL-2变体MOD展现两种特性，即，其对IL-2Rα展现基本上降低的结合或无结合，而且对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力，使得IL-2变体多肽对IL-2R展现总体降低的亲和力。包含此类变体(包括基本上不结合IL-2Rα并且对IL-2Rβ具有降低的亲和力的变体)的TMP已显示出优先结合并激活含有对TMP上的肽表位具有特异性的靶TCR的T细胞上的IL-2受体的能力，并且因此不太可能将IL-2递送至非靶T细胞，即，不含特异性地结合TMP上的肽表位的TCR的T细胞。也就是说，IL-2变体MOD与其在T细胞上的共刺激多肽的结合基本上由MHC-表位部分的结合而非Il-2的结合来驱动。
因此，合适的IL-2变体MOD包括针对IL-2R的包含对SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些情况下，与包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的IL-2多肽的结合亲和力相比，本公开的此种变体IL-2多肽对IL-2R展现降低的结合亲和力。例如，在一些情况下，当在相同条件下测定时，变体IL-2多肽结合IL-2R的结合亲和力比包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列的IL-2多肽对IL-2R(例如，包含有包含SEQ ID NO:16-18中列出的氨基酸序列的多肽的IL-2R)的结合亲和力低至少10％、低至少15％、低至少20％、低至少25％、低至少30％、低至少35％、低至少40％、低至少45％、低至少50％、低至少55％、低至少60％、低至少65％、低至少70％、低至少75％、低至少80％、低至少85％、低至少90％、低至少95％或低95％以上。在一些情况下，此种变体IL-2多肽对IL-2R具有100nM至100μM的结合亲和力。作为另一个实例，在一些情况下，变体IL-2多肽对IL-2R(例如，包含有包含SEQ ID NO:16-18中列出的氨基酸序列的多肽的IL-2R)的结合亲和力为约100nM至150nM、约150nM至约200nM、约200nM至约250nM、约250nM至约300nM、约300nM至约350nM、约350nM至约400nM、约400nM至约500nM、约500nM至约600nM、约600nM至约700nM、约700nM至约800nM、约800nM至约900nM、约900nM至约1μM、至约1μM至约5μM、约5μM至约10μM、约10μM至约15μM、约15μM至约20μM、约20μM至约25μM、约25μM至约50μM、约50μM至约75μM、或约75μM至约100μM。
在一些情况下，合适的变体IL-2多肽包含与以下氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列：APTSSSTKKTQLQLEALLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TAKFYMPKKA TELKHLQCLEEELKPLEEVL NLAQSKNFHLRPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNRWITFCQSIIS TLT(SEQ ID NO:241)，即，变体IL-2多肽具有野生型IL-2的氨基酸序列，但具有H16A和F42A取代(以粗体示出)。或者，可采用前述序列，但在H16和/或F42处具有除Ala以外的取代，例如，可采用H16T代替H16A。
支架多肽
本公开的TMP可包含Fc多肽或可包含另一种合适的支架多肽。
合适的支架多肽包括基于抗体的支架多肽和非基于抗体的支架。非基于抗体的支架包括例如白蛋白、XTEN(延伸重组)多肽、转铁蛋白、Fc受体多肽、弹性蛋白样多肽(参见例如Hassouneh等人,(2012)Methods Enzymol.502:215；例如，包含(Val-Pro-Gly-X-Gly；SEQID NO:561)的五肽重复单元的多肽，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)、白蛋白结合多肽、丝样多肽(参见例如Valluzzi等人,(2002)Philos Trans R Soc Lond B BiolSci.357:165)、丝弹性蛋白样多肽(SELP；参见例如Megeed等人,(2002)Adv Drug DelivRev.54:1075)等。合适的XTEN多肽包括例如WO 2009/023270、WO 2010/091122、WO2007/103515、US 2010/0189682和US 2009/0092582中所公开的那些多肽；也参见Schellenberger等人,(2009)Nat Biotechnol.27:1186)。合适的白蛋白多肽包括例如人血清白蛋白。
在一些情况下，合适的支架多肽将是延长半衰期的多肽。因此，在一些情况下，与缺乏支架多肽的对照TMP相比，合适的支架多肽增加TMP的体内半衰期(例如，血清半衰期)。例如，在一些情况下，与缺乏支架多肽的对照TMP相比，支架多肽使TMP的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或100倍以上。作为一个实例，在一些情况下，与缺乏Fc多肽的对照TMP相比，Fc多肽使TMP的体内半衰期(例如，血清半衰期)增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或100倍以上。
Fc多肽
在一些情况下，本公开的TMP的第一多肽链和/或第二多肽链包含Fc多肽。本公开的TMP的Fc多肽可为人类IgG1 Fc、人类IgG2 Fc、人类IgG3 Fc、人类IgG4 Fc等。在一些情况下，Fc多肽包含与图3A-3G中所描绘的Fc区的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc区包含与图3A中所描绘的人类IgG1 Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，所述人类IgG1 Fc多肽任选地包含N77的取代；例如，Fc多肽包含N77A取代。在一些情况下，Fc多肽包含与图3A中所描绘的人类IgG2Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图3A中所描绘的人类IgG2 Fc多肽的氨基酸99-325具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图3A中所描绘的人类IgG3 Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图3A中所描绘的人类IgG3 Fc多肽的氨基酸19-246具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图3B中所描绘的人类IgM Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图3B中所描绘的人类IgM Fc多肽的氨基酸1-276具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图3C中所描绘的人类IgA Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；例如，Fc多肽包含与图3C中所描绘的人类IgA Fc多肽的氨基酸1-234具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，Fc多肽包含与图3C中所描绘的人类IgG4 Fc多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，Fc多肽包含与图3C中所描绘的人类IgG4 Fc多肽的氨基酸100至327具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，IgG4 Fc多肽包含以下氨基酸序列：PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:175)。
典型地，TMP中所采用的Ig Fc将包含野生型序列中的氨基酸的一个或多个取代，使得Ig Fc“基本上不诱导细胞溶解”。例如，在一些情况下，存在于TMP中的Fc多肽包含图3A中所描绘的氨基酸序列(人类IgG1 Fc)，不同之处是L234(图3A中所描绘的氨基酸序列的L14)经除亮氨酸以外的氨基酸取代，或L235(图3A中所描绘的氨基酸序列的L15)经除亮氨酸以外的氨基酸取代。
在一些情况下，存在于TMP中的Fc多肽包含图3G中所描绘的氨基酸序列(对应于图3G中所描绘的氨基酸序列的位置14和15，包含L234A取代和L235A取代的人类IgG1 Fc)。在一些情况下，存在于TMP中的Fc多肽包含图3A中所描绘的氨基酸序列(人类IgG1 Fc)，不同之处是在L234和L235(图3A中所描绘的氨基酸序列的L14和L15)处经除亮氨酸以外的氨基酸取代。在一些情况下，存在于TMP中的Fc多肽包含图3A中所描绘的氨基酸序列(人类IgG1Fc)，不同之处是在L234和L235(图3A中所描绘的氨基酸序列的L14和L15)处经除亮氨酸以外的氨基酸取代，和P331(图3A中所描绘的氨基酸序列的P111)经除脯氨酸以外的氨基酸取代。在一些情况下，存在于TMP中的Fc多肽包含图3E中所描绘的氨基酸序列(对应于图3E中所描绘的氨基酸序列的氨基酸位置14、15和111，包含L234F、L235E和P331S取代的人类IgG1Fc)。在一些情况下，如图3G中所描绘，存在于TMP中的Fc多肽是包含L234A和L235A取代(图3A中所描绘的氨基酸序列的L14和L15经Ala取代)的IgG1 Fc多肽。
接头
本公开的TMP可包括一个或多个接头，其中所述一个或多个接头介于以下一者或多者之间：i)I类MHC多肽与Ig Fc多肽，其中此种接头在本文中称为“L1”；ii)免疫调节多肽与I类MHC多肽，其中此种接头在本文中称为“L2”；iii)第一免疫调节多肽与第二免疫调节多肽，其中此种接头在本文中称为“L3”；iv)肽抗原(“表位”)与I类MHC多肽；v)I类MHC多肽与二聚多肽(例如，二聚对的第一成员或第二成员)；vi)二聚多肽(例如，二聚对的第一成员或第二成员)与Ig Fc多肽。
合适的接头(也称为“间隔子”)可容易地选择，并且可具有许多合适长度中的任一者，例如1个氨基酸至25个氨基酸、3个氨基酸至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸。合适接头的长度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些情况下，接头的长度为25个氨基酸至50个氨基酸，例如，长度为25至30个、30至35个、35至40个、40至45个或45至50个氨基酸。
示例性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:366)和(GGGS)n(SEQ ID NO:367)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其他柔性接头。可使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser两者均相对非结构化，并因此可充当组分之间的中性系带。可使用甘氨酸聚合物；甘氨酸甚至比丙氨酸显著更接近phi-psi空间，并且比具有更长侧链的残基所受限制小得多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。示例性接头可包含氨基酸序列，包括但不限于GGSG(SEQ ID NO:368)、GGSGG(SEQ ID NO:369)、GSGSG(SEQ ID NO:370)、GSGGG(SEQ ID NO:371)、GGGSG(SEQ ID NO:372)、GSSSG(SEQ IDNO:373)等。示例性接头可包括例如Gly(Ser4)n(SEQ ID NO:374)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GSSSS)n(SEQ ID NO:375)，其中n是4。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GSSSS)n(SEQ ID NO:376)，其中n是5。
示例性接头可包括例如(GGGGS)n(SEQ ID NO:377)；也称为“G4S”接头)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情况下，接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:377)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情况下，接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:387)。具有氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:387)的接头也是合适的。在本公开的单链TMP中，β2M多肽可由(GGGGS)n(SEQ ID NO:377)接头连接至MHC重链多肽，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如，其中n＝3或7。
在一些情况下，存在于本公开的TMP的第一多肽中的接头多肽包括可与存在于本公开的TMP的第二多肽中的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基。在一些情况下，例如，合适的接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:388)。作为另一个实例，合适的接头可包含氨基酸序列GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:389)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8或9。例如，在一些情况下，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:390)。作为另一个实例，接头包含氨基酸序列GCGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:391)。
二聚TMP
在一些情况下，本公开的单链和异二聚TMP可形成二聚体；即，本公开提供包含本公开的TMP的二聚体的多肽。本公开提供了例如包含以下的蛋白质(本公开的二聚TMP)：A)第一异二聚体，其包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；和b)包含以下的第二多肽：i)第二MHC多肽，其中第一异二聚体包含一个或多个免疫调节多肽；和B)第二异二聚体，其包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；和b)包含以下的第二多肽：i)第二MHC多肽，其中第二异二聚体包含一个或多个免疫调节多肽，并且其中第一异二聚体和第二异二聚体彼此共价连接。或者，二聚TMP可包含彼此共价连接的两个单链TMP。二聚体的共价键可为第一单链或异二聚TMP中的Ig Fc多肽与第二单链或异二聚TMP中的Ig Fc多肽之间的二硫键。当TMP包含基本上不诱导细胞溶解的Ig Fc多肽，例如人类IgG1 Fc多肽(例如，图3G的多肽)时，TMP典型地将通过与另一TMP的IgG1 Fc多肽自发形成二硫键而自组装成二聚体。因此，例如，第一单链或异二聚TMP和第二单链或异二聚体中的Ig Fc多肽可由一个或多个二硫键彼此连接。在一些情况下，两个TMP就氨基酸序列而言彼此同一。在一些情况下，第一异二聚体和第二异二聚体是经由第一异二聚体的第二多肽的C末端区域和第二异二聚体的第二多肽的C末端区域彼此共价连接。在一些情况下，第一异二聚体和第二异二聚体是经由第一异二聚体的第二多肽的C末端氨基酸和第二异二聚体的第二多肽的C末端区域彼此共价连接；例如，在一些情况下，第一异二聚体的第二多肽的C末端氨基酸和第二异二聚体的第二多肽的C末端区域直接或经由接头彼此连接。接头可为肽接头。肽接头的长度可为1个氨基酸至200个氨基酸(例如，1个氨基酸(aa)至5aa、5aa至10aa、10aa至25aa、25aa至50aa、50aa至100aa、100aa至150aa或150aa至200aa)。在一些情况下，第一异二聚体的肽表位和第二异二聚体的肽表位包含相同氨基酸序列。在一些情况下，第一异二聚体和第二异二聚体的第一MHC多肽是I类MHCβ2-微球蛋白，并且其中第一异二聚体和第二异二聚体的第二MHC多肽是I类MHC重链。在一些情况下，第一异二聚体的免疫调节多肽和第二异二聚体的免疫调节多肽包含相同氨基酸序列。在一些情况下，第一异二聚体的免疫调节多肽和第二异二聚体的免疫调节多肽是与相应亲本野生型免疫调节多肽相比包含1至10个氨基酸取代的变体免疫调节多肽，并且其中1至10个氨基酸取代使得变体免疫调节多肽与同源共刺激多肽的亲和力结合降低。在一些情况下，第一异二聚体的免疫调节多肽和第二异二聚体的免疫调节多肽是各自独立地选自由IL-2、4-1BBL、PD-L1、CD80、CD86、ICOS-L、OX-40L、FasL、JAG1(CD339)、TGFβ、CD70和ICAM的野生型和变体多肽组成的组。本文描述了合适的MHC多肽、免疫调节多肽和肽表位的实例。
在一些情况下，本公开的单链TMP经二聚。因此，本公开提供了包含以下的蛋白质：a)本公开的第一单链TMP；和b)本公开的第二单链TMP，其中第一单链TMP和第二单链TMP彼此共价连接。共价键可为第一单链TMP中的Ig Fc多肽与第二单链TMP中的Ig Fc多肽之间的二硫键。
额外多肽
除上文所述的那些以外，本公开的TMP的多肽链可包括一个或多个多肽和缀合物药物。如上文所论述，合适的额外多肽(包括表位标签和亲和结构域)和药物缀合物在公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091中描述，其关于表位标签、亲和结构域和药物缀合物的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括WO2020132138A1的段落[00498]-[00508]和WO2019/051091的段落[00353]-[00363]。一个或多个额外多肽可包括于TMP的多肽链的N末端、TMP的多肽链的C末端或TMP的多肽链内部。
示例性TMP
在一些情况下，本公开的TMP包含至少一个异二聚体，所述至少一个异二聚体包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；b)包含第二MHC多肽的第二多肽；和c)至少一个免疫调节多肽，其中第一多肽和/或第二多肽包含免疫调节多肽，并且任选地包含Ig Fc。因此，在一些情况下，本公开的TMP包含至少一个异二聚体，所述至少一个异二聚体包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；和iii)至少一个免疫调节多肽；和b)包含第二MHC多肽并且任选地包含Ig Fc的第二多肽。在其他情况下，本公开的TMP包含至少一个异二聚体，所述至少一个异二聚体包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；和b)包含以下的第二多肽：i)第二MHC多肽；和ii)至少一个免疫调节多肽，并且任选地包含Ig Fc。在一些情况下，本公开的TMP包含至少一个异二聚体，所述至少一个异二聚体包含：a)包含以下的第一多肽：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；和iii)至少一个免疫调节多肽；和b)包含以下的第二多肽：i)第二MHC多肽；和ii)至少一个免疫调节多肽，并且任选地包含Ig Fc。在一些情况下，至少一个免疫调节多肽是野生型免疫调节多肽。在其他情况下，至少一个免疫调节多肽是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对共刺激多肽展现降低的亲和力。
如上文所提及并且如图17中示意性地描绘，免疫调节多肽(即，一个或多个免疫调节多肽)可存在于本公开的TMP中的多个位置中的任一者处。图17描绘变体IL-2多肽的两个拷贝的位置；然而，如本文所述，免疫调节多肽可为任何数目的免疫调节多肽和多种免疫调节多肽中的任一者。如图17中所描绘，免疫调节多肽可：1)在I类MHC重链的N末端(位置1)；2)在I类MHC重链的C末端和Ig Fc多肽的N末端；换句话说，在I类MHC重链与Ig Fc多肽之间(位置2)；3)在Ig Fc多肽的C末端(位置3)；4)在肽表位的N末端(位置4)；或5)在β2M多肽的C末端(位置5)。因此，在一些情况下，本公开的TMP包含具有所定义的组分排列的以下支架中的一者，其中第一MHC多肽是β2M多肽；并且第二MHC多肽是HLA重链多肽：
a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)至少一个免疫调节多肽；ii)第二MHC多肽；和iii)Ig Fc多肽(此排列称为MOD位置1)；
a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)第二MHC多肽；ii)至少一个免疫调节多肽；和iii)Ig Fc多肽(此排列称为MOD位置2)；TMP
a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；和ii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)第二MHC多肽；ii)Ig Fc多肽；和iii)至少一个免疫调节多肽(此排列称为MOD位置3)。
a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)至少一个免疫调节多肽；ii)KRAS肽；和iii)第一MHC多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)第二MHC多肽；和ii)IgFc多肽(此排列称为MOD位置4)；
a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；ii)第一MHC多肽；和iii)至少一个免疫调节多肽；和b)第二多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)第二MHC多肽；和ii)Ig Fc多肽(此排列称为MOD位置5)；
在上述支架中，第一多肽和第二多肽的组分中的任一者可任选地由接头连接至多肽中的下一个组分。在一些情况下，肽接头介于以下一者或多者之间：i)第二MHC多肽与IgFc多肽；ii)表位与第一MHC多肽；iii)第一MHC多肽与免疫调节多肽；和(在TMP包含第一多肽链上的两个免疫调节多肽的情况下)iv)介于两个免疫调节多肽之间；v)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；vi)第一MHC多肽与免疫调节多肽。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:387)。
在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n是1至10的整数(例如，其中n是2、3或4)。
在上述支架中的任一者中，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQID NO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQID NO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQID NO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQID NO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)；LVVVGADGV(SEQID NO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)；KLVVVGADGV(SEQID NO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)；LLVVGADGV(SEQID NO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)；FLVVVGADGV(SEQID NO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)。
在上述支架中，在一些情况下，第二MHC多肽是HLA重链，所述HLA重链包含与HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽或HLA-A24多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，HLA重链多肽是HLA-A*0201多肽。在一些情况下，HLA重链多肽是包含A236C取代的HLA-A*0201多肽。在一些情况下，HLA重链多肽是包含A236C取代的HLA-A*1101多肽。
在一些情况下，支架包含两个免疫调节多肽，其中两个免疫调节多肽具有相同氨基酸序列，例如，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代的变体IL-2多肽，或包含H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。
在一些情况下，Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1Fc多肽的变体，例如，包含L234A和L235A取代的IgG1 Fc多肽，例如图3G中所示。
在一些情况下，第一多肽和第二多肽彼此二硫键连接。
在一些情况下，本公开的TMP包含具有MOD位置1或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是野生型或变体HLA-A*0201多肽，例如，包含A236C取代或如图22C中所示的序列的HLA-A*0201多肽，或其变体。在一些情况下，Ig Fc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1 Fc多肽。在一些情况下，第一多肽和第二多肽彼此二硫键连接。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ IDNO:181)；VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ IDNO:184)；VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ IDNO:187)；LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ IDNO:194)；KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ IDNO:197)；LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ IDNO:200)；FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ IDNO:203)。
在一些情况下，本公开的TMP包含具有MOD位置1或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是野生型或变体HLA-A24多肽(也称为HLA-A*2402)，例如，包含A236C取代或图21O、图21P、图21Q、图21R、图21S或图21T中的任一者中所示的氨基酸序列的HLA-A*0201多肽，或其变体。在一些情况下，Ig Fc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1 Fc多肽。在一些情况下，第一多肽和第二多肽彼此二硫键连接。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ IDNO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ IDNO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQ IDNO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQ IDNO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)；LVVVGADGV(SEQ IDNO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)；KLVVVGADGV(SEQ IDNO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)；LLVVGADGV(SEQ IDNO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)；FLVVVGADGV(SEQ IDNO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)。
在一些情况下，本公开的TMP包含具有MOD位置1或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是如本文所公开的野生型或变体HLA-A*1101多肽，例如，包含A236C取代或具有如图21J或图21K中的一者中所示的氨基酸序列的HLA-A*1101多肽，或其变体。在一些情况下，IgFc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1 Fc多肽。在一些情况下，第一多肽和第二多肽彼此二硫键连接。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)；LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)；KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)；LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)；FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)。
在一些情况下，本公开的TMP包含具有MOD位置1或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是如本文所公开的野生型或变体HLA-A*1101多肽，例如，包含A236C取代或具有如图21J或图21K中的一者中所示的氨基酸序列的HLA-A*1101多肽，或其变体。在一些情况下，IgFc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1 Fc多肽。在一些情况下，第一多肽和第二多肽彼此二硫键连接。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)；LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)；KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)；LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)；FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)。在MOD位置1排列中，在一些情况下，一个或多个独立选择的肽接头位于以下一者或多者之间：i)KRAS肽与第一MHC多肽；ii)免疫调节多肽与第二MHC多肽(并且在TMP包含第二多肽链上的两个免疫调节多肽的情况下，介于两个免疫调节多肽之间)；和/或iii)第二MHC多肽与Ig Fc多肽。在MOD位置3的排列中，在一些情况下，一个或多个独立选择的肽接头位于以下一者或多者之间：i)KRAS肽与第一MHC多肽；ii)第二MHC多肽与Ig Fc多肽；和iii)Ig Fc与免疫调节多肽(并且在TMP包含第二多肽链上的两个免疫调节多肽的情况下，介于两个免疫调节多肽之间)TMP。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列AAAGG(SEQ ID NO:387)。在一些情况下，肽接头包含氨基酸序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:377)，其中n是1至10的整数(例如，其中n是2、3或4)。
此外，如上文所论述并且如图16A-16C中示意性地描绘，本公开的TMP的第一多肽链和第二多肽链可由一个或多个二硫键连接。例如，本公开的TMMP可包含：a)包含具有R12C取代的β2M多肽的第一多肽链；和b)包含具有A236C取代的I类MHC重链多肽的第二多肽链；从而在第一多肽链中的β2M多肽的位置12处的Cys与第二多肽链中的I类MHC重链多肽的位置236处的Cys之间形成二硫键。作为另一个实例，本公开的TMMP可包含：a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)肽表位；ii)包含GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:582)序列的肽接头，其中n是1、2或3；和iii)β2M多肽；和b)包含具有Y84C取代的I类MHC重链多肽的第二多肽，从而在第一多肽链中的肽接头中的Cys与第二多肽链中的I类MHC重链多肽的位置84处的Cys之间形成二硫键。在其他实例中，本公开的TMP可包含：a)第一多肽，其从N末端至C末端依次包含：i)肽表位；ii)包含GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:582)序列的肽接头，其中n是1、2或3；和iii)具有R12C取代的β2M多肽；和b)包含具有Y84C取代和A236C取代的I类MHC重链多肽的第二多肽，从而：i)在第一多肽链中的肽接头中的Cys与第二多肽链中的I类MHC重链多肽的位置84处的Cys之间形成第一个二硫键；和ii)在第一多肽链中的β2M多肽的位置12处的Cys与第二多肽链中的I类MHC重链多肽的位置236处的Cys之间形成第二个二硫键。为简单起见，第一个二硫键称为“G2C/Y84C”；并且第二个二硫键称为“R12C/A236C”。本公开的TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键；b)R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键；或c)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键。
本公开的TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键；和b)在位置1或3处的至少一个免疫调节多肽。本公开的TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键；和b)在位置2、4或5处的至少一个免疫调节多肽。
本公开的TMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键；和在位置1或3处的至少一个免疫调节多肽。本公开的TMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键；和在位置2、4或5处的至少一个免疫调节多肽。
本公开的TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)和在位置1或3处的至少一个免疫调节多肽。本公开的TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)和在位置2、4或5处的至少一个免疫调节多肽。
在一些情况下，本公开的TMP包含第二多肽，所述第二多肽包含(i)在位置84处包含Ala和在位置236处包含Cys的HLA-A0201(Y84A；A236C)多肽，或(ii)在位置84和139处包含Cys的HLA-A0201(Y84C；A139C)多肽，或(iii)在位置84处包含Cys和在位置236处包含丙氨酸的HLA-A0201(Y84C；A236)多肽，例如，分别如图13A、图13B或图13C中所描绘。
在一些情况下，本公开的单链TMP包含I类MHC重链多肽，所述I类MHC重链多肽包含(i)在位置84处包含Ala和在位置236处包含Cys的HLA-A*1101(Y84A；A236C)多肽，或(ii)在位置84和236处包含Cys的HLA-A*1101(Y84C；A236C)多肽，或(iii)在位置84处包含Cys和在位置236处包含丙氨酸的HLA-A*1101(Y84C；A236)多肽，例如，分别如图13D、图13E或图13F中所描绘。
在一些情况下，本公开的TMP包含第二多肽，所述第二多肽包含(i)在位置84处包含Ala和在位置236处包含Cys的HLA-A24(Y84A；A236C)多肽，或(ii)在位置84和236处包含Cys的HLA-A24(Y84C；A236C)多肽，或(iii)在位置84处包含Cys和在位置236处包含丙氨酸的HLA-A24(Y84C；A236)多肽，例如，如图13G、图13H或图13I中所描绘。
作为非限制性实例，本公开的TMP可包含下表2中所列出的第一多肽和第二多肽的组合中的一者：
表2
作为非限制性实例，本公开的TMP可包含下表3中所列出的第一多肽和第二多肽的组合中的一者：
表3
在一些情况下，本公开的异二聚TMP包含I类MHC重链，所述I类MHC重链包含链内二硫键。例如，在一些情况下，本公开的异二聚TMP包含I类MHC重链，所述I类MHC重链包含由Y84C和A139C取代产生的Cys残基之间形成的链内二硫键。在一些情况下，此种异二聚TMP也包含I类MHC重链，所述I类MHC重链包含A236C取代，其中Cys-236可与第二多肽链形成二硫键，所述第二多肽链包含：i)肽表位；ii)包含R12C取代的β2M多肽，使得Cys-12与I类MHC重链中的Cys-236形成二硫键；和iii)肽表位与β2M多肽之间的肽接头，其中所述接头包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n是1至9的整数(例如，n是1、2或3)。
作为实例，本公开的TMP可包含下表4中所列出的第一多肽和第二多肽的组合中的一者，以提供包含具有Y84C、A139C和A236C取代的I类MHC A02重等位基因的异二聚TMP；并且其中免疫调节多肽在如图17中所描绘的位置1或位置3处。
表4
作为另一个实例，本公开的异二聚TMP可包含：a)包含图13L中所描绘的氨基酸序列的第一多肽；并且第二多肽包含图14K中所描绘的氨基酸序列。作为另一个实例，本公开的异二聚TMP可包含：a)包含图13L中所描绘的氨基酸序列的第一多肽；并且第二多肽包含图14Q中所描绘的氨基酸序列。
如上文所提及，在一些情况下，本公开的TMP是包含第一多肽和第二多肽的异二聚TMP，其中第一多肽和第二多肽是由一个或多个二硫键，例如单个二硫键或两个二硫键连接。例如，如上文所论述，本公开的TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键；b)R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键；或c)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键。在一些情况下，例如，在本公开的TMP包括G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键的情况下，β2M多肽不包括R12C取代(而在位置12处具有Arg)，并且I类MHC重链多肽不包括A236C取代(而在位置236处具有Ala)；换句话说，β2M多肽和I类MHC重链多肽在β2M的位置12处和I类MHC重链多肽的位置236处不包括“游离”(未配对)Cys残基。类似地，在一些情况下，例如，在本公开的TMP包括R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键的情况下，肽表位与β2M多肽之间的接头不包括Cys取代(而接头是(GGGGS)n接头，其中n是1至5的整数)，并且I类MHC多肽不包括Y84C取代(而在位置84处具有Tyr)；换句话说，肽表位与β2M多肽抑或I类MHC多肽之间的接头在接头中或在I类MHC多肽的位置84处都不包括“游离”(未配对)Cys残基。
单链TMP
如上文所提及并且如图18中示意性地描绘，免疫调节多肽(即，一个或多个免疫调节多肽)可存在于本公开的单链TMP中的多个位置中的任一者处。图18描绘变体IL-2多肽的两个拷贝的位置；然而，如本文所述，免疫调节多肽可为任何数目的免疫调节多肽和多种免疫调节多肽中的任一者。如图18中所描绘，免疫调节多肽可：1)在I类MHC重链的C末端和IgFc多肽的N末端；2)在Ig Fc多肽的C末端；或3)在肽表位的N末端。
根据本公开的单链TMP的I类MHC多肽(即，β2M和重链多肽)、免疫调节多肽、Ig Fc组分和接头与上文针对异二聚TMP所述的那些相同。此外，单链TMP可包括与异二聚TMP中相同的二硫键，即，在I类MHC重链多肽中的链内，例如，如上文所论述在两个Cys残基之间(例如，在重链的Cys-84与Cys-139之间)，在β2M与重链多肽之间(例如，在β2M的R12C与重链的残基236处的Cys之间)的链间，和/或将I类MHC重链中的Cys连接至表位与β2M多肽之间的接头中的Cys残基的二硫键。在一些情况下，I类MHC重链是A02等位基因I类MHC重链。在一些情况下，I类MHC重链包含Y84C和A139C取代，从而在Cys-84与Cys-139之间形成链内二硫键。在一些情况下，I类MHC重链是A02等位基因I类MHC重链。
在一些情况下，本公开的单链TMP包含具有如图18中所示的MOD位置2或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是野生型或变体HLA-A*0201多肽，例如，包含A236C取代或如图22C中所示的序列的HLA-A*0201多肽，或其变体。在一些情况下，Ig Fc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1Fc多肽。在一些情况下，单链TMP包含链内二硫键，所述链内二硫键(i)在I类MHC重链多肽中的两个Cys残基之间，(ii)在β2M与重链多肽之间，和/或在I类MHC重链中的Cys与在KRAS表位与β2M多肽之间的接头中的Cys之间。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ IDNO:187)；LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ IDNO:194)；KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ IDNO:197)；LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ IDNO:200)；FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ IDNO:203)。
在一些情况下，本公开的单链TMP包含具有如图18中所示的MOD位置2或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是野生型或变体HLA-A24多肽(也称为HLA-A*2402)，例如，包含A236C取代或图21O、图21P、图21Q、图21R、图21S或图21T中的任一者中所示的氨基酸序列的HLA-A*0201多肽，或其变体。在一些情况下，Ig Fc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1 Fc多肽。在一些情况下，单链TMP包含链内二硫键，所述链内二硫键(i)在I类MHC重链多肽中的两个Cys残基之间，(ii)在β2M与重链多肽之间，和/或在I类MHC重链中的Cys与在KRAS表位与β2M多肽之间的接头中的Cys之间。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ IDNO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ IDNO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQ IDNO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQ IDNO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)；LVVVGADGV(SEQ IDNO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)；KLVVVGADGV(SEQ IDNO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)；LLVVGADGV(SEQ IDNO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)；FLVVVGADGV(SEQ IDNO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)。
在一些情况下，本公开的TMP包含具有如图18中所示的MOD位置2或位置3排列的支架，其中HLA重链多肽是如本文所公开的野生型或变体HLA-A*1101多肽，例如，包含A236C取代或具有如图21J或图21K中的一者所示的氨基酸序列的HLA-A*1101多肽，或其变体。在一些情况下，Ig Fc多肽是基本上不引起细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，例如，包含如图3G中所示的L234A和L235A取代的人类IgG1 Fc多肽。在一些情况下，单链TMP包含链内二硫键，所述链内二硫键(i)在I类MHC重链多肽中的两个Cys残基之间，(ii)在β2M与重链多肽之间，和/或在I类MHC重链中的Cys与在KRAS表位与β2M多肽之间的接头中的Cys之间。在一些情况下，免疫调节多肽是包含H16A和F42A取代或H16T和F42A取代的变体IL-2多肽。在一些情况下，KRAS肽具有选自下组的氨基酸序列：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)；VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)；VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)；VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)；VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)；VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)；VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)；VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)；VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)；VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)；VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)；VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)；LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)；LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)；LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)；KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)；KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)；KLVVVGACGV(SEQ ID NO:197)；LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)；LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)；LLVVGACGV(SEQ ID NO:200)；FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)；FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)；FLVVVGACGV(SEQ ID NO:203)。
如上文所论述，单链TMP的多肽可由一个或多个二硫键连接。例如，本公开的TMP可包含具有R12C取代的β2M多肽和具有A236C取代的I类MHC重链多肽；从而在β2M多肽的位置12处的Cys与I类MHC重链多肽的位置236处的Cys之间形成二硫键。作为另一个实例，本公开的单链TMP可包含i)由包含GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:582)序列的肽接头连接的KRAS表位和β2M多肽，其中n是1、2或3，和ii)具有Y84C取代的I类MHC重链多肽，从而在肽接头中的Cys与I类MHC重链多肽的位置84处的Cys之间形成二硫键。在其他实例中，本公开的单链TMP可包含i)由包含GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:582)序列的肽接头连接的KRAS表位和β2M多肽，其中n是1、2或3，并且其中β2M多肽包含R12C取代；和ii)具有Y84C取代和A236C取代的I类MHC重链多肽，从而a)在肽接头中的Cys与I类MHC重链多肽的位置84处的Cys之间形成第一个二硫键，和b)在β2M多肽的位置12处的Cys与I类MHC重链多肽的位置236处的Cys之间形成第二个二硫键。为简单起见，第一个二硫键称为“G2C/Y84C”；并且第二个二硫键称为“R12C/A236C”。本公开的单链TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键；b)R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键；或c)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键。在一些情况下，I类MHC重链在位置84处包含非天然存在的Cys并且在位置139处包含非天然存在的残基，从而在Cys-84与Cys-139之间形成链内二硫键。
本公开的单链TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键而非R12C/A236C二硫键；和b)在位置2或3处的至少一个免疫调节多肽。本公开的单链TMP可包括：a)R12C/A236C二硫键而非G2C/Y84C二硫键；和在位置2或3处的至少一个免疫调节多肽。本公开的单链TMP可包括：a)G2C/Y84C二硫键和R12C/A236C二硫键；和b)和在位置2或3处的至少一个免疫调节多肽。
在一些情况下，本公开的单链TMP包含I类MHC重链多肽，所述I类MHC重链多肽包含(i)在位置84处包含Ala和在位置236处包含Cys的HLA-A0201(Y84A；A236C)多肽，或(ii)在位置84和139处包含Cys的HLA-A0201(Y84C；A139C)多肽，或(iii)在位置84处包含Cys和在位置236处包含丙氨酸的HLA-A0201(Y84C；A236)多肽，例如，分别如图13A、图13B或图13C中所描绘。
在一些情况下，本公开的单链TMP包含I类MHC重链多肽，所述I类MHC重链多肽包含(i)在位置84处包含Ala和在位置236处包含Cys的HLA-A*1101(Y84A；A236C)多肽，或(ii)在位置84和236处包含Cys的HLA-A*1101(Y84C；A236C)多肽，或(iii)在位置84处包含Cys和在位置236处包含丙氨酸的HLA-A*1101(Y84C；A236)多肽，例如，分别如图13D、图13E或图13F中所描绘。
在一些情况下，本公开的TMP包含第二多肽，所述第二多肽包含(i)在位置84处包含Ala和在位置236处包含Cys的HLA-A24(Y84A；A236C)多肽，或(ii)在位置84和236处包含Cys的HLA-A24(Y84C；A236C)多肽，或(iii)在位置84处包含Cys和在位置236处包含丙氨酸的HLA-A24(Y84C；A236)多肽，例如，分别如图13G、图13H或图13I中所描绘。
作为一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19A中所描绘的氨基酸序列(TMP“4095”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19B中所描绘的氨基酸序列(TMP“4073”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19C中所描绘的氨基酸序列(TMP“4074”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19D中所描绘的氨基酸序列(TMP“4333”)。
作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19E中所描绘的氨基酸序列(TMP“4335”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19F中所描绘的氨基酸序列。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19G中所描绘的氨基酸序列(TMP“4238”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19H中所描绘的氨基酸序列(TMP“4241”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19I中所描绘的氨基酸序列(TMP“4334”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19J中所描绘的氨基酸序列(TMP“4144”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19K中所描绘的氨基酸序列(TMP“4145”)。作为另一个非限制性实例，本公开的单链TMP可包含图19L中所描绘的氨基酸序列(TMP“4146”)。
产生多聚T细胞调节多肽的方法
如上文所论述，获得包含与相应亲本野生型免疫调节多肽对共刺激多肽的亲和力相比，对同源共刺激多肽展现较低亲和力的一个或多个变体免疫调节多肽的TMP的方法在公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091中公开，其关于产生TMP的方法的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括WO2020132138A1的段落[00560]-[00583]和WO2019/051091的段落[00364]-[00387]。
核酸
本公开提供了一种包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的核酸。本公开提供了一种包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的核酸。
本公开提供了包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的核酸。在一些情况下，本公开的异二聚TMP的个别多肽链在独立的核酸中编码。在一些情况下，本公开的异二聚或单链TMP的所有多肽链都在单个核酸中编码。在一些情况下，第一核酸包含编码本公开的异二聚TMP的第一多肽的核苷酸序列；并且第二核酸包含编码本公开的异二聚TMP的第二多肽的核苷酸序列。在一些情况下，单个核酸包含编码本公开的TMP的第一多肽和本公开的异二聚TMP的第二多肽的核苷酸序列。
编码多肽的个别多肽链的独立核酸
上文所提及的TMPA，在一些情况下，本公开的异二聚TMP的个别多肽链在独立的核酸中编码。在一些情况下，编码本公开的TMP的独立多肽链的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件，例如启动子，例如在真核细胞中发挥功能的启动子，其中所述启动子可为组成型启动子或诱导型启动子。
因此，例如，本公开提供了第一核酸和第二核酸，其中第一核酸包含编码异二聚TMP的第一多肽的独立核苷酸序列，并且第二核酸包含编码本公开的异二聚TMP的第二多肽的独立核苷酸序列。例如，在上文针对异二聚TMP所论述的MOD位置1中(参见图17)，其中第一MHC多肽包含β2M多肽并且第二多肽包含HLA重链多肽，第一核酸编码第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；和ii)β2M多肽，并且第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：i)至少一个免疫调节多肽；ii)HLA重链多肽；和iii)Ig Fc多肽。如上文所提及，接头任选地可包括在第一多肽和第二多肽两者的个别组分之间。类似地，例如，对于MOD位置3，第一核酸编码第一多肽，所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：i)KRAS肽；和ii)β2M多肽，并且第二核酸编码第二多肽，所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：i)HLA重链多肽；ii)Ig Fc多肽；和iii)i)至少一个免疫调节多肽。再次地，接头任选地可包括在第一多肽和第二多肽两者的个别组分之间。
在一些情况下，编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列可操作地连接至转录控制元件。在一些情况下，转录控制元件是在真核细胞中发挥功能的启动子。在一些情况下，核酸存在于独立的表达载体中。
编码存在于多肽中的两个或更多个多肽的核酸
本公开也提供了包含编码本公开的异二聚或单链TMP的至少第一多肽和第二多肽的核苷酸序列的单个核酸。使用单个核酸制备异二聚TMP的TMP方法在公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091中公开，其关于编码TMP的核酸的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括WO2020132138A1的段落[00507]-[00514]和WO2019/051091的段落[00393]-[00400]。
重组表达载体
本公开提供了包含本公开的核酸的重组表达载体。在一些情况下，重组表达载体是非病毒载体。在一些情况下，重组表达载体是病毒构建体，例如重组腺相关病毒构建体(参见例如美国专利第7,078,387号)、重组腺病毒构建体、重组慢病毒构建体、重组反转录病毒构建体、非整合型病毒载体等。
合适的表达载体在公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091中公开，其关于此类表达载体的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括WO2020132138A1的段落[00515]-[00520]和WO2019/051091的段落[00401]-[00406]。
遗传修饰的宿主细胞
本公开提供了遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞经本公开的核酸遗传修饰。
合适的宿主细胞包括真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一些情况下，宿主细胞是哺乳动物细胞系的细胞。合适的哺乳动物细胞系包括人类细胞系、非人类灵长类动物细胞系、啮齿动物(例如小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、人胚肾(HEK)细胞(ATCC编号CRL1573)、HLHepG2细胞等。
在一些情况下，宿主细胞是已遗传修饰的哺乳动物细胞，使得其不合成内源性MHCβ2-M。
在一些情况下，宿主细胞是已遗传修饰的哺乳动物细胞，使得其不合成内源性I类MHC重链。在一些情况下，宿主细胞是已遗传修饰的哺乳动物细胞，使得其不合成内源性MHCβ2-M，并且使得其不合成内源性I类MHC重链。
如上文所提及，在一些情况下，TMP是单链多肽(例如，由单个多肽链组成；或者是单个多肽链的同二聚体)。观测到产生完整和全长的单链TMP，即，多肽链无裂解。在一些情况下，可产生比异二聚TMP更大量的单链TMP。
组合物
本公开提供了包含本公开的TMP(synTac)的组合物，包括药物组合物。本公开提供了包含本公开的TMP的组合物，包括药物组合物。本公开提供了包含本公开的核酸或重组表达载体的组合物，包括药物组合物。
包含TMP的组合物
除本公开的TMP以外，本公开的组合物也可包含以下一者或多者：盐，例如NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等；缓冲剂、增溶剂；洗涤剂，例如非离子型洗涤剂，例如Tween-20等；蛋白酶抑制剂；甘油；等。组合物也可包含药学上可接受的赋形剂，其中多种在本领域中是已知的并且在本文中无需详细论述。药学上可接受的盐、缓冲剂、赋形剂、制剂、剂型等的实例在公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091中公开，其关于包含本公开的TMP的组合物的公开内容通过引用明确并入本文，具体而言包括WO2020132138A1的段落[00526]-[00536]和WO2019/051091的段落[00412]-[00422]。
在本公开的TMP作为可注射剂(例如皮下、腹膜内、肌内和/或静脉内)直接向组织施用的情况下，制剂可呈即用剂型提供，可将所述即用剂型直接注射或输注至患者中或与盐水溶液混合以供输注，或者可能呈非水性形式(例如，可复原的储存稳定粉末)或水性形式，例如由药学上可接受的载体和赋形剂组成的液体。也可提供制剂以提高施用后TMP的血清半衰期。例如，TMP可在脂质体制剂中提供，制备成胶体，或用于延长血清半衰期的其他常规技术制备。多种方法可用于制备脂质体，如例如Szoka等人,1980Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467、美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中所述。制剂也可呈控释或缓释形式提供。
本公开的TMP在液体组合物制剂中的浓度可在宽范围内变化(例如，以重量计小于约0.1％，通常2％或至少约2％至高达20％至50％或更高)。包括在此范围内的浓度为约5至约15mg/mL，包括约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL和约15mg/mL。浓度可取决于众多因素，包括液体组合物中TMP的稳定性。
在一些情况下，本公开的TMP存在于液体组合物中。在一些情况下，本公开的TMP组合物包含：a)本公开的TMP；和b)盐水(例如0.9％NaCl)。在一些情况下，组合物是无菌的并且适合于向人类受试者施用。
包含核酸或重组表达载体的组合物
本公开提供了包含本公开的核酸或重组表达载体的组合物，例如药物组合物。公开的PCT申请WO2020132138A1和WO2019/051091公开如何制备此类组合物。参见WO2020132138A1的段落[00537]-[00546]和WO2019/051091的段落[00423]-[00432]，其公开内容通过引用明确并入本文。
调节T细胞活性的方法
本公开提供了一种选择性地调节表位特异性T细胞(例如，对KRAS表位具有特异性的T细胞，所述KRAS表位例如包含癌症相关突变的KRAS肽)的活性的方法，所述方法包括使T细胞与本公开的TMP接触，其中使T细胞与本公开的TMP接触选择性地调节表位特异性T细胞的活性。在一些情况下，接触在体外发生。在一些情况下，接触在体内发生。
在本公开的TMP包括作为激活多肽的免疫调节多肽的情况下，使T细胞与TMP接触会激活表位特异性T细胞。在一些情况下，表位特异性T细胞是对存在于癌细胞上的表位具有特异性的T细胞，并且使表位特异性T细胞与TMP接触会增加T细胞对癌细胞的细胞毒性活性和/或增加表位特异性T细胞的数目。
本公开提供了一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本公开的TMP。施用TMP会诱导表位特异性T细胞反应(例如，癌症表位特异性T细胞反应)和表位非特异性T细胞反应，其中表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少5:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少10:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少25:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少50:1。在一些情况下，表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少100:1。在一些情况下，个体是人类。在一些情况下，调节增加对癌细胞的细胞毒性T细胞反应，所述癌细胞是例如表达呈现由存在于TMP中的KRAS表位呈递的相同表位的抗原的癌细胞，和/或增加对KRAS表位具有特异性的T细胞的数目。在一些情况下，施用是静脉内、皮下、肌内、全身、淋巴内、在治疗部位远程、局部或在治疗部位处或附近。
本公开提供了一种将免疫调节多肽选择性地递送至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群体与本公开的TMP接触，其中所述混合T细胞群体包含靶T细胞和非靶T细胞，其中靶T细胞对存在于TMP内的表位具有特异性(例如，其中靶T细胞对存在于TMP内的表位具有特异性)，并且其中接触步骤将存在于TMP内的一个或多个免疫调节多肽递送至靶T细胞。在一些情况下，T细胞群体在体外。在一些情况下，T细胞群体在个体中在体内。在一些情况下，所述方法包括向个体施用TMP。在一些情况下，T细胞是细胞毒性T细胞。在一些情况下，混合T细胞群体是获自个体的体外混合T细胞群体，并且接触步骤使得靶T细胞活化和/或增殖，产生活化和/或增殖的靶T细胞群体；在这些情况中的一些情况下，所述方法还包括向个体施用活化和/或增殖的靶T细胞群体。
本公开提供了一种在获自个体的混合T细胞群体中检测结合目标表位(例如，癌症表位；包含癌症相关突变的KRAS肽)的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：a)使混合T细胞群体体外与本公开的TMP接触，其中所述TMP包含目标KRAS表位；以及b)检测响应于所述接触的T细胞活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示靶T细胞的存在。
治疗方法
本公开提供了一种治疗个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效治疗个体的量的本公开的TMP或一个或多个编码TMP的核酸。也提供了用于治疗人类或非人类动物体的方法中的本公开的TMP。在一些情况下，本公开的治疗方法包括向有需要的个体施用包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体。在一些情况下，本公开的治疗方法包括向有需要的个体施用包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的一个或多个mRNA分子。在一些情况下，本公开的治疗方法包括向有需要的个体施用本公开的TMP。如上文所述，可治疗的疾患包括例如癌症，例如表达KRAS多肽，例如突变体KRAS多肽的癌症。
在一些情况下，本公开的TMP当向有需要的个体施用时，诱导表位特异性T细胞反应和表位非特异性T细胞反应。换句话说，在一些情况下，本公开的TMP当向有需要的个体施用时，通过调节呈现以下两者的第一T细胞的活性来诱导表位特异性T细胞反应：i)对存在于TMP中的表位具有特异性的TCR；ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽；并且通过调节呈现以下两者的第二T细胞的活性来诱导表位非特异性T细胞反应：i)对除存在于TMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1、至少5:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1或至少100:1。表位特异性T细胞反应与表位非特异性T细胞反应的比率为约2:1至约5:1、约5:1至约10:1、约10:1至约15:1、约15:1至约20:1、约20:1至约25:1、约25:1至约50:1或约50:1至约100:1或大于100:1。“调节T细胞的活性”可包括以下一项或多项：i)激活细胞毒性(例如CD8+)T细胞；ii)诱导细胞毒性(例如CD8+)T细胞的细胞毒性活性；iii)诱导由细胞毒性(例如CD8+)T细胞产生和释放细胞毒素(例如穿孔素；颗粒酶；颗粒溶素)；和iv)增加细胞毒性(例如CD8+)T细胞的数目。
在MOD为野生型MOD的亲和力降低变体的情况下，MOD对其同源共刺激多肽降低的亲和力与表位对TCR的亲和力的组合为本公开的TMP提供增强的选择性。因此，例如，与本公开的TMP结合至呈现i)对除存在于TMP中的表位以外的表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽的第二T细胞的亲合力相比，本公开的TMP以更高亲合力结合至呈现以下两者的第一T细胞：i)对存在于TMP中的表位具有特异性的TCR；和ii)结合至存在于TMP中的免疫调节多肽的共刺激多肽。
因此，本公开提供了一种选择性地调节个体中表位特异性T细胞的活性的方法，所述方法包括向个体施用有效量的本公开的TMP或一个或多个包含编码TMP的核苷酸序列的核酸(例如，表达载体；mRNA等)，其中TMP选择性地调节个体中表位特异性T细胞的活性。选择性地调节表位特异性T细胞的活性可治疗个体的疾病或病症。因此，本公开提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括向有需要的个体施用有效量的本公开的TMP。
在一些情况下，免疫调节多肽(“MOD”)是激活多肽，并且TMP激活表位特异性T细胞。在一些情况下，TMP增加对KRAS表位具有特异性的T细胞的活性。在一些情况下，MOD是激活多肽，并且TMP激活表位特异性T细胞(例如，对KRAS表位具有特异性的T细胞)。在一些情况下，T细胞是T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)或NK-T细胞。在一些情况下，表位是癌症表位，并且TMP增加对表达KRAS癌症表位的癌细胞具有特异性的T细胞(例如，T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)和/或NK-T细胞)的活性。CD4+T细胞的活化可包括增加CD4+T细胞的增殖和/或诱导或增强由CD4+T细胞释放细胞因子。NK-T细胞和/或CD8+细胞的活化可包括：增加NK-T细胞和/或CD8+细胞的增殖；和/或诱导由NK-T细胞和/或CD8+细胞释放细胞因子如干扰素γ。
可向有需要的个体施用本公开的TMP以治疗所述个体的癌症，其中所述癌症表达存在于TMP中的KRAS肽。例如，癌症可为癌细胞表达或过表达如上文所述的KRAS(例如，KRAS的突变形式)的癌症。本公开提供了一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的本公开的TMP或一个或多个包含编码TMP的核苷酸序列的核酸(例如，表达载体；mRNA等)，其中TMP包含作为KRAS表位的T细胞表位，并且其中TMP包含刺激性免疫调节多肽。在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，减少所述个体中癌细胞的数目的量。例如，在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，使所述个体中癌细胞的数目与施用TMP之前或未施用TMP的个体中癌细胞的数目相比减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的量。在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，减少个体中癌细胞的数目，包括减至基本上不可检测的水平的量。
在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，减少所述个体的肿瘤质量的量。例如，在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体(患有肿瘤的个体)施用时，使所述个体的肿瘤质量与施用TMP之前或未施用TMP的个体的肿瘤质量相比减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的量。在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体(患有肿瘤的个体)施用时，减少所述个体的肿瘤体积的量。例如，在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体(患有肿瘤的个体)施用时，使所述个体的肿瘤体积与施用TMP之前或未施用TMP的个体的肿瘤体积相比减少至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的量。在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，增加所述个体的存活时间的量。例如，在一些情况下，本公开的TMP的“有效量”是当以一个或多个剂量向有需要的个体施用时，使所述个体的存活时间与未施用TMP的个体的预期存活时间相比增加至少1个月、至少2个月、至少3个月、3个月至6个月、6个月至1年、1年至2年、2年至5年、5年至10年或超过10年的量。
可用本公开的方法治疗的癌症包括癌细胞表达KRAS的突变形式的癌症。实例包括腺癌和血液恶性病。可用本公开的方法治疗的癌症的实例包括多发性骨髓瘤；B细胞淋巴瘤；乳腺癌；肺癌；卵巢癌；胰腺癌；结肠直肠癌；前列腺癌；肾癌；急性骨髓性白血病；间皮瘤；甲状腺癌；头颈癌；胃癌；尿路上皮癌；宫颈癌；和卵巢子宫内膜癌。
如上文所提及，在一些情况下，在实施主题治疗方法中，作为TMP本身，向有需要的个体施用本公开的TMP。在其他情况下，在实施主题治疗方法中，向有需要的个体施用一个或多个包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的核酸。因此，在其他情况下，向有需要的个体施用本公开的一个或多个核酸，例如，本公开的一个或多个重组表达载体。
如上文所论述，在需要接合对APP的KRAS肽具有特异性的T细胞的TCR的那些情况下，也可出于治疗目的向患者施用本公开的APP。在此类情况下，当APP与TCR接合时，患者中天然存在的免疫调节多肽的存在可影响T细胞的调节。
制剂
上文描述合适的制剂，其中合适的制剂包括药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，合适的制剂包含：a)本公开的TMP；和b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的核酸；和b)药学上可接受的赋形剂；在一些情况下，核酸是mRNA。在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的TMP的第一多肽的核苷酸序列的第一核酸；b)包含编码本公开的TMP的第二多肽的核苷酸序列的第二核酸；和c)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的TMP的核苷酸序列的重组表达载体；和b)药学上可接受的赋形剂。在一些情况下，合适的制剂包含：a)包含编码本公开的TMP的第一多肽的核苷酸序列的第一重组表达载体；b)包含编码本公开的TMP的第二多肽的核苷酸序列的第二重组表达载体；和c)药学上可接受的赋形剂。上文描述合适的药学上可接受的赋形剂。
剂量
合适的剂量可由主治医师或其他合格的医疗人员基于各种临床因素来确定。如医学领域中所熟知，用于任何一名患者的剂量取决于许多因素，所述因素包括患者的体型、体表面积、年龄，有待施用的特定多肽或核酸，患者的性别，施用的时间和途径，一般健康状况，和同时施用的其他药物。本公开的TMP可按以下量施用：每剂介于0.1毫克/千克体重与20毫克/千克体重之间，例如介于0.1毫克/千克体重至10毫克/千克体重之间，例如介于0.5毫克/千克体重至5毫克/千克体重之间；介于1毫克/千克体重至5毫克/千克体重之间；介于5毫克/千克体重至10毫克/千克体重之间；介于10毫克/千克体重至15毫克/千克体重之间；介于15毫克/千克体重至20毫克/千克体重之间，然而，尤其考虑到上述因素，可设想高于此示例性范围的剂量。如果方案是连续输注，则剂量也可在1微克至10毫克/千克体重/分钟的范围内。本公开的TMP可按以下量施用：约1毫克/千克体重至50毫克/千克体重，例如约1毫克/千克体重至约5毫克/千克体重、约5毫克/千克体重至约10毫克/千克体重、约10毫克/千克体重至约15毫克/千克体重、约15毫克/千克体重至约20毫克/千克体重、约20毫克/千克体重至约25毫克/千克体重、约25毫克/千克体重至约30毫克/千克体重、约30毫克/千克体重至约35毫克/千克体重、约35毫克/千克体重至约40毫克/千克体重、或约40毫克/千克体重至约50毫克/千克体重。
本领域的普通技术人员可基于所测量的停留时间和所施用的剂在体液或组织中的浓度来容易地估算给药的重复率。在成功治疗后，可能需要使患者经历维持疗法以预防疾病状态复发，其中本公开的TMP以维持剂量施用，所述维持剂量在约1毫克/千克体重至约5毫克/千克体重、约5毫克/千克体重至约10毫克/千克体重、约10毫克/千克体重至约15毫克/千克体重、约15毫克/千克体重至约20毫克/千克体重的范围内，或为超过20毫克/千克体重的量。
本领域技术人员将易于了解，剂量水平可随特异性TMP、症状的严重程度和受试者对副作用的敏感度而变化。给定化合物的优选剂量可由本领域技术人员通过多种方式容易地确定。
在一些情况下，施用本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体的多个剂量。本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体的施用频率可根据多种因素中的任一者而变化，所述因素是例如症状的严重程度等。例如，在一些情况下，本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体是每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天(qd)、每天两次(qid)或每天三次(tid)施用。
本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体的施用持续时间，例如施用本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体的时间段可根据多种因素中的任一者而变化，所述因素是例如患者反应等。例如，本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体可经一定时间段施用，所述时间段在约一天至约一周、约两周至约四周、约一个月至约两个月、约两个月至约四个月、约四个月至约六个月、约六个月至约八个月、约八个月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年的范围内，或更长时间。
施用途径
使用适合于药物递送的任何可用方法和途径，包括体内和体外方法以及全身和局部施用途径，向个体施用活性剂(本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体)。
本公开的TMP典型地将经由静脉内施用来递送，但可使用其他常规和药学上可接受的施用途径，包括肿瘤内、肿瘤周围、肌内、淋巴管内、气管内、颅内、皮下、皮内、局部施用、动脉内、经直肠、经鼻、经口和其他经肠和肠胃外施用途径。如果需要，则施用途径可组合，或根据TMP和/或所需作用而进行调整。本公开的TMP或本公开的核酸或重组表达载体可以单剂量或以多剂量施用。
可使用适合于递送常规药物的任何可用常规方法和途径，包括全身或局部途径，向宿主施用本公开的TMP、本公开的核酸或本公开的重组表达载体。一般来说，预期用于本公开的方法中的施用途径包括但不一定限于经肠、肠胃外和吸入途径。
组合疗法
本公开的TMP可与一种或多种额外治疗剂或治疗性处理组合，向有需要的个体施用。TMP的合适剂量将与使用APP的单一疗法的剂量(上文所述)相同，或者可小于或大于单一疗法剂量。合适的额外治疗剂包括例如：i)免疫检查点抑制剂；ii)癌症化学治疗剂；iii)抑制KRAS的癌症相关突变形式的剂；和iv)一个或多个额外TMP。合适的额外治疗性处理包括例如放射线、手术(例如肿瘤的手术切除)等。
在一些情况下，方法包括向有需要的个体施用：a)包含本公开的TMP的第一组合物；和b)包含免疫检查点抑制剂的第二组合物。在一些情况下，方法包括向有需要的个体施用：a)包含本公开的TMP的第一组合物；和b)包含抑制KRAS的癌症相关突变形式，例如KRAS(G12C)的剂的第二组合物。在一些情况下，方法包括向有需要的个体施用：a)包含本公开的TMP的第一组合物；和b)包含第二TMP的第二组合物。
可与施用一种或多种额外治疗剂同时或在不同时间，向有需要的个体施用本公开的TMP。
因此，例如，本公开的治疗方法可包括共同施用本公开的TMP和至少一种额外治疗剂。“共同施用”意指向个体施用本公开的TMP和至少一种额外治疗剂两者，但不一定同时施用，以达成治疗作用，所述治疗作用是已施用TMP和至少一种额外治疗剂两者的结果。TMP和至少一种额外治疗剂的施用可基本上同时进行，例如，在施用至少一种额外治疗剂约1分钟至约24小时内(例如，约1分钟内、约5分钟内、约15分钟内、约30分钟内、约1小时内、约4小时内、约8小时内、约12小时内或约24小时内)向个体施用TMP。在一些情况下，向正在经历至少一种额外治疗剂治疗或已经历所述治疗的个体施用本公开的TMP。TMP和至少一种额外治疗剂的施用可在不同时间和/或以不同频率进行。
作为另一个实例，本公开的治疗方法可包括共同施用本公开的TMP和免疫检查点抑制剂，例如对免疫检查点具有特异性的抗体。“共同施用”意指向个体施用本公开的TMP和对免疫检查点具有特异性的抗体两者，但不一定同时施用，以达到治疗效果，所述治疗效果是已施用TMP和免疫检查点抑制剂两者的结果。TMP和对免疫检查点具有特异性的抗体的施用可基本上同时进行，例如，在施用对免疫检查点具有特异性的抗体约1分钟至约24小时内(例如，约1分钟内、约5分钟内、约15分钟内、约30分钟内、约1小时内、约2小时、约4小时内、约8小时内、约12小时内或约24小时内)向个体施用TMP。在一些情况下，向正在经历对免疫检查点具有特异性的抗体治疗或已经历所述治疗的个体施用本公开的TMP。TMP和对免疫检查点具有特异性的抗体的施用可在不同时间和/或以不同频率进行。
示例性免疫检查点抑制剂包括靶向例如以下免疫检查点多肽的抑制剂：CD27、CD28、CD40、CD122、CD96、CD73、CD47、OX40、GITR、CSF1R、JAK、PI3Kδ、PI3Kγ、TAM、精氨酸酶、CD137(也称为4-1BB)、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、LAG3、TIM3、VISTA、CD96、TIGIT、CD122、PD-1、PD-L1和PD-L2。在一些情况下，免疫检查点多肽是选自CD27、CD28、CD40、ICOS、OX40、GITR、CD122和CD137的刺激性检查点分子。在一些情况下，免疫检查点多肽是选自A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、TIM3、CD96、TIGIT和VISTA的抑制性检查点分子。
在一些情况下，免疫检查点抑制剂是对免疫检查点具有特异性的抗体。合适的抗免疫检查点抗体包括但不限于纳武单抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、匹利珠单抗(pidilizumab)(Curetech)、AMP-224(GlaxoSmithKline/Amplimmune)、MPDL3280A(Roche)、MDX-1105(Medarex,Inc./BristolMyer Squibb)、MEDI-4736(Medimmune/AstraZeneca)、阿瑞鲁单抗(arelumab)(MerckSerono)、伊匹单抗(ipilimumab)(YERVOY,(Bristol-Myers Squibb)、曲美木单抗(tremelimumab)(Pfizer)、匹利珠单抗(CureTech,Ltd.)、IMP321(Immutep S.A.)、MGA271(Macrogenics)、BMS-986016(Bristol-Meyers Squibb)、利鲁单抗(lirilumab)(Bristol-Myers Squibb)、乌瑞鲁单抗(urelumab)(Bristol-Meyers Squibb)、PF-05082566(Pfizer)、IPH2101(Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb)、MEDI-6469(MedImmune/AZ)、CP-870,893(Genentech)、莫加珠单抗(Mogamulizumab)(Kyowa Hakko Kirin)、瓦利鲁单抗(Varlilumab)(CelIDex Therapeutics)、阿维鲁单抗(Avelumab)(EMD Serono)、加利昔单抗(Galiximab)(Biogen Idec)、AMP-514(Amplimmune/AZ)、AUNP 12(Aurigene和PierreFabre)、因多西莫(Indoximod)(NewLink Genetics)、NLG-919(NewLink Genetics)、INCB024360(Incyte)；KN035；及其组合。例如，在一些情况下，免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体。合适的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗、派姆单抗(也称为MK-3475)、匹利珠单抗、SHR-1210、PDR001和AMP-224。在一些情况下，抗PD-1单克隆抗体是纳武单抗、派姆单抗或PDR001。合适的抗PD1抗体描述于美国专利公开第2017/0044259号中。对于匹利珠单抗，参见例如Rosenblatt等人,(2011)J.Immunother.34:409-18。在一些情况下，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体。在一些情况下，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗或曲美木单抗。对于曲美木单抗，参见例如Ribas等人,(2013)J.Clin.Oncol.31:616-22。在一些情况下，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1抗体。在一些情况下，抗PD-L1单克隆抗体是BMS-935559、MEDI4736、MPDL3280A(也称为RG7446)、KN035或MSB0010718C。在一些实施方案中，抗PD-L1单克隆抗体是MPDL3280A(阿替珠单抗(atezolizumab))或MEDI4736(德瓦鲁单抗(durvalumab))。对于德瓦鲁单抗，参见例如WO 2011/066389。对于阿替珠单抗，参见例如美国专利第8,217,149号。
在一些情况下，至少一种额外治疗剂是选择性地抑制KRAS的突变形式，例如KRAS(G12C)、KRAS(K117A)等的剂。选择性地抑制KRAS的突变形式的剂的实例包括ARS-1620；AMG510；KRA-533；和MRTX849。
AMG150具有以下结构：
ARS-1620具有以下结构：
在一些情况下，至少一种额外治疗剂包括一种或多种额外TMP。在一些情况下，方法包括向有需要的个体施用：a)包含第一TMP的第一组合物，其中第一TMP是本公开的TMP；和b)包含第二TMP的第二组合物，其中第二TMP是与本公开的第一TMP不同的本公开的TMP，例如，包含不同KRAS表位和/或一个或多个不同MOD。另外或替代地，一个或多个额外TMP可包含表位，所述表位与除KRAS肽表位以外的癌症相关肽。
适合于治疗的受试者
适合于用本公开的方法治疗的受试者包括患有癌症的个体，包括已诊断为患有癌症的个体，已进行癌症治疗但对治疗无反应的个体，以及已进行癌症治疗并且最初有反应但随后对治疗而言变得难治的个体。适合于用本公开的方法治疗的受试者包括患有癌症的个体，在所述癌症中癌细胞表达KRAS的突变形式，其中KRAS的突变形式是癌症相关突变形式。适合于用本公开的方法治疗的受试者包括患有以下癌症的个体：例如多发性骨髓瘤；B细胞淋巴瘤；乳腺癌；肺癌；卵巢癌；胰腺癌；结肠直肠癌；前列腺癌；肾癌；急性骨髓性白血病；间皮瘤；甲状腺癌；头颈癌；胃癌；尿路上皮癌；宫颈癌；和卵巢子宫内膜癌。
在一些情况下，受试者是正在经历免疫检查点抑制剂治疗的个体。在一些情况下，受试者是已经历免疫检查点抑制剂治疗，但尽管已接受此种治疗，其疾病仍进展的个体。在一些情况下，受试者是正在经历癌症化学治疗剂治疗或已经历所述治疗的个体。在一些情况下，受试者是准备经历免疫检查点抑制剂治疗，正在经历所述治疗，或已经历所述治疗的个体。在一些情况下，受试者是准备经历癌症化学治疗剂治疗、放射线治疗、手术和/或另一种治疗剂治疗，正在经历所述治疗，或已经历所述治疗的个体。
本公开的非限制性方面的实施例
上文所述的本公开主题的方面(包括实施方案)单独或与一个或多个其他方面或实施方案组合可为有益的。在不限制前述描述的情况下，下文提供本公开的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见，可使用个别编号的方面中的每一者或与之前或之后个别编号的方面中的任一者组合。这旨在为方面的所有此类组合提供支持，并且不限于下文明确提供的方面的组合：
方面1.一种T细胞调节多肽(TMP)，所述T细胞调节多肽包含：
i)包含于癌细胞上表达的KRAS表位的KRAS肽，其中所述KRAS肽的长度为至少4个氨基酸；
ii)第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽；
iii)第二MHC多肽；和
iv)至少一个免疫调节多肽。
方面2.根据方面1所述的T细胞调节多肽，所述T细胞调节多肽还包含Ig Fc多肽。
方面3.根据方面2所述的T细胞调节多肽，其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽。
方面4.如方面2或3所述的T细胞调节多肽，其中IgG1 Fc多肽包含一个或多个选自N297A、L234A、L235A、L234F、L235E和P331S的氨基酸取代。
方面5.如方面4所述的T细胞调节多肽，其中所述IgG1 Fc多肽包含图3G的氨基酸序列。
方面6.如方面1-5中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽是β2-微球蛋白多肽；并且其中所述第二MHC多肽是I类MHC重链多肽。
方面7.如方面5所述的T细胞调节多肽，其中所述β2-微球蛋白多肽是由第一接头连接至所述KRAS肽。
方面8.如方面1-7中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述β2-微球蛋白多肽和所述I类MHC重链多肽彼此共价连接。
方面9.如方面8所述的T细胞调节多肽，其中所述共价连接是经由一个或多个二硫键。
方面10.如方面9所述的T细胞调节多肽，其中所述β2M多肽和所述MHC重链多肽是由二硫键连接，所述二硫键将所述β2M多肽中的Cys残基与所述MHC重链多肽中的Cys残基连接。
方面11.如方面10所述的T细胞调节多肽，其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys。
方面12.如方面7-11中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述第一接头包含Cys，并且其中二硫键将存在于所述第一接头中的Cys与存在于所述MHC重链多肽中的Cys连接。
方面13.如方面12所述的T细胞调节多肽，其中所述第一接头包含序列CGGGS(SEQID NO:141)、GCGGS(SEQ ID NO:139)、GGCGS(SEQ ID NO:587)、GGGCS(SEQ ID NO:588)或GGGGC(SEQ ID NO:590)，并且二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接。
方面14.如方面13所述的T细胞调节多肽，其中所述第一接头包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1-10的整数，例如2或3，并且二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接。
方面15.如方面9-14所述的T细胞调节多肽，其中所述TMP包含(i)在所述β2M多肽中的Cys残基与所述MHC重链多肽中的Cys残基之间的第一个二硫键，和(ii)将存在于所述第一接头中的Cys与存在于所述MHC重链多肽中的Cys连接的第二个二硫键。
方面16.如方面15所述的T细胞调节多肽，其中(i)所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，并且(ii)所述第一接头包含序列CGGGS(SEQ ID NO:141)、GCGGS(SEQ ID NO:139)、GGCGS(SEQ ID NO:587)、GGGCS(SEQ ID NO:588)或GGGGC(SEQ ID NO:590)，并且二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接。
方面17.如方面16所述的T细胞调节多肽，其中所述第一接头包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1-10的整数，例如2或3。
方面18.如方面1-17中任一项所述的T细胞调节多肽，其中二硫键将存在于所述MHC重链多肽中的两个Cys残基连接。
方面19.如方面1-18中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述MHC重链多肽包含：
a)与图7A中所描绘的HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2301、HLA-A*2402、HLA-A*2407、HLA-A*3303或HLA-A*3401氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
b)与图8A中所描绘的HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*1502、HLA-B*3802、HLA-B*4001、HLA-B*4601或HLA-B*5301氨基酸序列具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
c)与图9A中所描绘的HLA-C*0102、HLA-C*0303、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0602、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-C*0801或HLA-C*1502具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面20.如方面19所述的T细胞调节多肽，其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面21.如方面1-20中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述至少一个免疫调节多肽是活化免疫调节多肽的野生型或变体。
方面22.如方面1-21中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述至少一个免疫调节多肽是选自由IL-2多肽、4-1BBL多肽、CD80多肽、CD86多肽或其组合组成的组的活化免疫调节多肽的野生型或变体。
方面23.如方面1-22中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述至少一个免疫调节多肽中的至少一者是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对所述同源共刺激多肽展现降低的亲和力。
方面24.如方面21-23中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述至少一个免疫调节多肽是基本上不结合至IL-2Rα并且对IL-2Rβ具有降低的亲和力的IL-2变体。
方面25.如方面24所述的T细胞调节多肽，其中所述变体IL-2多肽包含：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面26.如方面1-25中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述多肽包含至少两个免疫调节多肽，并且其中所述免疫调节多肽中的至少两者是相同的。
方面27.如方面25或26中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述2种或更多种免疫调节多肽是串联的。
方面28.如方面27所述的T细胞调节多肽，所述T细胞调节多肽包含两个串联的变体IL-2多肽，每一者包含i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面29.如方面1-28中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是长度为至少4个氨基酸的肽，例如，4个氨基酸至约25个氨基酸(例如，4个氨基酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa或25aa，包括长度在4至20个氨基酸、6至18个氨基酸、8至15个氨基酸、8至12个氨基酸、5至10个氨基酸、9-10个氨基酸、10至20个氨基酸和15至25个氨基酸的范围内)。
方面30.如方面29所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)、VVGAVGVGK(SEQ IDNO:178)、VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VVVGACGVGK(SEQ IDNO:181)、VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)、VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)、VTGACGVGK(SEQ IDNO:184)、VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)、VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)和VTVGACGVGK(SEQID NO:187)；并且其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
方面31.如方面29所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：VVVGAGDVGK(SEQ ID NO:188)；VVGAGDVGK(SEQ ID NO:189)；VVVGARGVGK(SEQ IDNO:190)；和VVGARGVGK(SEQ ID NO:191)；并且其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
方面32.如方面29所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、LVVVGACGV(SEQ IDNO:194)、KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)、KLVVVGACGV(SEQ IDNO:197)、LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)、LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)、LLVVGACGV(SEQ IDNO:200)、FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)、FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)和FLVVVGACGV(SEQID NO:203)；并且其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
方面33.如方面29所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：KLVVVGAGDV(SEQ ID NO:204)；和KLVVVGARGV(SEQ ID NO:205)；其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
方面34.如方面29所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：GAGDVGKSAL(SEQ ID NO:206)；AGDVGKSAL(SEQ ID NO:207)；DVGKSALTI(SEQ IDNO:208)；GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)；AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)；YKLVVVGAV(SEQ IDNO:211)；ARGVGKSAL(SEQ ID NO:212)；GARGVGKSAL(SEQ ID NO:213)；EYKLVVVGAR(SEQ IDNO:214)；RGVGKSALTI(SEQ ID NO:215)；LVVVGARGV(SEQ ID NO:216)；GADGVGKSAL(SEQ IDNO:217)；ACGVGKSAL(SEQ ID NO:218)；和GACGVGKSAL(SEQ ID NO:219)；其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
方面35.如方面29所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VGAVGVGKS(SEQ IDNO:222)、VGAVGVGKSA(SEQ ID NO:223)、AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)、AVGVGKSALT(SEQ IDNO:225)、GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)、GAVGVGKSA(SEQ ID NO:227)、LVVVGAVGVG(SEQ IDNO:228)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)和KLVVVGAVG(SEQ IDNO:231)；其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
方面36.如方面29-35中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是长度为9或10个氨基酸的肽。
方面37.如方面36所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)或VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且长度为9个氨基酸。
方面38.如方面36所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)、VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)或VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)，并且长度为10个氨基酸。
方面39.如方面36所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)、VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)或VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)，并且长度为9个氨基酸。
方面40.如方面36所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)、VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)或VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)，并且长度为10个氨基酸。
方面41.如方面32所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是KLVVVGADGV(SEQ IDNO:195)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面42.如方面32所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是VVVGADGVGK(SEQ IDNO:179)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面43.如方面37所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是VVGAVGVGK(SEQ IDNO:178)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面44.根据方面1-43中任一项所述的异二聚T细胞调节多肽，所述异二聚T细胞调节多肽包含：
a)包含以下的第一多肽：
i)包含于癌细胞上表达的KRAS表位的KRAS肽，其中所述KRAS肽的长度为至少4个氨基酸；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b)I类MHC重链多肽，和
c)至少一个免疫调节多肽，
其中所述第一多肽和/或所述第二多肽包含所述免疫调节多肽。
方面45.如方面44所述的异二聚T细胞调节多肽，其中：
a1)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b1)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)至少一个免疫调节多肽；
ii)I类MHC重链多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a2)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b2)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)至少一个免疫调节多肽；和
iii)免疫球蛋白(Ig)Fc多肽；或
a3)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b3)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一个免疫调节多肽；或
a4)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)至少一个免疫调节多肽；
ii)所述KRAS肽；和
iii)β2-微球蛋白多肽；和
b4)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；或
a5)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；
ii)β2-微球蛋白多肽；和
iii)至少一个免疫调节多肽；和
b5)所述第二多肽包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽。
方面46.如方面45所述的异二聚T细胞调节多肽，其中：
a1)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b1)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)至少一个免疫调节多肽；
ii)I类MHC重链多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b3)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一个免疫调节多肽；并且
其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，任选地包含图3G的氨基酸序列，
其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)的第一接头连接至所述KRAS肽，其中n是1-10的整数，例如2或3，
其中所述MHC重链多肽包含残基84处的Cys和残基236处的Cys，
其中所述β2M多肽包含残基12处的Cys，
其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，
其中二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接，
其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述至少一个免疫调节多肽是包含以下的IL-2变体：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代，并且
其中所述多肽包含两个相同、串联并包含IL-2变体的免疫调节多肽，所述IL-2变体包含i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面47.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)或VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且长度为9个氨基酸。
方面48.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)、VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)或VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)，并且长度为10个氨基酸。
方面49.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)、VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)或VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)，并且长度为9个氨基酸。
方面50.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)、VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)或VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)，并且长度为10个氨基酸。
方面51.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面52.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面53.如方面46所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面54.根据方面1-43中任一项所述的单链T细胞调节多肽，所述单链T细胞调节多肽包含：
i)包含于癌细胞上表达的KRAS表位的KRAS肽，其中所述KRAS肽的长度为至少4个氨基酸；
ii)β2-微球蛋白多肽；
iii)I类MHC重链多肽；和
iv)至少一个免疫调节多肽。
方面55.如方面54所述的单链T细胞调节多肽，所述单链T细胞调节多肽从N末端至C末端依次包含：
A)i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；iv)一个或多个免疫调节多肽；和v)Ig Fc多肽；或
B)i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；iv)Ig Fc多肽；和v)一个或多个免疫调节多肽；或
C)i)一个或多个免疫调节多肽；ii)KRAS肽；iii)β2M多肽；iv)I类MHC重链多肽；和v)Ig Fc多肽。
方面56.如方面55所述的单链T细胞调节多肽，所述单链T细胞调节多肽从N末端至C末端依次包含：
i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；iv)Ig Fc多肽；和v)一个或多个免疫调节多肽，
其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，任选地包含图3G的氨基酸序列，
其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)的第一接头连接至所述KRAS肽，其中n是1-10的整数，例如2或3，
其中所述MHC重链多肽包含残基84处的Cys和残基236处的Cys，
其中所述β2M多肽包含残基12处的Cys，
其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，
其中二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接，
其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述β2M多肽是由(GGGGS)n(SEQ ID NO:377)接头连接至所述MHC重链多肽，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如n＝3或7，
其中所述至少一个免疫调节多肽是包含以下的IL-2变体：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代，并且
其中所述多肽包含两个相同、串联并包含IL-2变体的免疫调节多肽，所述IL-2变体包含i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
方面57.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)或VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且长度为9个氨基酸。
方面58.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)、VVVGACGVGK(SEQ ID NO:181)或VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)，并且长度为10个氨基酸。
方面59.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)、VTGACGVGK(SEQ ID NO:184)或VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)，并且长度为9个氨基酸。
方面60.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽具有氨基酸序列VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)、VTVGACGVGK(SEQ ID NO:187)或VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)，并且长度为10个氨基酸。
方面61.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面62.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面63.如方面56所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽是VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面64.一种T细胞调节多肽，其中所述TMP是包含方面44-53中任一项所述的第一异二聚体和第二异二聚体的同二聚体，
其中所述第一异二聚体和所述第二异二聚体是相同的并且由所述第一异二聚体和所述第二异二聚体的所述Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键共价结合。
方面65.一种T细胞调节多肽，其中所述TMP是包含方面54-63中任一项所述的第一单链TMP和第二单链TMP的同二聚体，
其中所述第一单链TMP和所述第二单链TMP是相同的并且由所述第一TMP和所述第二TMP的所述Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键共价结合。
方面66.一种核酸，所述核酸包含编码方面44-53中任一项所述的第一多肽或第二多肽的核苷酸序列。
方面67.一种核酸，所述核酸包含编码方面54-63中任一项所述的单链TMP的核苷酸序列。
方面68.一种表达载体，所述表达载体包含方面66或67所述的核酸。
方面69.一种选择性地调节对KRAS肽表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面1-65中任一项所述的T细胞调节多肽接触，其中所述接触选择性地调节所述表位特异性T细胞的活性。
方面70.一种在患有KRAS相关癌症的患者中治疗所述癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含根据方面1-65中任一项所述的T细胞调节多肽的药物组合物。
方面71.如方面70所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、肺腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管癌、结肠直肠癌或白血病。
方面72.如方面70或71所述的方法，其中所述施用是静脉内。
方面73.如方面70-72中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者共同施用免疫检查点抑制剂。
方面74.如方面73所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是对PD-L1、PD-1或CTLA4具有特异性的抗体。
方面75.如方面70-74中任一项所述的方法，所述方法还包括施用KRAS(G12C)抑制剂。
方面76.一种调节个体的免疫反应的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的方面1-65中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述施用诱导表位特异性T细胞反应和表位非特异性T细胞反应，其中所述表位特异性T细胞反应与所述表位非特异性T细胞反应的比率为至少2:1。
方面77.一种将免疫调节多肽选择性地递送至靶T细胞的方法，所述方法包括使混合T细胞群体与方面1-65中任一项所述的T细胞调节多肽接触，其中所述混合T细胞群体包含所述靶T细胞和非靶T细胞，其中所述靶T细胞对存在于所述T细胞调节多肽内的所述KRAS表位具有特异性，并且其中所述接触将存在于所述T细胞调节多肽内的所述一个或多个免疫调节多肽递送至所述靶T细胞。
方面78.一种在获自个体的混合T细胞群体中检测结合包含癌症相关突变的KRAS肽的靶T细胞的存在的方法，所述方法包括：a)使所述混合T细胞群体在体外与方面1-65中任一项所述的T细胞调节多肽接触，其中所述T细胞调节多肽包含所述肽表位；以及b)检测响应于所述接触的T细胞活化和/或增殖，其中活化和/或增殖的T细胞指示所述靶T细胞的存在。
方面79.一种检测KRAS特异性T细胞的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
A)使KRAS特异性T细胞与抗原呈递多肽(APP)接触，所述抗原呈递多肽包含：
i)包含对KRAS特异性T细胞上的TCR具有特异性的KRAS表位的KRAS肽；
ii)第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽；
iii)第二MHC多肽；和
iv)可检测标记，以及
B)检测所述标记的存在。
方面80.如方面79所述的方法，其中所述接触步骤在体内进行。
方面81.如方面79所述的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
方面82.根据方面79-81中任一项所述的方法，其中所述APP是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体，并且其中：
a1)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b1)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b3)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽，
其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，任选地包含图3G的氨基酸序列。
方面83.根据方面82所述的方法，
其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)的第一接头连接至所述KRAS肽，其中n是1-10的整数，例如2或3，
其中所述MHC重链多肽包含残基84处的Cys和残基236处的Cys，
其中所述β2M多肽包含残基12处的Cys，
其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，
其中二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接，并且
其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
方面84.根据方面79-81中任一项所述的方法，其中所述APP是包含以下的单链多肽：
i)KRAS肽；
ii)β2-微球蛋白多肽；和
iii)I类MHC重链多肽。
方面85.根据方面84所述的方法，其中所述单链APP从N末端至C末端依次包含：A)i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；和iv)Ig Fc多肽，
其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，任选地包含图3G的氨基酸序列。
方面86.根据方面85所述的方法，
其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)的第一接头连接至所述KRAS肽，其中n是1-10的整数，例如2或3，
其中所述MHC重链多肽包含残基84处的Cys和残基236处的Cys，
其中所述β2M多肽包含残基12处的Cys，
其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，
其中二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接，并且
其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
实施例
提出以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供关于如何制作和使用本公开的完整公开内容和描述，而不旨在限制本发明人认为是其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的所有或仅有实验。已尽力确保所用数值(例如量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有指示，否则份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下(ly)；等。
实施例1：产生KRAS G12V特异性HLA-A11+T细胞和评估其响应于KRAS G12V HLA-
A11 TMP的扩增
从HLA-A11+供体产生T细胞受体(TCR)转导的初级人类T细胞。TCR对KRAS G12V(7-16)肽有反应。评估包含KRAS G12V(7-16)和HLA-A11的TMP扩增KRAS G12V(7-16)特异性、TCR转导的CD8+T细胞的能力。
材料与方法
使用以下TMP：(i)TMP 4074(单链；包含G12V(7-16)作为肽表位)；(ii)TMP 4073(单链；包含G12D(7-16)作为肽表位)；(iii)TMP 4072-4030(分裂链，包含构建体4072和构建体4030的异二聚体；并且包含G12V(7-16)作为肽表位)；和(iv)TMP 4072-4029(分裂链，包含构建体4072和构建体4029的异二聚体；并且包含G12D(7-16)作为肽表位)。TMP包括HLA-A*11:01等位基因重链；β2M多肽；KRAS G12V(7-16)或KRAS G12D(7-16)作为肽表位；亲和力减弱的IL-2变体(IL-2(H16A；F42A))；和人类免疫球蛋白G1(IgG1)片段可结晶(Fc)多肽。
G12D(7-16)肽表位具有氨基酸序列：VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)。G12V(7-16)肽表位具有氨基酸序列：VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)。
4072-4029 TMP是两个异二聚体的同二聚体，每个异二聚体包含：a)4029多肽(图14K)，其是包括以下的“轻链”多肽：i)G12D(7-16)肽；ii)GCGGS(GGGS)2)(SEQ ID NO:584)接头；和iii)包含R12C取代的β2M多肽；和b)4072多肽(图13L)，其是包括以下的“重链”多肽：i)具有Y84C和A236C取代的HLA-A*11:01等位基因重链；ii)具有L234A和L235A取代的IgG1 Fc多肽；和iii)IL2(H16A；F42A)的两个拷贝。重链和轻链多肽是由在以下两者之间形成的两个二硫键连接：i)GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:585)接头中的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的Y84C取代形成的Cys；和ii)由β2M多肽中的R12C取代形成的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的A236C取代形成的Cys。4072-4029 TMP是由各个IgG1 Fc区之间形成的二硫键连接的异二聚体的两个拷贝的同二聚体。4072-4029 TMP在图20中称为“分链链G12DTMP”。
4072-4030 TMP是两个异二聚体的同二聚体，每个异二聚体包含：a)4030多肽(图14Q)，其包括：i)G12V(7-16)肽；ii)GCGGS(GGGS)2)(SEQ ID NO:584)接头；和iii)包含R12C取代的β2M多肽；和b)4072多肽(图13L)，其是包括以下的“重链”多肽：i)具有Y84C和A236C取代的HLA-A*11:01等位基因重链；ii)具有L234A和L235A取代的IgG1 Fc多肽；和iii)IL2(H16A；F42A)的两个拷贝。重链和轻链多肽是由在以下两者之间形成的两个二硫键连接：i)GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:585)接头中的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的Y84C取代形成的Cys；和ii)由β2M多肽中的R12C取代形成的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的A236C取代形成的Cys。4072-4030 TMP是由各个IgG1 Fc区之间形成的二硫键连接的异二聚体的两个拷贝的同二聚体。4072-4030 TMP在图20中称为“分裂链G12V TMP”。
4073TMP是两个单链多肽的同二聚体，每个单链多肽(图19B中所描绘)包含：i)G12D(7-16)肽；ii)GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:585)接头；iii)β2M(R12C)多肽；iv)具有Y84C和A236C取代的HLA-A*11:01等位基因重链；v)具有L234A和L235A取代的IgG1 Fc多肽；和vi)IL2(H16A；F42A)的两个拷贝。两个单链多肽中的每一者可包括在以下两者之间形成的链内二硫键：i)GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:585)接头中的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的Y84C取代形成的Cys；和ii)由β2M多肽中的R12C取代形成的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的A236C取代形成的Cys。两个单链多肽是经由在各个单链多肽中的IgG1 Fc多肽之间形成的二硫键彼此经二硫键键结。4073TMP在图20中称为“单链G12D TMP”。
4074TMP是两个单链多肽的同二聚体，每个单链多肽(图19C中所描绘)包含：i)G12V(7-16)肽；ii)GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:585)接头；iii)β2M(R12C)多肽；iv)具有Y84C和A236C取代的HLA-A*11:01等位基因重链；v)具有L234A和L235A取代的IgG1 Fc多肽；和vi)IL2(H16A；F42A)的两个拷贝。两个单链多肽中的每一者可包括在以下两者之间形成的链内二硫键：i)GCGGS(GGGGS)2(SEQ ID NO:585)接头中的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的Y84C取代形成的Cys；和ii)由β2M多肽中的R12C取代形成的Cys与由HLA-A*11.01重链多肽中的A236C取代形成的Cys。两个单链多肽是经由在各个单链多肽中的IgG1 Fc多肽之间形成的二硫键彼此经二硫键键结。4074TMP在图20中称为“单链G12V TMP”。
用对KRAS G12V(7-16)具有特异性的TCR转导HLA-A11+人类健康供体CD8+T细胞。在自体外周血液单核细胞(PBMC)作为饲养细胞存在下，用含有KRAS G12V(7-16)作为肽表位或含有KRAS G12D(7-16)作为肽表位的TMP刺激经转导的CD8+T细胞。使用对TCR(工程化为TCR)的小鼠恒定区具有特异性的抗体监测TCR转导的T细胞的扩增，并且通过流式细胞术进行评估。
结果
如图20中所描绘，在10天体外测定中，KRAS G12V(7-16)HLA-A11 TMP可以剂量依赖性方式扩增KRAS G12V(7-16)特异性CD8+T细胞，呈CD8+T细胞的百分比(上图)和呈抗原特异性细胞的总数(下图)。作用是表位特异性的，这是因为包含KRAS G12D(7-16)的对照TMP不以剂量依赖性方式诱导扩增。
尽管已参考本公开的特定实施方案来描述本公开，但本领域技术人员应了解，在不背离本发明的真正精神和范围的情况下，可作出各种改变并且可用等效物替换。另外，可作出许多修改以使特定情形、材料、物质组成、过程、一个或多个过程步骤适于本发明的目的、精神和范围。所有此类修改都旨在处于所附权利要求的范围内。
Claims (20)
1.一种T细胞调节多肽(TMP)，所述T细胞调节多肽包含：
i)包含于癌细胞上表达的KRAS表位的KRAS肽，其中所述KRAS肽的长度为至少4个氨基酸；
ii)第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽；
iii)第二MHC多肽；和
iv)至少一个免疫调节多肽，
其中所述第一主要组织相容性复合物(MHC)多肽是β2-微球蛋白多肽；并且其中所述第二MHC多肽是I类MHC重链多肽。
2.根据权利要求1所述的T细胞调节多肽，所述T细胞调节多肽还包含基本上不诱导细胞溶解的Ig Fc多肽，任选地，IgG1 Fc多肽包含一个或多个选自N297A、L234A、L235A、L234F、L235E和P331S的氨基酸取代。
3.如权利要求1或2所述的T细胞调节多肽，其中所述β2M多肽和所述MHC重链多肽是由将所述β2M多肽中的Cys残基与所述MHC重链多肽中的Cys残基连接的二硫键连接，任选地其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys。
4.如权利要求1-3所述的T细胞调节多肽，其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含Cys的第一接头连接至所述KRAS肽，并且其中二硫键将存在于所述第一接头中的Cys与存在于所述MHC重链多肽中的Cys连接，任选地其中所述第一接头包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)，其中n是1-10的整数，例如2或3，并且二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接。
5.如权利要求4所述的T细胞调节多肽，其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述至少一个免疫调节多肽是选自由IL-2、4-1BBL、CD80、CD86或其组合组成的组的活化免疫调节多肽的野生型或变体，任选地其中所述至少一个免疫调节多肽中的至少一者是变体免疫调节多肽，与相应野生型免疫调节多肽对同源共刺激多肽的亲和力相比，所述变体免疫调节多肽对所述同源共刺激多肽展现降低的亲和力。
7.如权利要求6所述的T细胞调节多肽，其中所述至少一个免疫调节多肽是基本上不结合至IL-2Rα并且对IL-2Rβ具有降低的亲和力的IL-2变体，任选地其中所述变体IL-2多肽包含i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
8.如权利要求1-7中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述KRAS肽包含选自由以下组成的组的序列：
A)VVGADGVGK(SEQ ID NO:176)、VVGACGVGK(SEQ ID NO:177)、VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)、VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VVVGACGVGK(SEQ IDNO:181)、VTGADGVGK(SEQ ID NO:182)、VTGAVGVGK(SEQ ID NO:183)、VTGACGVGK(SEQ IDNO:184)、VTVGADGVGK(SEQ ID NO:185)、VTVGAVGVGK(SEQ ID NO:186)和VTVGACGVGK(SEQID NO:187)；并且其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸；
B)VVVGAGDVGK(SEQ ID NO:188)；VVGAGDVGK(SEQ ID NO:189)；VVVGARGVGK(SEQ IDNO:190)；和VVGARGVGK(SEQ ID NO:191)；并且其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸；
C)LVVVGADGV(SEQ ID NO:192)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、LVVVGACGV(SEQ ID NO:194)、KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)、KLVVVGACGV(SEQ IDNO:197)、LLVVGADGV(SEQ ID NO:198)、LLVVGAVGV(SEQ ID NO:199)、LLVVGACGV(SEQ IDNO:200)、FLVVVGADGV(SEQ ID NO:201)、FLVVVGAVGV(SEQ ID NO:202)和FLVVVGACGV(SEQID NO:203)；并且其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸；
D)KLVVVGAGDV(SEQ ID NO:204)；和KLVVVGARGV(SEQ ID NO:205)；其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸；
E)GAGDVGKSAL(SEQ ID NO:206)；AGDVGKSAL(SEQ ID NO:207)；DVGKSALTI(SEQ ID NO:208)；GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)；AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)；YKLVVVGAV(SEQ ID NO:211)；ARGVGKSAL(SEQ ID NO:212)；GARGVGKSAL(SEQ ID NO:213)；EYKLVVVGAR(SEQ ID NO:214)；RGVGKSALTI(SEQ ID NO:215)；LVVVGARGV(SEQ ID NO:216)；GADGVGKSAL(SEQ ID NO:217)；ACGVGKSAL(SEQ ID NO:218)；和GACGVGKSAL(SEQ ID NO:219)；其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸；和
F)VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)、VVVGAVGVGK(SEQ ID NO:180)、VGAVGVGKS(SEQ ID NO:222)、VGAVGVGKSA(SEQ ID NO:223)、AVGVGKSAL(SEQ ID NO:210)、AVGVGKSALT(SEQ ID NO:225)、GAVGVGKSAL(SEQ ID NO:209)、GAVGVGKSA(SEQ ID NO:227)、LVVVGAVGVG(SEQ ID NO:228)、LVVVGAVGV(SEQ ID NO:193)、KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:196)和KLVVVGAVG(SEQ ID NO:231)；其中所述KRAS肽的长度为9个氨基酸或10个氨基酸，或长度为至少9个氨基酸或10个氨基酸。
9.如权利要求1-8中任一项所述的T细胞调节多肽，其中：
A)所述KRAS肽是KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
B)所述KRAS肽是VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)或VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述TMP包含异二聚体，并且其中所述异二聚体包含：
a1)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b1)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)至少一个免疫调节多肽；
ii)I类MHC重链多肽；和
iii)Ig Fc多肽；或
a3)所述第一多肽从N末端至C末端依次包含：
i)所述KRAS肽；和
ii)β2-微球蛋白多肽；和
b3)所述第二多肽从N末端至C末端依次包含：
i)I类MHC重链多肽；和
ii)Ig Fc多肽；和
iii)至少一个免疫调节多肽；并且
其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，任选地包含图3G的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的异二聚T细胞调节多肽，其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)的第一接头连接至所述KRAS肽，其中n是1-10的整数，例如2或3，
其中所述MHC重链多肽包含残基84处的Cys和残基236处的Cys，
其中所述β2M多肽包含残基12处的Cys，
其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，
其中二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接，
其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述至少一个免疫调节多肽是包含以下的IL-2变体：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代，并且
其中所述多肽包含两个相同、串联并包含IL-2变体的免疫调节多肽，所述IL-2变体包含i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
12.如权利要求10或11所述的异二聚T细胞调节多肽，其中
A)所述KRAS肽是KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
B)所述KRAS肽是VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)或VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求1-9中任一项所述的T细胞调节多肽，其中所述TMP是包含以下的单个多肽链：
i)包含于癌细胞上表达的KRAS表位的KRAS肽，其中所述KRAS肽的长度为至少4个氨基酸；
ii)β2-微球蛋白多肽；
iii)I类MHC重链多肽；和
iv)至少一个免疫调节多肽。
14.如权利要求13所述的单链T细胞调节多肽，所述单链T细胞调节多肽从N末端至C末端依次包含：
i)KRAS肽；ii)β2M多肽；iii)I类MHC重链多肽；iv)Ig Fc多肽；和v)一个或多个免疫调节多肽，
其中所述Ig Fc多肽是基本上不诱导细胞溶解的人类IgG1 Fc多肽，任选地包含图3G的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的单链T细胞调节多肽，其中所述β2-微球蛋白多肽是由包含序列CGGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:142)或GCGGS(GGGGS)n(SEQ ID NO:140)的第一接头连接至所述KRAS肽，其中n是1-10的整数，例如2或3，
其中所述MHC重链多肽包含残基84处的Cys和残基236处的Cys，
其中所述β2M多肽包含残基12处的Cys，
其中所述β2M多肽的氨基酸残基12处的Cys经二硫键键结至所述MHC重链多肽的氨基酸残基236处的Cys，
其中二硫键将所述接头中的Cys与取代所述MHC重链多肽的Tyr84的Cys连接，
其中所述β2M多肽是由(GGGGS)n接头连接至所述MHC重链多肽，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如n＝3或7，
其中所述MHC重链多肽包含与选自由HLA-A*0201多肽、HLA-A*1101多肽、HLA-A*3303多肽和HLA-A*2401多肽组成的组的HLA-A多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，
其中所述至少一个免疫调节多肽是包含以下的IL-2变体：i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代，并且
其中所述多肽包含两个相同、串联并包含IL-2变体的免疫调节多肽，所述IL-2变体包含i)H16A取代和F42A取代；或ii)H16T取代和F42A取代。
16.根据权利要求15所述的单链T细胞调节多肽，其中
A)所述KRAS肽是KLVVVGADGV(SEQ ID NO:195)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A*0201多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或
B)所述KRAS肽是VVVGADGVGK(SEQ ID NO:179)或VVGAVGVGK(SEQ ID NO:178)，并且所述MHC重链多肽包含与HLA-A11*01多肽具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
17.一种T细胞调节多肽，其中所述TMP是包含权利要求10-12中任一项所述的第一异二聚TMP和第二异二聚TMP或权利要求13-16中任一项所述的第一单链TMP和第二单链TMP的同二聚体，其中所述第一异二聚体和所述第二异二聚体是相同的并且是由所述第一异二聚体和所述第二异二聚体的所述Ig Fc多肽之间的一个或多个二硫键共价结合。
18.一种核酸，所述核酸包含编码根据权利要求10-12中任一项所述的异二聚TMP的第一多肽或第二多肽，或根据权利要求13-16中任一项所述的单链TMP的核苷酸序列。
19.一种选择性地调节对KRAS肽表位具有特异性的T细胞的活性的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据方面1-17中任一项所述的T细胞调节多肽接触，其中所述接触选择性地调节所述表位特异性T细胞的活性。
20.一种在患有KRAS相关癌症的患者中治疗所述癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的包含权利要求1-17中任一项所述的T细胞调节多肽的药物组合物，任选地还包括向所述患者共同施用免疫检查点抑制剂，任选地其中所述免疫检查点抑制剂是对PD-L1、PD-1或CTLA4具有特异性的抗体。
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