CN114410708A - 一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1，将发状念珠藻接种到含有氧化石墨烯的液体培养基中，得到培养体系；步骤2，将培养体系在日光灯下进行恒温摇床培养，之后将所得培养液中的胞外多糖依次进行提取和纯化，得到发状念珠藻胞外多糖。本发明通过添加外源物质氧化石墨烯的方式提高了胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性，操作简单易行、污染较少、成本较低，可应用于工业化生产。

Description

一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性 的方法

技术领域

本发明涉及蓝藻活性物质技术领域，具体为一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法。

背景技术

发状念珠藻是一种陆生固氮蓝藻，分布于中国西北或西北部干旱和半干旱的荒漠地带。由于其对特殊环境的适应和进化，形成了耐干旱、耐温差、耐高光、耐碱性和耐紫外辐射等生理特性，其中胞外多糖在保护藻细胞免受极端生境伤害起着重要作用。

胞外多糖是发状念珠藻在细胞表面分泌的一种酸性多糖，主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖和少量葡萄糖醛酸组成。胞外多糖具有多种生物活性，如体外抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎症、抗病毒和免疫调节，可应用食品和医药领域。同时，胞外多糖具有生物絮凝性，可吸附重金属离子，在食品工业和废水处理中具有一定应用价值。

胞外多糖的体外抗氧化活性和生物絮凝性在一定程度上受细胞培养条件的影响，如温度、光照和营养元素，同时也受盐胁迫影响。目前生产得到的发状念珠藻胞外多糖存在体外抗氧化活性和生物絮凝性较低和成本较高的问题。

发明内容

针对现有技术中胞外多糖生物活性低和生产成本高的问题，本发明提供一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，通过添加外源物质氧化石墨烯的方式提高了胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性，操作简单易行、污染较少、成本较低，可应用于工业化生产。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，包括如下步骤：

步骤1，将发状念珠藻接种到含有氧化石墨烯的液体培养基中，得到培养体系；

步骤2，将培养体系在日光灯下进行恒温摇床培养，之后将所得培养液中的胞外多糖依次进行提取和纯化，得到发状念珠藻胞外多糖。

优选的，步骤1中所述液体培养基中氧化石墨烯的浓度不大于50mg/L。

优选的，步骤2所述的培养体系在恒温摇床培养期间，温度为24-26℃，光强为40-45μmol photons m^-2s^-1。

优选的，步骤2所述的培养体系在恒温摇床培养期间，转速为120-140rpm。

优选的，步骤2所述的培养体系恒温摇床培养10-20天。

优选的，步骤2按如下过程将所得培养液中的胞外多糖依次进行提取和纯化：

将所述的培养液在80-95℃下加热45-75min，得到混合液A，之后将混合液A离心后收集上清液，在上清液中加入乙醇进行沉降，然后将乙醇除去后，剩余溶液冷冻干燥，得到粗胞外多糖，使用Sevage溶液除去粗胞外多糖中的蛋白质，最后将所得的混合物利用层析柱进行纯化。

进一步，使用所述的Sevage溶液按如下过程除去粗胞外多糖中的蛋白质，得到所述的混合物：

按200mg：4mL：1mL的比例，将粗胞外多糖、去离子水和Sevage溶液振荡后静置，分离得到上清液，之后去除上清液中的Sevage溶液，将剩余溶液冷冻干燥，得到所述的混合物。

进一步，按如下过程将所得的混合物利用层析柱进行纯化：

将所得的混合物用去离子水配制成溶液，之后倒入层析柱内，依次加入蒸馏水和NaCl溶液进行洗脱，将洗脱液旋蒸浓缩后进行透析和冷冻干燥，完成所得混合物的纯化，得到发状念珠藻胞外多糖。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明是一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，先将发状念珠藻接种到含有氧化石墨烯(GO)的液体培养基中，在日光灯下进行恒温摇床培养，培养结束后收集培养液进行胞外多糖的提取和纯化，在氧化石墨烯的作用下细胞产生的胞外多糖结构发生改变，经体外清除羟基自由基、DPPH自由基和ABTS⁺自由基以及生物絮凝性实验，表明GO处理的胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性提高，同时该方法促进发状念珠藻胞外多糖的合成，有利于得到大量的活性多糖。另外，通过HPLC和傅里叶红外光谱分别解析了该胞外多糖的单糖组成和官能团信息，为改善藻类多糖生物活性技术提供了参考，增强了其在食品医药领域的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中氧化石墨烯对发状念珠藻细胞生物量影响图。

图2为本发明实施例1中氧化石墨烯对胞外多糖含量影响图。

图3为本发明实施例3中傅里叶红外光谱测定结果图。

图4为本发明实施例4中胞外多糖絮凝活性图。

图5为本发明实施例5中胞外多糖对·OH自由基清除活性图。

图6为本发明实施例5中胞外多糖对DPPH自由基清除活性图。

图7为本发明实施例5中胞外多糖对ABTS⁺自由基清除活性图。

图8为本发明实施例3所述色谱柱的梯度洗脱程序图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

氧化石墨烯是石墨烯氧化的产物，其颜色为棕黄色，表面携带含氧官能团。氧化石墨烯具有优良的物理、化学、光学、电学性质，在太阳能电池、医药、生物技术等领域应用广泛。近年来发现氧化石墨烯在藻类生物技术方面具有一定的应用潜力。因此，本发明是一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，包括如下步骤：

步骤(1)，将生长状态良好的发状念珠藻接种到装有100mL BG11液体培养基的玻璃三角瓶中。

步骤(2)，在步骤(1)得到的培养液中加入氧化石墨烯水溶液，使氧化石墨烯的浓度不大于50mg/L，按照步骤(3)的方式进行摇床培养。

步骤(3)，将步骤(2)得到的培养液在LED日光灯和恒温光照室下摇床培养10-20天，转速为120-140rpm，光照强度为40-45μmol photons m^-2s^-1，温度为24-26℃，将所得培养液中的胞外多糖进行提取和纯化，得到发状念珠藻胞外多糖。

实施例1

发状念珠藻的细胞生物量和胞外多糖含量测定，包括如下步骤：

步骤(1)，将生长状态良好的发状念珠藻接种到装有100mL BG11液体培养基的玻璃三角瓶中，初始OD₇₃₀为0.20。

步骤(2)，在步骤(1)得到的培养液中加入氧化石墨烯水溶液(超声分散30min)，使氧化石墨烯的浓度为15mg/L，按照步骤(3)的方式进行摇床培养。

步骤(3)，将步骤(2)得到的培养液在LED日光灯和恒温光照室下摇床培养16天，转速为130rpm，光照强度为40μmol photons m^-2s^-1，温度为25℃。

步骤(4)，按图1所示的时间点对步骤(3)得到的培养液进行取样，取10mL培养液6000rpm离心20min收集样品，冷冻干燥，测定发状念珠藻的细胞生物量。

步骤(5)，按图2所示的时间点对步骤(3)得到的培养液进行取样，取10mL培养液，95℃水浴加热60min进行胞外多糖提取，之后6000rpm离心10min，取1mL上清液，将其和1mL去离子水加入到10mL具塞试管中，依次加入1mL质量分数为6％的苯酚水溶液和5mL浓硫酸，冷却至室温，在490nm处测定吸光度，空白对照为水，根据标准曲线计算胞外多糖含量。

从图1的氧化石墨烯对发状念珠藻细胞生物量影响图可以看到，氧化石墨烯促进了发状念珠藻的细胞生物量，第16天时，生物量增加了11.1％。

从图2的氧化石墨烯对胞外多糖含量影响图可以看到，氧化石墨烯促进了发状念珠藻的胞外多糖含量，第16天时，胞外多糖含量增加了36.1％。

实施例2

发状念珠藻的胞外多糖提取和纯化，包括如下步骤：

步骤(1)，收集实施例1步骤(3)第16天剩余的培养液，95℃水浴加热60min进行胞外多糖提取，6000rpm离心10min，收集上清液，加入质量分数为80％的乙醇水溶液，4℃过夜沉降，之后用旋转蒸发器将溶液中的乙醇蒸出，剩余溶液冷冻干燥得到粗胞外多糖。

步骤(2)，将步骤(1)得到的粗胞外多糖除去蛋白，具体是将200mg粗多糖溶于4mL去离子水后添加1mL的Sevage溶液(即正丁醇：氯仿的体积比为＝1:4)，于密闭容器中剧烈振荡10-15min，弃去中间层的变性蛋白以及下层的氯仿得到上清液。用旋转蒸发器将上清液中多余的Sevage溶液蒸出，剩余溶液冷冻干燥后备用。

步骤(3)，将步骤(2)得到的胞外多糖进一步纯化，具体是将其用去离子水溶解，配制成10mg/mL的溶液，倒入DEAE-52层析柱内，依次加入体积均2L的蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液、0.2mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液、0.4mol/L NaCl溶液、0.6mol/L NaCl溶液、0.8mol/L NaCl溶液和1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，流速为1mL/min，采用自动收集器收集，每管收集10mL，之后取1mL采用苯酚-硫酸法对每管收集的洗脱液进行胞外多糖含量的测定，剩余洗脱液进行旋蒸浓缩，于普通透析袋(8-140kDa)中透析48h，冻干备用。

步骤(4)，将步骤(3)得到的胞外多糖配制成10mg/mL溶液，倒入Sephadex G-100凝胶柱内，以去离子水为洗脱液，流速为1mL/min，采用自动收集器收集，每管收集10mL，采用苯酚-硫酸法进行胞外多糖含量的跟踪检测，在490nm处测定吸光值，证明DEAE-52层析柱纯化胞外多糖是均一组分。

步骤(5)，将步骤(3)得到的胞外多糖配制成1mg/mL溶液，转入石英比色皿中，在200-400nm波段下进行紫外全波长扫描，每隔1nm检测一次，证明胞外多糖中不含有杂质核酸和蛋白质。

实施例3

发状念珠藻的胞外多糖结构表征，包括如下步骤：

1、HPLC分析

步骤(1)，取16种单糖标准品(岩藻糖、盐酸氨基半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成标准溶液母液。取各单糖标准溶液母液精密配置浓度标准品作为混标，每种单糖浓度分别为5mg/L(岩藻糖)、3mg/L(盐酸氨基半乳糖)、5mg/L(鼠李糖)、3.7mg/L(阿拉伯糖)、5mg/L(盐酸氨基葡萄糖)、5mg/L(半乳糖)、5mg/L(葡萄糖)、5mg/L(N-乙酰-D氨基葡萄糖)、5mg/L(木糖)、5mg/L(甘露糖)、15mg/L(果糖)、10mg/L(核糖)、5mg/L(半乳糖醛酸)、5mg/L(葡萄糖醛酸)、10mg/L(古罗糖醛酸)、10mg/L甘露糖醛酸，按照步骤(2)的IC分析过程得到每个单糖浓度对应的峰面积。

步骤(2)，精密称量实施例2步骤3得到的10mg胞外多糖样品置于安瓿瓶中，加入10mL 3M的三氟乙酸(TFA)水溶液，在120℃水解3h。准确吸取水解后的溶液转移至离心管中并用氮气吹干，加入10mL去离子水涡旋混匀，取100μL加入900μL去离子水，12000rpm离心5min。取上清液进IC分析。

色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(规格为3mm×150mm)；流动相：A：H₂O；B:15mMNaOH；C:100mM NaOAC；梯度洗脱程序如图8所示。流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器，得到胞外多糖中各个单糖的色谱法面积A。

每个单糖的浓度计算方法如下：

C_标准品/A_标准品＝C_样品/A_样品，浓度单位为mg/L。

根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。

2、傅里叶红外光谱分析

称取1mg实施例2步骤3得到的胞外多糖样品，加入100mg KBr混匀研磨进行压片，在400-4000cm^-1进行检测。

表1 HPLC测定结果

从表1可以看出，胞外多糖是由8种单糖组成，包括葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、盐酸氨基半乳糖和盐酸氨基葡萄糖，经GO处理后葡萄糖、半乳糖和木糖比例提高，其他比例降低。

从图3傅里叶红外光谱测定结果图可以看到，两种胞外多糖都含有多糖类典型吸收峰，Control(对照)组分别在3455cm^-1和2922cm^-1处，GO处理组分别在3454cm^-1和2942cm^-1处；胞外多糖在1639cm^-1(Control和GO)处是羧基吸收峰；胞外多糖在1382cm^-1(G和GO)的吸收峰是C-H的伸缩振动引起；胞外多糖在1110cm^-1(Control)和1116cm^-1(GO)处的吸收峰证明存在吡喃环；胞外多糖在830cm^-1(Control)和834cm^-1(GO)处的吸收峰证明存在α-糖苷键；胞外多糖在872cm^-1(Control)、874cm^-1(GO)处的吸收峰证明存在β-糖苷键；GO处理的胞外多糖在708cm^-1的吸收峰是C＝O引起的，Control组在此处无吸收峰；GO处理的胞外多糖在623cm^-1的吸收峰是C-H面外弯曲振动引起的，Control组在此处无吸收峰。以上结果说明，GO处理后，胞外多糖的官能团发生了改变。

实施例4

胞外多糖生物絮凝活性的测定，包括如下步骤：

步骤(1)，将99mL 2g/L高岭土(400目)水溶液、0.5mL 10％CaCl₂水溶液和0.5mL不同浓度实施例2步骤3得到胞外多糖溶液混合均匀，得到100mL体系，胞外多糖浓度分别为0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L。

步骤(2)，将步骤(1)所制备的混合物分别在150rpm下旋转30min，然后静置30min。

步骤(3)，在步骤(2)得到的混合物中分别取2mL上清液，在550nm处测量吸光度。用去离子水代替胞外多糖溶液做空白对照(b)。絮凝活性计算公式如下：

絮凝活性＝1/OD₅₅₀-1/(OD₅₅₀)_b

其中OD是吸光度值。

从图4胞外多糖絮凝活性图可以看到，GO处理的胞外多糖絮凝性活性提高，当胞外多糖浓度为50mg/L时，絮凝活性提高了51.7％。

实施例5

胞外多糖体外抗氧化活性测定，包括如下步骤：

1、羟基自由基清除试验

吸取不同浓度的实施例2步骤3得到的胞外多糖溶液1mL加入试管中，胞外多糖浓度分别为0.4mg/L、1.0mg/L、1.6mg/L、2mg/L和2.5mg/L，随后分别加入1mL 9mmol/L FeSO₄溶液和1mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，最后加入1mL 8.8mmol/L H₂O₂水溶液启动反应，混匀后37℃反应30min后离心(12000rpm，10min)，在510nm处测定吸光度值，以水做空白对照，羟自由基清除率计算公式如下：

清除率(％)＝[1-(A₀-A)/A₀]×100％

A是胞外多糖反应溶液的吸光度；A₀是空白的吸光度(用水做空白对照)。

2、DPPH自由基清除试验

吸取0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液2mL置于10mL试管中，取不同浓度的实施例2步骤3得到的胞外多糖溶液2mL加入试管中，胞外多糖浓度分别为0.4mg/L、1.0mg/L、1.6mg/L、2mg/L和2.5mg/L，摇匀后暗处反应30min，于517nm处测定吸光度值A₁，以无水乙醇作为空白参比。DPPH清除率计算公式如下：

清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀]×100％

A₁为样品溶液在517nm的吸光度值；A₂为以无水乙醇代替DPPH乙醇溶液在517nm下的吸光度值；A₀为以无水乙醇代替胞外多糖溶液在517nm的吸光度值。

3、ABTS⁺自由基清除试验

分别取1mL 7.4mmol/L ABTS二胺盐溶液和1mL 4.9mmol/L过硫酸钾(K₂S₂O₈)溶液混合后黑暗环境放置16h，之后将形成的混合物用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.4)稀释直至734nm处的吸光度为0.5-0.9，得到稀释的ABTS⁺溶液。

分别取1mL不同浓度的实施例2步骤3得到的胞外多糖溶液与3mL稀释的ABTS⁺溶液混合，胞外多糖溶液的浓度分别为0.4mg/L、1.0mg/L、1.6mg/L、2mg/L和2.5mg/L，之后在黑暗中放置6min，然后在734nm处测量吸光度。ABTS⁺清除率计算公式如下：

ABTS⁺清除率(％)＝[1-(A-A₀)/A₁]×100

其中A是反应液的吸光度，A₀是背景(磷酸盐缓冲液代替ABTS⁺)的吸光度，A₁是空白(去离子水代替胞外多糖溶液)的吸光度。

从图5胞外多糖对·OH自由基清除活性图可以看到，两种胞外多糖清除·OH自由基活性提高，当胞外多糖浓度为2.5g/L时，GO处理后胞外多糖清除活性提高了32.9％。

从图6胞外多糖对DPPH自由基清除活性图可以看到，两种胞外多糖清除DPPH自由基活性提高，当胞外多糖浓度为2.5g/L时，GO处理后胞外多糖清除活性提高了57.8％。

从图7胞外多糖对ABTS⁺自由基清除活性图可以看到，两种胞外多糖清除ABTS⁺自由基活性提高，当多糖浓度为2.5g/L时，GO处理后多糖清除活性提高了21.2％。

Claims (8)

1.一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将发状念珠藻接种到含有氧化石墨烯的液体培养基中，得到培养体系；

步骤2，将培养体系在日光灯下进行恒温摇床培养，之后将所得培养液中的胞外多糖依次进行提取和纯化，得到发状念珠藻胞外多糖。

2.根据权利要求1所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，步骤1中所述液体培养基中氧化石墨烯的浓度不大于50mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，步骤2所述的培养体系在恒温摇床培养期间，温度为24-26℃，光强为40-45μmol photons m^-2s^-1。

4.根据权利要求1所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，步骤2所述的培养体系在恒温摇床培养期间，转速为120-140rpm。

5.根据权利要求1所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，步骤2所述的培养体系恒温摇床培养10-20天。

6.根据权利要求1所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，步骤2按如下过程将所得培养液中的胞外多糖依次进行提取和纯化：

将所述的培养液在80-95℃下加热45-75min，得到混合液A，之后将混合液A离心后收集上清液，在上清液中加入乙醇进行沉降，然后将乙醇去除，剩余溶液冷冻干燥，得到粗胞外多糖，使用Sevage溶液除去粗胞外多糖中的蛋白质，最后将所得的混合物利用层析柱进行纯化。

7.根据权利要求6所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，使用所述的Sevage溶液按如下过程除去粗胞外多糖中的蛋白质，得到所述的混合物：

按200mg：4mL：1mL的比例，将粗胞外多糖、去离子水和Sevage溶液振荡后静置，分离得到上清液，之后去除上清液中的Sevage溶液，将剩余溶液冷冻干燥，得到所述的混合物。

8.根据权利要求7所述的一种提高发状念珠藻胞外多糖体外抗氧化活性和生物絮凝性的方法，其特征在于，按如下过程将所得的混合物利用层析柱进行纯化：

将所得的混合物用去离子水配制成溶液，之后倒入层析柱内，依次加入蒸馏水和NaCl溶液进行洗脱，将洗脱液旋蒸浓缩后进行透析和冷冻干燥，完成所得混合物的纯化，得到发状念珠藻胞外多糖。

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