CN114410666A

CN114410666A - 一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1及其编码产物和应用

Info

Publication number: CN114410666A
Application number: CN202111627092.2A
Authority: CN
Inventors: 彭华胜; 杨正阳; 赵玉姣; 程铭恩; 尹旻臻; 童珍珍; 方清影
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS; Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS; Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-29

Abstract

本发明涉及一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1及其编码产物和应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；该基因的编码产物氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所提供的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1是首次从何首乌植物中克隆制备所得。何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1是何首乌黄酮类化合物合成途径的关键调控基因，可用于调节何首乌的黄酮类化合物含量，该酶可以应用于以对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物制备柚皮素。

Description

一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1及其编码产物和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1及其编码产物和应用。

背景技术

药用植物何首乌为蓼科植物何首乌Falopia multiflora(Thunb.)Harald.的干燥块根，味苦、甘、涩，归肝、肾二经，有清热解毒、润肠通便、滋补肝肾、强筋壮骨、乌须发等功效。何首乌中有效成分有二苯乙烯类、蒽醌类、黄酮类和酚类等；药理活性研究表明这些成分具有抗氧化、抗肿瘤、抑制细胞凋亡、抗缺血性脑损伤、促进骨形成和保护成骨细胞、抗脂质过氧化活性、神经保护、肝损伤保护以及改善血管功能和增强学习记忆能力等作用。

黄酮类化合物是何首乌中重要的一类次生代谢产物，查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)是催化黄酮类化合物生物合成过程的关键酶。然而，关于何首乌中黄酮类合成途径的生物合成基因还未被分离和鉴定。

发明内容

针对上述问题，本发明对何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1进行研究，为通过基因工程技术提高何首乌黄酮类活性成分的含量提供重要技术支持。

本发明采用以下技术方案：

一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

一种如上述所述的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1编码的产物，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种含有如权利要求1所述的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体以基因FmCHS1的cDNA为模板，如SEQ ID NO：3-4所示的引物，进行PCR扩增；将PCR产物和FmCHS1表达载体进行单酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌获得重组表达载体pET-32a-FmCHS1。

一种如上述所述的基因FmCHS1或上述所述的重组表达载体在制备黄酮类化合物中的应用。

进一步地，所述应用包括在细胞中转入所述何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1或利用何首乌查尔酮合酶促进黄酮类化合物的合成。

进一步地，所述黄酮类化合物为柚皮素。

本发明的有益效果如下：本发明所提供的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1是首次从何首乌植物中克隆制备所得。何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1是何首乌黄酮类化合物合成途径的关键调控基因，可用于调节何首乌的黄酮类化合物含量，该酶可以应用于以对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为底物制备柚皮素。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高何首乌黄酮类成分的含量，该技术可以用于后续通过在菌体系产生大量的黄酮类化合物，对于满足巨大市场对黄酮类化合物的需求提供有效方法。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。

图1为何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1结构功能域预测分析；

图3为何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1二级结构预测分析；

图4为何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1跨膜结构域预测；

图5为何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1三级结构预测分析；

图6为何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1系统进化树；

图7为何首乌查尔酮合酶FmCHS1蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

图8为柚皮素对照品的MRM色谱图；

图9为何首乌查尔酮合酶FmCHS1催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A产物的MRM色谱图；

图10为pET-32a空载体催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A产物的MRM色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验中使用的试剂盒如反转录试剂盒PrimeScript^TMII 1st Strand cDNASynthesis Kit购自Takara Bio公司；无毒型4S Green Plus核酸染料购于上海生工生物工程股份有限公司；切胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、T载体pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、原核表达感受态细胞BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；高保真酶

High-FidelityPCR Master Mix with HF Buffer、BamH I限制性内切酶等购自纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

一、何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的克隆

何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的克隆利用正向引物：上游引物：FmCHS1-F：5'-ATGGCGACGTCAGTGCAGGAGATAA-3'；下游引物：FmCHS1-R：5'-TCAGTTAGCTACGGGAACACTATGT-3'。以何首乌查尔酮合酶FmCHS1编码基因全长序列为模板进行PCR扩增。扩增体系(50μL)如下：2×Phusion Master Mix为25μL，引物primer-F和引物primer-R各2.5μL，模板cDNA 1μL，其余用无菌双蒸水补足。反应条件：98℃预变性2min、98℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸2min、40个循环后72℃延伸5min、4℃保存。至此获得了何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的克隆。何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，图1中M为Marker，泳道1为目的基因。目的基因FmCHS1片段大小约为1200bp，符合预期。

二、何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的生物信息学分析

本发明实施例中所获得的何首乌查尔酮合酶基因全长cDNA，基因Fm CHS1的开放阅读框(ORF)的长度为1179bp，其序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。根据FmCHS1全长cDNA编码392个氨基酸，详细序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。将FmCHS1基因序列用NCBI数据库中的BL AST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDStranslation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，该基因在氨基酸水平上与其他物种中的CHS有较高的同源性，如图2所示；FmCHS1蛋白二级结构由α螺旋，延伸链和无规则卷曲，如图3所示；FmCHS1无跨膜结构，为膜外蛋白，如图4所示；利用Swiss Model预测蛋白质的三级结构，如图5所示，以1jwx.1.A蛋白模型，FmCH S1蛋白序列的相似性为82.17％；用MEGA6软件构建Neighbor-joining系统进化树，如图6所示，何首乌FmCHS1氨基酸序列与蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Siebold et Zucc.)CHS4氨基酸序列位于同一分支点，其亲缘关系最高。

三、何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1原核表达载体的构建

1、选取BamH I作为酶切位点，对FmCHS1和pET32a载体进行限制性酶切及连接反应，构建pET32a-FmCHS1基因表达载体；

2、分别将pET32a空载体和pET32a-FmCHS1转化至大肠杆BL21(DE3)的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有100mg/L Amp的LB固体培养基中筛选阳性克隆。挑选阳性单克隆菌落并接种于含100mg/L Amp的LB液体培养基中，培养过夜；再将培养液按1:100进行扩大培养，待菌液OD₆₀₀达到0.4-0.6之间时，加入0.8mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，于16℃低温摇床中避光诱导12h，转速设置为200r/min，得到大量表达的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的菌液；

3、将诱导表达的菌液在4℃、5000×g转速条件下离心10min，弃去上清，加入5mLHis Buffer A(20mM Na₃PO₄·12H₂O、500mM NaCl、20mM咪唑)重悬，5000×g转速条件下离心10min，再次弃去上清，取出立即置于冰上冷却。加3mL Buffer A重悬，于冰上超声破碎。超声破碎后在4℃、10000×g转速条件下离心15min，分别取50μL上清进行12％SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中丙烯酰胺浓度为12％)分析。现在80V电压条件下电泳20min，再在120V电压条件下电泳150min，电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染色1h，再用脱色液脱色2h至条带清晰，观察结果并扫描保存胶图，如图7所示，图7中，M表示Protein Marker，1为pET-32a空载体，2为未诱导的FmCHS1，3为FmCHS1上清液；电泳结果表明与pET-32a空载相比，含有FmCHS1基因重组蛋白超声破碎后的上清在53.10kDa处出现明显的目的蛋白条带，符合预期FmCHS1蛋白分子量大小。

四、体外酶功能验证

在2mL的离心管中中配制500μL反应体系，反应体系包括280μM丙二酰辅酶A、150μM对香豆酰辅酶A、100μL粗酶(蛋白上清)和0.1M磷酸钾缓冲液，总体系500μL酶促反应条件为：30℃水浴反应60min后，用250μL乙酸乙酯萃取，12000rpm转速条件下离心10min后取上清(乙酸乙酯重复萃取3次)。氮吹仪吹干后，用100μL质谱甲醇溶解。采用分析平台为ABSciex QTRAP 5500三重四极杆-线性离子肼串联质谱仪，分析色谱柱为ACQUITY

BEH C18 1.7μm 2.1×100mm柱对产物和标准品柚皮素进行分析。

色谱分析条件为：流动相：0.1％甲酸水-A相，乙腈-B相；梯度洗脱：在0～1min时间段内，采用5％B相洗脱；在1～2min时间段内，采用5％～50％B相洗脱；在2～3min时间段内，采用50％～75％B相洗脱；在3～4min时间段内，采用90％～95％B相洗脱；在4～5min时间段内，采用5％B相洗脱。柱温40℃；流速0.4mL/min；进样量5μL。

质谱分析条件为：负离子化模式下，采取多反应监测(MRM)检测，喷雾气(Gas1)为45psi，加热辅助气(Gas2)为45psi，气帘气为40psi，柚皮素检测离子对质荷比(m/z)为271/151，去簇电压(DP)为-138V和碰撞电压(CE)为-24.5V。

图8示出了柚皮素对照品的MRM色谱图，从图8的分析结果可以看出：柚皮素的保留时间为2.34min，图9为FmCHS1催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A产物的MRM色谱图，从图9的分析结果可以看出：FmCHS1催化样品在保留时间为2.34min存在与柚皮素保留时间一致的特征峰；图10为pET-32a空载体催化对香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A产物的MRM色谱图，从图10的分析结果可以看出：pET-32a空载体催化样品在保留时间为2.34min没有存在与柚皮素保留时间一致的特征峰。

LC-MS(液相色谱质谱联用)结果如图9所示，pET-32a-FmCHS1可以将一分子的对香豆酰辅酶A和三分子的丙二酰辅酶A转化为柚皮素(其质荷比m/z为271/151)，因此可以认定pET-32a-FmCHS1具有催化一分子的对香豆酰辅酶A和三分子的丙二酰辅酶A合成柚皮素的活性。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 安徽中医药大学

中国中医科学院中药研究所

<120> 一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1及其编码产物和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgacgt cagtgcagga gataaggaag gctcaaaggg cggaggggcc ggccacggtg 60

ctggcgatcg ggacggccac cccgcccaac tgcgtctacc aggccgacta ccctgactac 120

tacttcaggg tcaccaacag cgaacacatg accgatttga aggaaaagtt caggcgcatg 180

tgcgacaaat cacagattga gaagcgttac atgcacctga ctgaggaaat cctgaagcaa 240

aaccccaaca tgtgcgaata catggcgccg tctctagact cgaggcaaga catggtggtg 300

agtgaggtgc ccaagctcgg caaagaagct gctcagaagg ccatcaagga gtggggccag 360

cccaagtcca agatcaccca cgtcatcatg tgcaccacct ccggcgttga catgcccggc 420

gctgattacc aactcaccaa gctcctcggc cttcgccctt ccgtcaagcg cttcatgatg 480

taccaacaag gctgctttgc tggtgggacc gtgctgcgta tggcaaaaga cctcgccgag 540

aacaacaagg gcgcccgtgt cctcgtcgtg tgctccgaga tcaccgcggt atgcttccgt 600

gggccaaccg acactcatct ggactccatg gtgggacagg ccctgttcgg tgacggggcc 660

ggagcagtca tagtgggggc ggacccggac ctctccatcg agaagcccat cttcgagctc 720

gtttggacgg cccaaaccat cctacccgac tcagagggcg caatcgacgg ccacttgcgt 780

gaagtcgggc tcaccttcca cttgctcaag gacgtccccg ggctaatctc gaagaacatc 840

gagaagagcc ttgtggaggc gttctcgcct ctcgaggtta gtgattggaa ctcactcttc 900

tgggtcgccc acccgggtgg ccccgctatc cttgaccagg tcgaggcgaa gcttgggctc 960

aaggaggaga agctcaaggc gactaggcaa gtgttgaatg actatggaaa catgtcgagc 1020

gcgtgtgttt tgtttatcat ggatgagatg aggaggaagt cgctccagaa cggccacgct 1080

accaccgggg aaggtttgga gtggggtgtg ttgtttgggt tcgggcccgg gcttacggtt 1140

gagaccgttg ttctacatag tgttcccgta gctaactga 1179

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Thr Ser Val Gln Glu Ile Arg Lys Ala Gln Arg Ala Glu Gly

1 5 10 15

Pro Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Pro Asn Cys Val

20 25 30

Tyr Gln Ala Asp Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Val Thr Asn Ser Glu

35 40 45

His Met Thr Asp Leu Lys Glu Lys Phe Arg Arg Met Cys Asp Lys Ser

50 55 60

Gln Ile Glu Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Gln

65 70 75 80

Asn Pro Asn Met Cys Glu Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Ser Arg Gln

85 90 95

Asp Met Val Val Ser Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Gln

100 105 110

Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Val

115 120 125

Ile Met Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln

130 135 140

Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Phe Met Met

145 150 155 160

Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Met Ala Lys

165 170 175

Asp Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser

180 185 190

Glu Ile Thr Ala Val Cys Phe Arg Gly Pro Thr Asp Thr His Leu Asp

195 200 205

Ser Met Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Gly Ala Val Ile

210 215 220

Val Gly Ala Asp Pro Asp Leu Ser Ile Glu Lys Pro Ile Phe Glu Leu

225 230 235 240

Val Trp Thr Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala Ile Asp

245 250 255

Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val

260 265 270

Pro Gly Leu Ile Ser Lys Asn Ile Glu Lys Ser Leu Val Glu Ala Phe

275 280 285

Ser Pro Leu Glu Val Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Val Ala His

290 295 300

Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Ala Lys Leu Gly Leu

305 310 315 320

Lys Glu Glu Lys Leu Lys Ala Thr Arg Gln Val Leu Asn Asp Tyr Gly

325 330 335

Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Met Asp Glu Met Arg Arg

340 345 350

Lys Ser Leu Gln Asn Gly His Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp

355 360 365

Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val

370 375 380

Leu His Ser Val Pro Val Ala Asn

385 390

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggccatggc tgatatcgga atggcgacgt cagtgcagga gataa 45

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgacggagct cgaattcgga tcagttagct acgggaacac tatgt 45

Claims

1.一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1，其特征在于，该基因FmCHS1核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种如权利要求1所述的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1编码的产物，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有如权利要求1所述的何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以基因FmCHS1的cDNA为模板，如SEQ ID NO：3-4所示的引物，进行PCR扩增；将PCR产物和FmCHS1表达载体进行单酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌获得重组表达载体pET-32a-FmCHS1。

5.权利要求1所述的基因FmCHS1或权利要求3-4任一项所述的重组表达载体在制备黄酮类化合物中的应用。

6.如权利要求5所述的一种何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1在制备黄酮类化合物中的应用，其特征在于，包括在细胞中转入所述何首乌查尔酮合酶基因FmCHS1或利用何首乌查尔酮合酶促进黄酮类化合物的合成。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物为柚皮素。