CN114377000A - 普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用，涉及药物新用途的技术领域。本发明发现普瑞巴林在放射性脑损伤小鼠模型中能抑制炎症因子的升高和抑制放射性脑损伤导致的小胶质细胞活化，进一步改善了炎症诱导的神经元损伤和凋亡，而且未见明显的副作用。所述普瑞巴林可用于开发预防或治疗放射性脑损伤的新型药物，具有广阔的医用前景和经济价值。

Description

普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物新用途的技术领域，具体涉及普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用。

背景技术

放疗是治疗头颈部肿瘤最有效的方法之一。鼻咽癌(NPC)是我国最常见的头颈部恶性肿瘤，其具有地域性的流行病学特点，尤其以我国南方发病率最高，每10万人中便有患病人数30-50例。鼻咽癌的病理类型绝大多数为非角化型未分化性癌，并与EB病毒感染有密切关系。由于其解剖结构及病理特殊性，具有高度射线敏感性，放射治疗成为鼻咽癌首选的治疗方式。放射治疗对头颈部肿瘤的治疗已广泛应用于临床，但放射治疗对神经损伤的风险较大。临床治疗发现，鼻咽癌患者经放射治疗后，30％患者出现放射性脑损伤，病理改变表现为脑部水肿、脑实质坏死以及脑微出血，同时伴有癫痫和意识障碍等症状，这严重影响患者的生活质量。针对放射性脑损伤，目前临床上多数采用高压氧、糖皮质激素、神经生长因子、贝伐单抗等药物治疗，但这些药物仅可以在一定程度上缓解放射性脑损伤并改善患者的生活质量，病理上对放射导致的炎症反应和小胶质细胞过度活化的改善效果并不显著。由于炎症反应在放射性脑损伤中扮演着至关重要的角色，针对此靶点的药物研究甚少，同时，目前对放射性脑损伤的神经保护还没有有效的治疗和预防方法，随着病患的逐年增加，因此新的治疗防护方法迫切需要。

普瑞巴林作为缓解神经痛的药物在临床上已经广泛使用，并得到一致的认可，其可以通过抑制神经元离子通道依赖性的疼痛递质的释放来缓解放射性神经痛。但是，普瑞巴林是否还有其它潜在的药理作用目前不明确。因此，进一步探讨普瑞巴林的药理机制，将会有助于临床上进一步对药物的使用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用。

普瑞巴林是一种抗癫痫药，临床上主要治疗带状疱疹后神经痛。普瑞巴林作为缓解神经痛的药物在临床上已经广泛使用，并得到一致的认可，其可以通过抑制神经元离子通道依赖性的疼痛递质的释放来缓解放射性神经痛。但是，普瑞巴林是否还有其它潜在的药理作用目前不明确。因此，进一步探究普瑞巴林的药理机制，将会有助于临床上进一步对药物的使用。

发明人在研究中意外发现普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤，而且未见明显的副作用。因此，普瑞巴林可用于开发用于预防或治疗放射性脑损伤的新型药物，具有广阔的医用前景和经济价值。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述放射性脑损伤为头颈部肿瘤放射治疗导致的放射性脑损伤。其中头颈部肿瘤包括常见的鼻咽癌以及脑转移瘤。

本发明还提供普瑞巴林在制备用于抑制放射性脑损伤导致的炎症反应的药物中的应用。

本申请发明人研究发现，放射性脑损伤囊性病灶及脑脊液中含有大量炎性介质如IL-1β、TNF-α、COX-2，且升高的炎性介质水平与放射后脑损伤严重程度呈正相关，提示放射后炎症微环境的形成可能参与放射性脑损伤。发明人经过大量实验发现，在放射性脑损伤小鼠模型中，普瑞巴林可以抑制炎症因子的升高，提示其具有抑制炎症的效果。

本发明还提供普瑞巴林在制备用于抑制放射性脑损伤导致的小胶质细胞的活化的药物中的应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物通过作用于神经元并降低神经元中HMGB1蛋白的核转位和分泌，进而抑制小胶质细胞的活化。

小胶质细胞是中枢神经系统参与炎症反应的最主要细胞，本申请发明人研究发现脑损伤病灶中小胶质细胞胞体明显变大，并且突起缩短，这表明小胶质细胞被激活。而且放射后活化的小胶质细胞可分泌大量炎症介质引起神经元的凋亡，抑制海马颗粒下层神经再生，引起脑损伤。发明人经过大量实验发现，普瑞巴林治疗后，大脑皮层和海马区小胶质细胞的胞体大小和CD68的表达均显著性降低，表明普瑞巴林抑制放射性脑损伤导致的小胶质细胞活化。

本发明还提供普瑞巴林在制备用于抑制放射性脑损伤导致的神经元二次损伤的药物中的应用。

本发明还提供普瑞巴林在制备用于改善放射性脑损伤导致的神经元的损伤和凋亡的药物中的应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物的使用量为每日30mg/kg体重。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物经静脉注射给药。

本发明还提供一种用于预防或治疗放射性脑损伤的药物组合物，包括普瑞巴林和药学上可接受的辅料。

本发明的有益效果：本发明提供的普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用，普瑞巴林不仅可以抑制神经元离子通道依赖性的疼痛递质的释放、抑制小胶质细胞活化减少致炎因子产生和改善神经元的损伤和凋亡，本发明将普瑞巴林应用于预防或治疗放射性脑损伤，不仅为制备预防或治疗放射性脑损伤的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了普瑞巴林新的药用价值。

附图说明

图1：A：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠治疗的实验流程图；B：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠炎症因子IL-1β的影响；C：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠炎症因子IL-6的影响；D：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠炎症因子TNF-α的影响；E：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠炎症因子COX-2的影响。

图2：A：单细胞测序实验发现放射后相关炎症因子主要表达在小胶质细胞；B：免疫荧光实验检测小胶质细胞的胞体大小和活化情况；C：放射性脑损伤小鼠模型中小胶质细胞的胞体大小变化情况；D：放射性脑损伤小鼠模型中小胶质细胞的活化情况；E～G：大脑皮层和海马区(CA1和DG)小胶质细胞的胞体大小和CD68的表达情况；H：大脑皮层和海马区(CA1和DG)小胶质细胞的胞体大小变化情况；I：大脑皮层和海马区(CA1和DG)小胶质细胞的活化情况。

图3：A：原代小胶质细胞中IL-6、TNF-α的mRNA水平；B：BV2小胶质细胞中IL-1β、TNF-α和ICAM-1的mRNA水平；C：普瑞巴林作用后BV2小胶质细胞IL-6的蛋白表达水平；D：普瑞巴林作用后BV2小胶质细胞TNF-α的蛋白表达水平；E：普瑞巴林作用后BV2小胶质细胞IL-6和TNF-α的蛋白表达水平；F：普瑞巴林通过作用神经元抑制小胶质细胞炎症反应的实验流程图；G：不同条件处理的神经元上清孵育小胶质细胞对相关炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平的影响；H：普瑞巴林作用神经元后对小胶质细胞IL-1β蛋白的分泌变化；I：普瑞巴林作用神经元后TNF-α蛋白的分泌的影响。

图4：A：普瑞巴林对神经元功能的影响实验流程图；B～C：辐照后的BV2小胶质细胞上清孵育神经元对神经元树突的影响；D：损伤后的神经元上清孵育BV2小胶质细胞后相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、INOS和ICAM-1的mRNA水平变化；E：小胶质细胞的活化导致神经元二次损伤的原理图；F：共培养原代神经元和小胶质细胞实验图；G：原代神经元和小胶质细胞共培养中，经普瑞巴林处理后小胶质细胞的炎症因子的mRNA水平的变化；H：普瑞巴林作用后小胶质细胞IL-1β蛋白的分泌变化；I：普瑞巴林作用后小胶质细胞TNF-α蛋白的分泌变化J：普瑞巴林作用后神经元树突形态的变化；K：普瑞巴林作用后神经元树突数目的变化。

图5：TUNEL染色实验检测普瑞巴林对神经元凋亡的影响；B：免疫荧光实验通过caspase 3/Neu N抗体检测普瑞巴林对神经元凋亡的影响；C：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠大脑皮层神经元数目的影响；D：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠海马CA1神经元数目的影响；E：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠海马CA3神经元数目的影响；F：普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠海马DG神经元数目的影响。

图6：A：Q-PCR实验筛选放射性脑损伤小鼠中主要表达在神经元上的相关趋化因子的变化；B：Q-PCR实验筛选放射性脑损伤小鼠经普瑞巴林治疗后相关趋化因子的变化；C：Q-PCR实验验证普瑞巴林对损伤的神经元中HMGB1的mRNA水平的影响；D：放射性脑损伤小鼠检测HMGB1主要表达在神经元上；E：免疫荧光实验检测普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠神经元HMGB1核转位的影响；F：普瑞巴林抑制放射性脑损伤小鼠神经元HMGB1的核转位；G：免疫荧光实验检测普瑞巴林对损伤的神经元HMGB1核转位的影响。H：普瑞巴林抑制损伤的神经元中HMGB1的核转位；I：神经元敲除HMGB1后，与小胶质细胞共培养；J-L：免疫荧光实验检测敲除神经元HMGB1后，普瑞巴林对小胶质细胞活化情况和炎症反应的影响。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠炎症反应的影响

(1)实验方法：选取3月龄雄性Balb/c小鼠，经30Gy照射剂量全脑照射构建放射性脑损伤小鼠模型。对小鼠静脉注射普瑞巴林，注射剂量为每日30mg/kg体重。在第3天和7天分别对小鼠进行取材，分离大脑皮层，提取组织RNA，使用Q-PCR检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2的mRNA水平，如图1A所示。

(2)实验结果如图1B-E所示。由图1B-E可知，放射后大脑皮层炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2的mRNA水平明显升高，而普瑞巴林治疗后，相关炎症因子的mRNA水平被显著性抑制(图1B-E)。结果表明，在放射性脑损伤小鼠模型中，普瑞巴林可以抑制炎症因子的升高，提示其具有抑制炎症的效果。

实施例2普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠的小胶质细胞活化的影响。

(1)实验方法：通过单细胞测序验证放射后大脑皮层炎症因子的mRNA主要表达是否在在小胶质细胞上。选取3月龄雄性Balb/c小鼠，经30Gy照射剂量全脑照射构建放射性脑损伤小鼠模型。对小鼠静脉注射普瑞巴林，注射剂量为每日30mg/kg体重。在第3天、7天和14天分别对小鼠进行取材，分离脑组织，经固定和脱水后，进行包埋切片，通过免疫荧光实验检测小胶质细胞的胞体的大小和活化情况。

(2)实验结果如图2A-I所示。由图2A可知，相关炎症因子的mRNA主要表达在小胶质细胞上。由图2B～D可知，放射后第3天、7天和14天小胶质细胞的胞体大小逐渐增加，同时CD68表达也逐渐增加，表明放射后小胶质细胞有所活化。由图2E-I可知，普瑞巴林连续治疗14d后，大脑皮层和海马区小胶质细胞的胞体大小和CD68的表达均显著性降低，表明普瑞巴林抑制放射诱导的小胶质细胞活化。

实施例3普瑞巴林通过作用于神经元抑制小胶质细胞的活化。

(1)实验方法：培养原代小胶质细胞和BV2小胶质细胞，并经10Gy照射剂量进行照射，检测相关炎症因子Il-1β、Il-6、TNF-α和ICAM-1的mRNA水平和通过免疫荧光染色实验检测IL-1β和TNF-α的蛋白表达情况；将照射后的细胞经普瑞巴林处理，检测相关炎症因子Il-1β、Il-6、TNF-α和ICAM-1的mRNA水平，通过免疫荧光染色实验检测IL-1β和TNF-α的蛋白表达情况；分别采用经10Gy照射剂量进行照射后的神经元的上清液和未经照射的神经元的上清液孵育小胶质细胞，检测相关炎症因子Il-1β、Il-6、TNF-α和ICAM-1的mRNA水平和通过免疫荧光染色实验检测IL-1β和TNF-α的蛋白表达情况。

(2)实验结果如图3A-I所示。由图3A-B可知，小胶质细胞经10Gy射线照射后，炎症因子Il-1β、Il-6、TNF-α和ICAM-1的mRNA水平显著性升高，但是普瑞巴林处理后，相关炎症因子的mRNA水平并不能被有效降低；由图C～E可知，BV2小胶质细胞经10Gy射线照射后，IL-6和TNF-α的蛋白表达水平有所增加，而普瑞巴林并不能抑制其表达；由图3F～H可知，与孵育未照射的神经元上清相比，照射后的神经元上清孵育小胶质细胞将进一步活化小胶质细胞，导致相关炎症因子Il-1β、Il-6和TNF-α的mRNA水平显著性增加，IL-1β和TNF-α蛋白的分泌同时有所增加。因此，普瑞巴林作用神经元后，相关炎症因子的mRNA水平以及蛋白的分泌被有效地抑制，表明普瑞巴林抑制小胶质细胞的炎症反应是通过作用在神经元。

实施例4普瑞巴林对小胶质细胞过度活化诱发的神经元二次损伤的影响。

(1)实验方法：培养BV2小胶质细胞，并经10Gy照射剂量进行照射，使用辐照后的BV2小胶质细胞上清孵育神经元，如图4B-C所示，观察孵育的神经元树突的数目的变化；取孵育后的神经元上清进一步孵育BV2小胶质细胞，检测小胶质细胞中相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、INOS和ICAM-1的mRNA表达水平；将原代神经元与小胶质细胞进行共培养，检测小胶质细胞中相关炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平、分泌的IL-1β和TNF-α的蛋白水平以及神经元树突数目的变化。

(2)实验结果如图4B-K所示。由图4B-C可知，辐照后的BV2小胶质细胞上清孵育神经元，神经元树突的数目有所减少，提示放射后小胶质细胞活化后释放的炎症因子将进一步损伤神经元，导致神经元的二次损伤；由图4D可知，将损伤后的神经元的上清进一步孵育BV2小胶质细胞，小胶质细胞中相关炎症因子Il-1β、Il-6、TNF-α、INOS和ICAM-1的mRNA水平显著性上升，提示损伤的神经元将会分泌相关物质进一步促进小胶质细胞的活化；由图4E可知，小胶质细胞的活化导致神经元二次损伤，神经元二次损伤后，将会进一步活化小胶质细胞，形成一个神经元持续损伤的状态；由图4F-K可知，通过共培养原代神经元和小胶质细胞，放射后小胶质细胞的相关炎症因子的水平显著性升高，神经元树突的数目显著性降低；由图4F-J可知，普瑞巴林处理后，小胶质细胞的炎症反应和神经元的损伤被有效抑制，因此普瑞巴林可以有效地抑制神经元的二次损伤。

实施例5普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠中神经元的损伤和凋亡的影响。

(1)实验方法：选取3月龄雄性Balb/c小鼠，经30Gy照射剂量全脑照射构建放射性脑损伤小鼠模型，并对小鼠静脉注射普瑞巴林，注射剂量为每日30mg/kg体重。普瑞巴林治疗14天后，对小鼠进行取材，分离脑组织并进行冰冻切片，通过TUNEL染色方法检测TUNEL阳性凋亡细胞的数目；对经30Gy照射剂量全脑照射的小鼠静脉注射普瑞巴林，注射剂量为每日30mg/kg体重对小鼠进行取材，分离脑组织并进行冰冻切片，免疫荧光实验通过caspase3和Neu N抗体染色检测普瑞巴林对神经元凋亡的抑制作用进行探究；免疫荧光通过Neu N抗体染色检测普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠大脑皮层和海马各个区域神经元数目的影响。

(2)实验结果如图5A-F所示。由图5A可知，小鼠经放射后，TUNEL阳性细胞数目显著增加，提示放射后神经元有明显的凋亡发生，而普瑞巴林可以缓解神经元的凋亡；由图5B可知，普瑞巴林对神经元凋亡有抑制作用；由图5C-F可知，神经元凋亡后，大脑皮层和海马区(CA1、CA3和DG)神经元数目明显减少，而普瑞巴林治疗后，神经元的数目有显著性恢复。

实施例6普瑞巴林通过抑制神经元中HMGB1的核转位和分泌进而改善放射性脑损伤中的炎症反应和小胶质细胞活化。

(1)实验方法：选取3月龄雄性Balb/c小鼠，经30Gy照射剂量全脑照射构建放射性脑损伤小鼠模型，并对小鼠静脉注射普瑞巴林治疗，注射剂量为每日30mg/kg体重。普瑞巴林治疗14天后，对小鼠进行取材，分离脑组织并进行冰冻切片，通过Q-PCR实验检测放射组以及普对巴林治疗组神经元高表达的相关趋化因子CCL2、HMGB1、CX3CL1、SP、CCL21和CGRP的mRNA水平的变化；Q-PCR实验在损伤的神经元细胞中进一步确认筛选出的HMGB1的mRNA水平的变化；免疫荧光实验在放射性脑损伤小鼠中检测HMGB1在神经元上的表达比例；免疫荧光实验检测普瑞巴林对放射性脑损伤小鼠神经元中HMGB1核转位的影响；检测敲除神经元HMGB1对小胶质细胞活化的影响。

(2)实验结果如图6A-L所示。由图6A-B可知，小鼠经30Gy放射后，HMGB1的mRNA水平上升最为显著，并且经普瑞巴林以注射剂量为每日30mg/kg体重治疗14天后，HMGB1的mRNA水平显著性降低；由图6C可知，普瑞巴林可以显著地抑制损伤神经元中HMGB1的mRNA水平的上调；由图6D-F可知，普瑞巴林主要表达在神经元，在其它细胞中表达较低，放射组观察到HMGB1蛋白发生明显的核转位，普瑞巴林治疗后可以抑制HMGB1的核转位；由图6G-H可知，普瑞巴林可以抑制损伤神经元中HMGB1蛋白的核转位；由图6I-L可知，神经元敲除HMGB1后与小胶质细胞共培养，敲除神经元HMGB1后小胶质细胞的胞体面积有所减小并且CD68的表达水平有所降低，与普瑞巴林的治疗效果相同。另外，在敲除HMGB1后，比较普瑞巴林治疗组与未治疗组没有显著差异，说明普瑞巴林通过抑制神经元中HMGB1的核转位和分泌进而改善放射性脑损伤中的炎症反应和小胶质细胞活化。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.普瑞巴林在制备用于预防或治疗放射性脑损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述放射性脑损伤为头颈部肿瘤放射治疗导致的放射性脑损伤。

3.普瑞巴林在制备用于抑制放射性脑损伤导致的炎症反应的药物中的应用。

4.普瑞巴林在制备用于抑制放射性脑损伤导致的小胶质细胞的活化的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物通过作用于神经元并降低神经元中HMGB1蛋白的核转位和分泌，进而抑制小胶质细胞的活化。

6.普瑞巴林在制备用于抑制放射性脑损伤导致的神经元二次损伤的药物中的应用。

7.普瑞巴林在制备用于改善放射性脑损伤导致的神经元的损伤和凋亡的药物中的应用。

8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的使用量为每日30mg/kg体重。

9.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物经静脉注射给药。

10.一种用于预防或治疗放射性脑损伤的药物组合物，其特征在于，包括普瑞巴林和药学上可接受的辅料。

Images