CN114402067A - 聚合酶 - Google Patents

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CN114402067A
CN114402067A CN202080065334.0A CN202080065334A CN114402067A CN 114402067 A CN114402067 A CN 114402067A CN 202080065334 A CN202080065334 A CN 202080065334A CN 114402067 A CN114402067 A CN 114402067A
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ile
glu
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玛丽安·帕丽丝
克里斯·伯努瓦
莫妮塔·西恩
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Seculet Biological Co ltd
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Seculet Biological Co ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies

Abstract

具有聚合酶活性的修饰多肽。

Description

聚合酶
技术领域
改性的病毒酶。
相关申请的交叉引证
本申请要求于2019年9月18日提交的美国临时申请序列号62/902,351的优先权，将其全部内容结合于此。
发明内容
本发明提供了具有聚合酶活性的修饰多肽。
附图说明
图1示出了显示分子量标记(L)的染色SDS-PAGE凝胶，部分纯化的样品加载(LD)到肝素柱上，洗脱级分为8至16。
具体实施方式
本发明提供了对具有903个指定氨基酸位置的SEQ ID NO：1具有一个或多个以下修饰的多肽。
在114位，可以将天然Asp修饰为Ala(D114A)或Val(D114V)以降低核酸外切酶结构域的活性。也可以将其修饰为其他脂肪族氨基酸(诸如G、L、I)或小氨基酸(诸如S或C)或N或T。
在115位，可以将天然Ile(I115)修饰为其他脂肪族氨基酸诸如Leu(I115L)或Val(I115V)，或其他脂肪族或疏水残基诸如F、M、T、W或Y。还可以将115位修饰为G或A。
在116位，可以将天然Glu修饰为Ala(El16A)或Val(El16V)，同样以降低核酸外切酶活性。也可以将其修饰为其他脂肪族氨基酸(诸如G、L、I)或小氨基酸(诸如G、S、C)或N或T。
在230或231至235位，可以将其中之一的氨基酸修饰为Ser或Cys。
在327位，可以将天然Asp(D327)修饰为Ala(D327A)、Val(D327V)，或修饰为E、N、Q或其他极性氨基酸。
在415位，可以将天然Leu修饰为Tyr(L415Y)、Ser(L415S)或Ala(L415A)以打开核苷酸口袋区域。可以将其修饰为S或芳香族氨基酸诸如F或W。也可以将其修饰为H、T、M或脂肪族氨基酸。
在416位，可以将天然Tyr修饰为Ala(Y416A)、Leu(Y416L)或Val(Y416V)，这可以增加具有庞大3'基团的核苷酸底物的空间。也可以将其修饰为其他脂肪族氨基酸(诸如G、V、I)或小氨基酸(诸如G、S、C)或N或T。
在417位，可以将天然Pro修饰为Val(P417V)、Ile(P417I)或Ser(P417S)以容纳3'基团。还可以将其修饰为脂肪族氨基酸如G、A、L、I或M、F、C、R、D或T。
在557位，可以将氨基酸Ile修饰为Gly(I557G)、Lys(I557K)、Ser(I557S)或Thr(I557T)。
在558位，可以将天然Asn修饰为Ala(N558A)。也可以将其修饰为Leu(N558L)或Val(N558V)或其他脂肪族氨基酸(诸如G或I)或小氨基酸(诸如G、S、C)或N或T。
在559位，可以将氨基酸Arg修饰为Asp(R559D)、His(R559H)或Asn(R559N)。
在587位，可以将天然Thr修饰为Ser(T587S)或Ala(T587A)。也可以将其修饰为G、C、A或其他小氨基酸诸如P、N、D或V。
在594位，可以将天然Leu修饰为Ile(L594I)。也可以将其修饰为V、M、C、A或G。
在703位，可以将天然Thr修饰为Ile(T703I)。也可以将其修饰为V、M、C、A或G。
修饰位置的氨基酸可以通过磷酸化、甲基化、乙酰化、酰胺化、吡咯烷酮羧酸的形成、异构化、羟基化、硫酸化、黄素结合、半胱氨酸氧化或亚硝基化进行化学修饰。
本发明的多肽可以在合适的反应条件下将核苷酸(诸如天然存在的或修饰的核苷酸)连接至核酸链。核苷酸可以在3'-OH位进行修饰，诸如用烯丙基或叠氮基进行修饰。多肽可以是全长的、多于或少于903个氨基酸的或含有其酶活性部分，同时保留用于SEQ ID NO：1的位置名称。
多肽可以包含额外的序列或序列修饰以便于克隆、表达或附着以进行纯化。例如，可以修饰氨基末端氨基酸或增加Met-Ile-Leu、Asp-Thr-Asp或其组合。可以将Met-Ile-Leu中的Ile进一步修饰为Ala-Val。
本发明包括具有上述修饰的多肽，以及另外的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个不同的氨基酸，或相差2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％。
本发明还提供了编码本发明的多肽(或其酶活性部分)的核酸，以及具有此类核酸或其互补物的载体。可以修饰核酸序列的密码子以优化在所需系统物种中的表达。本发明还提供了通过表达此类核酸获得的多肽及其试剂盒。
进一步提供了针对多肽的抗体，特别是可检测的标记抗体。本发明包括选择性检测多肽存在的方法和用与固相底物偶联的抗体纯化多肽的方法。
实施例
实施例1：修饰的多肽
制备具有SEQ ID NO：1的多肽，除了在114、116、415、416、417和558位处修饰。多肽由制备成编码修饰多肽的核酸序列表达。
实施例2：酶纯化和活性
表达具有用D114A、El16A、L415Y、Y416A、P417V、N558A修饰的SEQ ID NO：1序列的酶，带有His-标签以便于纯化。酶被镍螯合柱捕获并加载到Q Sepharose阴离子交换柱上。使用肝素柱进一步纯化洗脱的级分。级分10到12示出纯化的104kDa的酶，纯度>99％。
该酶在30℃至39℃示出dNTP掺入，在37℃具有峰值活性。该酶还显示了某些修饰核苷酸的掺入。
上面提供的标题仅用于方便浏览文件，不应用于表征与另一部分相比的文本部分的含义。技术人员将理解附加的实施方式在本发明的范围内。本发明仅由以下权利要求限定；说明书或其实施例中的限制不应被引入权利要求中。
序列表
<110> 美国赛库莱特生物有限公司
玛丽安·帕丽丝
克里斯·伯努瓦
莫妮塔·西恩
<120> 聚合酶
<130> SER-21wo
<150> US 62/902,351
<151> 2019-09-18
<160> 1
<210> 1
<211> 903
<212> PRT
<213> 未知（Unknown）
<220>
<223> 未知描述: Escherichia virus RB69
<400> 1
Met Lys Glu Phe Tyr Leu Thr Val Glu Gln Ile Gly Asp Ser Ile Phe
1 5 10 15
Glu Arg Tyr Ile Asp Ser Asn Gly Arg Glu Arg Thr Arg Glu Val Glu
20 25 30
Tyr Lys Pro Ser Leu Phe Ala His Cys Pro Glu Ser Gln Ala Thr Lys
35 40 45
Tyr Phe Asp Ile Tyr Gly Lys Pro Cys Thr Arg Lys Leu Phe Ala Asn
50 55 60
Met Arg Asp Ala Ser Gln Trp Ile Lys Arg Met Glu Asp Ile Gly Leu
65 70 75 80
Glu Ala Leu Gly Met Asp Asp Phe Lys Leu Ala Tyr Leu Ser Asp Thr
85 90 95
Tyr Asn Tyr Glu Ile Lys Tyr Asp His Thr Lys Ile Arg Val Ala Asn
100 105 110
Phe Asp Ile Glu Val Thr Ser Pro Asp Gly Phe Pro Glu Pro Ser Gln
115 120 125
Ala Lys His Pro Ile Asp Ala Ile Thr His Tyr Asp Ser Ile Asp Asp
130 135 140
Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Pro Tyr Gly Asn Val Glu
145 150 155 160
Glu Trp Ser Ile Glu Ile Ala Ala Lys Leu Gln Glu Gln Gly Gly Asp
165 170 175
Glu Val Pro Ser Glu Ile Ile Asp Lys Ile Ile Tyr Met Pro Phe Asp
180 185 190
Asn Glu Lys Glu Leu Leu Met Glu Tyr Leu Asn Phe Trp Gln Gln Lys
195 200 205
Thr Pro Val Ile Leu Thr Gly Trp Asn Val Glu Ser Phe Asp Ile Pro
210 215 220
Tyr Val Tyr Asn Arg Ile Lys Asn Ile Phe Gly Glu Ser Thr Ala Lys
225 230 235 240
Arg Leu Ser Pro His Arg Lys Thr Arg Val Lys Val Ile Glu Asn Met
245 250 255
Tyr Gly Ser Arg Glu Ile Ile Thr Leu Phe Gly Ile Ser Val Leu Asp
260 265 270
Tyr Ile Asp Leu Tyr Lys Lys Phe Ser Phe Thr Asn Gln Pro Ser Tyr
275 280 285
Ser Leu Asp Tyr Ile Ser Glu Phe Glu Leu Asn Val Gly Lys Leu Lys
290 295 300
Tyr Asp Gly Pro Ile Ser Lys Leu Arg Glu Ser Asn His Gln Arg Tyr
305 310 315 320
Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Asp Val Tyr Arg Val Leu Gln Ile Asp Ala
325 330 335
Lys Arg Gln Phe Ile Asn Leu Ser Leu Asp Met Gly Tyr Tyr Ala Lys
340 345 350
Ile Gln Ile Gln Ser Val Phe Ser Pro Ile Lys Thr Trp Asp Ala Ile
355 360 365
Ile Phe Asn Ser Leu Lys Glu Gln Asn Lys Val Ile Pro Gln Gly Arg
370 375 380
Ser His Pro Val Gln Pro Tyr Pro Gly Ala Phe Val Lys Glu Pro Ile
385 390 395 400
Pro Asn Arg Tyr Lys Tyr Val Met Ser Phe Asp Leu Thr Ser Leu Tyr
405 410 415
Pro Ser Ile Ile Arg Gln Val Asn Ile Ser Pro Glu Thr Ile Ala Gly
420 425 430
Thr Phe Lys Val Ala Pro Leu His Asp Tyr Ile Asn Ala Val Ala Glu
435 440 445
Arg Pro Ser Asp Val Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Met Met Tyr Tyr
450 455 460
Lys Asp Arg Asp Gly Val Val Pro Thr Glu Ile Thr Lys Val Phe Asn
465 470 475 480
Gln Arg Lys Glu His Lys Gly Tyr Met Leu Ala Ala Gln Arg Asn Gly
485 490 495
Glu Ile Ile Lys Glu Ala Leu His Asn Pro Asn Leu Ser Val Asp Glu
500 505 510
Pro Leu Asp Val Asp Tyr Arg Phe Asp Phe Ser Asp Glu Ile Lys Glu
515 520 525
Lys Ile Lys Lys Leu Ser Ala Lys Ser Leu Asn Glu Met Leu Phe Arg
530 535 540
Ala Gln Arg Thr Glu Val Ala Gly Met Thr Ala Gln Ile Asn Arg Lys
545 550 555 560
Leu Leu Ile Asn Ser Leu Tyr Gly Ala Leu Gly Asn Val Trp Phe Arg
565 570 575
Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Ala Thr Ala Ile Thr Thr Phe Gly Gln Met
580 585 590
Ala Leu Gln Trp Ile Glu Arg Lys Val Asn Glu Tyr Leu Asn Glu Val
595 600 605
Cys Gly Thr Glu Gly Glu Ala Phe Val Leu Tyr Gly Asp Thr Asp Ser
610 615 620
Ile Tyr Val Ser Ala Asp Lys Ile Ile Asp Lys Val Gly Glu Ser Lys
625 630 635 640
Phe Arg Asp Thr Asn His Trp Val Asp Phe Leu Asp Lys Phe Ala Arg
645 650 655
Glu Arg Met Glu Pro Ala Ile Asp Arg Gly Phe Arg Glu Met Cys Glu
660 665 670
Tyr Met Asn Asn Lys Gln His Leu Met Phe Met Asp Arg Glu Ala Ile
675 680 685
Ala Gly Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Ile Gly Gly Phe Trp Thr Gly
690 695 700
Lys Lys Arg Tyr Ala Leu Asn Val Trp Asp Met Glu Gly Thr Arg Tyr
705 710 715 720
Ala Glu Pro Lys Leu Lys Ile Met Gly Leu Glu Thr Gln Lys Ser Ser
725 730 735
Thr Pro Lys Ala Val Gln Lys Ala Leu Lys Glu Cys Ile Arg Arg Met
740 745 750
Leu Gln Glu Gly Glu Glu Ser Leu Gln Glu Tyr Phe Lys Glu Phe Glu
755 760 765
Lys Glu Phe Arg Gln Leu Asn Tyr Ile Ser Ile Ala Ser Val Ser Ser
770 775 780
Ala Asn Asn Ile Ala Lys Tyr Asp Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Lys
785 790 795 800
Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Ile Leu Thr Tyr Asn Arg Ala Ile Lys
805 810 815
Gly Asn Ile Asp Ala Pro Gln Val Val Glu Gly Glu Lys Val Tyr Val
820 825 830
Leu Pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys Cys Ile Ala Trp
835 840 845
Pro Ser Gly Thr Glu Ile Thr Asp Leu Ile Lys Asp Asp Val Leu His
850 855 860
Trp Met Asp Tyr Thr Val Leu Leu Glu Lys Thr Phe Ile Lys Pro Leu
865 870 875 880
Glu Gly Phe Thr Ser Ala Ala Lys Leu Asp Tyr Glu Lys Lys Ala Ser
885 890 895
Leu Phe Asp Met Phe Asp Phe
900

Claims (13)

1.一种多肽，具有SEQ ID NO:1所示序列，且在114、116、415、416、417或558位中的至少一处的修饰，并能够将核苷酸掺入至核酸链。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述核苷酸被修饰，可选地在3’-OH位被修饰。
3.根据权利要求1所述的多肽，在114位具有突变，可选地为114A或114V。
4.根据权利要求1所述的多肽，在116位具有突变，可选地为116V或116A。
5.根据权利要求1所述的多肽，在415位具有突变，可选地为415A、415S或415Y。
6.根据权利要求1所述的多肽，在416位具有突变，可选地为416A、416L或416V。
7.根据权利要求1所述的多肽，在417位具有突变，可选地为417V、417I或417S。
8.根据权利要求1所述的多肽，在558位具有突变，可选地为558A、558L或558V。
9.根据权利要求1所述的多肽，在114、116、415、416、417和558位中的至少四处具有修饰。
10.根据权利要求1所述的多肽，进一步包含在115、230、231、327、587、594或703位处的修饰。
11.根据权利要求1所述的多肽，进一步包含在557、558或559位的至少一个修饰。
12.一种编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸。
13.一种特异性结合权利要求1所述的多肽的抗体。
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