CN114376153A - 石墨化碳黑用于吸附豆浆中嘌呤的应用方法及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用，应用方法是向每100mL豆浆中加入1～2g石墨化碳黑，吸附40‑60分钟后离心或过滤祛除吸附有嘌呤的石墨化炭黑，即可得低嘌呤豆浆。本发明通过物理方法去除吸附剂GCB，在保持了豆浆原有营养价值及口感风味的同时获得了较高的嘌呤脱除率，且由于其结构特性，在确保高嘌呤脱除率的前提下，大大降低了豆浆及其制品中炭类物质的添加量，使得食品安全性更高。

Description

石墨化碳黑用于吸附豆浆中嘌呤的应用方法及检测方法
技术领域
本发明涉及一种石墨化碳黑用于吸附豆浆中嘌呤的应用及方法及检测，属于豆浆物理脱呤技术领域。
背景技术
豆浆作为一种优质的植物蛋白饮品，被认为是一种合适和经济的牛奶替代品，也是乳糖不耐受者的理想营养补充品，其含量丰富的植物蛋白、磷脂、维生素及矿物质等，以其浓郁独特的豆香口感备受人们亲睐，长期饮用还可达到预防疾病的效果。但因豆类中嘌呤含量较高，若不限量摄入易促使痛风病人引发痛风。嘌呤是核酸的重要组成部分，是生物体内新陈代谢过程中的重要物质。核酸类物质中核糖与嘌呤之间的糖苷键断裂，从而产生游离嘌呤碱和无嘌呤位点的过程称为脱嘌呤现象。
随着人们健康饮食要求的提高，通过一些物理、化学及生物方法对食品中嘌呤物质进行脱除成为近年来食品生物技术的热点，故本申请的目的在于找出一种物理脱呤的方法，提高豆浆的食品安全性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种石墨化碳黑(GCB)用于物理吸附豆浆中嘌呤的应用及应用方法进和豆浆中嘌呤的检测方法，可以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案是：一种将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用。
所述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法是，该方法是向每100mL豆浆中加入1～2g石墨化碳黑，吸附40-60分钟后离心或过滤祛除吸附有嘌呤的石墨化炭黑，即可得低嘌呤豆浆。
前述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法是，在加入石墨化碳黑前对豆浆进行超声处理，所述的豆浆超声处理时间为8-10min。
前述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法是，在豆浆中加入石墨化碳黑后，需对加入石墨化碳黑的豆浆常温下振荡，震荡频率250r/min，时间60min。
前述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法是，在用离心法脱除吸附有嘌呤的石墨化炭黑的工艺条件是，离心机转速8000r.min-1-12000r.min-1，时间10min。
前述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法是，所述的豆浆是将黄豆取杂清洗研磨过滤后形成。
检测豆浆中嘌呤的方法是将10体积份豆浆与10体积份酸水解溶液经油浴水解、冰浴冷却后萃取，萃取液离心过滤，去上清液2.5份，用12.5mol.L-1KOH溶液中和，再用50％的H3PO4调pH至2.95，在254nm波长处测定，根据标准曲线求出嘌呤的含量。
与现有技术比较，本发明具有以下优点：
1.国标《2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中将“活性炭”确定为“可在各类食品加工过程中使用，残留量不需要限定”的食品工业用加工助剂。其使用原则是：“使用时应具有工艺必要性，在达到预期目的的前提下应尽可能降低使用量”、“一般应在制成最终成品之前除去，无法完全除去的，应尽可能降低其残留量”。所用石墨化碳黑(GCB)为特殊条件深加工的平面网状结构固体炭质，因此参考活性炭可作为“食品加工助剂”的先例。在上述基础上，本申请在低嘌呤食品加工研究中创新应用GCB，利用新型吸附剂GCB作为食品加工助剂对豆浆中的嘌呤物质进行吸附处理，通过物理方法去除吸附剂GCB，在保持了豆浆原有营养价值及口感风味的同时获得了较高的嘌呤脱除率，且由于其结构特性，在确保高嘌呤脱除率的前提下，大大降低了豆浆及其制品中炭类物质的添加量，使得食品安全性更高。
2.采用物理吸附作为嘌呤脱除工艺，在达到吸附目的后，采取“过滤”和“离心”的工艺可将食品加工助剂GCB进行有效脱除，符合国标《2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中食品加工助剂的使用原则，且经过实验结果来看，GCB对豆浆的营养品质及食品安全不会产生较大的影响。
3.经酸水解后的豆浆需将其pH值调至2.95(UPLC流动相的pH值)，经离心再通过0.22um滤膜过滤后上机检测。在具体实验操作中，由于10mL豆浆与10mL酸水解溶液经油浴水解冰浴冷却后，酸性极强，用12.5mol.L-1的氢氧化钾溶液调pH时，强烈的酸碱中和反应产生巨大的热量，促使萃取溶液产生大量絮状物沉淀，且挥发出刺激性气体，既伤害实验人员身体，又对嘌呤的水解产生影响，还由于大量盐的加入，使得高效液相色谱柱及流路堵塞发生盐析。基于此采用冰浴后的萃取液先离心过滤，取少量上清液(2.5mL)后调pH值以改善上述不良影响。且经实验结果表明，改进后的方法对原豆浆嘌呤含量的测定无影响，值得在植物性高嘌呤食品的测定中推广。
同时为了证明上述效果，申请人进行了以下实验进行验证。
1材料与方法
1.1材料与仪器
东北大豆；腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤标准品(粉末)；氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸、磷酸二氢钾、三氟乙酸、甲酸；纯净水(超纯过滤)；甲醇、异丙醇-水混合清洗液；及各种检测试剂均为色谱纯；GCB(石墨化碳)为分析纯。
超高效液相色谱仪(Nexera LC-40)、超声波清洗器(JP-020S)、酸度计(ST3100)、高速冷冻离心机(TGL-20M)、磁力搅拌器(RET CVW S025)、集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S)、电子精密天平(ME204E)、超纯水系统(Milli-Q Direct8)、立体超低温冰箱(U410)、豆浆机(Power30)。
1.2UPLC检测条件
本实验利用超高效液相色谱法对豆浆中嘌呤的含量进行测定。色谱分离条件为:Shim-pack C18反相柱(2.1mm×100mm，1.9μm)色谱柱，以0.02mol·L-1磷酸二氢钾缓冲液(pH2.95)作为流动相，流速0.5mL·min-1，柱温30℃，进样量3μL，检测波长(λ1)为254nm。
利用最优色谱条件分别进样检测浓度为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0mg.mL-1的四种嘌呤标准物质混合溶液，以嘌呤浓度梯度为横坐标、以峰面积为纵坐标绘制四种嘌呤物质的标准曲线，确定线性范围。
1.3豆浆中嘌呤物质的水解和测定
根据本课题组前期研究结果，确定本实验豆浆嘌呤物质的水解条件为：取10mL样品于50mL烧瓶中，加入10mL三氟乙酸与甲酸(1:1)的混合液，在98～101℃油浴锅中密封水解1h，迅速冰浴冷却，用12.5mol.L-1KOH溶液中和，再用50％的H3PO4调pH至2.95，定容50mL，离心，0.22μm滤膜过滤，在254nm波长处测定，根据标准曲线求出嘌呤的含量。
考察浸泡大豆(12hours)与干大豆；去渣豆浆与原磨豆浆；调pH与离心先后顺序对原豆浆中嘌呤水解及嘌呤本底值测定结果的影响。
1.4嘌呤吸附率的计算
研究表明，大豆中嘌呤总含量>200mg/100g，属于高嘌呤食品，嘌呤含量高于其他豆类。大豆中嘌呤物质主要为腺嘌呤和鸟嘌呤，次黄嘌呤和黄嘌呤含量较少，仅占到嘌呤总含量的2％，因此本实验研究豆浆嘌呤吸附率以大豆中腺嘌呤和鸟嘌呤含量之和计算。
豆浆中嘌呤物质的去除率可用以下公式进行计算：
Figure BDA0002728575140000041
式中：C0-------处理前豆浆中嘌呤的含量，mg/100g。
C--------处理后豆浆中嘌呤的含量，mg/100g。
1.5GCB对嘌呤标准物质的吸附方法
配置同浓度10mg/L的四种嘌呤标准品混合溶液，加入一定量的GCB，超声10min，调pH值至2.95，0.22um滤膜过滤，上机检测，考察GCB的添加量对嘌呤的吸附率。
1.6豆浆中嘌呤物质脱除工艺
如图5，取东北优质大豆，清水浸泡12小时，以1:10大豆与水的质量体积比用豆浆机打磨过滤得到熟豆浆，取50mL豆浆于锥形瓶中，超声处理一定时间，加入一定量的GCB，在一定温度和频率下振荡吸附一定时间，离心得到低嘌呤豆浆。
探究嘌呤的吸附工艺：分别考察吸附剂对经超声处理与不超声处理的豆浆；同等时间下静置、振荡与磁力搅拌的吸附环境；脱除GCB的离心转速对豆浆嘌呤吸附率的影响。
1.7 GCB对嘌呤物质吸附特性的探究
考察GCB添加量；吸附振荡时间；吸附振荡频率这三个因素对豆浆中嘌呤物质吸附效果的影响。
2结果与分析
2.1 UPLC法对嘌呤的检测分析
2.1.1四种嘌呤物质的分离效果
利用1.2的实验方法，对嘌呤混合溶液进样分析测定。由图1可见，与普通的HPLC嘌呤分析方法相比，本实验利用的UPLC分析方法具有分离效能高，分析速度快等特点。四种嘌呤物质在10min内全部出峰，峰形、出峰时间及分离度均比较稳定，出峰顺序依次为：鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。
2.1.2四种嘌呤物质的标准曲线
由表1可得，本实验用UPLC法建立了鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤峰面积与相应浓度的线性回归方程，在0.5～40mg/L的浓度范围内，四种嘌呤的线性相关系数均高达0.999 99。
表1四种嘌呤的标准曲线
嘌呤 线性方程 相关系数 线性范围
鸟嘌呤 y＝163 71.1x-115 1.16 0.999 99 0.5～40
腺嘌呤 y＝115 45.6x-127 0.39 0.999 99 0.5～40
黄嘌呤 y＝137 63.1x-119 2.18 0.999 99 0.5～40
次黄嘌呤 y＝776 4.93x-985.806 0.999 99 0.5～40
2.2不同因素对原豆浆中嘌呤物质测定的影响
食品中的嘌呤物质一般以核酸碱基的形式存在，尤其是一些高嘌呤含量食品，因此需先通过酸水解、超声波萃取或超临界萃取等提取分离技术将其从食品或生物制品中提取出来再进行分析测定，通过前期研究，本实验采取1.3的酸水解的方式将嘌呤物质从豆浆中水解出来再进行分析测定。同时，为准确测得原豆浆中嘌呤物质的含量，排除前处理过程中几个关键因素对GCB嘌呤吸附率高低的影响，获得的实验结论对低嘌呤豆浆的研究有重要意义。
2.2.1干豆和浸泡大豆对原豆浆中嘌呤结果测定的影响
同等实验条件下，大豆浸泡12h与干大豆直接打磨制得的两种豆浆，用1.3试验方法进行水解，上机后检测得到：经浸泡后大豆制备的豆浆嘌呤本底值结果略高于干豆制备的豆浆，且经浸泡后的大豆打磨的豆浆口感更加细腻醇厚，因此，确定大豆清洗除杂后浸泡制备豆浆进行实验研究。
2.2.2豆渣过滤对原豆浆中嘌呤结果测定的影响
同等实验条件下，原磨和去渣熟豆浆，用本实验的水解及测定方法处理后，做6次精密度实验测得豆浆中嘌呤物质含量本底值分别为：156.25、147.48mg/100g，经过滤豆渣后的原豆浆其嘌呤测定结果略低于含渣豆浆，这是由于豆渣中也含有部分嘌呤物质，经过滤处理后有损失。由此可见：豆渣是否过滤对原豆浆中嘌呤物质的水解及测定结果有一定影响，但结果相差不大，由此而制备的低嘌呤豆浆亦可有原磨及去渣两种，供痛风病人选择饮用。
2.2.3pH值调节方式对原豆浆中嘌呤结果测定的影响
经酸水解后的豆浆需将其pH值调至2.95(UPLC流动相的pH值)，经离心再通过0.22um滤膜过滤后上机检测。在具体实验操作中，由于10mL豆浆与10mL酸水解溶液经油浴水解冰浴冷却后，酸性极强，用12.5mol.L-1的氢氧化钾溶液调pH时，强烈的酸碱中和反应产生巨大的热量，促使萃取溶液产生大量絮状物沉淀，且挥发出刺激性气体，既伤害实验人员身体，又对嘌呤的水解产生影响，还由于大量盐的加入，使得高效液相色谱柱及流路堵塞发生盐析。
对此，本实验尝试了冰浴后的萃取液先离心过滤，取少量上清液(2.5mL)后调pH值以改善上述不良影响。实验结果表明，改进后的方法对原豆浆嘌呤含量的测定无影响，在植物性高嘌呤食品的测定中具有较好的推广性。
2.3嘌呤物质含量的测定结果
经测定，本实验用东北优质大豆，以10:1(g:mL)料液比研磨后的熟豆浆，嘌呤物质含量以大豆计分别为：鸟嘌呤98.78mg/100g、腺嘌呤52.00mg/100g、黄嘌呤4.19mg/100g、次黄嘌呤1.28mg/100g，嘌呤总含量为156.25mg/100g。
2.4不同浓度GCB对不同嘌呤标准物质的吸附效果
根据1.5的实验方法，向已知浓度10mg.L-1的四种嘌呤标准混合溶液中分别加入0.005、0.01、0.02、0.03、0.04ug.mL-1的GCB，不同溶度的GCB对四种嘌呤物质的吸附效果如图2，可见GCB对四种嘌呤均具有较高的吸附率，同时，四种嘌呤物质的吸附率与GCB的添加量呈良好的线性关系。特别是在添加量为0.04ug.mL-1时，GCB对鸟嘌呤和黄嘌呤标准品的吸附率达到了90％以上。GCB(120/400目)比表面积100m2.g-1，因其非多孔性，对样品的吸附不要求其扩散至有孔区域，所以萃取过程非常迅速。这是由于GCB碳表面的正六元环结构，使其对平面分子有极强的亲和力。而嘌呤是一种含C、N的环状结构，分子式为C5H4N4，能够与GCB的正六元环结合成为较稳定的平面网状结构，因此可达到较高的吸附率。
2.5不同吸附工艺的对比与讨论
2.5.1豆浆超声处理对嘌呤吸附率的影响
见图3，从测定结果来分析，将同浓度的GCB加入未经超声处理的豆浆和经超声10min处理后的豆浆中，经超声后嘌呤物质的吸附率高于未经超声的豆浆。这是因为超声波在溶剂和样品之间产生声波空化作用，导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩，从而使固体样品分散，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率。
2.5.2吸附环境对嘌呤吸附率的影响
实验对比了同等条件下，不同吸附环境对嘌呤物质的吸附效果的影响。结果表明，三种条件吸附率从高到底依次为：振荡(250r/min)>磁力搅拌(1000r/min)>静置。振荡与磁力搅拌差别不大，且从吸附结束后分离GCB的难易度程度来看，磁力搅拌处理使得GCB与豆浆中的蛋白质、脂肪等大分子物质形成紧密粘合，导致离心和过滤均不能完全将GCB除去，因此，确定GCB的吸附环境为常温下振荡吸附。
2.5.3脱除GCB的离心转速对嘌呤吸附率的影响
经GCB吸附处理后的豆浆，需经过离心脱除GCB，再经酸水解后上机测定嘌呤含量。本实验控制离心时间为10min，探索不同转速对吸附剂GCB的脱除效果及嘌呤吸附率的影响，实验结果表明，转速在达到8000r.min-1及以上时，豆浆中GCB脱除较彻底，肉眼观察豆浆呈现正常的乳白色，无GCB残留。随着转速的增加，GCB脱除越彻底，同时豆浆中嘌呤含量越低。但是考虑到工业化生产的实际情况，建议中试选择12000r.min-1(10min)的离心条件。
2.6不同因素对GCB脱除豆浆中嘌呤物质吸附率的影响
2.6.1GCB添加量对豆浆嘌呤吸附率的影响
从图4可以看出，随着GCB添加量的不断增大，豆浆中嘌呤物质的吸附率逐渐增大。根据食品工业用加工助剂使用原则“使用时应具有工艺必要性，在达到预期目的的前提下应尽可能降低使用量”，同时从节约成本方面考虑，可选择GCB在0.01g.mL-1浓度下进行中试。
2.6.2振荡时间对豆浆嘌呤吸附率的影响
由图4可以看出，随着振荡反应时间的增加，嘌呤的吸附率呈现先增加，再趋于平缓的趋势。其中振荡处理60min，嘌呤脱除率达到最大。说明一定浓度和条件下GCB对豆浆中嘌呤物质的吸附有一个“时间阈”，超过60min出现解吸现象，因此吸附时间1h最佳。
2.6.3振荡频率对豆浆嘌呤吸附率的影响
由图4可以看出，随着振荡频率的增加，嘌呤的吸附率呈现先上升再下降的趋势，振荡频率为250r.min-1时，嘌呤脱除率达到最大，再提高振荡频率会发生解吸现象，企业可根据实际条件选定该频率进行中试。
2.7低嘌呤豆浆的品质评价
按照1.6的工艺，使用GCB吸附的方法对豆浆中的嘌呤物质进行脱除，再通过离心去除吸附剂GCB，得到的豆浆其感官要求(外观色泽、气味滋味、组织状态)正常，具有豆浆应有的气味与滋味。
将原豆浆及经GCB吸附处理后的低嘌呤豆浆进行品质对比，其理化指标(固形物含量、蛋白质含量和脂肪含量)测定结果分别见表2，由此可见，经处理后的低嘌呤豆浆营养有一定损失，但检测结果完全达到了《植物蛋白饮料豆奶(豆浆)和豆奶饮料》QB/T 2132-2008中的要求。
表2 GCB吸附处理后的豆浆理化指标检测结果
Figure BDA0002728575140000091
附图说明
图1图1四种嘌呤物质分离色谱图
图2不同浓度的GCB对四种嘌呤物质的吸附效果
图3豆浆超声处理对嘌呤物质吸附效果的影响结果
图4不同因素对GCB脱除豆浆中嘌呤物质吸附率的影响
图5豆浆中嘌呤物质脱除工艺图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用，其具体的应用脱除方法是向每100mL豆浆中加入1～2g石墨化碳黑，吸附40-60分钟后离心或过滤祛除吸附有嘌呤的石墨化炭黑，即可得低嘌呤豆浆。
为提高脱除率和豆浆口感，在豆浆制作和脱除过程中可以增加以下手段：(1)在豆浆在加入石墨化碳黑前对豆浆进行超声处理，所述的豆浆超声处理时间为8-10min。(2)在豆浆中加入石墨化碳黑后，需对加入石墨化碳黑的豆浆常温下振荡，震荡频率250r/min，时间60min。(3)在用离心法脱除吸附有嘌呤的石墨化炭黑的工艺条件是，离心机转速8000r.min-1-12000r.min-1，时间10min。(4)豆浆制作是现对黄豆取杂清洗、后研磨过滤。
检测豆浆中嘌呤的方法是将10体积份豆浆与10体积份酸水解溶液经油浴水解、冰浴冷却后萃取，萃取液离心过滤，去上清液2.5份，用12.5mol.L-1KOH溶液中和，再用50％的H3PO4调pH至2.95，在254nm波长处测定，根据标准曲线求出嘌呤的含量。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可做很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。

Claims (7)

1.一种将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用。
2.根据权利要求1所述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法，其特征在于：该方法是向每100mL豆浆中加入1～2g石墨化碳黑，吸附40-60分钟后离心或过滤祛除吸附有嘌呤的石墨化炭黑，即可得低嘌呤豆浆。
3.根据权利要求2所述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法，其特征在于：在加入石墨化碳黑前对豆浆进行超声处理，所述的豆浆超声处理时间为8-10min。
4.根据权利要求2或3所述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法，其特征在于：在豆浆中加入石墨化碳黑后，需对加入石墨化碳黑的豆浆常温下振荡，震荡频率250 r/min，时间60 min。
5.根据权利要求4所述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法，其特征在于：在用离心法脱除吸附有嘌呤的石墨化炭黑的工艺条件是，离心机转速8000r.min-1-12000 r.min-1，时间10 min。
6.根据权利要求5所述的将石墨化碳黑用于物理吸附豆浆中嘌呤脱除的应用方法，其特征在于：所述的豆浆是将黄豆取杂清洗研磨过滤后形成。
7. 一种检测豆浆中嘌呤的方法，其特征在于：该方法是将10体积份豆浆与10体积份酸水解溶液经油浴水解、冰浴冷却后萃取，萃取液离心过滤，去上清液2.5份，用12.5 mol.L-1 KOH溶液中和，再用50%的H3PO4调pH至2.95，在254 nm波长处测定，根据标准曲线求出嘌呤的含量。
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