CN114394670A - 一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用。本发明从金矿区分离获得一株小球藻(Chlorella thermophila)MEM‑A‑407，于2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20211114。该藻株可以在10℃‑40℃±5℃的温度下生长，耐受pH值为3‑11，耐受不同浓度的Pb2⁺和Cu²⁺离子，可用于去除废水中的重金属离子，为水生和陆生动植物群提供良好的生长环境。

Description

一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用。

背景技术

重金属(HMs)污染对生物体有严重的健康风险，并且由于HMs的高毒性以及它们的不可生物降解性和在食物链和生物体中的积累，导致环境质量越发恶化。许多行业将HMs直接或间接释放进河流或海水中，这是一个不容忽视的公众关注的问题。考虑到这一点，世界卫生组织和(WHO)以及美国环境保护署(USEPA)已经制定了严格的规定，规定了向环境中排放的HMs的允许水平。在HMs中，铜(Cu)和铅(Pb)具有剧毒，属于非常常见的环境污染物。除了常规使用的物理化学方法外，研究人员已经尝试了各种去除HMs的技术，最近，使用生物方法的逐渐兴起，很多研究都把目光放在了使用微藻去除HMs上。

目前，许多研究用于去除HMs的微藻藻株的效率不足以耐受高浓度的Cu和Pb，即使能耐受，也会由于不同的HMs浓度、温度和pH值，而影响其生长繁殖。因此，迫切需要发现一种能够在一种或多种HMs污染的水体中，以及在不同环境条件下健康生长的新型环境广适性微藻。

从富铅位点分离的嗜热小球藻(Chlorella thermophila)可以在不同的环境条件下健康生长，包括(1)温度范围在10℃到40℃±5℃之间，(2)pH值范围从3到11，以及(3)耐受海水中铅离子(Pb²⁺)和铜离子(Cu²⁺)的浓度可达150-200ppm。这种藻类是运用于不同环境中的优良生物，可用于从受污染的水体中去除重金属，以维护绿色无污染环境的长久性。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用，该藻株可耐受0～160ppm的Pb²⁺和Cu²⁺离子，可用于去除废水中的重金属离子，为水生和陆生动植物群提供良好的生长环境。

本发明从铅(Pb)矿场收集土壤和水样，从中分离出一株微藻，编号MEM-A-407。经18S rRNA基因测序，结合局部序列比对搜索工具(BLAST)和系统发育分析，鉴定为小球藻(Chlorella thermophila)。

MEM-A-407藻株于2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20211114。

试验结果显示，该藻株具有高度的重金属耐受性，能在极其恶劣的条件下生长，可耐受铅离子(Pb²⁺)和铜离子(Cu²⁺)范围从几个ppm到200ppm，温度从10℃到40℃±5℃之间，可耐受pH值在3-11之间，在上述条件下生长良好。因此，这株新分离到的藻株是良好的的生物材料，可以在指定或自然条件下以生态友好的方式经济地去除HMs，净化水质。

所述小球藻MEM407的18S rRNA基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的小球藻在处理重金属废水中的应用。其中，所述重金属包括铅和铜。

本发明测试通过小球藻MEM-A-407在高浓度金属下(铅和铜)的存活和增殖情况，发现MEM-A-407对铅和铜均具有明显的耐受性/抗性，表明可以去除废/污水中的重金属。

实验表明，小球藻MEM-A-407可耐受0～160ppm的Pb²⁺和Cu²⁺离子。

本发明还提供一种重金属处理剂，包括保藏编号为CCTCCNO:M20211114小球藻。

本发明还提供一种重金属废水的处理方法，将所述的小球藻MEM407于废水中进行培养，或本发明所述的重金属处理剂添加到含重金属的废水中。

本发明分离获得的小球藻MEM-A-407具有多种特性，可以在10℃-40℃±5℃的温度下生长，耐受pH值为3-11，耐受不同浓度的Pb²⁺和Cu²⁺离子，可用于去除废水中的重金属离子，为水生和陆生动植物群提供良好的生长环境。

生物保藏说明

小球藻MEM-A-407(Chlorella thermophila MEM-A-407)，于2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20211114。

附图说明

图1为微藻培养前后藻体颜色的变化情况；

图2为纯化和重复平板划线法对微藻进行纯化的结果；

图3为显微镜镜下新型分离株嗜热小球藻菌株的形态图，显微镜的放大倍数为100X；

图4为不同培养时间下MEM-A-407在液体培养基中的生长情况；

图5为1％琼脂糖凝胶电泳图，显示了新分离到藻株嗜热小球藻的18SrRNA基因的PCR扩增产物。泳道M是DL2000 DNA maker泳道1是18S rRNA基因扩增产物；

图6为使用MEGA-X软件获得的分离株嗜热小球藻18S rRNA基因序列的系统发育树；

图7为MEM-A-407在0ppm、10ppm、20ppm和40ppm铅和铜浓度下的生长模式；(a)铅(Pb)，和(b)铜(Cu)；

图8为MEM-A-407在0ppm、80ppm、120ppm和160ppm铅和铜浓度下的生长模式；(a)铅(Pb)和(b)铜(Cu)。

具体实施方式

本发明公开了一种小球藻及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1藻株的分离鉴定

(1)采集土壤和水样。

(2)样品到达实验室后，将石头、鹅卵石和稻草移走清洗样品，样品置于4℃待用。

(3)将土壤样品彻底混合，将具有代表性的10-15g土壤和(或)10mL均匀混合的水样加入100ml F/2培养基中，并添加20ppm浓度的铅(Pb²⁺)和铜(Cu²⁺)离子，在250ml锥形瓶中培养。

(4)藻类分离过程中使用的藻类培养基的组成如下。

步骤一：母液的制备：

表1

步骤二：

按照表2配制母液，121℃加热灭菌15分钟，加入步骤一制备的溶液中表2母液配方组成

表3微量元素母液的组成

按照表3配制好的溶液在121℃下加热灭菌20分钟并储存备用。

(4)将烧瓶在25℃和100μmol m^-2s^-1的恒定光照强度下培养16小时光照和8小时黑暗期，直到藻体颜色可见(图1)。

(5)在平板上散布藻悬液数天后，观察到近似均匀的混合微藻与真菌污染。选取生长速度快的微藻菌株，通过反复扩散和划线板法进行纯化，获得藻株MEM-A-407，见图2。于显微镜下进行形态学观察，发现MEM-A-407是一种直径约为10-20μm的呈绿色圆形的微藻，结果见图3。

(5)将纯化的MEM-A-407藻株接种至液体培养基，每隔24小时测定OD值(图4)。

PCR法扩增18S rRNA基因：收集1.0mL海藻培养物，提取基因组，扩增18S rRNA基因。PCR反应体系如下：

表4

PCR反应条件如下：

表5

(6)18S rRNA基因扩增子见图5，经桑格双脱氧测序分析其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

(7)使用Basic Alignment Search Tool(BLAST)和系统发育分析鉴定藻种。

利用NCBI的BLAST寻找与新分离株的18S rRNA基因序列高度相似的标准核苷酸序列。利用Mega-X软件对选定的序列进行比对，并采用1000bootstrap方法构建邻接系统进化树，如图6。

结合形态学、18S rRNA基因测序、局部序列比对搜索工具(BLAST)和系统发育分析，MEM-A-407藻株被鉴定为小球藻Chlorella thermophila。

实施例2MEM-A-407在不同浓度的Pb2+，Cu2+水体中的生长情况

分别配制Pb²⁺和Cu²⁺浓度为0ppm、10ppm、20ppm和40ppm的100mL F/2培养基，并将其添加到单独的管式生物反应器中。按照下述条件接种嗜热小球藻至管式生物反应器中，接种浓度OD₇₅₀为0.30，温度25℃，光照周期16小时(明)：8小时(暗)，光照强度50μmol/m^-2/s^-1。为了测试嗜热小球藻的存活率和生长率，每2天测量一次OD₇₅₀，总共10天(图7a、b)。结果表明，在这三种浓度的Pb²⁺和Cu²⁺下，对藻株MEM-A-407的生长没有影响。

实施例3 MEM-A-407在不同浓度的Pb2+，Cu2+水体中的生长情况

在F/2培养基中添加0ppm、80ppm、120ppm和160ppm浓度的Pb²⁺和Cu²⁺，然后，将嗜热小球藻接种至与上一节温度，光照周期，光照强度条件相同的管式生物反应器中。OD₇₅₀的测量表明，80ppm和120ppm的浓度改藻株株生长没显着影响，然而，在160ppm的浓度下，生长相对缓慢，但该藻小仍能生长繁殖(图8a、b)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用

<130> MP21029191

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtagtgacaa taaataacaa taccgggcct tttcaggtct ggtaattgga atgagtacaa 60

tctaaacccc ttaacgagga tcaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat 120

tccagctcca atagcgtata tttaagttgc tgcagttaaa aagctcgtag ttggatttcg 180

ggtggggcct gccggtccgc cgtttcggtg tgcactggca gggcccacct tgttgccggg 240

gacgagctcc tgggcttcac tgtccgggac tcggagtcgg cgctgttact ttgagtaaat 300

tagagtgttc aaagcaggcc tacgctctga atacattagc atggaataac acgataggac 360

tctggcctat cctgttggtc tgtaggaccg gagtaatgat taagagggac agtcgggggc 420

attcgtattt cattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat gaaagacgaa ctactgcgaa 480

agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca agaacgaaag ttgggggctc gaagacgatt 540

agataccgtc ctagtctcaa ccataaacga tgccgactag ggatcggcgg atgtttcttc 600

gatgactccg ccggcacctt atgagaaatc aaagtttttg ggttccgggg ggagtatggt 660

cgcaaggctg aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca ccaggcgtgg agcctgcggc 720

ttaatttgac tcaacacggg aaaacttacc aggtccagac atagtgagga ttgacagatt 780

gagagctctt tcttgattct atgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtgggttgc 840

cttgtcaggt tgattccggt aacgaacgag acctcagcct gctaaatagt cacggttggc 900

tcgccagccg gcggacttct tagagggact attggcgact agccaatgga aagcatgagg 960

caataacagg tctgtgatgc cc 982

Claims (6)

1.保藏编号为CCTCC NO:M20211114的小球藻(Chlorella thermophila)。

2.根据权利要求1所述的小球藻，其特征在于，其18S rRNA基因片段的序列如SEQ IDNO.1所示。

3.权利要求1或2所述的小球藻在处理重金属废水中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重金属为铅和/或铜。

5.一种重金属处理剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的小球藻。

6.一种重金属废水的处理方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的小球藻于废水中进行培养，或将权利要求5所述的重金属处理剂添加到含重金属的废水中。

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