CN114410544A - 桂林不动杆菌hzjk-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生防菌制备技术领域，具体涉及一种桂林不动杆菌HZJK‑2及其应用，所述桂林不动杆菌HZJK‑2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22143，该桂林不动杆菌HZJK‑2菌株及其培养物、挥发物或其加工物对防治石榴颈枯病的效果优越，且对石榴正常生长没有影响。

Description

桂林不动杆菌HZJK-2及其应用

技术领域

本发明属于生防菌制备技术领域，具体涉及一种桂林不动杆菌HZJK-2及其应用。

背景技术

石榴(Punica granatum)石榴科石榴属的一种经济树种，石榴具有实用、药用、观赏等价值，石榴各组织器官含有不同的生物活性物质，具有保健功能。近年来人们逐步发现了更多石榴应用价值，又因其适应环境能力较强、好栽培、容易管理、经济效益高而被广泛种植，石榴栽培面积也不断扩大。目前造成云南省会泽县娜姑镇石榴产业损失最严重的是石榴颈枯病，其病原为棒孢拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum。该病是一种土传真菌病害，表现为根颈部腐烂，石榴树吸收水分和养分的功能逐渐减弱，整株株根际土发黄枯萎，最后全株死亡，造成巨大经济损失。发病轻的石榴树根颈部地上部分0～ 20cm处部分树皮变褐，后期根颈部腐烂表皮呈乱麻状开裂，露出木质部。树势生长衰弱，遇大风树枝无法承受便容易倒伏，挂果率极低。发病重的石榴树根颈部树皮一周腐烂，地上部植株全部死亡，造成严重经济损失。

随着化学农药的长期使用，一些病虫害已形成较强的抗性，一些病虫害猖獗。许多化学农药严重污染水体、空气和土壤，对人体健康有害。科学利用生防菌，以菌防菌，以菌治菌，通过安全环保的方法进行病害防治，符合绿色发展的理念。因此筛选分离出一种防治石榴颈枯病，同时对环境、人类无害的生物菌株是有必要的。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种桂林不动杆菌HZJK-2，用以防治石榴颈枯病。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种桂林不动杆菌HZJK-2，该桂林不动杆菌菌株HZJK-2分类命名为Acinetobacter guillouiae，保藏编号CGMCC No.22143,该菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，于2021年4月7日收到并登记入册，且该生物材料由保藏中心于2021年4月7日检测，结果为存活，桂林不动杆菌菌株HZJK-2属于细菌界，细菌门，细菌纲，假单胞目、莫拉菌科，不动杆菌属。

进一步的，本发明还提供了一种生防菌剂，其活性成分桂林不动杆菌HZJK-2 及其培养物、挥发物或其加工物。

本发明所提供的桂林不动杆菌HZJK-2菌株对防治石榴颈枯病的效果优越，且对石榴正常生长没有影响。

本发明所提供的桂林不动杆菌HZJK-2菌株在对峙培养的第3天即可观察到石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)和小新壳梭孢(Neofusicoccwn parvum)受到抑制，且抑制效果明显。

本发明提供的桂林不动杆菌HZJK-2菌株易于获得，培养时间短，有利于大规模生产和推广应用。

附图说明

图1为实施例1中桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae系统发育树分析显示图；

图2为实施例2中桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2 对石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora

图3为实施例2中桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2 对石榴颈枯病病原菌小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum拮抗效果图；

图4为实施例3中桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2 挥发性气体对石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum的抑制效果雷达显示图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的桂林不动杆菌菌株HZJK-2分类命名为(Acinetobacterguillouiae)，保藏编号CGMCC No.22143,该菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称：CGMCC。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)，于2021年4月7日收到并登记入册，且该生物材料由保藏中心于2021年4月7日检测，结果为存活。

下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)菌株HZJK-2的获得、鉴定与保藏。

(1)桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)菌株HZJK-2的获得与鉴定。

本发明所述的桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2，是从健康石榴株根际土中分离得到。样品采自云南省会泽县娜姑镇石榴基地，在 4℃冷藏保存备用。从健康石榴根际土分离细菌：根际土均用无菌水浸泡，取浸泡液1ml，采用系列稀释法分别稀释2倍、5倍、10倍、20倍，分别取200μl 浸泡液，注入LB固体培养基表面，用三角涂布棒涂布均匀。至于恒温箱30℃培养24h，待菌落形成后，用无菌接种环挑出，用划线法进一步在新LB平板上进行纯化。如此多次，最终获得典型的单一菌落。

LB固体培养基成分以g/L计为：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，Nacl(10g/L),琼脂(20g/L)，pH＝7.0-7.2。对上述分离的菌株HZJK-2生理生化和分子生物学鉴定，实验结果记录如下：

A、形态特征：菌株HZJK-2菌落粉白色，不规则形，比较粘稠，不透明，菌落外缘有褶皱产生。

B、将拮抗菌株接种到LB平板培养基上，30℃恒温培养24h后，根据《常见细菌系统鉴定手册》，进行革兰氏染色呈阴性，观察菌株的菌体及菌落形态，同时根据《常见细菌系统鉴定手册》所述方法测定该菌株生理生化反应。微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中重要依据之一，微生物鉴定中常见的生理生化反应如下所示：氧化酶+、接触酶反应+，甲基红-、V-P反应+，淀粉、纤维素及果胶的水解活性，硝酸盐还原能力+，进行明胶液化试验+、吲哚试验+、以及对葡萄糖、梓檬酸盐和丙酸盐利用等试验，并观察试验结果。该菌株生理生化特征鉴定结果显示本发明所述菌株HZJK-2为桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae，生理生化特征如表1 所示，“+”表示有反应或可酶解；“-”表示无反应或不能酶解。

表1桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2的生理生化特征

反应/酶	结果	反应/酶	结果
				氧化酶Oxidase	+	纤维素水解Cellulose hydrolysis	-
接触酶Catalase	+	果胶水解Pectin hydrolysis	+
				甲基红试验Methy-red reaction	-	柠檬酸盐利用Utilization of citrate	+
V-P试验V-P reaction	+	丙二酸盐利用Utilization of propionate	+
				硝酸盐还原Nitrate reduction	+	吲哚试验Indole test	+
明胶液化Gelatin hydrolysis	+	糖醇类发酵Sugar alcohol fermentation	+

注：“+”表示有反应或可酶解；“-”表示无反应或不能酶解。

C、16S rRAN序列分析：对菌株进行16S rRAN序列测定(序列核苷酸序列如 SEQ IDNO:1所示)，以菌株HZJK-2DNA为模板,利用细菌16S rRAN通用引物 63F(5′-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′)和1387R(5′-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3′) 进行PCR扩增，反应体系如表2所示。

表2 PCR(50μl)反应体系

组分	用量
		Mix	25μl
Primer(10μmol/L)(F)	1μl
		Primer(10μmol/L)(F)	1μl
DNA模板	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	21μl

PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃解链30s，51℃退火1min，72℃ 90s延伸，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

将PCR产物送至昆明硕擎生物科技有限公司纯化测序，序列拼接后提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中比对分析。然后用MEGA6对这些序列进行分析、构建系统发育树如图1所示。

通过分子系统学分析和生理生化特征将菌株HZJK-2鉴定为桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae。

(2)桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2的保藏。

通过上述鉴定结果，确认菌株为桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae，编号命名为HZJK-2，于2021年4月7日提交至保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称：CGMCC。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。保藏，其保藏编号为CGMCC No.22143。

实施例2

桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2的拮抗效果。

(1)菌株的筛选。

利用十字交叉法对拮抗菌进行效果验证。具体操作如下：利用五点平板对峙法对拮抗菌进行筛选。具体操作如下：PDA平板背面画出任意两条垂直直径，在垂直线交叉点接种石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum作为指示菌，在直径上距离圆心各2cm处的4个位置处点接分离培养得到的细菌，无菌水处理作空白对照，每处理3重复，培养箱25℃培养。

(2)结果观察。

采取十字交叉法对分离到的细菌菌株进行病原菌拮抗试验，结果表明，桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2对石榴颈枯病有较好拮抗作用，具体拮抗效果如图2和图3所示，从图2和图3中可以明显的看出菌株HZJK-2 能抑制棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum，且拮抗效果优越有较为显著的抑菌圈。

在PDA平板中央接入直径为3mm的植物病原菌菌块，同时在距离中央2.5cm 处划线接入Acinetobacter guillouiae HZJK-2，25℃培养，以不接菌株AcinetobacterguillouiaeHZJK-2为空白对照。培养5d后，测定抑菌圈直径(mm)和对照处理直径(mm)，病计算抑菌率，结果如表3所示。计算公式：抑菌率＝[(对照处理菌落直径-处理菌落直径)/对照处理菌落直径]×100％。

表3菌株Acinetobacter guillouiae HZJK-2对植物病原菌的抑制作用

实施例3

桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2挥发性气体生防效果的测定。

(1)生防效果的测定。

拮抗菌株挥发性气体抑菌活性检测：在直径为9cm的二分皿中，分别往两个槽室内注入PDA培养基。待培养基凝固后，一个槽室用尾部连接法划线接种拮抗菌株，以不接种作为空白对照；另一槽室中央分别接种直径5mm的石榴颈枯病病原棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum菌饼。各设5组平行对照组。将培养皿于25℃恒温培养箱培养，定期观察。

(2)结果观察

从第3天起，桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2挥发性气体实验组的菌落直径已明显小于空白对照组，说明HZJK-2的挥发性气体能抑制石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢 Neofusicoccwn parvum的生长。培养5天后，病原菌已经长满所在槽室，而试验组中，石榴颈枯病病原菌生长缓慢。第5-7天，实验组中病原菌仍未长满所在槽室，而对照组中病原菌受到二分皿的塑料隔离板阻挡，菌落生长不明显，但部分气生菌丝已跨过挡板到达另一槽室中。记录第5天菌落直径，HZJK-2处理组中，棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora菌落的平均直径3.5cm，小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum菌落的平均直径3.7cm，空白对照组棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum菌落平均直径4.5cm(二分皿半径4.5cm)。说明拮抗菌株桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiaeHZJK-2的挥发性物质其中含有抑菌成分，对石榴颈枯病病原棒状拟盘多毛孢Neopestalotiopsisclavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum 有良好抑制效果。

抑菌效果雷达图是桂林不动杆菌Acinetobacter guillouiae菌株HZJK-2挥发性气体对石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛Neopestalotiopsis clavispora和小新壳梭孢Neofusicoccwn parvum在不同天数(1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d)抑菌效果图，并将7天的有关数据用比率表示出来，填写到一张能表示各自比率关系的等比例图形上，再用彩笔连接各自比率的结点后，恰似一张雷达图表。从图4 上可以看出桂林不动杆菌A.guillouiae菌株HZJK-2挥发性气体对石榴颈枯病病原菌棒状拟盘多毛N.clavispora和小新壳梭孢N.parvum抑制效果雷达图，更加直观的获取数据信息。注：雷达中心距顶点距离1cm/格，雷达五边形顶点为处理天数。

序列表

<110> 西南林业大学

<120> 桂林不动杆菌HZJK-2及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 829

<212> DNA

<213> 桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)

<400> 1

actgacctag cggcggacgg gtgagtaata cttaggaatc tgcctattaa tgggggacaa 60

catctcgaaa gggatgctaa taccgcatac gccctacggg ggaaagcagg ggatcacttg 120

tgaccttgcg ttaatagatg agcctaagtc ggattagcta gttggtgggg taaaggccta 180

ccaaggcgac gatctgtagc gggtctgaga ggatgatccg ccacactggg actgagacac 240

ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatggggg gaaccctgat 300

ccagccatgc cgcgtgtgtg aagaaggcct tatggttgta aagcacttta agcgaggagg 360

aggctctctt ggttaatacc caagatgagt ggacgttact cgcagaataa gcaccggcta 420

actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga gggtgcgagc gttaatcgga tttactgggc 480

gtaaagcgtg cgtaggcggc tttttaagtc ggatgtgaaa tccccgagct taacttggga 540

attgcattcg atactgggaa gctagagtat gggagaggat ggtagaattc caggtgtagc 600

ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac cgatggcgaa ggcagccatc tggcctaata 660

ctgacgctga ggtacgaaag catggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccatg 720

ccgtaaacga tgtctactag ccgttggggc ctttgaggct ttagtggcgc agctaacgcg 780

ataagtagac cgcctgggga gtacggtcgc aagactaaaa ctcaaatga 829

Claims (7)

1.桂林不动杆菌(Acinetobacter guillouiae)HZJK-2，其特征在于，所述桂林不动杆菌HZJK-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22143。

2.根据权利要求1桂林不动杆菌HZJK-2，其特征在于，所述桂林不动杆菌HZJK-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的桂林不动杆菌HZJK-2的培养物、挥发物或其加工物。

4.根据权利要求1、2或3所述的桂林不动杆菌HZJK-2及其培养物、挥发物或其加工物在防治石榴颈枯病中的应用。

5.根据权利要求1、2或3所述的桂林不动杆菌HZJK-2及其培养物、挥发物或其加工物在防治棒状拟盘多毛孢(Neopestalotiopsis clavispora)中的应用。

6.根据权利要求1、2或3所述的桂林不动杆菌HZJK-2及其培养物、挥发物或其加工物在防治小新壳梭孢(Neofusicoccwn parvum)病菌中的应用。

7.一种生防菌剂，其特征在于，其活性成分包括权利要求1、2或3所述的桂林不动杆菌HZJK-2及其培养物、挥发物或其加工物。

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