CN114394917A - 一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发一氧化氮释放材料及其应用 - Google Patents

一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发一氧化氮释放材料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发一氧化氮释放材料及其应用，首先提供了一种一氧化氮供体分子，具有下式(I)所示的结构：
Figure DDA0003475737100000011
式(I)中，R1为氢、甲基或苯基；R2为取代或未取代的苯基。所述一氧化氮给体分子通过缩合聚合可以获得可见光辐照触发的一氧化氮供体聚合物，该聚合物通过自组装的方式可以形成纳米组装体，负载光敏剂后，在绿光触发下实现一氧化氮释放。进一步对细菌的杀灭实验表明，组装体具有很好的杀菌效果，并可以促进小鼠伤口愈合，达到治疗效果。

Description

一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发一氧化氮释放材料 及其应用
技术领域
本发明属于一氧化氮供体化合物技术领域，具体涉及一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发一氧化氮释放材料及其应用。
背景技术
在抗生素出现之前，细菌感染引起的传染病是非常常见且难以治愈的。历史上出现的规模较大的流行病，例如黑死病、科科利兹利流行病、俄罗斯流行性斑疹伤寒、亚洲霍乱，造成了上亿人失去生命。抗生素的出现，很大程度上抑制了流行病的传播，同时拯救了千万人的生命。但伴随着抗生素的滥用，越来越多的细菌对抗生素产生了耐药性，甚至出现了对多种抗生素耐药的超级细菌[Lin A,Liu Y,Zhu X,et al.ACSnano,2019,13,13965-13984.]。超级细菌感染更加难以治愈，给病患和社会造成了沉重的负担，因此开发可有效杀死细菌且不会出现耐药性的新型抗菌剂变得至关重要。
气体治疗作为一个新兴领域，已经吸引了越来越多的关注。而在所有的气体信号分子中，一氧化氮(NO)无疑是其中最著名的气体递质，它于1992年被《科学》杂志评为“年度分子”[Snyder S H.Science,1992,257,494-496]，Furchgott、Ignarro和Murad也因发现一氧化氮作为心血管系统调控重要信号分子而获得1998年诺贝尔生理学或医学奖[IgnarroL J.Angew.Chem.Int.Ed.,1999,38,1882-1892]。
作为目前研究最广、发展前景最好的气体信号分子，一氧化氮在血管舒张、伤口修复、免疫反应、抗肿瘤、抗菌和抗氧化等领域展现了多重作用[Liu Y,Shi L,Su L,etal.Chem.Soc.Rev.,2019,48,428-446]。值得一提的是，尽管一氧化氮有着如此广泛的应用，但其作为气体信号分子，对生理功能进行调控时具有高度的浓度依赖性，因此如何实现一氧化氮的精准可控释放至关重要。
过去的研究中，外源性一氧化氮供体化合物主要包括有机硝酸盐、硝基化合物(如硝化甘油)、硫代亚硝基硫醇、二氮烯二醇衍生物(NONOates)以及金属-亚硝基络合物(如硝普钠)等，这些化合物都存在一个共同的不足就是稳定性差，造成一氧化氮过早泄漏和产生生理毒性等问题。其中，二氮烯二醇衍生物需要在高压条件下进行合成[Hrabie J A,Keefer L K.Chem.Rev.,2002,102,1135-1154]，硫代亚硝基硫醇在生理环境下可对多种物质响应，例如温度、还原物质等[Broniowska K A,Hogg N.Antioxid.Redox Signal.,2012,17,969-980]，金属-亚硝基络合物因其固有金属离子易产生生理毒性。因此，非常有必要合成具有高稳定性的一氧化氮供体分子，并且可在外界刺激条件下实现一氧化氮可控释放。
光作为一种外界刺激条件，具有时空可控的优点，通过光触发实现一氧化氮的可控释放已经获得了广泛的研究。目前，光响应释放一氧化氮的化合物主要包括硝基苯衍生物和N-亚硝胺衍生物，对于这两类化合物，一般需要紫外光进行辐照才能释放一氧化氮，尽管N-亚硝胺衍生物在低辐照强度下就可以触发N-N键断裂释放一氧化氮，但紫外光穿透深度和固有生物毒性限制了它们的进一步使用。
研究发现，光敏剂在吸收长波长光能量后，可通过能量转移或者电子转移的方式将能量或者电子转移到受体分子上，实现对需要短波长(例如紫外光)触发的化合物的活化[Shen Z,Zheng S,Hu J,et al.Angew.Chem.Int.Ed.,2021,60,20452-20460]。因此，通过不同的组装方式将一氧化氮供体聚合物和光敏剂封装在纳米载体中，在可见光辐照下，借助光敏剂的作用实现长波长光照触发一氧化氮释放的目的，聚合物形式的一氧化氮供体可以有效延长一氧化氮作用时间，例如线性、星形和树突状聚合物以及其他拓扑结构的聚合物已被制备成NO聚合物供体并且实现很好的治疗效果。聚合物还可以通过各种化学改性地方式制备靶向、可控的递送载体。综上，借助光敏剂对一氧化氮供体的活化作用，使用长波长可见光辐照触发一氧化氮可控释放，制备出具有高效杀菌性能并具有良好生物相容性的水分散纳米载体具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发一氧化氮释放材料及其应用。本发明提供的一氧化氮供体分子可通过缩合聚合制备聚合物，并且能够在可见光触发下可控释放一氧化氮，提高了一氧化氮的稳定性，实现时空可控释放。
本发明首先提供了一种可见光辐照触发释放的一氧化氮供体分子，具有下式(I)所示的结构：
Figure BDA0003475737080000021
式(I)中，R1为氢、甲基或苯基；R2为取代或未取代的苯基。
进一步地，所述R2选自下式R2-1至式R2-8中的任一结构：
Figure BDA0003475737080000022
Figure BDA0003475737080000031
其中，
Figure BDA0003475737080000032
表示与亚甲基相连，*表示与氧原子相连。
所述一氧化氮供体分子结构中，主要含有两个N-亚硝胺基团的主体结构，可以在紫外光照下触发可控释放一氧化氮的分子。
进一步地，所述一氧化氮供体分子优选为下式(I-1)至式(I-6)所示的结构：
Figure BDA0003475737080000033
本发明一氧化氮供体分子的制备方法，首先对R2结构进行修饰，通过醛基与对苯二胺化合物中两端氨基反应，生成席夫碱；接着采用还原剂(例如硼氢化物)进行席夫碱还原反应，再通过亚硝化反应，得到可释放一氧化氮的基础化合物(可称一氧化氮释放基元或一氧化氮供体分子)，即为式(I)所示的一氧化氮供体分子。上述合成过程简单，操作容易。
本发明一氧化氮供体分子的制备方法，以(I-4)和式(I-6)为例，首先对R2结构进行修饰，将苯甲醛类化合物(例如5-羟基-2-硝基苯甲醛、4-羟基苯甲醛)的羟基与2-溴乙醇反应成醚，该步骤控制投料比为1.5～2:1，一般使用乙腈作为溶剂，90℃回流反应12h；生成产物与对苯二胺两端氨基反应，该步骤控制投料比为2～2.5:1，一般使用乙醇作为溶剂，80℃加热回流12h，最终得到黄色固体产物。席夫碱中间产物经硼氢化钠还原后加入冰醋酸中，滴加至亚硝酸钠水溶液中，冰浴条件下反应2h，有淡黄色固体析出，抽滤，干燥得淡黄色固体产物，即为式(I-4)或式(I-6)所示的一氧化氮供体分子。其它四个化合物可以以替换原料的方式通过相同的制备方法制备获得，故列出其中两个作为模型分子。上述合成过程简单，操作容易。
本发明还提供了一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发的一氧化氮供体聚合物，其结构通式如下式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0003475737080000041
式(Ⅱ)中，R1为氢、甲基或苯基；R2为取代或未取代的苯基；m取值为2～80之间的任意整数，n取值为2～30之间的任意整数。
所述一氧化氮供体聚合物是以所述一氧化氮供体分子为基元，与六亚甲基二异氰酸酯(1.1倍当量，式(Ⅳ))和聚乙二醇单甲醚(0.3倍当量，式(Ⅲ))混合，在引发剂二月桂酸二丁基锡(DBTL)的存在下其结构两端的羟基位置发生缩聚反应，该反应须在惰性氛围下进行，最终得到具有式(Ⅱ)所示结构的在可见光触发下释放一氧化氮的两亲性嵌段聚合物。
Figure BDA0003475737080000042
式(Ⅱ)的聚合物结构中，两端亲水性链段是聚乙二醇链段，其分子量可为80～5000Da；中间部分为疏水性链段，主要是一氧化氮供体部分。应该注意的是，所述亲水性链段不限于聚乙二醇结构，它的作用主要是稳定组装体，维持在水分散材料中的稳定性；本领域中常用的包裹疏水核心的亲水聚合物链段均可以用于本发明。
在本发明的实施例中，n选自2～30之间的任意整数。本发明实施例中的亲水性链段长度可以任意选择，如聚乙二醇(PEG)聚合度m＝2～80；疏水性嵌段聚合度n可以在2～30之间选择，可根据条件进行适当改变。本领域技术人员理解，对于本发明来说，聚合度m和n不是关键，只要对本发明没有不利影响即可；本发明实施例可选用m＝20～60，且n＝10～20。具体地，所述两亲性嵌段聚合物的分子量可为2000～15000Da。
所述一氧化氮供体聚合物是一种含有光响应N-亚硝胺衍生物基元的两亲性嵌段聚合物，这种聚合物材料可通过自组装得到纳米粒子，该方式得到纳米粒子可在紫外光辐照下释放一氧化氮，也通过负载光敏剂的方式，实现在氧气存在条件下使用低强度(10～50mW/cm2)可见光辐照触发一氧化氮可控释放，通过改变光照时间、辐照强度来调控一氧化氮释放量以及释放速率，具有较好的穿透深度。
本发明一氧化氮供体聚合物的应用，是用于制备负载型疏水药物。
具体包括如下步骤：
首先将一氧化氮供体聚合物自组装得到直径为20～200nm的聚合物纳米组装体；随后负载光敏剂，从而实现在氧气存在条件下使用低强度可见光辐照触发一氧化氮可控释放。其中，随着光敏剂负载量的提高，其催化一氧化氮释放的效率也会相应提高，但由于胶束负载量有限，一般一氧化氮供体分子与光敏剂比例为10:1时光敏剂含量已经达到较高水平。相比小于分子，聚合物提高了一氧化氮供体的稳定性，延长了其在体内的循环时间，避免其过早释放造成安全性问题，不会在很短的时间内被代谢掉。
所述光敏剂包括但不限于三(2-苯基吡啶)合铱等疏水性光敏剂，四苯基卟啉锌、四苯基四苯并卟啉钯(II)、酞菁和吲哚菁绿等疏水性光敏剂均可以负载于该聚合物纳米粒子中，可以根据需要选择合适的光敏剂进行负载。
进一步地，本发明一氧化氮供体聚合物可以用于制备杀菌药物。一氧化氮供体聚合物自组装后得到聚合物纳米组装体，随后负载光敏剂，在可见光触发下释放一氧化氮，用于细菌杀灭。
进一步地，所述一氧化氮供体聚合物通过加水或纳米闪沉的方式自组装得到直径为20～200nm的聚合物纳米组装体，通常是聚合物纳米粒子水分散液。
在一个优选实施方式中，所述聚合物纳米粒子水分散液按照如下步骤形成：将所述一氧化氮供体聚合物溶解在作为共溶剂的有机溶剂中，在一定温度和搅拌条件下加入超纯水中，然后用透析的方式除去有机溶剂，获得所述聚合物纳米粒子水分散液(其中包括几十到一百多纳米尺寸的纳米粒子)。本发明实施例采用共溶剂，以纳米闪沉的方式组装，可以多种有机溶剂(包括但不限于二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环、四氢呋喃等)作为共溶剂，均可以得到稳定的纳米级别聚合物组装体。
本发明提供的如式(I)结构所示的一氧化氮供体分子，可以在光敏剂存在条件下，使用低强度绿光辐照产生一氧化氮分子，该策略可弥补此类供体分子仅可在较短波长光照下释放一氧化氮的不足。本发明提供了一种绿光触发的一氧化氮给体聚合物的制备方法和应用，该聚合物为所述的一氧化氮给体分子通过缩合聚合获得。并且通过自组装的方式可以形成纳米组装体，负载光敏剂后，在绿光触发下实现一氧化氮释放，进一步对细菌的杀灭实验表明，组装体具有很好的杀菌效果，并可以促进小鼠伤口愈合，达到治疗效果。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中的一氧化氮供体BNN-NO2的a)核磁氢谱、b)碳谱、c)质谱图和d)高效液相色谱曲线；
图2示出了本发明实施例1中的一氧化氮供体BNN的a)核磁氢谱、b)碳谱、c)质谱图和d)高效液相色谱曲线；
图3示出了本发明实施例2中的两亲性嵌段聚合物PBNN-NO2的a)核磁氢谱和b)凝胶渗透色谱(GPC)曲线；
图4示出了本发明实施例2中的两亲性嵌段聚合物PBNN的a)核磁氢谱和b)凝胶渗透色谱(GPC)曲线；
图5示出了本发明实施例3中的a)Ir@PBNN-NO2和b)Ir@PBNN聚合物纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片；
图6示出了本发明实施例4中的Ir@PBNN-NO2和Ir@PBNN聚合物纳米粒子在可见光辐照触发下一氧化氮释放的定量曲线；
图7示出了本发明实施例5中的Ir@PBNN-NO2聚合物纳米粒子在500nm光照下对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀灭效果的柱状图；
图8示出了本发明实施例6中的Ir@PBNN-NO2聚合物纳米粒子的细胞毒性。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本发明提供的一氧化氮给体分子、聚合物及其制备方法和应用进行具体地描述。
实施例1：一氧化氮供体小分子合成
制备一氧化氮释放基元，通过醛基与氨基反应生成席夫碱，接着进行席夫碱还原，最后通过亚硝化反应得到一氧化氮释放基元。该合成过程简单，操作容易。为了更清楚的帮助理解，以下主要选择其中一个结构化合物举例说明，具体反应式如下所示：
Figure BDA0003475737080000071
制备方法：5-羟基-2-硝基苯甲醛2.5g(15mmol)和2-溴乙醇3.75g(30mmol)溶于50mL乙腈中，澄清后加入4.15g无水碳酸钾，加热回流12h(避光)浓缩除去溶剂，得无色糖浆状液体；加入0.32g对苯二胺(3mmol)，溶于50mL乙醇，加热回流12h，抽滤，乙醇洗涤，得产物黄色固体1.2g(2.4mmol)。将得到的黄色固体产物溶解于30mL四氢呋喃和10mL甲醇中，再加入0.36g(10mmol)硼氢化钠，室温还原反应4h，反应完全，向反应结束后的混合液中加入少量稀盐酸，浓缩除去部分溶剂。将还原后的产物溶解于10mL四氢呋喃和2.5mL冰醋酸中，再加入1.03g(15mmol)亚硝酸钠水溶液20mL，冰浴条件下反应2h，有淡黄色固体析出，抽滤，干燥得淡黄色固体产物BNN-NO2 0.61g(1.1mmol)。BNN合成过程除原料更换成对醛基苯甲醇外，其余与上述过程类似。得到的淡黄色固体BNN-NO2和BNN的结构通过其核磁氢谱、核磁碳谱、高分辨质谱和高效液相色谱进行表征，结果显示于图1-2。
实施例2：一氧化氮供体聚合物合成
将实施例1得到的一氧化氮释放基元进一步通过缩合聚合制备到两亲性嵌段聚合物。具体反应式如下：
Figure BDA0003475737080000081
制备方法：将mPEG45-OH与上述光响应的一氧化氮释放单体(该一氧化氮给体分子可称为BNN-NO2或者BNN分子)混合，通过缩合聚合，得到可借助铱金属光敏剂作用在低强度可见光辐照条件下释放一氧化氮的两亲性嵌段聚合物。亲水嵌段为聚乙二醇(PEG)，其链段长度可以任意选择(如PEG聚合度m＝2～80)；疏水嵌段聚合度n可以在n＝2～30之间选择，可根据条件进行适当改变。为了更清楚地帮助理解，以下选用m＝45和n＝9的聚合物为例说明：
将150mg(0.27mmol)BNN-NO2分子、50mg HDI(六亚甲基二异氰酸酯，0.29mmol)和162mg(0.08mmol)mPEG45-OH加入10mL圆底烧瓶中，再加入1mL二甲基亚砜(DMSO)溶解。聚合反应18小时后，终止反应，所得聚合物溶液中加入少量四氢呋喃，沉淀于无水乙醚与甲醇的混合溶剂中，重复沉淀三次，真空烘箱干燥，得到微黄色聚合物PBNN-NO2 138mg(产率：56％)。两亲性嵌段聚合物PBNN的制备方式除供体分子不同外，其余与上述过程类似。得到的两亲性嵌段聚合物PBNN-NO2和PBNN的结构通过其核磁氢谱与凝胶渗透色谱GPC进行表征，结果显示于图3～4。核磁图谱和GPC数据都充分证明了所合成的聚合物结构。
实施例3：组装体纳米粒子构筑
通过实施例2得到的两亲性嵌段聚合物制备组装得到纳米粒子。采用共溶剂，纳米闪沉的方式组装，所用共溶剂可进行选择，不仅限于1,4-二氧六环、二甲基亚砜以及N,N-二甲基甲酰胺等；最终得到的纳米粒子粒径为20～200nm。具体如下：
将2mg两亲性嵌段聚合物PBNN-NO2或PBNN与0.4mg光敏剂Ir(ppy)3溶解于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，室温高速搅拌条件下闪沉于纯净水中，将制备的组装体放置于透析袋中(MWCO 14000Da)，室温透析于水中，透析12小时后除尽有机溶剂。得到纳米组装体，TEM结果证实为直径大小约50～80nm的纳米粒子，图5示出了所得纳米粒子的TEM表征结果。
实施例4：光照触发释放一氧化氮定量
通过Griess试剂定量一氧化氮的释放：使500nm LED(30mW/cm2)灯光照上述得到的纳米粒子组装体，取不同光照时间的组装体与等体积的Griess试剂混合，避光37℃培养10min后，测试混合后液体的紫外吸收光谱，并通过530nm处的吸光度定量一氧化氮释放量。
测试结果表明：随着光照时间的延长，聚合物纳米粒子释放一氧化氮的量逐渐增加，最终趋于平衡，说明该聚合物纳米粒子具有光响应性，并且可以实现一氧化氮的释放，图6示出了所得纳米粒子光照条件下释放一氧化氮的定量曲线。
实施例5：聚合物组装体Ir@PBNN-NO2用于细菌杀灭
具体操作是，取灭菌TSB液体培养基2.5mL加入细菌培养管中，使用接种环取固体琼脂板上的菌落转移至培养基中培养16～18小时，此为一次接种；再按照1:100的比例取一次接种菌液加入灭菌TSB液体培养基中，培养至对数生长期，通过离心洗涤以及稀释得到最终需要的菌液浓度为5*105CFU/mL。在96孔板中分别加入100μL不同浓度组装体溶液以及50μL菌液，500nm光照(30mW/cm2，30min)后，37℃培养10min，再稀释100倍取20μL进行平板涂布，置于细菌培养箱中37℃培养16h进行菌落计数，得到杀菌效果柱状图。
实验结果如图7所示，可以看到，在0.2g/L时光照30分钟即可杀灭98％以上的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。从结果可以看出，这种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发的一氧化氮释放材料能够在很低浓度下就可以有效杀灭革兰氏阳性细菌。证明这种材料在抗菌应用方面具有非常广阔的前景，为将来研究气体信号分子杀灭细菌提供了有效可靠的参考。
实施例6：聚合物组装体Ir@PBNN-NO2生物毒性
使用L929细胞(小鼠成纤维细胞)进行实验。使用96孔板进行实验，每孔种板密度(104个/孔)，设置四个浓度(分别为0.25,0.05,0.1,0.2g/L)与PBS空白组，每个浓度设置6组平行，每孔加入100μL，。细胞种板后37℃培养24h，使细胞贴壁，洗涤细胞，加入PBS和不同浓度组装体样品与完全培养基混合液200μL，继续培养24h。取5g/L的MTT溶液20μL加入到孔板中，37℃孵育4h。将孔板中的上清液吸出，加入100μLDMSO。在37℃摇床中震荡15min，使蓝紫色结晶甲臜充分溶解，用酶标仪读取490nm处的吸收值。计算并根据所得数据作出细胞存活率与组装体浓度图，如图8所示。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种可见光辐照触发释放的一氧化氮供体分子，其特征在于具有下式(I)所示的结构：
Figure FDA0003475737070000011
式(I)中，R1为氢、甲基或苯基；R2为取代或未取代的苯基。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮供体分子，其特征在于：
所述R2选自下式R2-1至式R2-8中的任一结构：
Figure FDA0003475737070000012
其中，
Figure FDA0003475737070000013
表示与亚甲基相连，*表示与氧原子相连。
3.根据权利要求1或2所述的一氧化氮供体分子，其特征在于所述一氧化氮供体分子为下式(I-1)至式(I-6)所示的任一结构：
Figure FDA0003475737070000014
4.一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发的一氧化氮供体聚合物，其特征在于其结构通式如下式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0003475737070000021
式(Ⅱ)中，R1为氢、甲基或苯基；R2为取代或未取代的苯基；m取值为2～80之间的任意整数，n取值为2～30之间的任意整数。
5.一种权利要求4所述的一氧化氮供体聚合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
以式(I)所示的一氧化氮供体分子为基元，与式(Ⅳ)所示的六亚甲基二异氰酸酯和式(Ⅲ)所示的聚乙二醇单甲醚混合，在引发剂二月桂酸二丁基锡的存在下其结构两端的羟基位置发生缩聚反应，该反应在惰性氛围下进行，最终得到具有式(Ⅱ)所示结构的在可见光触发下释放一氧化氮的两亲性嵌段聚合物；
Figure FDA0003475737070000022
6.一种铱金属光敏剂调控的可见光辐照触发的一氧化氮供体聚合物的应用，其特征在于：
所述一氧化氮供体聚合物用于制备负载型疏水药物，包括如下步骤：
首先将一氧化氮供体聚合物自组装得到直径为20～200nm的聚合物纳米组装体；随后负载光敏剂，从而实现在氧气存在条件下使用低强度可见光辐照触发一氧化氮可控释放。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述一氧化氮供体聚合物通过加水或纳米闪沉的方式自组装得到直径为20～200nm的聚合物纳米组装体。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述一氧化氮供体聚合物用于制备杀菌药物。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述低强度可见光为光辐照度10～50mW/cm2的可见光。
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