CN114410300A

CN114410300A - 一种荧光探针及其制备方法和生物应用

Info

Publication number: CN114410300A
Application number: CN202210113744.9A
Authority: CN
Inventors: 李佳佳; 韩光梅; 张瑞龙; 刘正杰; 张忠平
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2022-01-30
Filing date: 2022-01-30
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2042-01-30
Also published as: CN114410300B

Abstract

本发明公开了一种荧光探针及其制备方法和生物应用。所述荧光探针用于活细胞内质网实时成像，是一种非激发光依赖性的橙色荧光碳点。该橙色荧光碳点尺寸小，粒径分布在2.5‑5.5nm，平均粒径约4.0nm。所述橙色荧光碳点中C、N、O的质量含量分别为80％‑81％、5％‑6％、14％‑15％。本发明的荧光探针油水分配系数(LogP值)在1.2‑1.3之间，亲脂性较好，且具有内质网靶向特异性，抗光漂白性能较强，生物相容性好，对细胞基本没有毒性。因此，本发明的荧光探针用于活细胞内质网结构超分辨成像同时可以观察活细胞有丝分裂时期内质网形态变化，克服了普通内质网探针的光漂白性及细胞毒性等问题，在生物成像分析领域具有广泛的应用。

Description

一种荧光探针及其制备方法和生物应用

技术领域

本发明属于材料合成及生物成像分析技术领域，具体涉及一种定位内质网的荧光探针及其制备方法和生物应用。

背景技术

内质网是真核细胞内最大的、最多变的封闭膜性细胞器，根据有无核糖体的附着，分为粗面内质网和滑面内质网，不仅是蛋白质、脂质、糖类的合成基地，而且在钙离子存储和信号传导等过程中也发挥着重要作用。当内质网内外环境改变造成内质网功能障碍时，会诱发内质网应激反应。研究表明，这种应激反应可能会显著扰乱细胞与其环境之间的相互作用，并导致人类疾病的产生及加重，因此，内质网最近被认为是癌症等疾病诊断与治疗的重要靶点，对其精细结构变化的实时影像分析对内质网应激相关疾病的诊断及治疗具有重要意义。

目前，碳点荧光探针成像由于其生物相容性高，抗光漂白能力强，可以实时监测细胞内反应已成为一个热门的研究课题，并已应用于细胞显影、化学传感、光动力治疗、磁共振成像等许多领域。尽管已经报道了各种用于观察内质网形态及检测其成分的各种荧光探针，但现已开发的内质网荧光探针的抗光漂白性和生物相容性仍需提高。因此，开发用于活细胞内质网实时成像的荧光探针是非常重要的。

发明内容

为了解决现有荧光探针抗光漂白性差，生物相容性低的技术问题，本发明提供一种用于活细胞内质网实时成像的荧光探针、所述荧光探针的制备方法、所述荧光探针在生物学中的应用。

本发明采用以下技术方案实现：一种非激发光依赖的橙色荧光碳点荧光探针，所述橙色荧光碳点的粒径分布在2.5-5.5nm，平均粒径4.0nm。所述橙色荧光碳点中C、N、O的质量含量分别为80％-81％、5％-6％、14％-15％。

本发明的荧光探针油水分配系数(LogP值)在1.2-1.3之间，亲脂性较好，且具有内质网靶向特异性，抗光漂白性能较强，对细胞基本没有毒性。荧光探针的橙色荧光碳点(Phe-CDs) 具有抗光漂白性能好，生物相容性高的特点。因此本发明的荧光探针特别适应用于活细胞内质网实时成像，在活细胞中观察内质网在有丝分裂过程中的形态变化。

作为上述方案的进一步改进，所述橙色荧光碳点以邻苯二胺和苯丙氨酸为原料，在聚- 四氟乙烯不锈钢反应釜中经水热法反应获得。

本发明还提供上述荧光探针在活细胞内质网实时成像中的应用，尤其是在活细胞中观察内质网在有丝分裂过程中的形态变化的应用。

本发明还提供一种荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将邻苯二胺与苯丙氨酸固体一起加入超纯水中，超声溶解后转移至聚-四氟乙烯内衬的反应釜中，在所述反应釜中进行高温高压反应，将附着在所述反应釜的内壁上和浮于所述反应釜内溶液上层的棕黑色固体取出；

(2)将步骤(1)得到的棕黑色固体用甲醇溶解后，先用柱层析纯化，蒸发浓缩得棕色溶液后，用薄层层析纯化取橙红色部分；将橙红色部分刮下用甲醇超声、溶解，多次过滤洗涤，去除中性二氧化硅，将剩余溶液旋转蒸发浓缩后，烘干，得到棕红色固体粉末，即所述荧光探针。

邻苯二胺是已知的较好的缩合、聚合、碳化成碳点的材料，而苯丙氨酸是作为组成人体必备蛋白质的氨基酸。用苯丙氨酸修饰邻苯二胺碳化的碳点，增加其生物相容性。

作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，反应温度为180℃，反应时间为8h。

作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，邻苯二胺、苯丙氨酸固体、超纯水的比例为： 0.15g:0.30g:60mL。

作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述反应釜为聚-四氟乙烯不锈钢反应釜。

作为上述方案的进一步改进，步骤(2)中，柱层析纯化过程中洗出液为二氯甲烷与乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝5:1)，薄层层析纯化过程中层析液为二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝3:1)。

作为上述方案的进一步改进，步骤(2)中，用烘箱70℃烘干。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明的橙色碳点，合成方法简单，原料廉价，易于重复；

2.本发明的橙色碳点实现对正常细胞与癌细胞内质网实时成像；

3.本发明的荧光探针具有高特异性，定位于细胞内质网，抗光漂白能力强，生物相容性高。

附图说明

图1是本发明的荧光探针的橙色荧光碳点的合成简要示意图。

图2是实施例中橙色荧光碳点的FT-IR结果示意图。

图3是实施例中橙色荧光碳点的UV-可见光谱和激发发射光谱示意图。

图4是实施例中橙色荧光碳点在不同激发光激发下的荧光发射光谱示意图。

图5是实施例中橙色荧光碳点的不同紫外照射时间下的荧光强度变化示意图。

图6是实施例中橙色荧光碳点的TEM图像示意图。

图7是实施例中橙色荧光碳点的尺寸分布结果示意图。

图8是实施例中橙色荧光碳点的XPs谱图分析示意图。

图9是实施例中橙色荧光碳点的LogP图分析示意图。

图10是实施例中橙色荧光碳点对细胞内含有的各种分析底物的选择性分析示意图。

图11是实施例中橙色荧光碳点与不同浓度的脂质体(从上到下0-1000μg/mL)混合后的荧光光谱示意图。

图12是实施例中橙色荧光碳点细胞毒性分析示意图。

图13是实施例中橙色荧光碳点进细胞实时成像示意图。

图14是实施例中橙色荧光碳点在多种细胞中的共定位成像分析示意图。

图15是实施例中橙色荧光碳点对活细胞内质网超分辨荧光成像示意图。

图16是实施例中橙色荧光碳点的有丝分裂期内质网形态的分析示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步地详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明的荧光探针是一种用于活细胞内质网实时成像的荧光探针，包括非激发光依赖性的橙色荧光碳点。所述橙色荧光碳点的粒径分布在2.0-6.0nm，所述橙色荧光碳点中C、N、 O的质量含量分别为80％-81％、5％-6％、14％-15％。所述橙色荧光碳点的尺寸较小，平均粒径4.0nm。

所述橙色荧光碳点以邻苯二胺和苯丙氨酸为原料，在聚-四氟乙烯内衬的反应釜(如聚- 四氟乙烯不锈钢反应釜)中经水热法反应获得。具体的制备过程如实施例2所示。

实施例2

请参阅图1，其为本发明的荧光探针的橙色荧光碳点的合成简要示意图。荧光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)将邻苯二胺与苯丙氨酸固体一起加入超纯水中，超声溶解后转移至聚-四氟乙烯内衬的反应釜中，在所述反应釜中进行高温高压反应，将附着在所述反应釜的内壁上和浮于所述反应釜内溶液上层的棕黑色固体取出。

邻苯二胺、苯丙氨酸固体、超纯水的比例可按照：0.15g:0.30g:60mL实行，如邻苯二胺取0.30g，则苯丙氨酸固体取0.60g，超纯水需要120ml。在所述反应釜中进行高温高压反应时，反应温度优选为180℃，反应时间优选为8h。

(2)将步骤(1)得到的棕黑色固体用甲醇溶解后，先用柱层析纯化，蒸发浓缩得棕色溶液后，用薄层层析纯化取橙红色部分；将橙红色部分刮下用甲醇超声、溶解，多次过滤洗涤，去除中性二氧化硅，将剩余溶液旋转蒸发浓缩后，烘干(如用烘箱70℃烘干)，得到棕红色固体粉末，即所述荧光探针。

柱层析纯化过程中洗出液为二氯甲烷与乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝5:1)，薄层层析纯化过程中层析液为二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝3:1)。

实施例3

针对实施例2的荧光探针的制备方法，在本实施例中进行详细的举例介绍。

将0.15g邻苯二胺与0.30g苯丙氨酸固体一起加入60mL超纯水中，将其超声15分钟，待邻苯二胺与苯丙氨酸完全溶解后转移至容积为100mL的聚四氟乙烯内衬的反应釜中，180℃反应8h后，自然冷却至室温。将附着在内壁和浮于溶液上层的棕黑色固体用甲醇溶解后，先用柱层析纯化，洗出液为二氯甲烷与乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝5:1)，蒸发浓缩得棕色溶液后，用薄层层析纯化取橙红色部分，层析液为二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷： V_乙酸乙酯＝3:1)。将橙红色部分刮下用甲醇溶解，超声30min，反复过滤3遍，去除中性二氧化硅，将剩余溶液旋转蒸发浓缩后，用烘箱70℃烘干，得到棕红色固体粉末。

本实施例制备得到的橙色荧光碳点的表征如图2所示，通过FTIR光谱测定合成的Phe-CDs的表面官能团。Phe-CDs在3423cm^-1附近的吸收带归因于其表面的-OH和-NH。观察到1635、1590和1349cm^-1处的峰值分别对应于C＝O/C＝N、C＝C和C-O的吸收带。2994 ～2881cm^-1的吸收带课归因于C-H键。通过UV-Vis吸收光谱和荧光光谱证实了所合成的 Phe-CDs的光学性质。

请参阅图3，图3中实线所示，280nm处的吸收峰可归因于碳核的C＝C键产生的π→π* 跃迁，以及370nm到600nm的吸收带可归因于sp²杂化体系边缘的C＝O/C＝N键所产生的n→π*跃迁；如虚线所示，在最佳激发波长为473nm时，其对应的最大发射峰值为580nm。从图3的插图中描绘的照片，黄棕色水溶液在(365nm)紫外灯的照射下呈现亮橙色。

请参阅图4及图5，在图4中，随着激发波长从380nm增加到560nm，合成后的Phe-CDs的发射波长几乎没有变化。图5是连续紫外灯(365nm)照射10min、20min、30min、40min、50min、60min分别照射以后的碳点的荧光强度，荧光强度没有明显下降，这表明Phe-CDs 具有优异的光稳定性。

请参阅图6及图7，从图6和7中可以看出，合成的Phe-CDs的形状近似球形，Phe-CDs的尺寸分布结果表明Phe-CDs的直径分布在2.0-6.0nm，平均直径在3.98nm左右，在溶剂中成像均匀分散的状态。

请参阅图8，可知：Phe-CDs样品中主要存在C、N和O三种元素，其含量分别为80.12％、 5.72％和14.15％(原子比)。C1s的高分辨率XPS光谱可拟合出三个特征峰285.5eV (C-C/C＝C)、286.2eV(C-N/C-O)和286.9eV(C＝N/C＝O)。N1s的高分辨率XPS光谱表明N 主要以吡啶-N、吡咯-N和氨基-N的形式存在。

请参阅图9，可知：Phe-CDs中油水分配系数(LogP值)在1.2-1.3之间，亲脂性较好。

实施例4

本实施例中，针对上述各实施例的荧光探针做了各种探究

一、荧光探针的选择性探究。

为测试橙色碳点对细胞内含有的生物分子如：无机盐，氨基酸，多肽以及其它蛋白或酶的选择性，在PBS缓冲溶液(0.01M,pH 7.4)中加入荧光探针(10μg/mL)，再分别加入细胞内常见的生物分子，如亚铁离子、硫化氢、过氧化氢、次氯酸、亚硫酸根、铜离子、锌离子、钾离子、钙离子、谷胱甘肽、半胱氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、胃蛋白酶、免疫球蛋白G、脂质体，分别测量其与探针反应后的荧光变化。请参阅图10，由图10可知，只有加入脂质体时，荧光探针分子在580nm的荧光强度才会发生明显变化。说明该探针具有很好的选择性。

二、荧光探针在不同浓度的脂质体下荧光强度的变化。

为测试荧光探针分子在不同浓度的脂质体条件下荧光强度变化的研究,在1mlPBS缓冲液(0.01M,pH7.4)中加入荧光探针分子使其浓度为10μg/mL，，研究其荧光强度变化。请参阅图11，由图11可知，随着脂质体浓度的增加，580nm处的荧光强度逐渐增强。当加入脂质体的终浓度为600μg/mL时，该荧光探针分子的增长倍数可达到15倍。

三、细胞毒性分析。

将人胚肾细胞(HEK-293)细胞及人宫颈癌细胞(HeLa)按每孔1×10⁴个细胞接种至96 孔板中，将96孔板放置于细胞培养箱中，培养条件为：37℃、5％CO₂、饱和湿度，培养24h，使之完全贴壁。之后更换新鲜培养液，加入10μL不同浓度的荧光探针分散液，培养24h后，每个孔中加入MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h，然后向每孔加100μL DMSO，将96孔板置于水平振荡摇床上振荡10min，在酶标仪上将波长设定为492nm，测定96孔板每孔溶液的吸光度(OD值)，按下列公式计算细胞生存率：细胞存活率＝(OD_待测组－OD _空白组)/(OD_细胞组－OD_空白组)×100％。请参阅图12，从图12中看出，荧光探针在0.5-20μg/mL 范围内几乎无细胞毒性。

四、荧光探针进细胞过程实时成像。

将人宫颈癌细胞(HeLa)接种到玻璃底培养皿中，并在37℃的环境中培养2天。随后，将探针(2μg/mL)加入到细胞中，在37℃下，并用激光共聚焦显微镜成像，结果如图13 所示，橙色碳点在2分钟后就开始进入细胞，到36分钟后荧光强度达到最高。

五、细胞内共定位成像。

在共定位实验中，首先将人膀胱癌细胞系(5637),人胚肾细胞(HEK-293),人宫颈癌细胞(HeLa)，人正常乳腺上皮细胞(MCF-10a),人神经母细胞瘤细胞(SHSY5Y)，人胚胎肺成纤维细胞(WI-38)细胞与荧光探针(2μg/mL)共孵育30min，然后1μM内质网商染试剂孵育20min。最后，细胞用PBS溶液(pH 7.4)洗涤1次，并用激光共聚焦显微镜成像。结果如图14所示，橙色碳点phe-CDs通道与内质网商染通道皮尔森重叠系数至少为73％，最高可达90％，证明其定位内质网细胞器。

六、荧光探针的超分辨成像。

在共聚焦显微镜下对荧光探针进行超分辨纳米显微镜实验，在超分辨激光下激发该探针，并使用HyD反射光检测器收集发射信号。超分辨成像活细胞(采用宫颈癌细胞)的制备方法与普通共聚焦显微镜成像一致。在授权许可下，使用Huygens专业软件(版本：16.05)对超分辨显微照片进行进一步处理。请参阅图15，从图15可知，内质网在细胞内成网状，分布于整个细胞中。

七、荧光探针的观察细胞有丝分裂形态变化。

首先将人宫颈癌细胞(HeLa)与荧光探针(2μg/mL)共孵育30min，然后1μM DNA 商染与1μM微管蛋白商染试剂孵育20min。最后，细胞用PBS溶液(pH 7.4)洗涤3次，并用激光共聚焦显微镜成像。橙色碳点phe-CDs通道为内质网通道。请参阅图16，从图16 可知，细胞在有丝分裂时期与有丝分裂间期不同，没有呈现出大面积的网状，而是呈现出丝状围绕在染色体周围。

综上所述，本发明的荧光探针为一种用于活细胞内质网结构超分辨成像同时可以观察活细胞有丝分裂时期内质网形态变化的荧光探针，所述荧光探针是一种橙色碳点。本发明的荧光探针可以选择性地定位在细胞内质网。本发明的荧光成像荧光探针克服了普通内质网探针的光漂白性，同时其他内质网荧光探针成像将带来的严重细胞毒性等问题。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荧光探针，其特征在于，包括非激发光依赖性的橙色荧光碳点，所述橙色荧光碳点的粒径分布在2.5-5.5nm，平均粒径4.0nm；所述橙色荧光碳点中C、N、O的质量含量分别为80％-81％、5％-6％、14％-15％。

2.如权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述橙色荧光碳点以邻苯二胺和苯丙氨酸为原料，在聚-四氟乙烯不锈钢反应釜中经水热法反应获得。

3.一种如权利要求1或2所述的荧光探针在活细胞内质网实时成像中的应用。

4.一种如权利要求1或2所述的荧光探针在活细胞中观察内质网在有丝分裂过程中的形态变化的应用。

5.一种荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，反应温度为180℃，反应时间为8h。

7.如权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，邻苯二胺、苯丙氨酸固体、超纯水的比例为：0.15g:0.30g:60mL。

8.如权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述反应釜为聚-四氟乙烯不锈钢反应釜。

9.如权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，柱层析纯化过程中洗出液为二氯甲烷与乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝5:1)，薄层层析纯化过程中层析液为二氯甲烷和乙酸乙酯混合液(V_二氯甲烷：V_乙酸乙酯＝3:1)。

10.如权利要求5所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用烘箱70℃烘干。