CN114381458A - 基于液滴pcr的东方恙虫定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒。本发明提供了具有如SEQ ID NO.1～6所示核苷酸序列的引物、具有如SEQ ID NO.7和8所示核苷酸序列的探针。本发明灵敏性好，远低于荧光定量PCR的检测限，避免可能出现的假阴性；可同时进行两个检测通道和一个内控通道的检测，减少了多次加样可能造成的污染；多重数字PCR实现芯片内液滴数的绝对定量，无需依赖标准曲线，定量结果更加准确。

Description

基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒。
背景技术
恙虫病是由东方恙虫感染导致的自然疫源性疾病，中间宿主是恙螨，主要通过叮咬传播至人体。恙虫病的主要症状包括发烧、皮疹、肌痛、淋巴结肿大、恶心、呕吐、焦痂(在螨咬伤部位出现黑点)、腹痛和非特异性流感等，同时可能会有多种并发症：黄疸、急性肾功能衰竭和弥散性血管内凝血(DIC)、急性呼吸窘迫综合征、心肌炎和脑膜脑炎，甚至多器官衰竭。令人头疼的是，恙虫病的症状与钩端螺旋体病、登革热、布鲁氏菌病和伤寒等疾病类似，这使得鉴别诊断十分困难。恙螨叮咬部位出现焦痂是临床诊断恙虫病的特异性标志物(98.9％)，然而，焦痂的存在在患者中的差异很大，从7％～97％不等，尤其是印度和其他亚洲人群中焦痂的存在量很少，不适合用于诊断东方恙虫，因此，诊断更依赖于实验室检测。恙虫病的实验室诊断依赖于血清学检测，如Weil-Felix检测、间接免疫荧光检测、间接免疫过氧化物酶检测、酶联免疫吸附检测(ELISA)和免疫层析检测(ICT)等，其中ELISA检测IgM对诊断恙虫病最为可靠。然而，血清学检测仍存在灵敏度特异性不足、操作繁琐、技术要求高，成本需求大等弊端，尤其是灵敏度不够，限制了其诊断价值。
另一方面，基于分子的方法，如聚合酶链反应(PCR)，对恙虫病的诊断具有应用价值。目前，PCR具有检测周期短、高灵敏高特异等优点，同时，定量PCR可用于监测治疗效果和预后评估，极具临床意义。主流的分子检测以荧光定量PCR为主，但随着技术的发展，新一代分子检测技术——数字PCR逐渐崭露头角。数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其核心是通过大规模单分子扩增实现拷贝数的直接绝对定量，直接获知目标核酸分子的个数，提高了检测灵敏度和准确度。数字PCR具有超高灵敏度、高特异性、绝对定量、高耐受性等优势，能够早期、快速、准确、定量的诊断东方恙虫。
而荧光定量PCR的灵敏度低于数字PCR，可造成漏检，出现假阴性；再者，荧光定量PCR通常只能做到两个荧光通道同时检测，无法兼顾内控通道。或者检测两份，即分别采用两个基因和一个内控基因构成检测体系；最后，荧光定量PCR实现拷贝数的定量依赖于标准曲线，经已知浓度标准品推算未知浓度的样本，没有实现真正的绝对定量。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒，该引物或试剂盒具有灵敏度高、多靶标性、绝对定量的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物，其具有：
(I)、如SEQ ID NO.1～6中任意所示的核苷酸序列；或
(II)、如(I)所示的核苷酸序列的互补序列；或
(III)、如(I)或(II)所示的苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(I)或(II)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或
(IV)、与(I)～(III)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。
本发明提供了探针，其具有：
(V)、如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或
(VI)、如(V)所示的核苷酸序列的互补序列；或
(VII)、如(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(V)或(VI)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或
(VIII)、与(V)～(VII)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，上述探针具有VIC荧光基团和/或MGB。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的修饰为成倍扩增。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的取代为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的缺失为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，对核苷酸序列的添加为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个和/或10个碱基。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的引物组的核苷酸序列与上述引物组的核苷酸序列的同源性为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本发明还提供了引物探针组，其包括上述引物和/或上述探针。
本发明还提供了上述引物、上述探针和/或上述引物探针组在制备东方恙虫的定性和/或定量试剂盒中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述试剂盒适用于进行数字PCR。
本发明还提供了试剂盒，其包括上述引物、上述探针和/或上述引物探针组，以及可接受的辅料和/或助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，上述述试剂盒适用于进行数字PCR。
在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒的反应体系包括：
3μL5Xmix；
0.15μL初始浓度为100μM的上游引物；
0.15μL初始浓度为100μM的下游引物；
0.0375μL初始浓度为100μM的探针；
模板和ddH2O；共15μL。
在本发明的一些具体实施方案中，上述试剂盒的扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15s，56～62℃退火延伸30s，返回变性然后退火延伸，如此循环39次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述的辅料或助剂包括DMSO、TMAC、SSB、甲酰胺、海藻糖、甜菜碱、非离子型洗涤剂、dNTPs、UDG酶、Tth酶和/或MgCl2中的一种或多种。
本发明还提供了东方恙虫的检测方法，其包括使用上述引物、上述探针和/或上述引物探针组对待测样品扩增、检测；或使用上述试剂盒对待测样品进行扩增检测。
本发明还提供了检测装置，其包被有上述引物、上述探针和/或上述引物探针组。
在本发明的一些具体实施方案中，上述检测装置包括芯片或其他可接受的载体。
本发明的引物以及试剂盒有如下效果：
(1)多重数字PCR的检测限远低于荧光定量PCR的检测限，避免可能出现的假阴性；
(2)多重数字PCR同时进行两个检测通道和一个内控通道，检测量高于荧光定量PCR，并减少了多次加样可能造成的污染；
(3)多重数字PCR实现芯片内液滴数的绝对定量，无需依赖标准曲线，定量结果更加准确。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示淘汰引物探针组的假阳性检测结果；横坐标为芯片上微液滴孔数；纵坐标为VIC(东方恙虫)；灰色散点表示不含东方恙虫，阴性；绿色散点表示含有东方恙虫；
图2示东方恙虫阳性二维图(低丰度水平)；左下角灰色液滴表示阴性；右下角紫色散点表示A425内参阳性、东方恙虫阴性；左上角绿色散点表示东方恙虫阳性、A425内参阴性；右上角散点表示内参和东方恙虫皆阳性；
图3示东方恙虫阳性二维图(高丰度水平)；左下角灰色液滴表示阴性；右下角紫色散点表示A425内参阳性、东方恙虫阴性；左上角绿色散点表示东方恙虫阳性、A425内参阴性；右上角散点表示内参和东方恙虫皆阳性；
图4示阴性质控一维图；横坐标为芯片上微液滴孔数；纵坐标为VIC(东方恙虫)；灰色散点表示不含东方恙虫，阴性；若出现绿色散点则表示含有东方恙虫；
图5示一代测序验证结果的测序峰图；
图6示一代测序验证结果的NCBI比对结果。
具体实施方式
本发明公开了基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的主要目的在于，建立一种高灵敏度、多靶标性、绝对定量的多重数字PCR诊断东方恙虫。
本发明前期通过东方恙虫的基因组分析，确定了东方恙虫多个基因的多个靶位点，设计多对特异性引物，并优化引物混合体系，优化荧光信号及算法，经模拟样本的核酸、东方恙虫纯培养物、临床样本验证，确保检测性能真实可靠，力求广覆盖、多靶标诊断，为临床诊疗恙虫病提供充足依据，以达到降低死亡率、缩短住院时间、减少抗菌药物使用、降低医疗成本的目标。
数字PCR检测灵敏度较荧光定量PCR更低，能够检测低丰度东方恙虫的样本，更能精准诊断病原体。临床样本检测发现，低丰度东方恙虫的样本经数字PCR检测阳性，实时荧光定量PCR和宏基因组测序均为阴性，采用一代测序验证后发现，确实为东方恙虫感染的样本(见实施例3)。
本发明的引物探针特异性高；灵敏度强，目前发现能够检测到低至2.69copies/μL，避免了荧光定量PCR可能出现的假阴性；同时进行两个检测通道和一个内控通道，减少了加样可能造成的污染，液滴中实现绝对定量，无需利用标准曲线。
本发明提供的检测引物、探针或其组合，以及检测试剂、检测试剂盒中，所用原料及试剂均可由市场购得。本发明中所用仪器分别为：全自动核酸提取仪(领航Auto-Pure108)、样本制备仪(领航DG32)、PCR扩增仪(领航TC1)、生物芯片阅读仪(领航CS5)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：样品检测
1、引物探针序列
依据东方恙虫的保守区序列，采用Primer express软件设计引物探针，经过多方比对和序列分析，选择特异性优异的2对引物，扩增产物为73～74bp，可以高效扩增。同时，为了减少体系的非特异性结合，探针序列CCCCCAAAAA同时存在于选定的扩增产物内(2对引物共用一个探针)，且不存在于东方恙虫其他序列上，具有唯一性。具体信息如表1所示：
表1引物及探针序列
Figure BDA0003532174870000061
前期引物设计和选择时，其他引物存在假阳性结果灵敏度不够等问题，例如以下引物探针组：
ORF-F3：CACATACTCAATCAATCAACAACGAA(SEQ ID NO.9)
ORF-R3：GATCGCGGTTTCATTTCTAATAACTA(SEQ ID NO.10)
ORF-P3：VIC-CACTGTTAATGAGCTAATC-MGB(SEQ ID NO.11)
采用该引物探针组进行数字PCR检测阴性对照(NTC)时，出现假阳性结果。如图1，VIC一维图，可见散在出现的绿色荧光点，为阳性点，即检测NTC时出现了东方恙虫阳性结果，表明该对引物的特异性差。
另外，采用本专利中的引物(F1-R1-F2-R2-P)和被淘汰的引物(F3-R3-P3)同时检测同一份阳性样本(样本1，2，3)，F1-R1-F2-R2-P检测浓度明显高于F3-R3-P3，可见采用双引物单探针(F1-R1-F2-R2-P)的检测性能更优(表2)。
表2引物探针组之间的比较
Figure BDA0003532174870000071
2、样品
(1)模拟样本的核酸：东方恙虫的靶基因基因由生物公司合成，溶解DNA粉末后稀释100倍，500倍冷冻备用。
(2)内对照基因：采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提口腔脱落细胞的基因组DNA，稀释到5ng/μL备用。
(3)病原体纯培养物：经适宜条件培养出的东方恙虫，经DNA提取试剂盒提取总DNA，冷冻备用。
(4)临床样本：东方恙虫患者血浆样本，冷冻备用。
3、核酸提取
(1)离心取血浆后采用领航基因的核酸提取纯化试剂盒提取cfDNA，提取时加入合成的DNA片段(内参)用于质控。
(2)用(1)所述试剂盒对ddH2O进行提取，作为质控。
(3)所有提取过程均在全自动核酸提取仪(领航Auto-Pure 108)上完成。
4、检测体系
检测体系如表3所示，扩增试剂(如5X mix)采用领航基因科技(杭州)有限公司的专用试剂。其中东方恙虫为VIC标记，内参为A425标记。
表3检测体系
Figure BDA0003532174870000081
检测体系配制完毕，加入芯片孔中，使用样本制备仪(领航DG32)生成芯片液滴，用于下一步扩增。
5、扩增程序
采用PCR扩增仪(领航TC1)扩增芯片，扩增程序如表4所示：
表4扩增程序
Figure BDA0003532174870000082
6、检测结果
扩增后的芯片，经生物芯片阅读仪(领航CS5)读取结果。内参提取、扩增均正常，血样样本中检出东方恙虫，对照水中无检出。检测结果散点图如图2、图3和图4所示。图2为低丰度水平的东方恙虫阳性二维图；图3为高丰度水平的东方恙虫阳性二维图，图中横坐标为A425(内参)，纵坐标为VIC(东方恙虫)。左下角灰色液滴表示阴性；右下角紫色散点表示A425内参阳性、东方恙虫阴性；左上角绿色散点表示东方恙虫阳性、A425内参阴性；右上角散点表示内参和东方恙虫皆阳性。图4为阴性质控一维图，横坐标为芯片上微液滴孔数；纵坐标为VIC(东方恙虫)；灰色散点表示不含东方恙虫，阴性，若出现绿色散点则表示含有东方恙虫。具体拷贝数如表5所示。
表5检测结果
Figure BDA0003532174870000091
检测结果换算为拷贝数的计算过程如下：
例：
A*15/8*60/1＝A*112.5copies/μL
注：A为数字PCR输出值；
15为液滴生成所用的体积；
8为核酸上样量；
60是提取DNA洗脱量。
低丰度东方恙虫的样本经数字PCR检测阳性，实时荧光定量PCR和宏基因组测序均为阴性。采用巢式PCR对低丰度样品进行扩增，引物如表6所示，扩增体系如表7所示，扩增程序如表8所示。采用一代测序对扩增产物进行验证后发现，确实为东方恙虫感染的样本。一代测序峰图如图5所示；测序结果的NCBI Blast比对结果如图6所示。
表6巢式PCR引物
序列名 序列 编号
外围F ATCAGTACTAATTCCAATCGAAAAATA SEQ ID NO.12
外围R CTTGGAGAATCAACTGTATGCAA SEQ ID NO.13
内围F GTTACTAACACTATCTTTAAAACAGCATTAA SEQ ID NO.14
内围R CTAAATGCTAAAGGTGATGAGGTTA SEQ ID NO.15
表7巢式PCR扩增体系
组分 含量/μL
10×buffer 2
dNTPs 0.5
酶 0.4
外围F(10μM) 0.3
外围R(10μM) 0.3
内围F(10μM) 0.3
内围R(10μM) 0.3
模板 5
水 10.9
表8巢式PCR扩增程序
Figure BDA0003532174870000101
实施例2：特异性试验
采用本发明的引物(F1-R1-F2-R2-P)同时检测多种常见病原体，包括链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌。所有的病原体均为经MALDI-TOF鉴定的纯培养物，混到阴性血浆中，形成模拟样本。按照实施例1中所述的试验方法进行特异性试验，未检出阳性结果，表明引物的特异性高，检测结果如表9所示。
表9特异性试验结果
Figure BDA0003532174870000111
实施例3：灵敏度试验
阴性血浆加入东方恙虫(10～20copies/mL)，采用数字PCR和荧光定量PCR同时检测各组样本，数字PCR检测为阳性，而荧光定量PCR检测为阴性，相关检测结果如表10所示。
表10灵敏度试验结果
Figure BDA0003532174870000112
实施例4：重复性试验
同一份东方恙虫样本，分装成5份，冻存在-80℃冰箱，分5天检测，验证其重复性，检测结果如表11所示，重复性好。
表11重复性试验结果
天数 D1 D2 D3 D4 D5
东方恙虫(copies/μL) 128.5 135.1 139.4 119.2 124.4
内参(copies/μL) 108.4 113.7 102.8 113.2 104.2
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省人民医院
<120> 基于液滴PCR的东方恙虫定量检测试剂盒
<130> MP21035742
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcatttggc gataacaaga tattg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcagagcagt tactgctttt atgtg 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggttagata tgcagtgttt gttgatac 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgatacaaga agttttatta attaatgcag g 31
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggaaaggta acccaggtaa a 21
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attactctta acttttaagc cgggag 26
<210> 7
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cccccaaaaa a 11
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acacacactc tctctc 16
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacatactca atcaatcaac aacgaa 26
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatcgcggtt tcatttctaa taacta 26
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cactgttaat gagctaatc 19
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcagtacta attccaatcg aaaaata 27
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cttggagaat caactgtatg caa 23
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttactaaca ctatctttaa aacagcatta a 31
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctaaatgcta aaggtgatga ggtta 25

Claims (10)

1.引物，其特征在于，具有：
(I)、如SEQ ID NO.1～6中任意所示的核苷酸序列；或
(II)、如(I)所示的核苷酸序列的互补序列；或
(III)、如(I)或(II)所示的苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(I)或(II)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或
(IV)、与(I)～(III)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。
2.探针，其特征在于，具有：
(V)、如SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；或
(VI)、如(V)所示的核苷酸序列的互补序列；或
(VII)、如(V)或(VI)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(V)或(VI)的相同或相似，所述多个为2个至10个；或
(VIII)、与(V)～(VII)任意所示的核苷酸序列同源性达到不低于80％的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，具有VIC荧光基团和/或MGB。
4.引物探针组，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和/或如权利要求2或3所述的探针。
5.如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组在制备东方恙虫的定性和/或定量试剂盒中的应用。
6.试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组，以及可接受的辅料和/或助剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其反应体系包括：
3μL 5X mix；
0.15μL初始浓度为100μM的上游引物；
0.15μL初始浓度为100μM的下游引物；
0.0375μL初始浓度为100μM的探针；
模板和ddH2O；共15μL。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，其扩增程序包括：95℃预变性5min；95℃变性15s，56～62℃退火延伸30s，返回变性然后退火延伸，如此循环39次。
9.东方恙虫的检测方法，其特征在于，包括使用如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组对待测样品扩增、检测；或使用如权利要求6至8任一项所述的试剂盒对待测样品进行扩增检测。
10.检测装置，其特征在于，包被有如权利要求1所述的引物、如权利要求2或3所述的探针和/或如权利要求4所述的引物探针组。
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