CN114375195A - 使用编码阿柏西普的aav2变体治疗眼新血管疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法，其包括向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其中所述rAAV颗粒包含：a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：(35)的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入衣壳蛋白的位置(587)和(588)之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：(14))，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2VP1衣壳蛋白。

Description

使用编码阿柏西普的AAV2变体治疗眼新血管疾病的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年9月11日提交的美国临时专利申请号62/899,070、2019年10月10日提交的美国临时专利申请号62/913,648、2019年11月18日提交的国际申请号PCT/US2019/062066、2020年1月10日提交的美国临时专利申请号62/959,784、2020年2月7日提交美国临时专利申请号62/971,835、2020年5月1日提交的美国临时专利申请号63/019,190、2020年5月27日提交的美国临时专利申请号63/030,819和2020年8月7日提交的美国临时专利申请号63/063,203的权益，将其各自的公开内容通过通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开内容涉及治疗个体中的眼新血管疾病和病症的方法，其包括向个体的眼部施用单一单位剂量的编码抗-VEGF试剂(例如，阿柏西普(flibercept))重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
ASCII文本文件的序列表的提交
将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名称：627002001241SEQLIST.TXT，记录日期：2020年9月9日，大小：41KB)。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种影响黄斑的退化性眼病，黄斑是视网膜中心负责阅读和精细视力的光敏小区域。影响黄斑的病症降低中心视力，同时保持周边视力不变。在严重的情况下，该疾病可以导致中心失明。AMD是美国65岁及以上人群中视力丧失的主要原因，并且在40岁以上人群中任何AMD的估计患病率为约6.5％(Klein et al.,(2011)ArchOphthalmol,129(1):75-80)。新血管或渗出性或湿性AMD(nAMD、wAMD或nAMD)是AMD的晚期形式。wAMD的标志是脉络膜新生血管(CNV)，其是视网膜中来自下脉络膜层的异常血管浸润，导致视网膜细胞损伤和中心失明。这种异常的血管生成过程由生长因子，特别是血管内皮生长因子(VEGF)调节。wAMD的标准护理是一类结合和螯合VEGF的分子，例如雷珠单抗(Lucentis)和阿柏西普(Eylea)。
糖尿病性视网膜病(DR)是糖尿病的主要并发症，并且是工作年龄人群中视力丧失的主要原因。DR可以是非增殖性的(NPDR)，没有新的血管生长，或者是增殖性的DR(PDR)，在视网膜或脉络膜内有新的异常血管生长。糖尿病性黄斑水肿(DME)是DR的并发症，并且是影响黄斑的眼病的另一个实例。DME影响高达10％的糖尿病患者，并且是由黄斑中的流体积聚引起的。DME是DR人群中视力丧失的最常见原因。治疗DME的可用疗法包括激光和抗血管内皮生长因子(抗VEGF)药物，例如阿柏西普。
阿柏西普是一种重组融合蛋白，其充当血管内皮生长因子亚型A和B(VEGF-A和VEGF-B)和胎盘生长因子(PGF)的诱饵受体。通过结合这些配体，阿柏西普能够阻止它们与血管内皮生长因子受体(VEGFR)、VEGFR-1和VEGFR-2结合，从而抑制新血管形成和降低血管通透性。阿柏西普由与IgG1的Fc片段融合的VEGFR-1的结构域2和VEGFR-2的结构域3组成。
目前的标准护理抗VEGF试剂(例如阿柏西普)需要每4至8周经由玻璃体内(IVT)注射重新施用，以实现最佳的治疗结果并保持视力。依从这样的方案对于患者、其护理者和保健系统来说是繁重的，并且大多数患者随时间推移不能依从最佳疗法，这与视力丧失相关(Khanani AM,et al.)。此外，还存在并发症，包括眼内炎、视网膜脱离、外伤性白内障和眼内压(IOP)升高；这些并发症的风险可能随着重复IVT注射而增加(Falavarjani et al.,(2013)Eye(Lond),27(7):787-794)。
因此，本领域需要有效、降低副作用的风险并适合高长期患者依从性的眼新生血管疾病(如wAMD、DR或DME)的疗法。
发明简述
在一个方面，本文提供一种用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法，所述方法包括向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的约6×1011个载体基因组(vg)或更少的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其中所述个体是人，并且其中所述rAAV颗粒包含：(a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和(b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，或由其组成，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述方法包括减少个体的眼睛中的视网膜流体。
在另一个方面，本文提供一种用于减少患有眼新血管疾病的个体眼睛中的视网膜液体的方法，所述方法包括向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒，其中所述个体是人，并且其中所述rAAV颗粒包含：(a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和(b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，或由其组成，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述个体在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约最后12周已接受至少一种抗VEGF试剂的治疗。在一些实施方案中，所述个体的一只眼睛中的视网膜液体的量或存在对使用抗VEGF试剂的先前治疗是难治性的。在一些实施方案中，所述抗VEGF试剂是阿柏西普。在一些实施方案中，一只眼睛中的视网膜流体减少至少约60％。在一些实施方案中，与将rAAV施用至个体之前个体的一只眼睛中的视网膜液体水平相比，一只眼睛中的视网膜液体减少约80％。在一些实施方案中，视网膜流体是视网膜下流体(SRF)或视网膜内流体(IRF)。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约6×1011个载体基因组(vg/眼睛)或更少。
在另一个方面，本文提供一种用于治疗个体中眼新血管疾病的方法，所述方法包括：(a)向个体的一只眼睛施用抗-VEGF试剂；和(b)在施用抗-VEGF试剂之后，向个体的一只眼睛施用单位剂量为约6×1011个载体基因组(vg)或更少的重组腺病毒相关病毒(rAAV)颗粒，其中所述个体为人，并且其中所述rAAV颗粒包含：(i)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和(ii)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述方法包括在施用抗VEGF试剂之后约1周或约7天，向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括在施用抗VEG试剂之后约1周至约2周，向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括在施用抗VEGF试剂之后约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天或约15天，向个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括在第1天向个体的一只眼睛施用抗-VEGF试剂，和在第8天向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述抗VEGF试剂包含阿柏西普。在一些实施方案中，阿柏西普以约2mg的剂量通过玻璃体内注射施用。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用局部类固醇治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗是二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇持续约四周，随后每天约三次施用局部类固醇持续约一周，随后每天约两次施用局部类固醇持续约一周，并且随后每天约一次施用局部类固醇持续约一周；从施用抗VEGF试剂开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇持续约四个月，随后每天约三次施用局部类固醇持续约一个月，随后每天约两次施用局部类固醇持续约一月，随后每天约一次施用局部类固醇持续约一月；从施用抗VEGF试剂开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇持续约一个月，随后每天约三次施用局部类固醇持续约一个月，随后每天约两次施用局部类固醇持续约一月，随后每天约一次施用局部类固醇持续约一月；从施用rAAV颗粒开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇包含约1μg至约3μg剂量的二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方案中，局部类固醇包含约2.5μg剂量的二氟泼尼酯0.05％。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约6×1010至约2×1011个载体基因组(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约2×1011或约6×1010个载体基因组(vg/眼睛)。在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约6×1010至约6×1011个载体基因组(vg/眼睛)。在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约6×1010至约2×1011个载体基因组(vg/眼睛)。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约2×1011至约6×1011个载体基因组(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为每只眼睛约2×1011或约6×1010个载体基因组(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约2×1011vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1011 vg/眼睛。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，个体的对侧眼睛具有一种或多种眼新血管疾病的症状。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周。在一些实施方案中，向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒与向一只眼睛施用施用位剂量的rAAV颗粒是在同一天；或者，向对侧眼睛施用位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用施用位剂量的rAAV颗粒之后约1天至约14天。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含与向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒相同或更少的载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。在一些实施方案中，向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约2周。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含比向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒更多的载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO：40的核酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽为阿柏西普。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，核酸进一步包含第一增强子区、启动子区、5'UTR区、第二增强子区和聚腺苷酸化位点。在一些实施方案中，核酸以5'至3'顺序包含：(a)第一增强子区；(b)启动子区；(c)5'UTR区；(d)编码包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸；(e)第二增强子区；和(f)聚腺苷酸化位点；并且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，第一增强子区包含含有SEQ ID NO：22的序列或与其具有至少85％同一性的序列的CMV序列。在一些实施方案中，启动子区包含含有SEQ ID NO：23的序列或与其具有至少85％同一性的序列的CMV序列。在一些实施方案中，编码多肽的核酸包含SEQ ID NO：40的核酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，多肽为阿柏西普。在一些实施方案中，5'UTR区以5'至3'顺序包含TPL序列和eMLP序列，所述TPL序列包含SEQ ID NO：24的序列或与其具有至少85％同一性的序列，eMLP序列包含SEQ ID NO：25的序列或与其具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，第二增强子区包含完整EES序列，所述完整EES序列包含SEQ ID NO：26的序列或与其具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述聚腺苷酸化位点包含含有SEQ ID NO：27的序列或与其具有至少85％同一性的序列的HGH聚腺苷酸化位点。在一些实施方案中，所述核酸进一步包含(a)第一增强子区，其包含含有SEQ IDNO：22的序列或与其具有至少85％同一性的序列的CMV序列；(b)启动子区，其包含含有SEQID NO：23的序列或与其具有至少85％一致性的序列的CMV序列；(c)5'UTR区，其以5'至3'顺序包含TPL序列和eMLP序列，所述TPL序列包含SEQ ID NO:24的序列或与其具有85％同一性的序列，eMLP序列包含SEQ ID NO:25的序列或与其具有85％同一性的序列；(d)第二增强子区，其包含完整EES序列，所述完整EES序列包含SEQ ID NO：26的序列或与其具有至少85％同一性的序列；和(e)HGH聚腺苷酸化位点，其包含SEQ ID NO：27的序列或与其具有至少85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述核酸包含侧接所述元件的AAV ITR。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO：39的核酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有GH环的AAV2 VP1衣壳蛋白，所述GH环包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有GH环的AAV2 VP1衣壳蛋白，所述GH环包含与SEQ ID NO：38具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性中任一个的氨基酸序列。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2 VP1衣壳蛋白，所述AAV2 VP1衣壳蛋白包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与SEQ ID NO：37具有至少90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2 VP1衣壳蛋白，所述AAV2VP1衣壳蛋白包含与SEQ ID NO：37具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性中任一个的氨基酸序列。
在可以与任何前述实施方式组合的一些实施方式中，AAV2衣壳蛋白包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ IDNO：14)，或由其组成。在一些实施方案中，AAV2衣壳蛋白包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV2衣壳蛋白包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)。在一些实施方案中，AAV2衣壳蛋白包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ IDNO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV2衣壳蛋白质包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过玻璃体内施用的。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为药物制剂形式。在一些实施方案中，药物制剂包含rAAV颗粒、氯化钠、磷酸钠和表面活性剂。在一些实施方案中，药物制剂包含每mL(vg/mL)rAAV的颗粒约150至约200mM的氯化钠、约1至约10mM的磷酸二氢钠、约1至约10mM的磷酸氢二钠、约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188和约6×1013至约6×1010个载体基因组(vg)，其中所述药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，所述药物制剂包含约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠、约6×1012 vg/mL的所述rAAV颗粒和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。在一些实施方案中，所述药物制剂包含约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠、约2×1012 vg/mL的rAAV颗粒和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。在一些实施方案中，所述药物制剂包含约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠、约6×1011 vg/mL的rAAV颗粒和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约25μL至约250μL的体积。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约100μL的体积。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约30μL的体积。在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含约25μL至约250μL的体积。在一些实施方案中，向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含约100μL的体积。在一些实施方案中，向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含约30μL的体积。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，所述个体接受了使用抗VEGF试剂对眼新血管疾病的先前治疗。在一些实施方案中，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用rAAV颗粒之前，所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛接受1次或2次抗-VEGF试剂注射。在一些实施方案中，所述个体没有接受使用抗VEGF试剂对眼新血管疾病的先前治疗。在一些实施方案中，抗-VEGF试剂为阿柏西普。
在可以与任一项前述实施方案中组合的一些实施方案中，眼新生血管疾病是湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜新生血管形成、脉络膜新血管形成、糖尿病性视网膜病变、增殖性糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜水肿或其任意组合。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，将单位剂量的rAAV颗粒与类固醇治疗组合施用。在一些实施方案中，类固醇治疗是皮质类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗是全身性类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗是口服类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗是泼尼松治疗。在一些实施方案中，口服泼尼松治疗包括在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前3天开始，以约60mg/天的剂量施用泼尼松，共6天，随后以约40mg/天的剂量施用泼尼松，共3天，随后以约20mg/天的剂量施用泼尼松，共2天，随后以约10mg/天的剂量施用泼尼松，共2天。在一些实施方案中，类固醇治疗是局部类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗是二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用类固醇。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用类固醇。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，类固醇治疗是局部类固醇治疗，并且局部类固醇治疗是从施用单位剂量的rAAV颗粒起持续至多约4周、至多约6周或至多约8周的每天类固醇治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在约第1周约四次施用局部类固醇，在约第2周约三次施用局部类固醇，在约第3周约两次施用局部类固醇，和在约第四周约一次施用局部类固醇；从施用单位剂量的rAAV颗粒开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在施用单位剂量的rAAV颗粒之后每天约四次施用局部类固醇，持续约3周，随后每天约三次施用局部类固醇，持续约1周，随后每天约2次施用局部类固醇，持续约1周，和随后约1次施用局部类固醇，持续约1周。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇，持续约四周，随后每天约三次施用局部类固醇，持续约一周，随后每天约两次施用局部类固醇，持续约一周，和随后每天约一次施用局部类固醇，持续约一周；从施用单位剂量的rAAV颗粒之前约一周开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇，持续约一个月，随后每天约三次施用局部类固醇，持续约一个月，随后每天约两次施用局部类固醇，持续约一个月，和随后每天约一次施用局部类固醇，持续约一个月；从约施用单位剂量的rAAV颗粒时开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇，持续约一个月，随后每天约三次施用局部类固醇，持续约一个月，随后每天约两次施用局部类固醇，持续约一个月，和随后每天约一次施用局部类固醇，持续约一个月；从约施用单位剂量的rAAV颗粒之前约一周开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇包括约1μg至约3μg剂量的二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方案中，局部类固醇包括约2.5μg剂量的二氟泼尼酯0.05％。
在一些实施方案中，眼新血管疾病为湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的维持或减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，视网膜厚度的维持或减少是在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周、约34周、约44周、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间出现。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，视网膜厚度的减少是至少约10％。在一些实施方案中，视网膜厚度为中央亚视场厚度(CST)或中心视网膜厚度(CRT)。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的维持或减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比黄斑体积的维持或减少是在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周、约34周、约44周、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间出现。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，黄斑体积的减少是至少约10％。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的维持或改善。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，视力维持或改善是在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周、约34周、约44周、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间出现。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的改善。在一些实施方案中，视力为最佳矫正视力(BCVA)。
在可以与任一项前述实施方案中组合的一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒提供治疗益处(例如，治疗眼新血管疾病、减少视网膜流体、维持或减少视网膜厚度、维持或减少黄斑体积、和/或维持或改善视力)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单一单位剂量的rAAV颗粒提供治疗益处，其在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周或更长、约34周或更长、约44周或更长、约6个月或更长、约1年或更长、约1.5年或更长、或约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间出现。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约50％不需要抗-VEGF救援治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，所述多个个体中至少约50％不需要抗-VEGF救援治疗至少约20周、至少约36周、至少约52周、至少约56周或更长时间。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单一单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约67％不需要抗-VEGF救援治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，所述多个个体中至少约67％不需要抗-VEGF救援治疗至少约20周、至少约36周、至少约52周、至少约60周、至少约64周或至少约66周。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约78％不需要抗-VEGF救援治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，所述多个个体中至少约78％不需要抗-VEGF救援治疗至少约20周、至少约36周、或更长时间。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述个体100％不需要抗-VEGF救援治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，所述个体100％不需要抗-VEGF救援治疗至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周或更长时间。
在可以与任一项前述实施方案组合的一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的年化抗-VEGF注射率(annualized anti-VEGF injection rate)相比，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起年化抗VEGF注射率降低至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％。
在一些实施方案中，眼新血管疾病是糖尿病性黄斑水肿(DME)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起糖尿病性视网膜病变严重程度量表(DRSS)的2步或3步改善。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起糖尿病性视网膜病变严重程度量表(DRSS)的2步改善。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒导致糖尿病性视网膜病变严重程度量表(DRSS)的3步改善。
通过参考并入
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均以其整体引入作为参考并入。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下详细描述和附图，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，以下详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施例，附图中：
图1A-1B提供实施例1和2中描述的研究性药品和I期研究的示意图。图1A是AAV2.7m8-阿柏西普的示意图。AAV2.7m8-阿柏西普是一种重组的复制缺陷型腺相关病毒(rAAV)载体，其含有AAV2.7m8蛋白衣壳和载体基因组，所述载体基因组含有在遍在性嵌合启动子(C11)控制下的密码子优化形式的阿柏西普cDNA的表达盒。AAV2.7m8-阿柏西普载体基因组还含有侧接阿柏西普cDNA表达盒的两个AAV2反向末端重复序列(ITR)。图1B是概述实施例1和2中描述的I期研究的研究设计的图。
图1C提供AAV2.7m8-阿柏西普载体基因组(SEQ ID NO：39)的图。载体基因组包含AAV血清型2的两个反向末端重复(ITR)(在SEQ ID NO：39的位置1-145和3772-3916处)、包含CMV启动子的表达盒(在SEQ ID NO：39的位置180-693处)、包含腺病毒三联前导序列和合成内含子的5'非翻译区(UTR)(在SEQ ID NO：39的位置694-1314处)、Kozak序列(在SEQ IDNO：39的位置1329-1340处)、密码子优化的阿柏西普cDNA(在SEQ ID NO：39的位置1338-2714处)、包含人支架附着区的3'UTR(在SEQ ID NO：39的位置2717-3527处)和人生长激素聚腺苷酸化/转录终止信号(在SEQ ID NO：39的位置3546-3748处)。AAV＝腺相关病毒；CMV＝巨细胞病毒；GH＝生长激素；ITR＝末端反向重复；polyA＝聚腺苷酸化；SAR＝支架附着区；TPL＝三联前导序列。
图2A-2L显示光学相干断层扫描(OCT)图像和视网膜厚度图，其来源于从实施例1所述研究的群组1中受试者采集的OCT图像。OCT图像是在施用AAV2.7m8-阿柏西普(第1天)之前和之后的指定时间采集的。对所有受试者都指明了抗VEGF-IVT治疗间隔。图2A提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射之前指定的时间在五次诊所就诊(office visits)时从受试者1采集的。OCT图像是在用阿柏西普标准护理治疗之前立即采集的。受试者1每5-7周需要阿柏西普IVT，并显示难治性视网膜下流体和色素上皮脱离(PED)，尽管阿柏西普是护理治疗的标准。图2B提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射(第7天)、在AAV2.7m8-阿柏西普注射(第1天)和在所指定时间的随访就诊时从受试者1采集的。受试者1在注射AAV2.7m8-阿柏西普之后不需要任何救援注射。受试者1在第4周开始时显示出视网膜下流体消退，并且保持不含视网膜下和视网膜内流体(保持干燥)。图2C提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射之前指定的时间在五次诊所就诊就诊时从受试者2采集的。OCT图像是在用阿柏西普标准护理治疗之前立即采集的。受试者2在AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前的8个月中需要六次阿柏西普IVT治疗以保持视网膜解剖学。图2D提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射(第-7天)、在AAV2.7m8-阿柏西普注射(第1天)和在指定时间的随访就诊时从受试者2采集的。受试者2在注射AAV2.7m8-阿柏西普之后不需要任何救援注射。受试者2显示出没有视网膜下或视网膜内流体的稳定的视网膜解剖学直至第24周。图2E提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射之前指定的时间在四次诊所就诊就诊时从受试者3采集的。在第-27周采集的OCT图像未显示。OCT图像是在用阿柏西普标准护理治疗之前立即采集的。受试者3显示视网膜下流体，该液体当阿柏西普IVT之间的间隔从5周增加至7周时增加。图2F提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射(第-7天)、在AAV3.7m8-阿柏西普注射(第1天)和在指定时间的随访就诊时从受试者3采集的。受试者3在注射AAV2.7m8-阿柏西普之后不需要任何救援注射。受试者3在第8周显示出难治性视网膜下流体的消退，以及稳定的视网膜解剖学直至第24周。图2G提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射之前指定的时间在五次诊所就诊就诊时从受试者4采集的。OCT图像是在用雷珠单抗0.5mg IVT标准护理治疗之前立即采集的。受试者4显示出雷珠单抗IVT注射剂难治性的视网膜下流体。图2H提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射(第-14天)、在AAV2.7m8-阿柏西普注射(第1天)和在指定时间的随访就诊时从受试者4采集的。受试者4在注射AAV2.7m8-阿柏西普之后不需要任何救援注射。受试者4在第8周显示出难治性视网膜下流体的消退，以及稳定的视网膜解剖学直至第24周。图2I提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射之前指定的时间在五次诊所就诊就诊时从受试者5采集的。OCT图像是在用阿柏西普标准护理治疗之前立即采集的。图2J提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射(第-14天)、在AAV2.7m8-阿柏西普注射(第1天)和在指定时间的随访就诊时从受试者5采集的。受试者5在注射AAV2.7m8-阿柏西普之后不需要任何救援注射。在AAV2.7m8-阿柏西普治疗时存在的视网膜下流体和PED随时间消退，并且视网膜解剖学保持稳定并且不含视网膜下或视网膜内流体直至第24周。图2K提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射之前指定的时间在五次诊所就诊就诊时从受试者6获得的。OCT图像是在用贝伐单抗1.5mg IVT标准护理或雷珠单抗0.5mg IVT标准护理(如指出的)治疗之前立即采集的。受试者6的视网膜的外观与息肉状脉络膜血管病变(PCV)一致。图2L提供OCT图像和从OCT图像获得的视网膜厚度图，所述OCT图像是在筛选阿柏西普注射(第-10天)、在AAV2.7m8-阿柏西普注射(第1天)和在指定时间的随访就诊时从受试者6采集的。受试者6在注射AAV2.7m8-阿柏西普之后不需要任何救援注射。受试者6未显示出视网膜下流体的任何增加，且实现一些解剖学改善直至第24周。受试者6的对侧眼睛在试验过程中每4周接受标准护理阿柏西普注射，并显示出与AAV2.7m8-阿柏西普治疗的眼睛类似的视网膜形态。
图3显示在指定时间点，实施例1中所述研究的群组1中受试者的平均中心视网膜厚度(CST)的变化。误差条表示使用T分布计算的90％置信区间。基线(BL)表示在第1天AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前7-15天(例如7-14天)筛选阿柏西普注射之前进行的测量。在AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后24周，受试者平均显示CRT变化-52.7μm(90％CI-86.5，-18.8)。BL＝基线；D＝天；W＝周。第1天的就诊发生在基线就诊之后7-14天。
图4显示在指定时间点，对于实施例1中所述研究的群组1中的受试者基于早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)字母评估的平均最佳矫正视力(BCVA)测量。误差条表示使用T-分布计算的90％置信区间。基线(BL)表示在第1天A AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前7-15天(例如7-14天)筛选阿柏西普注射之前进行的测量。在AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后24周，受试者平均显示出-2个字母的BCVA变化(90％CI-9.1，5.1)。BL＝基线；D＝天；W＝周。第1天的就诊发生在基线就诊之后7-14天。
图5提供阿柏西普的核酸序列(SEQ ID NO：36)。
图6显示了实施例1中描述的研究的受试者1-6用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后前房细胞和玻璃体细胞计数的图。在每个图下指示对每个患者施用的类固醇治疗。房水细胞计数类别是基于葡萄膜炎命名标准(SUN)的标准化(Jabs,DA et al.,J Ophthalmol.2005；140:509–516)。玻璃体细胞计数类别是基于国家卫生研究所(NIH)指南。对于水性细胞，0.5+的细胞计数值表示1-5个细胞；细胞计数值1+表示6-15个细胞；细胞计数值2+表示16-25个细胞；细胞计数值3+表示26-50个细胞；而4+的细胞计数值指示＞50个细胞。对于玻璃体细胞，0.5+的细胞计数值表示1-10个细胞；细胞计数值1+表示11-20个细胞；细胞计数值2+表示21-30个细胞；细胞计数值3+表示31-100个细胞；和细胞计数值4+表示＞100个细胞。捕获0.5+的稀有细胞用于显示在该图中的分析。
图7A-7B显示光学相干断层扫描(OCT)图像和视网膜厚度图，所述OCT图像示在34周的中位随访时间时从实施例1中所述研究的群组1中的受试者1-6采集的。此外，还提供每名受试者1-6的BCVA相对于基线的变化、在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前的8个月内的抗VEGF IVT注射次数、以及在研究期间施用的救援抗VEGF-IVT注射的次数。指示在其期间获得每个受试者的OCT图像和视网膜厚度图的实际周数(受试者1＝第44周；受试者2＝第40周；受试者3＝第36周；受试者4＝第32周；受试者5＝第28周；和受试者6＝第28周)。在研究期间没有受试者需要救援抗VEGF-IVT注射，并且在直至第44周的随访期期间的任何时间点都没有满足再治疗标准。没有受试者在OCT成像上显示出疾病再激活的迹象。
图8显示对于实施例1中所述研究的群组1中受试者1-6，用AAV2.7m8-阿柏西普治疗后直至44周(40-52周)的中位随访时间的房水细胞和玻璃体细胞计数的图。在每个图下方指示了向每个受试者施用的类固醇治疗。房水细胞级类别基于葡萄膜炎命名标准(Standardization of Uveitis Nomenclature，SUN)准则(Jabs，DA等人，Ophthalmol.2005；140:509-516)。玻璃体细胞级类别基于国家卫生研究所(NationalInstitutes of Health，NIH)指南。对于房水细胞，细胞等级0.5+表示1-5个细胞；细胞等级1+表示6-15个细胞；细胞等级2+表示16-25个细胞；细胞等级3+表示26-50个细胞；和细胞等级4+表示＞50个细胞。对于玻璃体细胞，细胞等级0.5+表示1-10个细胞；细胞等级1+表示11-20个细胞；细胞等级2+表示21-30个细胞；细胞等级3+表示31-100个细胞；和细胞等级4+表示＞100个细胞。捕获的稀有细胞为细胞等级0.5+。
图9A-9B显示从在44周的中位随访时间从实施例1中所述研究的群组1中的受试者1-6采集的光学相干断层扫描(OCT)图像和来源于OCT图像的视网膜厚度图。还提供了BCVAETDRS字母和CST从基线的变化。指示从每个受试者获得OCT图像和视网膜厚度图的实际周数。星号表示受试者4经历了通过气泡注射的视网膜脱离修复，以便修复脱离孔源性视网膜脱离(RRD)的自发性人工晶状体下黄斑(图9B)。受试者4保持随访；受试者4的OCT图像和BCVA值对应于视网膜脱离之前的最后一次观察结果。
图10显示了在指定时间点，基于实施例2和3中所述研究的群组2中的受试者的早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)字母评估的平均最佳矫正视力(BCVA)测量结果。误差条表示使用T分布计算的平均绝对BCVA的90％置信区间。基线(BL)表示在第1天AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前7-15天(例如7-14天)筛选阿柏西普注射之前进行的测量。在AAV2.7m8-阿柏西普治疗后24周，受试者显示BCVA的平均变化为-4.8个字母。BL＝基线；D＝天；W＝周。在基线就诊后7-15天进行第1天的就诊。
图11显示实施例2和3中所述研究的群组2中的受试者在指定时间点的平均中心视网膜厚度(CST)。误差条表示使用T分布计算的平均绝对CST的90％置信区间。基线(BL)表示在第1天AAV2.7m8-阿柏西普治疗前7-15天(例如7-14天)筛选阿柏西普注射之前进行的测量。在AAV2.7m8-阿柏西普治疗后24周，受试者显示-27.8μm的CST平均变化。BL＝基线；D＝天；W＝周。第1天的就诊发生在基线就诊后7-15天。
图12显示对于实施例2和3中所述研究的群组1中受试者，用AAV2.7m8-阿柏西普治疗治疗后直至24周的随访时间的房水细胞和玻璃体细胞计数的图。在每个图下方指示了向每个受试者施用的类固醇治疗；指示局部类固醇(二氟泼尼酯)滴眼剂的施用的频率(例如，1x＝每天一次，2x＝每天两次，3x＝每天3次，4x＝每天4次)。房水细胞级类别基于葡萄膜炎命名标准(Standardization of Uveitis Nomenclature，SUN)准则(Jabs，DA等人，Ophthalmol.2005；140:509-516)。玻璃体细胞级类别基于国家卫生研究所(NationalInstitutes of Health，NIH)指南。对于房水细胞，细胞等级0.5+表示1-5个细胞；细胞等级1+表示6-15个细胞；细胞等级2+表示16-25个细胞；细胞等级3+表示26-50个细胞；和细胞等级4+表示＞50个细胞。对于玻璃体细胞，细胞等级0.5+表示1-10个细胞；细胞等级1+表示11-20个细胞；细胞等级2+表示21-30个细胞；细胞等级3+表示31-100个细胞；和细胞等级4+表示＞100个细胞。对于该分析，捕获的稀有细胞为细胞等级0.5+。
图13A-13B显示直至24周的随访时间从实施例2和3中所述研究的群组2中的受试者1-6采集的光学相干断层扫描(OCT)图像和来源于OCT图像的视网膜厚度图。还提供了BCVA从基线的变化、CST从基线的变化和在24周随访期期间施用的救援抗VEGF注射的次数。在图13A中，星号表示受试者3接受了3次救援抗VEGF注射，包括在第24周的，所有都是由于BCVA从基线丧失≥10个字母。这归因于视网膜内或视网膜下流体。在图13B中，星号表示受试者5接受了3次救援抗VEGF注射，最后一次发生在第20周，因为中央亚视场厚度从基线增加＞75μm。
图14是实施例1-3中所述研究的群组1和2中受试者的抗VEGF注射次数的游泳道图(Swimmer's Lane Plot)，x轴表示相对于施用AAV2.7m8-阿柏西普的时间的以周计的时间。Y轴显示群组1和2中的每名单独受试者。圆形表示在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前和之后施用的抗VEGF IVT注射液。星号表示群组2的受试者6在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前6.4个月被诊断患有nAMD。平分该图的垂直线表示当施用AAV2.7m8-阿柏西普时的第1天。在平分垂直线的右侧是随后61次研究就诊中的每一次。
图15A-15C显示对于实施例1-5中所述研究的群组1、2和3的受试者，在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后通过裂隙灯检查测量的房水细胞和玻璃体细胞计数的图。图15A显示直到第64周的随访时间(中值＝60周；范围＝52-64周)，群组1中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。图15B显示直到第40周随访时间(中值＝36周；范围＝32-40周)，群组2中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。图15C显示直到第20周随访时间，群组3中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。在图15A-15C中，在每个图下方指示了向每个受试者施用的类固醇治疗；房水细胞级类别基于葡萄膜炎命名标准(Standardization of UveitisNomenclature，SUN)准则(Jabs,DA等人，Ophthalmol.2005；140:509-516)；玻璃体细胞级类别基于国家卫生研究所(National Institutes of Health，NIH)指南；房水细胞，0.5+＝1-5个细胞；1+＝6-15个细胞；2+＝16-25个细胞；3+＝26-50个细胞；4+＝>50个细胞；玻璃体细胞：0.5+＝1-10个细胞；1+＝11-20个细胞；2+＝21-30个细胞；3+＝31-100个细胞；4+＝>100个细胞；对于该分析，将稀有细胞捕获为0.5+。QID＝每天四次；TID＝每天三次；BID＝每天两次；QD＝每天一次；QOD＝每隔一天一次；“QD>>”表示受试者继续接受每天一次局部类固醇；“BID>>”表示受试者继续接受每天两次局部类固醇；和“QID>>”表示受试者连续接受每天四次局部类固醇。
图16A-16B提供实施例1-5(n＝6)中所述研究的群组1中的受试者从基线至52周的平均BCVA和平均CST。图16A显示从基线至第52周的平均BCVA(ETDRS字母)。星号表示一个受试者在第44和48周由于视网膜脱离具有低BCVA得分。图16B显示从基线到第52周的平均CST(μm)。星号表示一个受试者在第44和48周由于视网膜脱离不具有CST数据。在图16A-16B中，误差条表示使用T分布的平均绝对BCVA和CST值的90％置信区间；BL＝基线；D＝天；W＝周。
图17A-17B提供了实施例1-5(n＝6)中所述研究的群组2中受试者从基线到第36周的平均BCVA和平均CST。图17A显示从基线到第36周的平均BCVA(ETDRS字母)。图17B显示从基线到第36周的平均CST(μm)。在图17A-17B中，误差条表示使用T分布的平均绝对BCVA和CST值的90％置信区间；BL＝基线；D＝天；W＝周；一个受试者错过了第36周的就诊。
图18A-18B提供实施例1-5中所述研究的群组3中的五名受试者从基线到第20周的平均BCVA和平均CST。图18A显示从基线到第20周的平均BCVA(ETDRS字母)。图18B显示从基线到第20周的平均CST(μm)。在图18A-18B中，误差条表示使用T分布的平均绝对BCVA和CST值的90％置信区间；BL＝基线；D＝天；W＝周；一个受试者错过了第36周的就诊。
图19是实施例1-5中所述研究的群组1、2和3中施用给受试者的抗VEGF注射次数的游泳道图。x轴表示相对于施用AAV2.7m8-阿柏西普的时间的以周计的时间。y轴显示群组1-3中的每名单独受试者。圆形表示在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前和之后施用的抗VEGFIVT注射液。平分该图的垂直线表示当施用AAV2.7m8-阿柏西普时的第1天。在平分垂直线的右侧是随后研究就诊中的每一次。
图20A-20B显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的指定时间，从实施例1-5所述研究的群组1中的受试者4采集的光学相干断层扫描(OCT)图像和来源于OCT图像的视网膜厚度图。图20A显示了在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前指定时间(周)，群组1中受试者4的OCT图像和视网膜厚度图谱，在此期间向受试者施用抗VEGF IVT注射(雷珠单抗)。图20B显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的指定时间，群组1中的受试者4的OCT图像和视网膜厚度图。指示了筛选抗VEGF IVT注射剂(“筛选抗VEGF IVT”)和AAV2.7m8-阿柏西普(“AAV2.7m8-阿柏西普”)的施用时间。提供了在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的各个指定时间的BCVA(ETDRS字母)和CST(μm)。星号表示受试者具有与AAV2.7m8-阿柏西普无关的视网膜脱离事件。
图21A-21B显示了在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的指定时间，从实施例1-5所述研究的群组3中的受试者5采集的光学相干断层扫描(OCT)图像和来源于OCT图像的视网膜厚度图。图21A显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前指定时间(周)，群组3中受试者5的OCT图像和视网膜厚度图谱，在此期间，向受试者施用抗VEGF IVT注射(阿柏西普)。图21B显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的指定时间，群组3中的受试者5的OCT图像和视网膜厚度图。指示了筛选抗VEGF IVT注射剂(“筛选抗VEGF IVT”)和AAV2.7m8-阿柏西普(“AAV2.7m8-阿柏西普”)的施用时间。提供了在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的各个指定时间的BCVA(ETDRS字母)和CST(μm)。
图22A-22D显示对于实施例1-5和7中所述研究的群组1、2、3和4的受试者，在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后通过裂隙灯检查测量的房水细胞和玻璃体细胞计数的图。图22A显示直到第80周的随访时间，群组1中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。图22B显示直到第56周随访时间，群组2中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。图22C显示直到第36周随访时间，群组3中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。图22D直到第8周随访时间，群组4中的受试者的房水细胞和玻璃体细胞的图。在图22A-22D中，在每个图下方指示了向每个受试者施用的类固醇治疗；房水细胞级类别基于葡萄膜炎命名标准(Standardization of Uveitis Nomenclature，SUN)准则(Jabs,DA等人，Ophthalmol.2005；140:509-516)；玻璃体细胞级类别基于国家卫生研究所(NationalInstitutes of Health，NIH)指南；房水细胞，0.5+＝1-5个细胞；1+＝6-15个细胞；2+＝16-25个细胞；3+＝26-50个细胞；4+＝>50个细胞；玻璃体细胞：0.5+＝1-10个细胞；1+＝11-20个细胞；2+＝21-30个细胞；3+＝31-100个细胞；4+＝>100个细胞；对于该分析，将稀有细胞捕获为0.5+。QID＝每天四次；TID＝每天三次；BID＝每天两次；QD＝每天一次；QOD＝每隔一天一次；“QD>>”表示受试者继续接受每天一次局部类固醇；“BID>>”表示受试者继续接受每天两次局部类固醇；和“QID>>”表示受试者连续接受每天四次局部类固醇。
图23A-23B提供实施例1-5和7(n＝6)中所述研究的群组1中受试者从基线到第72周的平均BCVA和平均CST。图23A显示从基线到第72周的平均BCVA(ETDRS字母)。一个受试者在第44和48周由于视网膜脱离而具有低BCVA评分。*从第56周至第72周，n＝5。图23B显示从基线到第72周的平均CST(μm)。一个受试者在第44和48周由于视网膜脱离不具有CST数据。*从第56周至第72周，n＝5。在图23A-23B中，误差条表示使用T分布的平均绝对BCVA和CST值的90％置信区间；BL＝基线；D＝天；W＝周。
图24A-24B提供实施例1-5和7(n＝6)中所述研究的群组2中的受试者从基线到第52周的平均BCVA和平均CST。图24A显示从基线到第52周的平均BCVA(ETDRS字母)。*对于第36周和第40周，n＝5。图24B显示从基线到第52周的平均CST(μm)。*对于第36周和第40周，n＝5。在图24A-24B中，误差条表示使用T分布的平均绝对BCVA和CST值的90％置信区间；BL＝基线；D＝天；W＝周。
图25A-25B提供实施例1-5和7(n＝9)中所述研究的群组3中的受试者从基线到第20周的平均BCVA和平均CST。图25A显示从基线到第20周的平均BCVA(ETDRS字母)。*对于第4、16和20周，n＝8。图25B显示从基线到第20周的平均CST(μm)。*对于第周4、16和20，n＝8。在图25A-25B中，误差条表示使用T分布的平均绝对BCVA和CST值的90％置信区间；BL＝基线；D＝天；W＝周。
图26是实施例1-5和7中所述研究的群组1、2、3和4中受试者的抗VEGF注射次数的游泳道图，x轴表示相对于施用AAV2.7m8-阿柏西普的时间的以周计的时间。y轴显示群组1-4中的每名单独受试者。圆形表示在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前和之后施用的抗VEGFIVT注射液。平分该图的垂直线表示当施用AAV2.7m8-阿柏西普时的第1天。在平分垂直线的右侧是随后次研究就诊中的每一次。五个受试者在AAV2.7m8-阿柏西普注射之前<1年被诊断(群组2和3组中各1名受试者，群组4中3名受试者)。在群组4中，受试者2(由于重新定位)和5(因为受试者参与了在诊断后使用未知药物进行临床试验)第1天之前的数据不完整。
图27A-27B显示实施例1-5和7中所述研究的群组1-3中的受试者的平均年化抗VEGF注射率。图27A提供群组1中的受试者(施用6×1011 vg/眼睛的“高剂量”，n＝6)及群组2和3中的受试者(施用2×1011 vg/眼睛的“低剂量”，n＝15)的平均年化抗VEGF注射率的比较。图27B提供群组1(n＝6)、2(n＝6)和3(n＝9)中每一个受试者的平均年化抗VEGF注射率的比较。在图27A-27B中，年化率(前)＝(在AAV2.7m8-阿柏西普之前12个月内的抗VEGF IVT注射次数)/(过去12个月内第一次抗VEGF IVT注射至AAV2.7m8-阿柏西普注射的天数/365.25)；和年化率(后)＝(自AAV2.7m8-阿柏西普以来抗VEGF IVT注射的次数)/(从AAV2.7m8-阿柏西普到最后一个研究随访的天数/365.25)。
图28A-28B显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的指定时间，从实施例1-5和7所述研究的群组3中的受试者5采集的光学相干断层扫描(OCT)图像和来源于OCT图像的视网膜厚度图。图28A显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前指定时间(周)，群组3中的受试者5的OCT图像和视网膜厚度图谱，在此期间，向受试者施用抗VEGF IVT注射(阿柏西普)。图28B显示在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的指定时间(周)，群组3中的受试者5的OCT图像和视网膜厚度图。显示了筛选抗VEGF IVT注射剂(“阿柏西普IVT”)和AAV2.7m8-阿柏西普的给药次数。提供了在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前和之后的各个指定时间的BCVA(ETDRS字母)和CST(μm)。
图29显示实施例6中所述研究的设计图，其评价患有糖尿病性黄斑水肿(DME)的受试者中AAV2.7m8-阿柏西普的单次玻璃体内(IVT)注射的持久性。DRSS＝糖尿病性视网膜病严重程度评分；OCT＝光学相干断层扫描；CST＝中央亚视场厚度。*所有的受试者均接受7周时程的二氟泼尼酯滴眼剂，从QID开始并逐渐减少至QD。**PE＝主要终点判定。***EOS＝研究终止评估。
详细说明
下面参考实施例应用描述几个方面以进行说明。应当理解，阐述了许多具体细节、关系和方法以提供对本文所述特征的充分理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，可以在没有一个或多个特定细节的情况下或利用其他方法来实践本文描述的特征。本文所述的特征不受所说明的动作或事件的顺序的限制，因为一些动作可以以不同顺序发生和/或与其它动作或事件同时发生。此外，并不要求所有说明的动作或事件实现根据本文所述特征的方法。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
本文使用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，而不是旨在限制。如本文使用的单数形式“一个(种)”和“所述的”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。此外，在详细说明和/或权利要求书中使用的术语“包含(including)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体的程度上，这样的术语类似于术语“包括(comprising)”的方式是包含性的。如本文使用的术语“包含”与“包括”或“含有”是同义，并且是包含性的或开放式的。
除非另有说明，否则本文中任何对“或”的提及均旨在涵盖“和/或”。如本文使用的术语“约”一个数字指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”一个范围指该范围减去其最低值的10％并加上其最大值的10％。本文提及的“约”值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的实施方案。
术语“受试者”、“患者”或“个体”指灵长类动物，例如人和非人灵长类动物，例如非洲绿猴(AfricanGreen monkeys)和恒河猴(rhesus monkeys)。在一些实施方案中，受试者是人类。
如本文使用的术语“治疗”、“处理”、“改善”和其它语法等效物指减轻、缓和或改善眼新血管疾病或病症或眼新血管疾病或病症的症状，防止眼部新血管疾病或病症的其它症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制眼新血管疾病或病症，例如阻止眼新血管疾病或病症的发展，减轻眼新血管疾病或病症，引起眼部新血管疾病或病症的消退，或停止眼新血管疾病或病症的症状，并且旨在包括预防。该术语进一步包括实现治疗益处和/或预防益处。术语“治疗益处”指根除或改善所治疗的眼新血管疾病或病症。此外，通过根除或改善与眼新生血管疾病或病症相关的一种或多种生理学症状使得在受试者中观察到改善实现治疗益处，尽管在一些实施方案中，受试者仍然罹患眼新生血管疾病或病症。对于预防性益处，将药物组合物施用于即使尚未做出疾病或病症的诊断，但处于发展眼新血管疾病或病症的风险中的受试者，或施用于报告眼新血管疾病或病症的一种或多种生理症状的受试者。
如本文使用的术语“施用”、“给药”等可以指用于能够将治疗剂或药物组合物递送至期望的生物作用部位的方法。这些方法包括玻璃体内或视网膜下注射至眼睛。
如本文使用的术语“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”可以指足够量的至少一种所施用的药物组合物或化合物，其将在一定程度上缓解治疗的眼部疾病或病症的一种或多种症状。药物组合物的“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”可以作为单位剂量施用于需要其的受试者(如本文在别处进一步详细描述的)。
如本文使用的术语“可药用的”可以指不会消除本文公开的化合物的生物活性或性质并且相对无毒(即，当将该物质施用于个体时，其不会引起不希望的生物效应，也不会以有害的方式与含有的组合物的任何组分相互作用)的物质，例如载体或稀释剂。
如本文使用的术语“药物组合物”或简而言之“组合物”可以指任选地与至少一种可药用化学组分混合的生物活性化合物，所述化学组分例如但不限于载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、赋形剂等。
如本文使用的“AAV载体”或“rAAV载体”指腺相关病毒(AAV)载体或重组AAV(rAAV)载体，其包含用于转导至靶细胞或靶组织中的非AAV来源的多核苷酸序列(例如，与AAV异源的多核苷酸，如编码治疗性转基因(例如阿柏西普)的核酸序列)。通常，异源多核苷酸侧接至少一个，通常为两个AAV反向末端重复序列(ITR)。术语rAAV载体包括rAAV载体颗粒和rAAV载体质粒。rAAV载体可以是单链(ssAAV)或自身互补的(scAAV)。
“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“rAAV载体颗粒”或“rAAV颗粒”指包含至少一种AAV衣壳蛋白和多核苷酸rAAV载体的病毒颗粒。在一些情况下，所述至少一种AAV衣壳蛋白来自野生型AAV或是变体AAV衣壳蛋白(例如，具有插入，例如，如下所述的7m8氨基序列的插入的AAV衣壳蛋白)。如果颗粒包含异源多核苷酸(例如，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，比如待递送至靶细胞或靶组织的转基因)，则其被称为“rAAV颗粒”、“rAAV载体颗粒”或“rAAV载体”。因此，rAAV颗粒的制备必然包括rAAV载体(比如，包含在rAAV颗粒之内的载体)的制备。
如本文使用的术语“包装”可以指一系列细胞内事件，其可以导致rAAV颗粒的装配和衣壳化。
AAV“rep”和“cap”基因指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
术语“多肽”可以涵盖天然存在和非天然存在的蛋白质(例如，融合蛋白)、肽、其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体、二聚体、三聚体或多聚体。进一步，多肽可以包含许多不同的结构域，其中每个结构域具有一种或多种不同的活性。为了避免疑义，“多肽”可以是大于两个氨基酸的任何长度。
如本文使用的“多肽变体”或简而言之“变体”指其序列含有氨基酸修饰的多肽。在一些实施方案中，所述修饰是与参考蛋白或多肽，例如天然或野生型蛋白的氨基酸序列相比，一个或多个氨基酸的插入、复制、缺失、重排或取代。变体可以具有一个或多个氨基酸点取代(其中在一个位置的单个氨基酸已经改变为另一个氨基酸)，一个或多个插入和/或缺失(其中在参考蛋白的序列中分别插入或缺失一个或多个氨基酸)，和/或在氨基或羧基末端之一或两者处氨基酸序列的截短。与参考蛋白或未修饰的蛋白相比，变体可以具有相同或不同的生物活性。
在一些实施方案中，变体可以与其对应的参考蛋白具有例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总体序列同源性。在一些实施方案中，变体可以与野生型蛋白具有至少约90％的总体序列同源性。在一些实施方案中，变体显示出至少约95％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.9％的总体序列同一性。
如本文使用的“重组”可以指生物分子，例如基因或蛋白，其(1)已经从其天然存在的环境中移出，(2)不与自然界中发现该基因的多核苷酸的全部或一部分结合，(3)可操作地连接自然界中未连接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。术语“重组”可用于指克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或通过异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由这样的核酸编码的蛋白质和/或mRNA。因此，例如，如果由存在于细胞中的重组基因合成的mRNA合成由微生物合成的蛋白，则该蛋白是重组的。
术语“抗VEGF试剂”包括任何治疗剂，包括蛋白质、多肽、肽、融合蛋白、多聚体蛋白、基因产物、抗体、人单克隆抗体、抗体片段、适体、小分子、激酶抑制剂、受体或受体片段或核酸分子，其可减少、干扰、破坏、阻断和/或抑制内源性VEGF和/或内源性VEGF受体(VEGFR)的活性或功能，或体内VEGF-VEGFR相互作用或途径。抗-VEGF试剂可以是当其在体内被递送到细胞、组织或受试者中时，其可以减少新血管生长或形成和/或水肿(oedem)或肿胀的任何一种已知的治疗剂，例如雷珠单抗(ranibizumab)、布鲁单抗(brolucizumab)或贝伐单抗(bevacizumab)。在一些实施方案中，抗VEGF试剂可以是天然存在的、非天然存在的或合成的。在一些实施方案中，抗VEGF试剂可以来源于天然存在的分子，其随后被修饰或突变以赋予抗VEGF活性。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是融合蛋白或嵌合蛋白。在这样的蛋白质中，功能结构域或多肽被人工融合到部分或多肽上，以制备可以在体内螯合VEGF或作为VEGFR诱饵起作用融合蛋白或嵌合蛋白。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是阻断内源性VEGFR与其配体相互作用的融合蛋白或嵌合蛋白。
如本文使用的“VEGF”可以指VEGF的任何同种型，除非另有要求，否则包括但不限于VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F或其任何组合或任何功能片段或变体。除非另有要求，否则“VEGF”可以指VEGF家族的任何成员，包括成员：VEGF-A、胎盘生长因子(PGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D，或其任何组合、功能片段或变体。如本文使用的“VEGF受体”或“VEGFR”或“VEGF-R”用于指VEGF受体中的任一种，包括但不限于VEGFR-1(或Flt-1)、VEGFR-2(或Flk-1/KDR)和VEGFR-3(或Flt-4)。VEGFR可以是膜结合或可溶形式，或受体的功能片段或截短形式。抗VEGF试剂的实例包括，但不限于雷珠单抗、贝伐单抗、布鲁单抗或其任何组合、变体或功能片段。
“可操作地连接”或“偶联”可以指遗传元件的并置(juxtaposition)，其中所述元件处于允许它们以预期方式操作的关系。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可以可操作地连接至编码区。在启动子和编码区之间可以存在插入残基，只要保持这种功能关系。
术语“表达载体”或“表达构建体”或“盒”或“质粒”或简而言之“载体”可包括任何类型的基因构建体，包括AAV或rAAV载体，其含有编码基因产物的核酸或多核苷酸，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录且适于基因治疗。转录物可以翻译成蛋白。在一些实施方案中，转录物是部分翻译的或未翻译的。在某些方面，表达包括基因的转录和mRNA翻译成基因产物。在其它方面，表达仅包括编码目标基因的核酸的转录。表达载体还可以包含与编码区可操作连接的控制元件，以促进蛋白在靶细胞中的表达。控制元件和与它们可操作地连接用于表达的一个或多个基因的组合有时可被称为“表达盒”，其中许多是本领域已知和可获得的，或者可容易地由本领域可获得的组分构建。
术语“异源的”可以指在基因型上不同于与其比较的实体的其余部分的实体。例如，通过基因工程技术引入源自不同物种的质粒或载体的多核苷酸可以是异源多核苷酸。从其天然编码序列中移除并与天然未发现连接的编码序列可操作连接的启动子可以是异源启动子。
如本文使用的“7m8”指氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO:1)。
“7m8变体”指rAAV，其可以具有任何血清型，具有插入衣壳蛋白的暴露于溶剂的GH环中的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)。
当7m8插入rAAV2中(也称为AAV2.7m8)时，氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)被插入AAV2衣壳蛋白的氨基酸570-611内的GH环中，例如在AAV2衣壳蛋白VP1的位置587和588之间。在一些情况下，当7m8插入rAAV2中(也称为AAV2.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV2衣壳蛋白的GH环中，例如在包含SEQ ID NO：13序列的AAV2 VP1的位置587和588之间。当7m8插入rAAV1中(也称为AAV1.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV1衣壳蛋白的AAV1的氨基酸571-612内，例如在AAV1衣壳蛋白的氨基酸590与591之间的GH环中。当7m8插入rAAV5中(也称为AAV5.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV5衣壳蛋白的AAV5的氨基酸560-601内，例如在AAV5衣壳蛋白的氨基酸575和576之间的GH环中。当7m8插入rAAV6中(也称为AAV6.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV6衣壳蛋白的氨基酸571至612内的GH环中，例如在AAV6衣壳蛋白的氨基酸590与591之间。当7m8插入rAAV7中(也称为AAV7.7m8)时，氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV7衣壳蛋白的氨基酸572至613内，例如在AAV7衣壳蛋白的氨基酸589和590之间的GH环中。当7m8插入rAAV8中(也称为AAV8.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV8衣壳蛋白的氨基酸573至614内，例如在AAV8衣壳蛋白的氨基酸590与591之间的GH环中。当7m8插入rAAV9中(也称为AAV9.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV9衣壳蛋白的GH环中，例如在AAV9衣壳蛋白的氨基酸588与589之间。当7m8插入rAAV10中(也称为AAV10.7m8)时，将氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)插入AAV10衣壳蛋白的氨基酸573至614内，例如在AAV10衣壳蛋白的氨基酸589和590之间的GH环中。
概述
用于眼新血管疾病如wAMD的目前疗法(例如，阿柏西普重组蛋白，雷珠单抗重组蛋白)需要约每4-8周施用终生IVT。这会增加一些患者中炎症、感染和其他副作用的风险。进一步，由于重复和/或频繁去医疗机构进行治疗，目前疗法产生了顺应性挑战，尤其是在最受wAMD影响的老年患者中。施用频率的降低与视力丧失和眼病或眼病症的恶化相关。AAV载体在IVT注射后有效转导目标视网膜细胞的能力已被用于成功地将治疗基因转移到光感受器、视网膜色素上皮和内视网膜中以治疗多种视网膜疾病。因此，施用编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的rAAV颗粒可提供抗VEGF试剂在体内的延长和/或持续释放。
令人惊讶地，向患有眼新血管疾病的个体的眼睛施用单一低单位剂量的6×1011个载体基因组(vg)/眼睛的编码阿柏西普的rAAV颗粒在所有治疗的个体中引起疾病的稳定化和的强解剖学响应(参见实施例1)。另外，在所有治疗的个体中视力稳定，并且在施用单一单位剂量的6×1011vg/眼睛编码阿柏西普的rAAV颗粒之后，个体均不需要救援抗VEGF治疗(例如阿柏西普IVT注射)。此外，向患有眼新血管疾病的个体施用单一单位剂量的编码阿柏西普的rAAV颗粒出人意料地引起症状的减轻(例如消退)，所述症状包括对先前的抗VEGF治疗(例如阿柏西普、雷珠单抗或贝伐单抗的长期IVT注射)难治性的视网膜内和视网膜下流体。
因此，本公开内容提供通过施用单一单位剂量的6×1011 vg/眼睛或更少的编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的rAAV颗粒治疗个体中眼新血管疾病的方法。另外，此外，本公开内容提供通过施用单一单位剂量的编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的rAAV颗粒减少患有眼新血管疾病的个体的眼睛中的视网膜流体的方法。本文公开的方法减少或消除了重复IVT注射的需要，同时提供长期功效，从而解决非顺从性和非依从性的问题。此外，本文提供的方法减少了与多次IVT注射相关的副作用。
治疗方法
本文提供一种用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法，所述方法包括向所述个体的眼睛施用单位剂量的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
本文还提供一种用于减少患有眼新血管疾病的个体的眼睛中的视网膜流体的方法，所述方法包括向所述个体的眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。
本文还提供一种用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法，所述方法包括对所述个体的眼睛施用抗VEGF试剂(例如阿柏西普)，并且在施用所述抗VEGF试剂之后向所述个体的眼睛施用单位剂量的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
在一些实施方案中，眼新生血管疾病是湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)、视网膜新生血管形成、脉络膜新血管形成糖尿病性视网膜病变、增殖性糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病、糖尿病性视网膜水肿或其任意组合。
在一些实施方案中，术语眼新血管疾病还涵盖VEGF驱动的新生血管性前期疾病(VEGF-driven pre-neovascular diseases)，如果不治疗，其发展成新生血管性形式。在一些实施方案中，眼新生血管疾病是新生血管性前期疾病、非增生性糖尿病性视网膜病。
在一些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前的约最后8周、约最后9周、约最后10周、约最后11周、约最后12周、约最后13周、约最后14周、约最后15周或约最后16周，个体接受至少一种使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗(faricimab)、阿比斯帕培果(abicipar pegol)、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)对眼新血管疾病的至少一种先前治疗(例如至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少5次或更多次治疗)。在一些实施方案中，所述个体对使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗表现出有意义的响应。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是阿柏西普、其功能变体或其功能片段。在一些实施方案中，抗VEGF试剂包含含有与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，个体的眼睛中的视网膜流体是视网膜内流体(IRF)和/或视网膜下流体(SRF)。在一些实施方案中，个体的眼睛中视网膜流体的量或存在对于用抗VEGF剂(例如贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗是难治的。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是阿柏西普、其功能变体或其功能片段。在一些实施方案中，抗VEGF试剂包含含有与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，眼新血管疾病是糖尿病性黄斑水肿(DME)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体患有1型或2型糖尿病。在一些实施方案中，个体具有由于涉及糖尿病性黄斑水肿的中心引起的视力损伤。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，在施用rAAV颗粒的眼中，个体具有约78至50个ETDRS字母(例如，50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78个ETDRS字母中的任一个)的视力(BCVA)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前施用rAAV颗粒的眼睛中，个体具有约20/32至约20/100之间的视力(斯内伦等效值)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛具有≥325μm(使用具有涉中心IRF(中心1mm)的Heidelberg
Figure BDA0003539340930000341
)的中央亚视场厚度(CST)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛的视力降低，这主要是由于糖尿病性黄斑水肿。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约6个月或更短时间，例如在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约6个月、约5个月、约4个月、约3个月、约2个月、约1个月或更短时间中的任一个，个体诊断为患有糖尿病性黄斑水肿。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体接受0、1或2次用于眼睛中DME的先前治疗，例如0、1或2次使用抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的玻璃体内注射。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前至少约60天(即，约2个月)，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中接受使用抗VEGF试剂的先前治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中显示对先前使用抗VEGF试剂的治疗在中央亚视场厚度中有意义的响应，例如，中央亚视场厚度减少至少10％。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体未经历使用抗VEGF试剂的先前治疗的不良反应。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体不具有针对AAV2.7m8的中和抗体。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，例如在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约6个月内，个体不具有大于1:125的抗AAV2.7m8中和抗体滴度。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体不具有对阿柏西普、皮质类固醇或荧光素染料或荧光素钠(例如，用于血管造影术)的过敏史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体具有对阿柏西普、皮质类固醇或荧光素染料或荧光素钠(例如，用于血管造影术)的轻度过敏史，其中过敏症能够治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体不具有不受控制的糖尿病，例如大于10％的HbA1C。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约3个月内，个体不具有糖尿病酮酸中毒的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体未开始强化胰岛素治疗，例如用胰岛素泵或每日多次胰岛素注射。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒后约3个月内，个体不计划开始强化胰岛素治疗，例如用胰岛素泵或每日多次胰岛素注射。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体没有需要用全身性类固醇治疗或免疫抑制治疗(例如甲氨蝶呤或阿达木单抗)进行治疗的全身性自身免疫病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，不向个体施用已知引起黄斑水肿的全身性药物，例如芬戈莫德、他莫昔芬、氯喹或羟氯喹。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，不向个体施用全身性抗VEGF治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有高风险增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)。在一些实施方案中，PDR定义为任何玻璃体或视网膜前出血、在相当于临床检查的标准ETDRS7-视野的区域内的别处＞1/2-视盘区的新血管形成、或临床检查的＞1/3-视盘区的盘的新血管形成。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不进行聚焦或栅格激光光凝固(grid laser photocoagulation)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中未进行任何先前全视网膜光凝(PRP)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中未接受抗VEGF疗法(例如，阿柏西普IVT注射)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中未接受抗VEGF疗法(例如，阿柏西普IVT注射)至少60天。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中未接受超过两次抗VEGF治疗(例如，阿柏西普IVT注射)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有前段新血管形成(例如虹膜[NVI]新血管形成或新血管性青光眼[NVG])、显著的玻璃体出血、纤维血管增殖或牵引性视网膜脱离中任一个的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛的中央凹处不具有结构异常(例如，致密硬性渗出物、色素异常、中央凹萎缩、玻璃体黄斑牵引或视网膜前膜中的任一种)，其导致黄斑水肿或视觉缺陷。在一些实施方案中，通过临床检查或OCT评估中央凹处的结构异常。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有除糖尿病性视网膜病变之外的视网膜疾病(例如，年龄相关性黄斑变性(在任一眼睛中)、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞或病理性近视)病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有除糖尿病性黄斑水肿之外的眼部疾病史，例如显著性白内障或黄斑牵引，或后囊下白内障的迹象。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前至少约3个月内，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有白内障摘除或钇铝石榴石(YAG)囊切开术的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中没有视网膜脱离(修复或未修复)的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有小梁切除术、青光眼分流或微创青光眼手术(MIGS)中的任一种的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中没有玻璃体切除术或其他过滤手术的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有无晶状体或前房人工晶状体。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛中不具有不受控制的眼高血压或青光眼，例如尽管用抗青光眼药物治疗但IOP＞22mmHg，或目前使用＞2种IOP降低药物治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛不具有任何用于眼部病症的眼内或眼周类固醇治疗(例如IVT Triesence、Iluvien或Ozurdex)病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前至少约90天内，个体的施用rAAV颗粒的眼睛未进行屈光手术。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛未进行先前的穿透性角膜移植术(penetratingkeratoplasty)、内皮角膜成形术或眼辐射。在一些实施例中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的施用rAAV颗粒的眼睛未进行任何先前玻璃体视网膜手术。在一些实施方案中，在施用单位剂量rAAV颗粒之前，个体没有葡萄膜炎或眼内炎症(例如，除了已消退的轻度预期手术后炎症之外的轻微或更高等级)的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体不具有与局部类固醇施用相关的IOP升高的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体没有眼部单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或巨细胞病毒(CMV)(包括病毒葡萄膜炎、视网膜炎或角膜炎)的病史。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体没有任何眼部外部感染(包括结膜炎)、睑板腺囊肿或显著的睑缘炎中任一个的迹象。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体不具有眼部弓形虫病史。
在一些实施方案中，单位剂量表示为载体基因组的数量(vg)。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1011个载体基因组(vg)或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量表示为每只眼睛的载体基因组(vg)的数量(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1011 vg/眼睛或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010至约2×1011 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约2×1011或约6×1010vg/眼睛。
在一些实施方案中，将单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是右眼或左眼。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是右眼。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是左眼。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是右眼，且对侧眼睛是左眼。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是左眼，且对侧眼睛是右眼。
在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周(例如，约0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)。在一些实施方案中，施用至个体的对侧眼睛的单位剂量的rAAV颗粒与施用至个体的一只眼睛的单位剂量的rAAV颗粒几乎相同(例如高或低小于1％、高或低小于5％、高或低小于10％、高或低小于20％)或更低(例如高或低约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％)。
在一些实施方案中，向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约2周(例如，至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长)。在一些实施方案中，施用至个体的对侧眼睛的单位剂量的rAAV颗粒高于(例如，高于约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％或更多中的任一个)施用至个体的一只眼睛的单位剂量的rAAV颗粒。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.99％或100％同一性的氨基酸序列，和b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID号14)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。SEQ ID NO：35的序列提供如下：
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:35)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID号14)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽是阿柏西普或其功能变体或其功能片段。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有密码子优化的序列且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述密码子优化的序列编码与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有密码子优化的序列且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述密码子优化的序列编码与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有密码子优化的序列且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述密码子优化的序列编码与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有阿柏西普或其功能变体或其功能片段的cDNA序列，且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有阿柏西普或其功能变体或其功能片段的密码子优化的cDNA序列，且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有SEQ ID NO：36的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，核酸进一步包含(a)包含CMV序列的第一增强子区；(b)包含CMV序列的启动子区；(c)5'UTR区，其以5'至3'的顺序包含TPL序列和eMLP序列；(d)包含完整EES序列的第二增强子区；和(e)HGH聚腺苷酸化位点。在一些实施方案中，包含CMV序列的增强子区包含SEQ ID NO：22的序列。在一些实施方案中，包含CMV序列的启动子区包含SEQID NO：23的序列，在一些实施方案中，TPL序列包含SEQ ID NO：24的序列，在一些实施方案中，eMLP序列包含SEQ ID NO：25的序列，在一些实施方案中，包含完整EES序列的第二增强子区包含SEQ ID NO：26的序列。在一些实施方案中，HGH腺苷酸化位点包含SEQ ID NO：27的序列。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)。SEQ IDNO：13的序列提供如下：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:13)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ IDNO：1)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的任何下述氨基酸序列，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白：LALGETTRPA(SEQ ID NO:1)；LANETITRPA(SEQ ID NO:2)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:3)、LAKDPKTTNA(SEQ ID NO:4)、KDTDTTR(SEQ ID NO:5)、RAGGSVG(SEQ ID NO:6)、AVDTTKF(SEQID NO:7)、STGKVPN(SEQ ID NO:8)、LAKDTDTTRA(SEQ ID NO:9)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:10)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:11)、LASTGKVPNA(SEQ ID NO:12)、LGETTRP(SEQ ID NO:14)、NETITRP(SEQ ID NO:15)、KAGQANN(SEQ ID NO:16)、KDPKTTN(SEQ ID NO:17)、KDTDTTR(SEQID NO:18)、RAGGSVG(SEQ ID NO:19)、AVDTTKF(SEQ ID NO:20)、and STGKVPN(SEQ ID NO:21)。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的任何下述氨基酸序列：LALGETTRPA(SEQ ID NO:1)；LANETITRPA(SEQ ID NO:2)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:3)、LAKDPKTTNA(SEQ ID NO:4)、KDTDTTR(SEQ ID NO:5)、RAGGSVG(SEQ ID NO:6)、AVDTTKF(SEQ ID NO:7)、STGKVPN(SEQ IDNO:8)、LAKDTDTTRA(SEQ ID NO:9)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:10)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:11)、LASTGKVPNA(SEQ ID NO:12)、LGETTRP(SEQ ID NO:14)、NETITRP(SEQ ID NO:15)、KAGQANN(SEQ ID NO:16)、KDPKTTN(SEQ ID NO:17)、KDTDTTR(SEQ ID NO:18)、RAGGSVG(SEQID NO:19)、AVDTTKF(SEQ ID NO:20)、and STGKVPN(SEQ ID NO:21)。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过玻璃体内(IVT)注射、眼内施用或视网膜内注射。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过玻璃体内(IVT)注射。
在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为药物制剂形式。在一些实施方案中，药物制剂包含rAAV颗粒、一种或多种渗透或离子强度剂、一种或多种缓冲剂、一种或多种表面活性剂和一种或多种溶剂。在一些实施方案中，渗透或离子强度剂是氯化钠。在一些实施方案中，一种或多种缓冲剂为磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠。在一些实施方案中，表面活性剂为泊洛沙姆188。在一些实施方案中，溶剂为水。在一些实施方案中，药物制剂包含rAAV颗粒、氯化钠、磷酸钠和表面活性剂。在一些实施方案中，药物制剂包含约1×1010 vg/mL至约1×1013 vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL至约6×1012vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约150mM至约200mM的氯化钠(例如，约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM或约200mM中的任一种)。在一些实施方案中，药物制剂包含约1mM到约10mM的磷酸二氢钠(例如，约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM)。在一些实施方案中，药物制剂包含约1mM至约10mM的磷酸氢二钠(例如，约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM)。在一些实施方案中，药物制剂包含约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188(例如，约0.0005％(w/v)、0.0006％(w/v)、0.0007％(w/v)、0.0008％(w/v)、0.0009％(w/v)、0.001％(w/v)、0.002％(w/v)、0.003％(w/v)、0.004％(w/v)或约0.005％(w/v)中的任一个)。在一些实施方案中，药物制剂具有约7.0至约7.5(例如，约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4或约7.5中的任一个)的pH。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒、约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL的rAAV颗粒、约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。
在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含在约25μL至约250μL之间的体积(例如，约25μL、约30μL、约40μL、约50μL、约60μL、约70μL、约80μL、约90μL、约100μL、约110μL、约120μL、约130μL、约140μL、约150μL、约160μL、约170μL、约180μL、约190μL、约200μL、约210μL、约220μL、约230μL、约240μL或约250μL中的任一个)。在一些实施方案中，调节药物制剂中rAAV颗粒的浓度以使施用至个体眼睛的单位剂量rAAV颗粒的体积在约25μL至约250μL之间。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约100μL的体积。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约30μL的体积。
在一些实施方案中，将单位剂量的rAAV颗粒与类固醇治疗组合施用。在一些实施方案中，类固醇治疗为皮质类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为全身性类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为口服类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗是泼尼松治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为眼用类固醇治疗。在一些实施方案中，眼用类固醇治疗为局部类固醇治疗(例如滴剂)、眼周类固醇治疗(例如眼筋膜囊内、结膜下)、玻璃体内类固醇治疗或脉络膜上(superchoroidal)类固醇治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗、甲羟松治疗、氯替泼诺治疗、泼尼松龙治疗、氟轻松治疗、曲安西龙治疗、利美索龙治疗、地塞米松治疗、氟米龙治疗、氟轻松治疗、利美索龙治疗或泼尼松治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前和期间施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前和之后施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间和之后施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和之后施用类固醇治疗。
在一些实施方案中，类固醇治疗为眼用类固醇治疗(例如二氟泼尼酯)。在一些实施方案中，眼用类固醇治疗(例如二氟泼尼酯)为从施用单位剂量的rAAV颗粒起持续至多约4周、约6周或约8周的每日类固醇治疗。在一些实施方案中，眼用固醇治疗包括在约第1周约四次施用眼用类固醇，在约第2周约三次施用眼用类固醇，在约第3周约两次施用眼用类固醇，以及在约第4周约一次施用眼用类固醇；从施用单位剂量的rAAV颗粒开始和之后计时。在一些实施方案中，眼用类固醇为约0.005％至约0.5％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，眼用类固醇为约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.4％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％或约0.1％的二氟泼尼酯中的任一种。在一些实施方案中，眼用类固醇为二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方案中，0.05％的二氟泼尼酯的剂量为一滴眼用溶液。在一些实施方案中，一滴为约50μL(例如，约25μL至约50μL，约50μL至约100μL)。在一些实施方案中，二氟泼尼酯的剂量包含约1μg至约5μg，或约2μg至约3μg，或约2.5μg的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，二氟泼尼酯的剂量包含约2.5μg的二氟泼尼酯。
在一些实施方案中，类固醇治疗为眼用类固醇治疗(例如二氟泼尼酯)。在一些实施方案中，眼用类固醇治疗(例如二氟泼尼酯)为从施用单位剂量的rAAV颗粒起持续至多约4周、约6周或约8周的每日局部类固醇治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在约第1周约四次施用局部类固醇，在约第2周约三次施用局部类固醇，在约第3周约两次施用局部类固醇，以及在约第4周约一次施用局部类固醇；从施用单位剂量的rAAV颗粒开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在施用单位剂量的rAAV颗粒之后约每天四次施用局部类固醇(即，QID)持续约3周，随后每天约3次施用局部类固醇(即，TID)持续约3周，随后每天约2次施用局部类固醇(即，BID)持续约1周，和随后每天约1次施用局部类固醇(即，QD)持续约1周。在一些实施方式中，局部类固醇包含约1μg至约3μg剂量的二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方案中，局部类固醇包含约2.5μg剂量的二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方案中，局部类固醇为约0.005％至约0.5％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，局部类固醇为约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.4％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％或约0.1％的二氟泼尼酯中的任一种。在一些实施方案中，局部类固醇为二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方案中，0.05％的二氟泼尼酯的剂量为一滴眼用溶液。在一些实施方案中，一滴为约50μL(例如，约25μL至约50μL，约50μL至约100μL)。在一些实施方案中，二氟泼尼酯的剂量包含约1μg至约5μg，或约2μg至约3μg，或约2.5μg的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，二氟泼尼酯的剂量包含约2.5μg的二氟泼尼酯。
在一些实施方案中，在将单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛之后，个体的眼睛中的视网膜流体(例如SRF和/或IRF)减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％中的任一个。在一些实施方案中，与在施用单位剂量的rAAV颗粒之前个体的眼睛中的视网膜流体的水平相比，在将单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛之后，个体的眼睛中的视网膜流体(例如SRF和/或IRF)减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前个体的眼睛中的视网膜液体水平相比，在将单位剂量的rAAV颗粒施用至所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛之后，个体的眼睛中的视网膜流体(例如SRF和/或IRF)减少约100％。
在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，监测个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中的视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的水平。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后约1天、约3天、约8天、约2周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周、约20周、约24周、约28周、约32周、约36周、约40周、约44周、约48周、约52周、约56周、约60周、约64周、约68周、约72周、约76周、约80周、约84周、约88周、约92周、约96周、约100周、约104周或更长的任何时间，首次观察到眼睛中视网膜液(例如SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，眼内视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的减少持续或维持至少1周、至少2周、至少4周、至少6周、至少8周、至少12周、至少16周、至少20周、至少24周、至少28周、至少32周、至少36周、至少40周、至少44周、至少48周、至少52周、至少56周、至少60周、至少64周、至少68周、至少72周、至少76周、至少80周、至少84周、至少88周、至少92周、至少96周、至少100周、至少104周或更长时间。
在一些实施方案中，通过本领域已知的任何方法测定眼睛中视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，通过光学相干断层扫描(OCT)、谱域OCT(SD-OCT)、OCT血管造影术、荧光素血管造影术或通过直接视网膜观察来测定眼睛中的视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，通过光学相干断层扫描(OCT)测定眼睛中视网膜流体(例如，SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，通过谱域OCT(SD-OCT)测定眼睛中视网膜流体(例如，SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，通过OCT血管造影术测定眼睛中视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，通过荧光素血管造影术测定眼睛中视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的减少。在一些实施方案中，通过直接视网膜观察测定眼睛中视网膜流体(例如SRF和/或IRF)的减少。
在一些实施方案中，基于视网膜流体(例如，视网膜内流体(IRF)和/或视网膜下流体(SRF))的水平，与将单位剂量的rAAV颗粒施用至一只眼睛和/或对侧眼睛之前(例如，如上所述)的视网膜流体(例如，SRF和/或IRF)的水平的比较来评估在将单位剂量的rAAV颗粒施用至一只眼睛和/或对侧眼睛之后对个体中的眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，视网膜流体是视网膜下流体(SRF)或视网膜内流体(IRF)。在一些实施方案中，视网膜流体是视网膜下液体(SRF)。在一些实施方案中，视网膜流体是视网膜内流体(IRF)。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒(例如如上所述)之前的视网膜流体(例如IRF和/或SRF)的水平相比，观察到在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后观察到视网膜流体(例如IRF和/或SRF)减少，则确定在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼部新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，眼新血管疾病是wAMD。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的维持或减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的减少。在一些实施方案中，视网膜厚度是中央亚视场厚度(CST)或中心视网膜厚度(CRT)。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％中的任一个。在一些实施方案中，通过OCT或SD-OCT确定视网膜厚度(例如，CST或CRT)。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约10μm至约100μm(例如，超过约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm、约95μm、约100μm或更多中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约5μm至约50μm(例如，约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm或约50μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约5μm至约40μm(例如，约5μm、约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm或约40μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约5μm至约30μm(例如，约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm、约25μm、约26μm、约27μm、约28μm、约29μm或约30μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约5μm至约25μm(例如，约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm、约20μm、约21μm、约22μm、约23μm、约24μm或约25μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约5μm至约20μm(例如，约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm、约15μm、约16μm、约17μm、约18μm、约19μm或约20μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约18μm至约75μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约18.5μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约21.0μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约8.3μm。向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约25.5μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约24.8μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约75μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约100μm或更多(例如，约100μm或更多、约110μm或更多、约120μm或更多、约130μm或更多、约140μm或更多、约150μm或更多、约160μm或更多、约170μm或更多、约180μm或更多、约190μm或更多、或约200μm或更多中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约10μm至约200μm(例如，约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约50μm至约200μm(例如，约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约60μm至约200μm(例如，约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约70μm至约200μm(例如，约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约80μm至约200μm(例如，约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约90μm至约200μm(例如，约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约100μm至约200μm(例如，约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约110μm至约200μm(例如，约110μm、约120μm、约130μm、约140μm、约150μm、约160μm、约170μm、约180μm、约190μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约115μm至约200μm(例如，中的任一个约115μm、约120μm、约125μm、约130μm、约135μm、约140μm、约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约120μm至约200μm(例如，约120μm、约125μm、约130μm、约135μm、约140μm、约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约125μm至约200μm(例如，约125μm、约130μm、约135μm、约140μm、约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约130μm至约200μm(例如，约130μm、约135μm、约140μm、约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约135μm至约200μm(例如，约135μm、约140μm、约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约140μm至约200μm(例如，约140μm、约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约145μm至约200μm(例如约145μm、约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm，中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约150μm至约200μm(例如，约150μm、约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约155μm至约200μm(例如，约155μm、约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约160μm至约200μm(例如，约160μm、约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约165μm至约200μm(例如，约165μm、约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约170μm至约200μm(例如，约170μm、约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约175μm至约200μm(例如，约175μm、约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约180μm至约200μm(例如，约180μm、约185μm、约190μm、约195μm或约200μm中的任一个)。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约21.0μm在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约8.3μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约26.2μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约24.8μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约40.8μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约30.0μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约118.6μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约119.0μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约137.8μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约152.7μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约153.3μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约149.8μm。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化在约-200μm至约+40μm之间(例如，约-200μm、约-180μm、约-160μm、约140μm、约-120μm、约-100μm、约-80μm、约-60μm、约-40μm、约-20μm、约0μm、约+5μm、约+10μm、约+15μm、约+20μm、约+25μm、约+30μm、约+35μm或约+40μm中任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约8μm、约11μm、约16μm、约29μm、约33μm、约38μm、约55μm、约61μm或约117μm。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约27.8μm或约30.8μm中的任一个。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的增加是约4μm、约12μm或约32μm中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-21.0μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-8.3μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-26.2μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-24.8μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-40.8μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-30.0μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-118.6μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-119.0μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-137.8μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-152.7μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-153.3μm。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化是约-149.8μm。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化(例如，减少)出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约1天、约1周、约2周、约4周、约8周、约16周、约24周、约30周、约32周、约34周、约40周、约44周、约48周、约52周或更长时间的任一时间。与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的变化(例如，减少)出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约约1天、约1周、约2周、约4周、约8周、约12周、约16周、约20周、约24周、约28周、约32周、约36周、约40周、约44周、约48周、约52周、约56周、约60周、约64周、约68周、约72周、约76周、约80周、约84周、约88周、约92周、约96周、约100周、约104周、约108周或更长时间中的任一时间。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％中的任一个。在一些实施方案中，与在施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是至少约10％。。在一些实施方案中，与在施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)的减少是约15％或更多。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中中央亚视场厚度(CST)的增加小于约40μm(例如，小于约40μm、小于约35μm、小于约30μm、小于约25μm、小于约20μm、小于约15μm、小于约10μm、小于约5μm、小于约1μm或更小中的任一个)。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起中心视网膜厚度(CRT)或中中央亚视场厚度(CST)的增加小于约32μm。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比视网膜厚度的维持、减少或增加出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周或更长时间。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比视网膜厚度的维持、减少或增加出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周、约34周、约44周、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间中的任一时间。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的保持或减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减少超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减少是至少约10％。在一些实施方案中，通过OCT或SD-OCT测定黄斑体积。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减少是至少约10％。在一些实施方案中，通过OCT或SD-OCT测定黄斑体积。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减少是至少约15％。在一些实施方案中，通过OCT或SD-OCT测定黄斑体积。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比黄斑体积的维持或减少出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周或更长时间。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比黄斑体积的维持或减少出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周、约34周、约44周、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间中的任一时间。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的维持或改善。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的改善。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的改善超过约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％或更多中的任一个。在一些实施方案中，视力是最佳矫正视力(BCVA)。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善。在一些实施方案中，BCVA表示为ETDRS评分，其对应于正确读取的字母的数量(Vitale et al.,(2016)JAMA Opthalmol 134(9):1041:1047)。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是至少15个ETDRS字母(Vitale等人，(2016)JAMA Opthalmol134(9)：1041:1047)(例如至少约15、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60或约70个字母)。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约1至约15(例如，约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15)个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约5个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约1、约2、约3、约4、约5、约6或约7个ETDRS字母中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约3个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约4个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约5.1个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约6.4个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约6.8个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约8.8个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的改善是约2.3个ETDRS字母。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中所述个体损失少于15个ETDRS字母(Vitale等人，(2016)JAMA Opthalmol 134(9)：1041:1047)(例如，15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约2个字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、或约9个ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中所述个体损失0个字母。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约1个字母。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约2.7个字母。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约2.8个字母。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约2个字母。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约3.2个字母。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约15至约0个字母(例如，约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约10至约0个字母(例如，约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约5至约0个字母(例如，约5、约4、约3、约2、约1或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约4至约0个字母(例如，约4、约3、约2、约1或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约3至约0个字母(例如，约3、约2、约1或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约2至约0个字母(例如，约2、约1或0个字母中的任一个)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA维持，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，所述个体损失约1至约0个字母。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-20至+7个或更多(例如，-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的增加是约16、7或5个ETDRS中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的减少是约19、14、7、6、5、4、3、2或1个字母中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的减少是约4.8或约0.8个ETDRS。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的减少是约2个字母或更少。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的减少是约3.2个ETDRS或更少。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-15至+7个或更多(例如，-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-10至+7个或更多(例如，-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-5至+7个或更多(例如，-5、-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-4至+7个或更多(例如，-4、-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-3至+7个或更多(例如，-3、-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-2至+7个或更多(例如，-2、-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约-1至+7个或更多(例如，-1、0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约0至+7个或更多(例如，0、+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约+1至+7个或更多(例如，+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约+2至+7个或更多(例如，+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约+3至+7个或更多(例如，+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约+4至+7个或更多(例如，+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约+5至+7个或更多(例如，+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19、+20个或更多中的任一个)ETDRS字母。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起BCVA的变化是约+6或约+7个ETDRS字母。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起短暂炎症(例如，由房水细胞和/或玻璃体细胞、房水闪光、虹膜后粘连(posteriorsynchiae)、瞳孔扩大差引起的炎症)。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起炎症(例如，由房水细胞和/或玻璃体细胞、房水闪光、虹膜后粘连、瞳孔扩大差引起的炎症)，其在施用口服和/或局部类固醇治疗和/或散瞳剂(mydryatics)之后得到改善。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起炎症(例如，由房水细胞和/或玻璃体细胞引起的炎症)，其在施用口服和/或局部类固醇治疗之后消退。可以使用本领域已知的任何方法，例如裂隙灯检查测量发炎(例如，由房水细胞和/或玻璃体细胞、房水闪光、虹膜后粘连、瞳孔扩大差引起的炎症))。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，视力(例如BCVA)的维持或改善出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约1天、约1周、约2周、约4周、约8周、约12周、约16周、约20周、约24周、约28周、约32周、约36周、约40周、约44周、约48周、约52周、约56周、约60周、约64周、约68周、约72周、约76周、约80周、约84周、约88周、约92周、约96周、约100周、约104周、约108周或更长时间中的任一时间。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，视力(例如BCVA)的维持或改善出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周或更长时间。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，视力(例如BCVA)的维持或改善出现在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约30周、约34周、约44周、约6个月、约1年、约1.5年、约2年、约3年、约5年、约10年或更长时间中的任一时间。
在一些实施方案中，基于一只眼睛和/或对侧眼睛中的最佳矫正视力(BCVA)来评估在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，BCVA表示为ETDRS评分，其对应于正确读取的字母的数量(Vitaleet al.,(2016)JAMA Opthalmol 134(9):1041:1047)。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，个体在ETDRS评分中损失少于15个字母(例如，15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1个或0个字母中的任一个)，则确定个体的视力和/或视力得到维持。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，个体获得至少15个字母(例如至少约15、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60或约70个字母中的任一个)，则确定个体的视力和/或视力得到改善。
在一些实施例中，基于一只眼睛和/或对侧眼睛中的中央亚视场厚度(CST)或中心视网膜厚度(CRT)来评估在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，通过SD-OCT测定CST或CRT。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后通过SD-OCT评估的CST或CRT减少，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后通过SD-OCT评估的CST或CRT得到保持，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。
在一些实施方案中，基于一只眼睛和/或对侧眼睛中的黄斑体积评估在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，通过SD-OCT测定黄斑体积。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后通过SD-OCT评估的黄斑体积减少，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后通过SD-OCT评估的黄斑体积得到保持，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。
在一些实施方案中，基于一只眼睛和/和对侧眼睛中的视网膜厚度(例如，中央视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST))和黄斑体积来评估个体中的眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，通过SD-OCT测定CST和黄斑体积。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后通过SD-OCT评估的黄斑体积减少，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后通过SD-OCT评估的黄斑体积得到保持，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。
在一些实施方案中，基于在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后个体需要的救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)的次数评估个体中在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后眼部新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后，个体在每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周或更长时间的任一时间需要少于一次救援疗法治疗(例如阿柏西普注射)，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。
在一些实施方案中，如果在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少15周、至少20周、至少30周、至少40周、至少50周、至少60周、至少70周、至少80周、至少90周、至少100周、至少110周或更长时间的任一时间，个体不需要任何救援疗法治疗(例如阿柏西普注射)，则确定在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。
在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约24个月、至少约23个月、至少约22个月、至少约21个月、至少约20个月、至少约19个月、至少约18个月、至少约17个月、至少约16个月、至少约15个月、至少约14个月、至少约13个月、至少约12个月、至少约11个月、至少约10个月、至少约9个月、至少约8个月、至少约7个月、至少约6个月、至少约5个月、至少约4个月、至少约3个月、至少约2个月、至少约1个月、至少约3周、至少约2周或至少约1周中的任一时间，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约12个月，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约10个月，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约7个月，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约6个月，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约2个月，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约1个月，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)。
在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约50％(例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％中的任一个)的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约67％(例如，至少约67％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％中的任一个)的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约50％的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约78％的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约80％的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约82％的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中100％的个体不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。
在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约50％(例如，至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％中的任一个)的个体在施用rAAV颗粒之后至少约4周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约4周、至少约8周、至少约12周、至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周、至少约88周、至少约92周、至少约96周、至少约100周、至少约104周、至少约108周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约50％的个体在施用rAAV颗粒之后约52周或更长时间、或约56周或更长时间，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约67％(例如，至少约67％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％中的任一个)的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少78％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约4周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约4周、至少约8周、至少约12周、至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周、至少约88周、至少约92周、至少约96周、至少约100周、至少约104周、至少约108周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约78％的个体在施用rAAV颗粒之后约20周或更长时间、或约36周或更长时间，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约80％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中至少约82％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中100％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中100％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约4周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约4周、至少约8周、至少约12周、至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周、至少约88周、至少约92周、至少约96周、至少约100周、至少约104周、至少约108周或更长时间中的任一时间)，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中100％的个体在施用rAAV颗粒之后约64周或更长时间、72周或更长时间、或84周或更长时间中的任一时间，不需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。
在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中约78％或更少(例如，约78％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2.5％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少中的任一个)的个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中约50％或更少(例如，约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2.5％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少中的任一个)的个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中小于约30％或更少(例如，小于约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2.5％或更少、约1％或更少、或约0.5％中的任一个)的个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中小于约30％的个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述所述多个个体中小于约20％的个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中0％的个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要抗VEGF救援治疗(例如，阿柏西普注射)。
在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中约78％或更少(例如，例如，约78％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2.5％或更少、约1％或更少、或约0.5％或更少的任一个)的个体在施用rAAV颗粒之后至少约4周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约4周、至少约8周、至少约12周、至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周、至少约88周、至少约92周、至少约96周、至少约100周、至少约104周、至少约108周或更长时间中的任一时间)，需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中小于约30％(例如，小于约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约2.5％、约1％或约0.5％中的任一个)的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中小于约30％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中小于约20％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中0％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约20周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约66周或更长时间中的任一时间)，在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。在一些实施方案中，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒引起所述多个个体中0％的个体在施用rAAV颗粒之后至少约4周(例如，在施用rAAV颗粒之后至少约4周、至少约8周、至少约12周、至少约16周、至少约20周、至少约24周、至少约28周、至少约32周、至少约36周、至少约40周、至少约44周、至少约48周、至少约52周、至少约56周、至少约60周、至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周、至少约88周、至少约92周、至少约96周、至少约100周、至少约104周、至少约108周或更长时间中的任一时间)，在一只眼睛和/或对侧眼睛中需要任何救援治疗(例如，阿柏西普注射)。
在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的平均年化抗-VEGF注射率(annualized anti-VEGF injection rate)相比，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起平均年化抗VEGF注射率的降低是至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％中的任一个。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的平均年化抗-VEGF注射率相比，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起平均年化抗VEGF注射率的降低是约87％或更多。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的平均年化抗-VEGF注射率相比，向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起平均年化抗VEGF注射率的降低是100％。
在一些实施方案中，根据下式计算在施用单位剂量的rAAV颗粒之前的平均年化抗-VEGF注射率：
在施用单位剂量的rAAV颗粒之前的年化注射率＝(在施用单位剂量的rAAV颗粒之前12个月的抗-VEGF注射次数)/(从施用单位剂量的rAAV颗粒之前的过去12个月内第一次抗VEGF注射至施用单位剂量的rAAV颗粒的天数/365.25)。
在一些实施方案中，根据下式计算在施用单位剂量的rAAV颗粒之后的平均年化抗-VEGF注射率：
在施用单位剂量的rAAV颗粒之后的年注射率＝(从施用单位剂量的rAAV颗粒的抗-VEGF注射次数)/(从施用单位剂量的rAAV颗粒的天数/365.25)。
在一些实施方案中，如果与在施用rAAV颗粒之前施用rAAV颗粒的一只眼睛和/或对侧眼睛中的BCVA相比，个体施用rAAV颗粒的一只眼睛和/或对侧眼睛中显示出由视网膜内或视网膜下流体引起的BCVA中10个或更多个字母的损失(例如，如通过SD-OCT确定)，则确定个体在施用rAAV颗粒之后需要救援治疗(例如，抗VEGF玻璃体内注射，如阿柏西普注射)，在一些实施方案中，如果与在施用rAAV颗粒之前施用rAAV颗粒的一只眼睛和/或对侧眼睛中的中央亚视场厚度相比，个体施用rAAV颗粒的一只眼睛和/或对侧眼睛中显示出中央亚视场厚度(例如，CST或CRT)的增加大于75μm(例如，如通过SD-OCT确定)，则确定个体在施用rAAV颗粒之后需要救援治疗(例如，抗VEGF玻璃体内注射，如阿柏西普注射)。在一些实施方案中，如果个体显示出由于施用rAAV颗粒的一只眼睛和/或对侧眼睛中的AMD引起的威胁视力的出血，则确定个体在施用rAAV颗粒后需要救援治疗(例如，抗VEGF玻璃体内注射，如阿柏西普注射)。
在一些实施方案中，救援治疗包括施用标准护理抗VEGF疗法。这种标准护理抗VEGF疗法包括一种或多种抗VEGF治疗(例如，抗VEGF玻璃体内注射)。在一些实施方案中，救援治疗包括一种或多种阿柏西普IVT注射。在一些实施方案中，救援治疗包括一种或多种包含约2mg阿柏西普的阿柏西普IVT注射。
在一些实施方案中，基于视网膜流体的水平与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前视网膜流体的水平的比较评估在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前视网膜流体的水平相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后观察到视网膜流体的减少，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，眼新血管疾病为wAMD。
在一些实施方案中，基于与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的PED相比色素上皮脱离(PED)消退，评估在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的PED相比，观察到在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后PED的消退，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，眼新血管疾病是wAMD。
在一些实施方案中，基于如通过荧光素血管造影术确定的脉络膜新生血管(CNV)病变生长评估在一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前存在的CNV病变相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后CNV病变缩小(例如，超过约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或100％中的任一个)，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前存在的CNV病变相比，在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后CNV病变没有生长(例如，生长小于约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％或约20％中的任一个)，则确定在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，眼新血管疾病为wAMD。
在一些实施方案中，根据本领域已知的任何方法(例如，SD-OCT、OCT、荧光素血管造影术、数码彩色眼底照相等)，基于一只眼睛和/或对侧眼睛的解剖学特征，评估在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后观察到一只眼睛和/或对侧眼睛的解剖学特征的改善，则确定在一只眼睛和/对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，眼新血管疾病为wAMD。
在一些实施方案中，基于眼科检查、眼内压(例如，使用Goldmann压平眼压计或Tono-Pen)、间接检眼镜检查、一只眼睛和/或对侧眼睛及附件的检查、眼睑和/或瞳孔反应性、眼睑下垂、异常瞳孔形状、瞳孔不相等、对光的异常反应、传入性瞳孔缺陷、裂隙灯检查(包括眼睑、结膜、角膜、晶状体、虹膜和前房)、玻璃体后段异常、视神经、外周视网膜和视网膜血管、SD-OCT、荧光素血管造影术、数码彩色眼底照相(包括视网膜、视神经盘和/或黄斑的图像)、房水采样、玻璃体液采样、OCT-血管造影(OCT-A)、屈光和/或视力(BCVA)，评估在一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后对个体中眼新血管疾病的治疗。在一些实施方案中，进行SD-OCT以评价视网膜厚度(例如，中心视网膜厚度或中央亚视场厚度)、黄斑体积和/或流体(例如，视网膜下流体或视网膜内流体)的存在。在一些实施方案中，眼新血管疾病是wAMD。
可以通过本领域已知的任何方法向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。例如，可以经眼内或玻璃体内注射向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是经眼内。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过玻璃体内(IVT)或视网膜下注射。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过IVT注射。在一些实施方案中，采用无菌技术通过玻璃体内注射施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，使用聚维酮-碘的无菌技术通过玻璃体内注射施用单位剂量的rAAV颗粒。
在一些实施方案中，个体没有接受眼新血管疾病的先前治疗。在一些实施方案中，个体没有接受在一只眼睛和/或对侧眼睛中用于眼新血管疾病的先前治疗。在一些实施方案中，个体没有接受过使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在一些实施方案中，个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中没有接受过使用抗VEGF试剂(例如贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在一些实施方案中，个体未接受过先前阿柏西普治疗。在一些实施方案中，个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中没有接受过先前的阿柏西普治疗。
类固醇治疗
在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒与类固醇治疗组合施用。在一些实施方案中，类固醇治疗为皮质类固醇治疗。示例性的皮质类固醇包括但不限于阿氯米松、安西米特(amcinomide)、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龙、氯泼尼醇、可的伐唑、地夫可特、脱氧皮质酮、地奈德去羟米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龙、二氟泼尼酯、氟氯龙、氟氢可的松、氟氢缩松、氟米松、氟尼缩松、氟轻松、醋酸氟轻松、氟西奈德(fluocinonide)、氟可龙、氟米龙、氟培龙、氟替卡松、氟泼尼定(fuprednidene)、福莫可他(formocortal)、哈西奈德、卤米松、醋丙酸氢化可的松、丙丁酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、氯替泼诺、甲羟松、甲泼尼松、甲泼尼龙、醋丙泼尼龙、糠酸莫米松、帕拉米松、泼尼卡酯、泼尼龙、泼尼松龙、泼尼立定、利美索龙(remexolone)、替可的松(tixocortol)、曲安西龙和乌倍他索。在一些实施方案中，类固醇治疗是全身性类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为口服类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为眼用类固醇治疗。在一些实施方案中，眼用类固醇治疗为局部类固醇治疗(例如滴剂)、眼周类固醇治疗(例如眼筋膜囊内、结膜下)、玻璃体内类固醇治疗或脉络膜上(superchoroidal)类固醇治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗、甲羟松治疗、氯替泼诺治疗、泼尼松龙治疗、氟轻松治疗、曲安西龙治疗、利美索龙治疗、地塞米松治疗、氟米龙治疗、氟轻松治疗、利美索龙治疗或泼尼松治疗。在一些实施方案中，眼用局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为泼尼松治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。
在一些实施方案中，类固醇治疗包括全身类固醇治疗和局部类固醇治疗。在一些实施方案中，全身性类固醇治疗为口服类固醇治疗。在一些实施方案中，全身类固醇治疗为泼尼松治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，全身类固醇治疗和局部类固醇治疗同时施用(例如，在同一天)。在一些实施方案中，全身类固醇治疗和局部类固醇治疗分开施用(例如，在不同天)。
在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间和/或之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前和期间施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间和之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前和/或之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前和之后施用类固醇。
在一些实施方案中，类固醇治疗为全身类固醇治疗。在一些实施方案中，类固醇治疗为口服类固醇治疗。
在一些实施方案中，类固醇治疗为口服泼尼松治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前开始口服泼尼松治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天、约1天或0天中的任一个，以每天约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg或约70mg的泼尼松中的任一种剂量施用初始口服泼尼松治疗，并持续约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天或约10天或更长时间中的任一个。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV之前约3天，以每天约60mg的泼尼松的剂量施用初始口服泼尼松治疗，并持续约3天。
在一些实施方案中，初始口服泼尼松治疗之后逐渐减少口服泼尼松治疗剂量。在一些实施方案中，按以下剂量施用逐渐减少的口服泼尼松治疗剂量：每天约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg或约50mg泼尼松中的任一个，持续约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天中的任一个，随后每天约10mg、约15mg、约20mg或约25mg泼尼松的剂量持续约1天、约2天、约3天或约4天中的任一个，随后每天约5mg、约10mg或约15mg泼尼松的剂量持续约1天、约2天、约3天或约4天。在一些实施方案中，按以下剂量施用逐渐减少的泼尼松剂量：每天约40mg的泼尼松中任一个持续3天，随后每天约20mg的泼尼松持续2天，随后每天约10mg的泼尼松持续2天。
在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前3天，按以下剂量开始初始口服泼尼松治疗：每天60mg的泼尼松的剂量持续共6天，随后每天40mg的泼尼松的剂量持续共3天，随后每天20mg的泼尼松的剂量持续2天，随后每天10mg的泼尼松的剂量持续2天。
在一些实施方案中，类固醇治疗为眼用类固醇治疗。在一些实施方案中，眼用类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之之前和期间施用类固醇治疗。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前和之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒期间和之后施用类固醇。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用类固醇。
在一些实施方案中，类固醇治疗为眼用类固醇治疗，例如局部类固醇治疗。在一些实施方案中，眼用类固醇治疗，例如局部类固醇治疗，是在施用单位剂量的rAAV颗粒后持续至多4周、至多6周、至多8周、至多3个月、至多4个月、至多5个月或至多6个月的每天类固醇治疗。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在约第1周约四次施用局部类固醇，在约第2周约三次施用局部类固醇，在约第3周约两次施用局部类固醇，和在约第4周约一次施用局部类固醇；从施用单位剂量的rAAV颗粒开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在施用单位剂量的rAAV颗粒之后每天施用约四次局部类固醇(即，QID)持续约3周，随后每天施用约3次局部类固醇(即TID)持续约1周，随后每天施用约2次局部类固醇(即，BID)持续约1周，随后周每天施用约1次局部类固醇(即，QD)持续约1周。在一些实施方案中，由治疗医师决定延长眼用类固醇治疗。
在一些实施方案中，眼用类固醇为约0.005％至约0.5％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，眼用类固醇为约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.4％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％或约0.1％的二氟泼尼酯中的任一种。在一些实施方案中，眼用类固醇为二氟泼尼酯0.05％。在一些实施方式中，0.05％的二氟泼尼酯的剂量是一滴眼用溶液。在一些实施方案中，一滴为约50μL(例如，约25μL至约50μL，或约50μL至约100μL)。在一些实施方案中，二氟泼尼酯的剂量包含约1μg至约5μg，或约2μg至约3μg，或约2.5μg的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，二氟泼尼酯的剂量包含约2.5μg的二氟泼尼酯。
在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括7周的局部类固醇治疗，例如0.05％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约四周，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约一周，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约一周，随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约一周；在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约一周开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约28天，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约7天，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约7天，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约7天；从施用单位剂量的rAAV颗粒之前约7天开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括包括在第1天到第28天每天约四次施用局部类固醇(即，QID)，随后在第29天到第35天每天约三次施用局部类固醇(即，TID)，随后在第36天到第42天每天约两次施用局部类固醇(即，BID)，和随后在第43天到第49天每天约一次施用局部类固醇(即，QD)；在第1天开始计时。在一些实施方案中，如果存在炎症，则继续局部类固醇治疗。
在一些实施方案中，本文提供的治疗方法包括在向个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前向个体的一只眼睛施用抗-VEGF试剂(例如，阿柏西普IVT注射)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约7天或约1周施用抗VEGF试剂。在一些实施方案中，在约第1天施用抗VEGF试剂，并且在约第8天施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括7周的局部类固醇治疗，例如0.05％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约四周，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约一周，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约一周，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约一周；从施用抗-VEGF试剂开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约28天，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约7天，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约7天，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约7天；从施用抗-VEGF试剂开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在第1天到第28天每天约四次施用局部类固醇(即，QID)，随后在第29天到第35天每天约三次施用局部类固醇(即，TID)，随后在第36天到第42天每天约两次施用局部类固醇(即，BID)，和随后在第43天到第49天每天约一次施用局部类固醇(即，QD)；在第1天开始计时。在一些实施方案中，如果存在炎症，则继续局部类固醇治疗。
在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括4个月的局部类固醇治疗，例如0.05％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约一个月，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约一个月，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约一个月，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约一个月；从施用单位剂量的rAAV颗粒之前约一周开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约30天，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约30天，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约30天，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约30天；从施用单位剂量的rAAV颗粒之前约7天开始计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在第1天到第30天每天约四次施用局部类固醇(即，QID)，随后在第31天到第60天每天约三次施用局部类固醇(即，TID)，随后在第61天到第90天每天约两次施用局部类固醇(即，BID)，和随后在第91天到第120天每天约一次施用局部类固醇(即，QD)；在第1天开始计时。在一些实施方案中，如果存在炎症，则继续局部类固醇治疗。
在一些实施方案中，本文提供的治疗方法包括在向个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前向个体的一只眼睛施用抗-VEGF试剂(例如，阿柏西普IVT注射)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约7天或约1周施用抗VEGF试剂。在一些实施方案中，在约第1天施用抗VEGF试剂，并且在约第8天施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括4个月的局部类固醇治疗，例如0.05％的二氟泼尼酯。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约一个月，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约一月，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约一月，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约一月；从施用抗-VEGF试剂开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇(即，QID)持续约30天，随后每天约三次施用局部类固醇(即，TID)持续约30天，随后每天约两次施用局部类固醇(即，BID)持续约30天，和随后每天约一次施用局部类固醇(即，QD)持续约30天；从施用抗-VEGF试剂开始和之后计时。在一些实施方案中，局部类固醇治疗包括在第1天到第30天每天约四次施用局部类固醇(即，QID)，随后在第31天到第60天每天约三次施用局部类固醇(即，TID)，随后在第61天到第90天每天约两次施用局部类固醇(即，BID)，和随后在第91天到第120天每天约一次施用局部类固醇(即，QD)；在第1天开始计时。在一些实施方案中，如果存在炎症，则继续局部类固醇治疗。
用于向靶细胞递送转基因的载体
在一些实施方案中，重组腺相关病毒(rAAV)颗粒包含来源于腺相关病毒(AAV)的重组病毒载体，所述重组病毒载体已经被改变，使得其在受试者(例如，人或非人灵长类动物)中是复制缺陷型的。在一些实施方案中，腺相关病毒(AAV)为重组AAV(rAAV)。
AAV或rAAV为小的无包膜单链DNA病毒。rAAV为非致病性人细小病毒，并且可以使其依赖于辅助病毒(包括腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和CMV)进行复制。
暴露于野生型(wt)AAV不与任何人类病理相关或已知不会引起任何人类病理且常见于一般人群中，使得AAV或rAAV成为用于基因疗法的合适递送系统。用于递送抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的基因治疗的AAV和rAAV可以具有任何血清型。在一些实施方案中，本发明的方法提供任何合适的AAV血清型的用途，所述AAV血清型包括AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、AAV-DJ和其任何杂交或嵌合AAV。在一些实施方案中，使用的血清型是基于病毒的向性或目标靶细胞的感染性。在一些实施方案中，可以产生几种AAV载体以允许选择最佳血清型，用于与抗VEGF试剂转基因(例如阿柏西普转基因)一起使用。
在一些实施方案中，本公开内容的方法提供假型(pseudotyped)AAV的用途。假型AAV颗粒包含被另一种AAV血清型的AAV衣壳壳体化(encapsidated)的一种AAV血清型的AAV基因组反向末端重复序列(ITR)。典型地，假型AAV被称为“AAV#/#”，其中第一个“#”表示AAVITR血清型，第二个“#”表示衣壳血清型。例如，包含AAV2 ITR和AAV1衣壳的AAV颗粒将被称为“AAV2/1”。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含核酸，例如异源核酸。在一些实施方案中，核酸编码转基因，例如抗VEGF试剂(例如阿柏西普)。在一些实施方案中，编码的转基因，例如抗VEGF试剂，处于启动所述核酸转录的启动子的转录控制下。在一些实施方案中，启动子为“遍在”启动子。在一些实施方案中，启动子为“强的”或组成型活性启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1α(EFla)启动子、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子或连接蛋白36(或“Cx36”)启动子。在一些实施方案中，启动子是在特定组织或细胞如视网膜细胞中活化的组织特异性启动子，以降低对非靶细胞的潜在毒性或不期望的作用。在一些方面，可以产生几种AAV载体以允许选择用于抗VEGF试剂转基因(例如阿柏西普转基因)的最佳血清型和启动子。在一些实施方案中，核酸侧接AAV反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，核酸侧接为AAV2 ITR。
在一些实施方案中，AAV载体包含用于靶细胞(例如视网膜细胞)中转基因(例如抗VEGF试剂，如阿柏西普)的增强表达的多核苷酸盒。在一些实施方案中，多核苷酸盒包含以5'至3'顺序的：(a)包含CMV序列(SEQ ID NO:22)的第一增强子区；(b)包含CMV序列(SEQ IDNO：23)的启动子区；(c)5'UTR区，其以5'至3'的顺序包含TPL序列和eMLP序列(分别为SEQID NO：24和SEQ ID NO：25)；(d)编码肽或多肽(例如，抗-VEGF试剂，比如阿柏西普)的编码序列；(e)包含完整EES序列(SEQ ID NO：26)的第二增强子区；和(f)HGH聚腺苷酸化位点(SEQ ID NO：27)。在这些实施方案的某些中，多核苷酸盒包含选自SEQ ID NO：28-32的一个或多个序列或与其具有至少85％同一性的序列。在这些实施方案的某些中，多核苷酸盒的5'臂包含SEQ ID NO：33或与其具有至少85％同一性的序列或由其组成。在这些实施方案的某些中，多核苷酸盒的3'臂包含SEQ ID NO：34或与其具有至少85％同一性的序列或由其组成。SEQ ID NO：22-34的核酸序列提供如下：
Figure BDA0003539340930000871
Figure BDA0003539340930000881
Figure BDA0003539340930000891
Figure BDA0003539340930000901
Figure BDA0003539340930000911
在一些实施方案中，多核苷酸盒包括SEQ ID NO：39或与其具有至少85％同一性的序列或由其组成：gcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtactctggagacgacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgctgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagaggccatccacgctgttttgacctccatagtggacaccgggaccgatccagcctccgcgtctcaggggagatctcgtttagtgaaccgtcagatcctcactctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttgggctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacggtactccgccaccgagggacctgagcgagtccgcatcgaccggatcggaaaacctctcgagaaaggcgtctaaccagtcacagtcgcaaggtaggctgagcaccgtggcgggcggcagcgggtggcggtcggggttgtttctggcggaggtgctgctgatgatgtaattaaagtaggcggtcttgagacggcggatggtcgaggtgaggtgtggcaggcttgagatccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcattacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgatctggccatacacttgagtgacaatgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccaggtccaagtttaaacgccgccaccatggtgtcatactgggatactggagtcttgctttgtgccctgctgtcctgcctcctcctgactggctccagctcgggctcagataccggtcgccccttcgtggagatgtactccgagatcccggaaattatccacatgactgaggggcgcgaacttgtgatcccctgccgggtcaccagcccgaacattactgtgactttgaagaagttccccctggacaccctgattccggatgggaagagaattatctgggattcacggaagggattcatcatcagcaacgcgacctacaaggaaattggcctcctcacttgcgaagccactgtgaacggacacttgtacaagaccaactacctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtcgtcctgtccccttcgcacgggatcgagctctcggtgggagagaagttggtgcttaactgcaccgcccggacggaactgaatgtgggaatcgacttcaactgggaatacccgtccagcaagcatcagcataagaagctggtgaaccgggacctcaagactcagtccggcagcgaaatgaagaagttcctgtcgaccctcactattgacggagtgaccagatccgaccagggcctctacacttgcgccgcttccagcggactcatgaccaagaagaacagcactttcgtgagggtgcatgagaaggacaagacccacacgtgtccgccgtgcccagccccagagctgctgggaggcccttccgtgttcctgtttccgcccaagccaaaggataccctgatgatctcaaggacccctgaggtcacatgcgtcgtggtggatgtgtcgcacgaggaccctgaagtcaaattcaattggtatgtggacggagtggaagtccacaacgcgaaaaccaagccgagagaagaacagtacaattccacctaccgggtggtgtcggtgctgactgtgctgcaccaggactggctcaacggaaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggctctgcccgcacctattgaaaagaccatctccaaggccaagggtcaacctcgcgagcctcaggtgtacactctgcctccaagccgggacgaactgactaagaaccaagtctctctgacctgtttggtgaagggcttctacccgtcagacatcgcagtggagtgggagtcaaacggtcagccggagaacaactacaaaacaaccccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaagcttaccgtggataagagccgctggcaacagggcaacgtgttttcctgctccgtcatgcacgaagccctgcacaaccattatacccagaagtccctgtcgctgtcccccgggaaatagtgactgttctcatcacatcatatcaaggttatataccatcaatattgccacagatgttacttagccttttaatatttctctaatttagtgtatatgcaatgatagttctctgatttctgagattgagtttctcatgtgtaatgattatttagagtttctctttcatctgttcaaatttttgtctagttttattttttactgatttgtaagacttctttttataatctgcatattacaattctctttactggggtgttgcaaatattttctgtcattctatggcctgacttttcttaatggttttttaattttaaaaataagtcttaatattcatgcaatctaattaacaatcttttctttgtggttaggactttgagtcataagaaatttttctctacactgaagtcatgatggcatgcttctatattattttctaaaagatttaaagttttgccttctccatttagacttataattcactggaatttttttgtgtgtatggtatgacatatgggttcccttttattttttacatataaatatatttccctgtttttctaaaaaagaaaaagatcatcattttcccattgtaaaatgccatatttttttcataggtcacttacatatatcaatgggtctgtttctgagctctactctattttatcagcctcactgtctatccccacacatctcatgctttgctctaaatcttgatatttagtggaacattctttcccattttgttctacaagaatatttttgttattgtctttgggctttctatatacattttgaaatgaggttgacaagttacctaggaaaactgtcttcctgcccgggtggcatccctgtgacccctccccagtgcctctcctggccctggaagttgccactccagtgcccaccagccttgtcctaataaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggaggggggtggtatggagcaaggggcccaagttgggaagaaacctgtagggcctgcgtacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgc(SEQ ID NO:39)。
上文所示的SEQ ID NO：39以5'至3'方向包含AAV血清型2的反向末端重复序列(ITR)，其包含SEQ ID NO：39的核苷酸1-145；CMV启动子，其包含SEQ ID NO：39的核苷酸180-693；5'非翻译区(UTR)，其包含腺病毒三联前导序列和合成内含子，且包含SEQ ID NO：39的核苷酸694-1314；Kozak序列，其包含SEQ ID NO：39的核苷酸1329-1340；密码子优化的阿柏西普cDNA序列，其包含SEQ ID NO：39的核苷酸1338-2714；3'UTR，其包含人支架附着区，并且包含SEQ ID NO：39的核苷酸2717-3527；人生长激素聚腺苷酸化/转录终止信号，其包含SEQ ID NO：39的核苷酸3546-3748；和AAV血清型2的反向末端重复(ITR)，其包含SEQID NO：39的核苷酸3772-3916。参见例如图1C。
用于靶细胞(比如视网膜细胞)中转基因(例如编码抗VEGF试剂，比如阿柏西普的转基因)的增强表达的另外的多核苷酸盒公开在WO2018/170473中，将其与用于靶细胞中转基因的增强表达的多核苷酸盒相关的内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含对靶细胞(例如视网膜细胞)具有增加的感染性的变体衣壳蛋白，其用于在个体中增加视网膜细胞的转导或增加基因递送至视网膜细胞的靶向。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含在AAV衣壳蛋白的衣壳蛋白GH环/环IV中的氨基酸修饰。在一些实施方案中，修饰位点是AAV衣壳蛋白的GH环/环IV的溶剂可接近部分。关于AAV衣壳的GH环/环IV的描述，参见例如van Vliet et al.(2006)Mol.Ther.14:809；Padronet al.(2005)J.Virol.79:5047；and Shen et al.(2007)Mol.Ther.15:1955。已知几种AAV衣壳变体，包括7m8变体。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含变体AAV衣壳蛋白，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变体AAV衣壳蛋白包含在衣壳蛋白的GH环中5个氨基酸至11个氨基酸(例如7个氨基酸序列)的插入，并且其中与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒对视网膜细胞的感染性相比，所述变体衣壳蛋白赋予视网膜细胞增加的感染性。在一些实施方案中，可以将以下氨基酸序列中的任一种插入衣壳蛋白的GH环中：LALGETTRPA(SEQ ID NO:1)；LANETITRPA(SEQ ID NO:2)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:3)、LAKDPKTTNA(SEQID NO:4)、KDTDTTR(SEQ ID NO:5)、RAGGSVG(SEQ ID NO:6)、AVDTTKF(SEQ ID NO:7)、STGKVPN(SEQ ID NO:8)、LAKDTDTTRA(SEQ ID NO:9)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:10)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:11)、and LASTGKVPNA(SEQ ID NO:12)、LGETTRP(SEQ ID NO:14)、NETITRP(SEQ ID NO:15)、KAGQANN(SEQ ID NO:16)、KDPKTTN(SEQ ID NO:17)、KDTDTTR(SEQID NO:18)、RAGGSVG(SEQ ID NO:19)、AVDTTKF(SEQ ID NO:20)和STGKVPN(SEQ ID NO:21)。在一些实施方案中，将SEQ ID NO：1-12和14-21中阐述的氨基酸序列的任一个插入rAAV中VP1衣壳蛋白的溶剂暴露的GH环中。关于可插入衣壳蛋白GH环(例如，以促进IVT注射后目标核酸转导至视网膜细胞)中的氨基酸序列的其它细节提供在WO2012145601、US9587282、US10202657和US10214785中，将其涉及可插入衣壳蛋白GH环中的氨基酸序列的内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV衣壳蛋白，例如AAV2衣壳蛋白，其包括下列氨基酸序列中的任一种：LALGETTRPA(SEQ ID NO:1)；LANETITRPA(SEQ ID NO:2)、LAKAGQANNA(SEQ ID NO:3)、LAKDPKTTNA(SEQ ID NO:4)、KDTDTTR(SEQ ID NO:5)、RAGGSVG(SEQ ID NO:6)、AVDTTKF(SEQ ID NO:7)、STGKVPN(SEQ ID NO:8)、LAKDTDTTRA(SEQ ID NO:9)、LARAGGSVGA(SEQ ID NO:10)、LAAVDTTKFA(SEQ ID NO:11)和LASTGKVPNA(SEQ ID NO:12)、LGETTRP(SEQ ID NO:14)、NETITRP(SEQ ID NO:15)、KAGQANN(SEQ ID NO:16)、KDPKTTN(SEQ ID NO:17)、KDTDTTR(SEQ ID NO:18)、RAGGSVG(SEQ ID NO:19)、AVDTTKF(SEQ ID NO:20)和STGKVPN(SEQ ID NO:21)其插入到以下位置：在AAV2衣壳蛋白的位置587和588之间；在AAV1衣壳蛋白的氨基酸590和591之间；在AAV5衣壳蛋白的575和576之间；在AAV6衣壳蛋白的氨基酸590和591之间；在AAV7衣壳蛋白的氨基酸589和590之间；在AAV8衣壳蛋白的氨基酸590和591之间；在AAV9衣壳蛋白的氨基酸588和589之间；或在AAV10衣壳蛋白的氨基酸589和590之间。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2衣壳蛋白，其包含插入在包含SEQ ID NO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ IDNO：1)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自AAV2的7m8变体衣壳蛋白，其包含插入在AAV2 VP1的位置587和588之间的AAV2 VP1蛋白的GH环中的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ IDNO：1)。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2 VP1衣壳蛋白，其包含含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的GH环。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2 VP1衣壳蛋白，其包含含有与SEQ ID NO：38具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性中任一种的氨基酸序列的GH环。
FSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDI
RDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDE
EKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLAL
GETTRPARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLK
HPPPQILIKN(SEQ ID NO:38)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自AAV2的7m8变体衣壳蛋白，其包含插入在AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)。包含氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)的AAV2的7m8变体衣壳蛋白的序列插入在AAV2 VP1的位置587和588之间，如下提供：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLALGETTRPARQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ IDNO:37)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP1，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP2，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP3，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，其中VP1、VP2和VP3各自包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ IDNO：14)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP1，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP2，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP3，其包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白VP1、VP2和VP3，其中VP1、VP2和VP3各自包含插入在衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
在一些实施方案中，用于产生rAAV病毒的重组病毒和/或质粒包含其它转录或调节元件，例如poly A(聚腺苷酸化)序列、非翻译区(UTR)、3'UTR或终止序列。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)或类似元件从载体或质粒表达多于一种基因，其允许两种或更多种蛋白共表达或产生多基因或多顺反子mRNA。
在一些实施方案中，用于产生rAAV的rAAV和/或质粒包含一个或多个下列核酸元件：第一ITR序列；启动子序列；内含子序列；第一UTR序列；编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的异源核酸；第二UTR序列；polyA序列；和第二ITR序列。在一些实施方案中，接头序列插入在两个或更多个核酸元件之间。在一些实施方案中，异源核酸编码治疗性多肽，编码阿柏西普(或其功能片段或功能变体)。
在一些实施方案中，载体是靶向载体，尤其是靶向rAAV(例如AAV2.7m8)，其显示对特定细胞例如视网膜细胞(例如光感受器、视网膜神经节细胞、米勒细胞、双极细胞、无长突细胞、水平细胞或视网膜色素上皮细胞)的感染性更高。用于本公开内容的病毒载体可以包括在个体中显示低毒性和/或低免疫原性，并且在个体(例如人)中表达治疗有效量的抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的那些。本领域已知的任何合适的方法都可用于重组病毒(例如rAAV)的生化纯化，例如用于制备本文别处所述的药物组合物。重组AAV病毒可以直接从细胞或从含有细胞的培养基中收获。病毒可以使用各种生化方法纯化，如凝胶过滤、过滤、层析、亲和纯化、梯度超速离心或尺寸排阻方法。在一些实施方案中，病毒是冻干的。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含7m8变体衣壳蛋白，例如rAAV2.7m8，和编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普，或其功能片段或功能变体)的核酸序列。在一些实施方案中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，rAAV颗粒(例如7m8变体)使视网膜细胞的感染性增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％中的任一个。在一些实施方案中，与包含相应的亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，视网膜细胞的感染性的增加是增加5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％中的任一个。
在一些实施方案中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，rAAV变体(例如rAAV2.7m8)的视网膜细胞感染性的增加为至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍中的任一个。在一些实施方案中，与包含相应的亲代AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，感染性的提高是至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍中的任一个。在一些实施方案中，与包含相应的亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，感染性的提高是至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或至少100倍中的任一个。
在一些实施方案中，与包含相应亲本或未修饰的AAV颗粒的AAV颗粒相比，rAAV变体(例如rAAV2.7m8)的视网膜细胞感染性的增加为10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍或10倍至15倍。
在一些实施方案中，与包含相应亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，视网膜细胞感染性的增加为2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
在一些实施方案中，与包含相应的亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒穿过受试者的眼睛中内界膜(ILM)的能力相比，本文描述的衣壳蛋白的氨基酸修饰可赋予穿过个体(例如人)眼睛中内界膜(ILM)的能力提高。在一些实施方案中，与包含相应的亲本或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，杂交rAAV变体(例如rAAV2.7m8)穿过ILM的能力的提高是提高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％中的任一个。在一些实施方案中，与亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白相比，穿过ILM的能力的提高是提高5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％或5％至10％。
在一些实施方案中，与包含相应亲本AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，rAAV变体(例如rAAV2.7m8)穿过ILM的能力的提高是至少1倍、至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2倍中的任一个。在一些实施方案中，与包含相应亲代的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，穿过ILM的能力的提高是至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍中的任一个。在一些实施方案中，与包含相应的亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，穿过ILM的能力的提高是至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍或至少100倍中的任一个。
在一些实施方案中，与包含相应的亲代或未修饰的AAV衣壳蛋白的AAV颗粒相比，rAAV变体(例如rAAV2.7m8)穿过ILM的能力提高是10倍至100倍、10倍至95倍、10倍至90倍、10倍至85倍、10倍至80倍、10倍至75倍、10倍至70倍、10倍至65倍、10倍至60倍、10倍至55倍、10倍至50倍、10倍至45倍、10倍至40倍、10倍至35倍、10倍至30倍、10倍至25倍、10倍至20倍或10倍至15倍。
在一些实施方案中，与包含相应的亲代或未修饰的AAV蛋白的衣壳颗粒相比，rAAV变体(例如rAAV2.7m8)穿过ILM的能力的提高是2倍至20倍、2倍至19倍、2倍至18倍、2倍至17倍、2倍至16倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
在一些实施方案中，包含编码阿柏西普的核酸的rAAV.7m8用于基因疗法。在一些实施方案中，使用AAV2或rAAV2经由玻璃体内或视网膜下注射将编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的核酸序列递送至受试者的眼睛或视网膜细胞中。在一些实施方案中，使用AAV2或rAAV2经由玻璃体内注射将编码抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的核酸序列递送至受试者的眼睛或视网膜细胞中。在一些实施方案中，使用rAAV2.7m8将抗VEGF试剂(例如阿柏西普)的核酸序列递送至受试者的视网膜细胞中。在一些实施方案中，异源核酸(例如，编码抗VEGF试剂如阿柏西普的核酸)整合入靶细胞基因组(例如，视网膜细胞基因组)，引起例如抗VEGF试剂(如阿柏西普)在靶细胞中的长期表达。在一些实施方案中，病毒载体将包含异源核酸(例如，编码抗VEGF试剂如阿柏西普的核酸)的质粒或其它染色体外遗传元件递送至靶细胞(例如，视网膜细胞)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.99％或100％同一性中任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码阿柏西普的核酸，且侧接AAV2反向末端重复(ITR)。SEQ ID NO：35的序列提供如下：
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:35)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与SEQ ID NO：36的核酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约100％序列同源性中任一个的核酸，且其中所述核酸侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。SEQ ID NO：36的序列提供在图5中。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与阿柏西普的核酸序列(例如SEQ ID NO：36)具有至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约100％序列同源性中任一个的核酸，且其中所述核酸侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，阿柏西普的核酸序列来源于其氨基酸序列。在一些实施方案中，阿柏西普的核酸序列经密码子优化以改善其在受试者中的表达。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与SEQ ID NO：40的核酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.9％或至少约100％序列同源性中任一个的核酸，且其中所述核酸侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有SEQ ID NO：40的核酸序列的核酸。在一些实施方案中，且其中所述核酸侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)。atggtgtcatactgggatactggagtcttgctttgtgccctgctgtcctgcctcctcctgactggctccagctcgggctcagataccggtcgccccttcgtggagatgtactccgagatcccggaaattatccacatgactgaggggcgcgaacttgtgatcccctgccgggtcaccagcccgaacattactgtgactttgaagaagttccccctggacaccctgattccggatgggaagagaattatctgggattcacggaagggattcatcatcagcaacgcgacctacaaggaaattggcctcctcacttgcgaagccactgtgaacggacacttgtacaagaccaactacctgacccaccgccagaccaacaccatcatcgacgtcgtcctgtccccttcgcacgggatcgagctctcggtgggagagaagttggtgcttaactgcaccgcccggacggaactgaatgtgggaatcgacttcaactgggaatacccgtccagcaagcatcagcataagaagctggtgaaccgggacctcaagactcagtccggcagcgaaatgaagaagttcctgtcgaccctcactattgacggagtgaccagatccgaccagggcctctacacttgcgccgcttccagcggactcatgaccaagaagaacagcactttcgtgagggtgcatgagaaggacaagacccacacgtgtccgccgtgcccagccccagagctgctgggaggcccttccgtgttcctgtttccgcccaagccaaaggataccctgatgatctcaaggacccctgaggtcacatgcgtcgtggtggatgtgtcgcacgaggaccctgaagtcaaattcaattggtatgtggacggagtggaagtccacaacgcgaaaaccaagccgagagaagaacagtacaattccacctaccgggtggtgtcggtgctgactgtgctgcaccaggactggctcaacggaaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggctctgcccgcacctattgaaaagaccatctccaaggccaagggtcaacctcgcgagcctcaggtgtacactctgcctccaagccgggacgaactgactaagaaccaagtctctctgacctgtttggtgaagggcttctacccgtcagacatcgcagtggagtgggagtcaaacggtcagccggagaacaactacaaaacaaccccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaagcttaccgtggataagagccgctggcaacagggcaacgtgttttcctgctccgtcatgcacgaagccctgcacaaccattatacccagaagtccctgtcgctgtcccccgggaaatag(SEQ ID NO:40)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含SEQ IDNO：41的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQID NO：41的氨基酸序列。
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:41)。
在一些实施方案中，阿柏西普的核酸序列是密码子优化的，用于在灵长类动物或人类受试者中表达。对应于阿柏西普氨基酸序列的合成基因的构建已描述在文献中，例如Kanda A,Noda K,Saito W,Ishida S.Aflibercept TrapsGalectin-1,an AngiogenicFactor Associated with Diabetic Retinopathy.Scientific Reports 5:17946(2015)(描述“通过IDT(Coralville，IA)产生呈合成基因的VEGF-TrapR1R2(对应于阿柏西普)cDNA”)。考虑到阿柏西普的可用氨基酸序列，可使用本领域已知的任何方法产生阿柏西普的cDNA，用于基因治疗或本文所述的rAAV中。
可以用本领域已知的任何方法实现密码子优化。密码子优化是指修饰核酸序列以增强基因在目标靶或宿主细胞(例如，人视网膜细胞)中的表达的方法，其通过用在宿主细胞中更频繁使用或最频繁使用的密码子替代天然序列的至少一个密码子(例如，约或超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、100或更多个密码子)同时保持天然氨基酸序列。密码子使用表是容易获得的，包括例如，GenScript Codon Usage Frequency Table Tool在www(dot)genscript(dot)com/tools/codon-frequency-table；Codon Usage Database在www(dot)kazusa(dot)or(dot)jp/codon/；以及Nakamura,Y.,et al.“Codon usage tabulated fromthe international DNA sequence databases:status for the year 2000”Nucl.AcidsRes.28:292(2000)。
同源性是指两个序列之间比对的残基的保守百分比，所述序列包括但不限于功能片段，包含插入、缺失、取代的序列，假片段，假基因，剪接变体或人工优化的序列。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含编码阿柏西普的核酸。在一些实施方案中，多肽是阿柏西普。
如本文使用的“阿柏西普”指与上文鉴定的阿柏西普氨基酸序列(SEQ ID NO：35)具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或100％同源性中的任一个的多肽或蛋白质序列、或其功能片段或变体或突变体。同源性是指两个序列之间比对的残基的保守百分比，所述序列包括但不限于功能片段，包含插入、缺失、取代的序列，假片段，假基因，剪接变体或人工优化的序列。
在一些实施方案中，阿柏西普的氨基酸序列与SEQ ID NO：35的阿柏西普氨基酸序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％同源性中的任一个。在一些实施方案中，将本文公开的编码阿柏西普的核酸序列与上文鉴定的阿柏西普氨基酸序列的相应cDNA序列进行比较，并显示阿柏西普核酸序列(例如SEQ ID NO：36)之间至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的序列同源性中的任一个。在一些实施方案中，阿柏西普与阿柏西普具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的空间同源性(例如，在其二级、三级和四级结构或构象方面)中的任一个。在一些实施方案中，阿柏西普与标准护理中使用的阿柏西普具有至多80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的空间同源性的任一个(例如，二级、三级和四级结构或构象)。
在一些实施方案中，阿柏西普基因产物或阿柏西普转基因(如包括在基于rAAV的基因治疗中)包含本文公开的衣壳变体(例如，7m8变体)，编码与上述SEQ ID NO:35的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％中的任一个的蛋白、融合蛋白或多肽，或者在阿柏西普的相应cDNA序列(例如，与SEQ ID NO：36相比的基因疗法中使用的阿柏西普序列的cDNA)之间。在一些实施方案中，本文公开的方法、组合物包含阿柏西普的功能片段或其变体或突变体。在一些实施方案中，阿柏西普的核酸序列经修饰或密码子优化以增强其体内活性、表达、稳定性和/或溶解性。
阿柏西普为一种115kDa融合蛋白，其可以被糖基化。阿柏西普包含与人VEGFR-1和VEGFR-2的细胞外VEGF受体序列融合的IgG主链，并且通过以比其天然或内源性受体更大的亲和力结合VEGF-A起可溶性诱饵受体的作用。参见，例如，Stewart MW.Aflibercept(VEGFTrap-eye):the newest anti-VEGF drug.Br.J.Ophthalmol.2012Sep；96(9):1157-8。阿柏西普对VEGF的高亲和力干扰或破坏了天然或内源性VEGF受体的随后结合和活化。降低的VEGF活性可以导致血管生成和血管通透性降低。阿柏西普对胎盘生长因子PlGF和VEGF-B的抑制也可有助于治疗以异常(例如过度)血管生成和/或新血管形成为特征的眼部疾病或障碍。PlGF已经与血管生成有关，并且某些眼部疾病或病症，如湿性AMD，可能与PlGF水平升高相关。VEGF-B过表达可能与血液-视网膜屏障的破坏和视网膜血管生成相关。因此，VEGF-A、VEGF-B和PlGF的抑制都可能促进阿柏西普的功效。
用于制备向靶细胞递送转基因的载体的方法
在一些实施方案中，使用本领域已知的任何方法制备rAAV颗粒。在一些实施方案中，在Sf9细胞中使用杆状病毒表达载体系统制备rAAV颗粒。Sf9细胞是一种通常用于使用杆状病毒生产重组蛋白的昆虫细胞培养细胞系。在一些实施方案中，在Sf9细胞中使用两种杆状病毒制备rAAV颗粒。在一些实施方案中，在Sf9细胞中使用两种杆状病毒制备rAAV颗粒，其中第一杆状病毒编码AAV2 Rep和AAV2.7m8 Cap蛋白的基因，第二杆状病毒编码抗VEGF试剂。在一些实施方案中，在Sf9细胞中使用两种杆状病毒制备rAAV颗粒，其中第一杆状病毒编码AAV2 Rep和AAV2.7m8 Cap蛋白的基因，并且第二杆状病毒编码阿柏西普(例如，人阿柏西普)cDNA表述盒。在一些实施方案中，在Sf9细胞中使用两种杆状病毒制备rAAV颗粒，其中第一杆状病毒编码AAV2 Rep和AAV2.7m8 Cap蛋白的基因，并且第二杆状病毒包含编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽是阿柏西普。
剂量
在一些实施方案中，将单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是右眼或左眼。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是右眼。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是左眼。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是右眼，且对侧眼睛是左眼。在一些实施方案中，个体的一只眼睛是左眼，且对侧眼睛是右眼。
在一些实施方案中，向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约2周(例如，至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年、至少约5年或更长)。在一些实施方案中，向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约2周，并且向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒比向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒更高(例如，高于约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％或更多中的任一个)。
在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约1周、至多约2周、至多约3周或至多约4周。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周(例如，约0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周(例如约0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)，并且向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒与向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒大致相同(例如，高或低小于1％、高或低小于5％、高或低小于10％、或高或低小于20％)或更低(例如，更低约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％)。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周，并且向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒与向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒大致相同(例如，高或低小于1％、高或低小于5％、高或低小于10％、或高或低小于20％)。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周，并且向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒比向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒更低(例如，低约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％)。
在一些实施方案中，将单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒表示为载体基因组的数目(vg)。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1011个载体基因组(vg)或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约1×1010至约2×1010、约2×1010至约3×1010、约3×1010至约4×1010、约4×1010至约5×1010、约5×1010至约6×1010、约6×1010至约7×1010、约7×1010至约8×1010、约8×1010至约9×1010、约9×1010至约10×1010、约1×1011至约2×1011、约2×1011至约3×1011、约3×1011至约4×1011、约4×1011至约5×1011或约5×1011至约6×1011 vg的rAAV颗粒，包括这些范围内的任何值的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010个载体基因组(vg)至约2×1011 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg至约2×1011 vg、约7×1010 vg至约2×1011 vg、约8×1010 vg至约2×1011 vg、约9×1010 vg至约2×1011 vg、约10×1010 vg至约2×1011 vg或约1×1011 vg至约2×1011 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg至约2×1011 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg至约7×1010 vg、约7×1010 vg至约8×1010 vg、约8×1010 vg至约9×1010 vg、约9×1010 vg至约10×1010 vg、约10×1010 vg至约1×1011 vg、或约1×1011 vg至约2×1011vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010vg、约7×1010 vg、约8×1010 vg、约9×1010 vg、约10×1010 vg、约1×1011 vg或约2×1011 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg或约2×1011 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg、约2×1011 vg或约6×1011 vg。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg。在一些实施方案中，单位剂量为约2×1011 vg。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1011 vg。
在一些实施方案中，将单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛。在一些实施方案中，单位剂量表示为载体基因组的数目(vg)/眼睛(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1011vg/眼睛或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约1×1010至约2×1010、约2×1010至约3×1010、约3×1010至约4×1010、约4×1010至约5×1010、约5×1010至约6×1010、约6×1010至约7×1010、约7×1010至约8×1010、约8×1010至约9×1010、约9×1010至约10×1010、约1×1011至约2×1011、约2×1011至约3×1011、约3×1011至约4×1011、约4×1011至约5×1011或约5×1011至约6×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒，包括这些范围内的任何值的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为6×1010 vg/眼睛至约2×1011vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、约7×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、约8×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、约9×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、约10×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛或约1×1011 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010vg/眼睛至约7×1010 vg/眼睛、约7×1010 vg/眼睛至约8×1010 vg/眼睛、约8×1010 vg/眼睛至约9×1010 vg/眼睛、约9×1010 vg/眼睛至约10×1010 vg/眼睛、约10×1010 vg/眼睛至约1×1011 vg/眼睛或约1×1011 vg/眼睛至约2×1011vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛、约7×1010 vg/眼睛、约8×1010vg/眼睛、约9×1010 vg/眼睛、约10×1010 vg/眼睛、约1×1011 vg/眼睛或约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛或约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛、约2×1011 vg/眼睛或约6×1011 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1010 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量为约2×1011 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量为约6×1011 vg/眼睛。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，E为以10为底取幂的简写，并且xEy指x乘以底10的y次方/幂。在一些实施方案中，单位剂量表示为载体基因组的数目(vg)。在一些实施方案中，单位剂量为约6E11个载体基因组(vg)或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约1E10至约2E10、约2E10至约3E10、约3E10至约4E10、约4E10至约5E10、约5E10至约6E10、约6E10至约7E10、约7E10至约8E10、约8E10至约9E10、约9E10至约10E10、约1E11至约2E11、约2E11至约3E11、约3E11至约4E11、约4E11至约5E11或约5E11至约6E11 vg的rAAV颗粒，包括在这些范围内的任何值的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10个载体基因组(vg)至约2E11 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg至约2E11 vg、约7E10 vg至约2E11 vg、约8E10 vg至约2E11vg、约9E10 vg至约2E11 vg、约10E10 vg至约2E11 vg、或约1E11 vg至约2E11 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg至约2E11 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg至约7E10 vg、约7E10 vg至约8E10 vg、约8E10 vg至约9E10 vg、约9E10 vg至约10E10 vg、约10E10 vg至约1E11 vg、或约1E11 vg至约2E11 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg、约7E10 vg、约8E10 vg、约9E10 vg、约10E10 vg、约1E11 vg或约2E11vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg或约2E11 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg、约2E11 vg或约6E11 vg。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg。在一些实施方案中，单位剂量为约2E11vg。在一些实施方案中，单位剂量为约6E11 vg。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量表示为载体基因组(vg)的数量/眼睛(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量为约6E11vg/眼睛或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约1E10至约2E10、约2E10至约3E10、约3E10至约4E10、约4E10至约5E10、约5E10至约6E10、约6E10至约7E10、约7E10至约8E10、约8E10至约9E10、约9E10至约10E10、约1E11至约2E11、约2E11至约3E11、约3E11至约4E11、约4E11至约5E11、或约5E11至约6E11 vg/眼睛的rAAV颗粒，包括在这些范围内的任何值的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛、约7E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛、约8E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛、约9E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛、约10E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛、或约1E11 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛至约7E10 vg/眼睛、约7E10 vg/眼睛至约8E10 vg/眼睛、约8E10 vg/眼睛至约9E10 vg/眼睛、约9E10 vg/眼睛至约10E10 vg/眼睛、约10E10 vg/眼睛至约1E11 vg/眼睛、或约1E11 vg/眼睛至约2E11 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛、约7E10 vg/眼睛、约8E10 vg/眼睛、约9E10 vg/眼睛、约10E10 vg/眼睛、约1E11 vg/眼睛、或约2E11 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛或约2E11 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛、约2E11 vg/眼睛、或约6E11 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量为约6E10 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量为约2E11vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量为约6E11 vg/眼睛。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起玻璃体液中治疗性蛋白(例如，抗VEGF试剂，如阿柏西普)表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在玻璃体液中实现约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10μg/ml或更高(包括这些值之间的任何范围)中任一个的治疗性蛋白(例如抗VEGF试剂，如阿柏西普)浓度的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起玻璃体液中阿柏西普表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在玻璃体液中实现约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10μg/ml或更高(包括这些值之间的任何范围)中任一个的阿柏西普浓度的单位剂量。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒是足以引起治疗性蛋白(例如抗VEGF试剂，如阿柏西普)在房水液(aqueous fluid)中表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在房水液中中实现至少约0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0μg/ml或更高(包括这些值之间的任何范围)的治疗性蛋白质(例如抗VEGF试剂，如阿柏西普)浓度的的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起房水液中阿柏西普表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在房水液中实现至少约0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0μg/ml或更高(包括这些值之间的任何范围)的阿柏西普浓度的单位剂量。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起治疗性蛋白(例如抗VEGF试剂，如阿柏西普)在视网膜中表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在视网膜中实现至少约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10μg/g或更高(包括这些值之间的任何范围)的治疗性蛋白(例如，抗VEGF试剂，如阿柏西普)浓度的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起阿柏西普在视网膜中表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在视网膜中实现至少约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10μg/g或更高(包括这些值之间的任何范围)的阿柏西普浓度的单位剂量。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起治疗性蛋白(例如抗VEGF试剂，如阿柏西普)在脉络膜中表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在脉络膜中实现约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10μg/g或更高(包括这些值之间的任何范围)中任一个的治疗性蛋白(例如，抗VEGF试剂，如阿柏西普)浓度的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以引起阿柏西普在脉络膜中表达的单位剂量。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒是足以在视网膜中实现约3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10μg/g或更高(包括这些值之间的任何范围)中任一个的阿柏西普浓度的单位剂量。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起视网膜厚度的维持或降低，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起视网膜厚度的降低，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，视网膜厚度是中央亚视场厚度(CST)或中心视网膜厚度(CRT)。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起视网膜厚度降低超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％中的任一个，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，通过OCT或SD-OCT测定视网膜厚度(例如，CST或CRT)。
在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起黄斑体积的维持或降低，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起黄斑体积降低，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起皇帝体积降低超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％中的任一个，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，通过OCT或SD-OCT测定黄斑体积。
在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起视力的维持或改善，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起视力的改善，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起视力改善超过约5％、约10％、约15％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％或更多中的任一个，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起BCVA的改善，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，BCVA表示为ETDRS评分，其对应于正确阅读的字母的数量(Vitale et al.,(2016)JAMA Opthalmol 134(9):1041:1047)。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起BCVA改善至少15个ETDRS字母(Vitale等人，(2016)JAMA Opthalmol134(9)：1041:1047)(例如至少约15、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60或约70个字母)的，则该单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的BCVA相比，单位剂量的rAAV颗粒足以引起BCVA改善，其中个体损失少于15个ETDRS字母(Vitale等人，(2016)JAMAOpthalmol 134(9)：1041:1047)(例如15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、2个或更少、1或0个字母)，则该单位剂量为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，确定个体的视力得到维持，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，确定个体的视力得到改善，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前，通过SD-OCT评估的CST或CRT降低，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前，通过SD-OCT评估的CST或CRT得到保持，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比黄斑体积减少，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比黄斑体积得到保持，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，视网膜厚度(例如，中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST))和黄斑体积降低，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，视网膜厚度(例如，中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST))和黄斑体积得到保持，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之后约每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周、每10周或更长的任一时间，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后个体需要少于一次的救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，个体不需要任何救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)持续至少约1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周、至少10周、至少15周、至少20周、至少30周、至少40周、至少50周、至少60周、至少70周、至少80周、至少90周、至少100周、至少110周或更长时间，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜液体水平相比，确定个体的视网膜液体减少，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜液体水平相比，确定个体的视网膜液体得到维持，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的IRF和/或SRF的水平相比，确定个体的IRF和/或SRF减少，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的PED相比，确定个体的色素上皮脱离(PED)消退，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前存在的CNV病变相比，CNV病变缩小，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前存在的CNV病变相比，CNV病变缩小超过约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前存在的CNV病变相比，CNV病变没有生长，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前存在的CNV病变相比，CNV病变不会生长超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％中的任一个，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的解剖学特征相比，确定个体的解剖学特征得到改善，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。在一些实施方案中，如果在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用单位剂量的rAAV颗粒之前的解剖学特征相比，确定个体的解剖学特征稳定和/或得到保持，则该单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，如果在向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用的剂量减少、停止或预防眼新血管疾病或病症的至少一种症状，则该单位剂量的rAAV颗粒是治疗有效的。在以异常(例如过度)血管生成为特征的眼新血管疾病或病症的情况下，这样的症状包括但不限于例如视觉畸变(例如色觉受损、视力模糊、中心视觉退化)和视力丧失。在一些实施方案中，如果向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起眼新血管疾病的一种或多种临床特征的维持、部分消退或完全消退，则向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。例如，如果向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起眼新血管疾病的完全消退、部分消退或维持(如通过本领域已知的任何方法测量)，则向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒为治疗有效剂量。I在一些实施方案中，如果向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起眼新血管疾病的完全消退、部分消退或维持，如通过最佳矫正视力(BCVA)(例如，基于ETDRS评分；Vitale等人，(2016)JAMA Opthalmol 134(9)：1041:1047)、如通过SD-OCT测定中心视网膜厚度、在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后个体需要的救援疗法治疗(例如，阿柏西普注射)的次数、视网膜内流体(IRF)和/或视网膜下流体(SRF)的存在、色素上皮脱离(PED)的消退、脉络膜新生血管(CNV)病变生长、基于本领域已知的任何方法(例如，SD-OCT、OCT、荧光素血管造影术、数码彩色眼底摄影等)的解剖学特征进行评估，则向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒是治疗有效的。在一些实施方案中，如果向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起眼新血管疾病的完全消退、部分消退或维持，则向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒是治疗有效的，如基于眼科检查、眼内压(例如，使用Goldmann压平眼压计或Tono-Pen)、间接检眼镜检查、一只眼睛和/或对侧眼睛及附件的检查、眼睑和/或瞳孔反应性、眼睑下垂、异常瞳孔形状、瞳孔不相等、对光的异常反应、传入性瞳孔缺陷、裂隙灯检查(包括眼睑、结膜、角膜、晶状体、虹膜和前房)、玻璃体后段异常、视神经、外周视网膜和视网膜血管、SD-OCT、荧光素血管造影术、数码彩色眼底照相(包括视网膜、视神经盘和/或黄斑的图像)、房水采样、玻璃体液采样、OCT-血管造影(OCT-A)、屈光和/或视力(BCVA)进行评估。
在一些实施方案中，向个体一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒与向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒相同。在一些实施方案中，向个体一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒与向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒不同。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒比向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒更高，例如高约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％或更多中的任一个。在一些实施方案中，向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒比向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒更高，例如高约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约125％、约150％、约175％、约200％、约225％、约250％、约275％、约300％或更多中的任一个。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒表示为每只眼睛载体基因组(vg)的数量(vg/眼睛)。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1011vg/眼睛或更少的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约1×1010至约2×1010、约2×1010至约3×1010、约3×1010至约4×1010、约4×1010至约5×1010、约5×1010至约6×1010、约6×1010至约7×1010、约7×1010至约8×1010、约8×1010至约9×1010、约9×1010至约10×1010、约1×1011至约2×1011、约2×1011至约3×1011、约3×1011至约4×1011、约4×1011至约5×1011或约5×1011至约6×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒，包括在这些范围内的任何值的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010vg/眼睛至约2×1011vg/眼睛、约7×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、约8×1010vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、约9×1010 vg/眼睛至约2×1011vg/眼睛、约10×1010vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛、或约1×1011 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛至约7×1010 vg/眼睛、约7×1010 vg/眼睛至约8×1010 vg/眼睛、约8×1010 vg/眼睛至约9×1010 vg/眼睛、约9×1010vg/眼睛至约10×1010 vg/眼睛、约10×1010 vg/眼睛至约1×1011 vg/眼睛、或约1×1011 vg/眼睛至约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛、约7×1010 vg/眼睛、约8×1010 vg/眼睛、约9×1010 vg/眼睛、约10×1010 vg/眼睛、约1×1011 vg/眼睛、或约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛或约2×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛、约2×1011 vg/眼睛、或约6×1011 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1010 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约2×1011 vg/眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约6×1011vg/眼睛。
在一些实施方案中，同时施用向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒和向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，在不同时间施用向个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒和向个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒。在一些实施方案中，在向一只眼睛施用单位剂量之后至少约1小时、至少约2小时、至少约4小时、至少约8小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约1周、至少2周、至少约3周、至少约4周或更长时间中的任一时间向对侧眼睛施用施用单位剂量。在一些实施方案中，向对侧眼睛施用的单位剂量是在向一只眼睛施用单位剂量滞后至少约2周施用。
在一些实施方案中，将单个单位剂量的rAAV颗粒施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛。在一些实施方案中，向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的rAAV颗粒的单个单位剂量为治疗有效剂量。在一些实施方案中，将超过一个剂量的rAAV颗粒(例如，超过约2、3、4、5或更多个单位剂量中的任一个)施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛。在一些实施方案中，施用于一只眼睛和/或对侧眼睛的rAAV颗粒的超过一个剂量为治疗有效剂量。
在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒(例如，单位剂量为约2×1011vg/眼睛至约6×1011vg/眼睛的rAAV颗粒)之前至少约一周，例如至少约7天，向施用rAAV颗粒的一只眼睛和/或对侧眼睛施用抗-VEGF试剂(例如，阿柏西普)的IVT注射。在一些实施方案中，在约第1天向眼睛施用抗VEGF治疗，例如抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的IVT注射，并在约第8天向眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒，例如单位剂量为约2×1011 vg/眼睛至约6×1011vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为约2×1011vg/眼睛或约6×1011 vg/眼睛的rAAV颗粒。在一些实施方案中，眼新血管疾病是糖尿病性黄斑水肿。
药物制剂
在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒为药物制剂形式。在一些实施方案中，药物制剂包含rAAV颗粒、一种或多种渗透或离子强度剂、一种或多种缓冲剂、一种或多种表面活性剂和一种或多种溶剂。在一些实施方案中，渗透或离子强度剂为氯化钠。在一些实施方案中，一种或多种缓冲剂为磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠。在一些实施方案中，表面活性剂为泊洛沙姆188。在一些实施方案中，溶剂为水。在一些实施方案中，药物制剂包含rAAV颗粒、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和表面活性剂。
在一些实施方案中，药物制剂包含约1×1010 vg/mL至约1×1013 vg/mL的rAAV颗粒、约150mM至约200mM的氯化钠、约1mM至约10mM的磷酸二氢钠、约1mM至约10mM的磷酸氢二钠和约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL至约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒、约150mM至约200mM的氯化钠、约1mM至约10mM的磷酸二氢钠、约1mM至约10mM的磷酸氢二钠和约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL的rAAV颗粒、约150mM至约200mM的氯化钠、约1mM至约10mM的磷酸二氢钠、约1mM至约10mM的磷酸氢二钠和约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒、约150mM至约200mM的氯化钠、约1mM至约10mM的磷酸二氢钠、约1mM至约10mM的磷酸氢二钠和约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。
在一些实施方案中，药物制剂中的rAAV颗粒以约1×1010 vg/ml至约1×1013 vg/ml的浓度存在。在一些实施方案中，药物制剂中的rAAV颗粒以约1×1009 vg/ml至约6×1014vg/ml的浓度存在。在某些实施方案中，药物制剂中的rAAV颗粒以下述浓度存在：1×1009vg/ml至约2×1009 vg/ml、约2×1009vg/ml至约3×1009、约3×1009vg/ml至约4×1009、约4×1009vg/ml至约5×1009、约5×1009 vg/ml至约6×1009、约6×1009 vg/ml至约7×1009、约7×1009vg/ml至约8×1009、约8×1009vg/ml至约9×1009、约9×1009vg/ml至约10×1009、约10×1009vg/ml至约1×1010、约1×1010 vg/ml至约2×1010、约2×1010 vg/ml至约3×1010、约3×1010 vg/ml至约4×1010、约4×1010 vg/ml至约5×1010、约5×1010vg/ml至约6×1010、约6×1010vg/ml至约7×1010、约7×1010 vg/ml至约8×1010、约8×1010 vg/ml至约9×1010、约9×1010vg/ml至约10×1010、约10×1010vg/ml至约1×1011、约1×1011 vg/ml至约2×1011、约2×1011 vg/ml至约3×1011、约3×1011vg/ml至约4×1011、约4×1011 vg/ml至约5×1011、约5×1011vg/ml至约6×1011、约6×1011 vg/ml至约7×1011、约7×1011 vg/ml至约8×1011、约8×1011vg/ml至约9×1011、约9×1011 vg/ml至约10×1011、约1×1012 vg/ml至约2×1012、约2×1012 vg/ml至约3×1012、约3×1012 vg/ml至约4×1012、约4×1012vg/ml至约5×1012、约5×1012vg/ml至约6×1012、约6×1012vg/ml至约7×1012、约7×1012vg/ml至约8×1012、约8×1012vg/ml至约9×1012、约9×1012vg/ml至约10×1012、约1×1013 vg/ml至约2×1013、约2×1013vg/ml至约3×1013、约3×1013 vg/ml至约4×1013、约4×1013vg/ml至约5×1013、约5×1013 vg/ml至约6×1013、约6×1013 vg/ml至约7×1013、约7×1013 vg/ml至约8×1013、约8×1013 vg/ml至约9×1013、约9×1013 vg/ml至约10×1013、约1×1014vg/ml至约2×1014、约2×1014 vg/ml至约3×1014、约3×1014vg/ml至约4×1014、约4×1014 vg/ml至约5×1014、或约5×1014 vg/ml至约6×1014 vg/mL。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL至约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL至约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL的rAAV颗粒。
在一些实施方案中，药物制剂中的氯化钠以约150mM至约200mM的浓度存在。在某些实施方案中，药物制剂中的氯化钠以约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM或约200mM的浓度存在。在某些实施方案中，药物制剂中的氯化钠以约180mM的浓度存在。
在一些实施方案中，磷酸二氢钠以约1mM至约10mM的浓度存在于药物制剂中。在一些实施方案中，磷酸二氢钠以约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM中的任一种浓度存在于药物制剂中。在某些实施方案中，磷酸二氢钠以约5mM的浓度存在于药物制剂中。
在一些实施方案中，磷酸氢二钠以约1mM至约10mM的浓度存在于药物制剂中。在一些实施方案中，磷酸氢二钠以约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM中的任一种浓度存在于药物制剂中。在某些实施方案中，磷酸氢二钠以约5mM的浓度存在于药物制剂中。
在一些实施方案中，泊洛沙姆188以约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的浓度存在于药物制剂中。在一些实施方案中，泊洛沙姆188以约0.0005％(w/v)、约0.0006％(w/v)、约0.0007％(w/v)、约0.0008％(w/v)、约0.0009％(w/v)、约0.001％(w/v)、约0.002％(w/v)、约0.003％(w/v)、约0.004％(w/v)或约0.005％(w/v)中任一个的浓度存在于药物制剂中。在某些实施方案中，泊洛沙姆188以约0.001％(w/v)的浓度存在于药物制剂中。
在一些实施方案中，药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。在一些实施方案中，药物制剂具有约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4或约7.5的pH。在某些实施方案中，药物制剂具有约7.3的pH。在一些实施方案中，使用盐酸和氢氧化钠来调节药物制剂的pH。
在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1012 vg/mL的rAAV颗粒、约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。在一些实施方案中，药物制剂包含约6×1011 vg/mL的rAAV颗粒、约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。
在一些实施方案中，药物制剂适于经由玻璃体内(IVT)注射施用至个体(例如人类患者)的一只眼睛和/或对侧眼睛以实现期望的治疗或预防作用。在一些实施方案中，药物制剂作为重构的均质溶液提供。在一些实施方案中，溶液是悬浮液。在一些实施方案中，药物制剂作为冷冻悬浮液提供，并且在施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛之前解冻。在一些实施方案中，溶液是等渗的。
在其它实施方案中，包含例如AAV2.7m8载体的药物组合物以冻干形式提供，所述载体包含编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普或其功能片段或变体)的核酸序列，并在施用于个体的一只眼睛和/或对侧眼睛之前重构。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括在施用于受试者之前在缓冲液中重构、溶解或增溶包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普或其功能片段或变体)的冻干药物组合物的步骤。在一些实施方案中，这样的冻干药物组合物包含以下的一种或多种：冷冻保护剂、表面活性剂、盐、稳定剂或其任何组合。
在一些实施方案中，药物制剂是均质溶液。在一些实施方案中，均质溶液在预填充注射器中提供。在一些实施方案中，药物制剂作为悬浮液提供。在一些实施方案中，悬浮液为溶液。在一些实施方案中，将悬浮液冷藏。在一些实施方案中，将悬浮液冷冻。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括将冷冻的混悬液加热至室温和/或搅拌该悬浮液以确保活性成分在施用于个体的一只眼睛和/或对侧眼睛(例如，经由IVT注射)之前溶解和/或均匀分布在溶液中的步骤。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括将冷冻的悬浮液解冻和升温至室温和/或搅拌该悬浮液，以确保活性成分在施用于个体的一只眼睛和/或对侧眼睛(例如，经由IVT注射)之前溶解和/或均匀分布在溶液中的步骤。在一些实施方案中，在施用于受试者之前(例如，经由IVT注射)稀释悬浮液。在一些实施方案中，悬浮液作为预填充注射器提供。
在一些实施方案中，药物制剂作为冷冻悬浮液提供。在一些实施方案中，悬浮液包含可药用赋形剂，例如表面活性剂、甘油、非离子表面活性剂、缓冲剂、二醇、盐及其任意组合。
在一些实施方案中，悬浮液是溶液。在一些实施方案中，悬浮液包含胶束。
在一些实施方案中，为了储存稳定性和操作的便利性，将包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普或其功能片段或变体)的核酸序列的药物制剂配制成冻干的、冷冻干燥的或真空干燥的粉末，其在施用至个体的一只眼睛和/或对侧眼睛之前用盐水、缓冲液或水重构。或者，药物制剂配制成水溶液，例如悬浮液或均匀溶液。药物制剂可含有rAAV颗粒，其包含编码阿柏西普的核酸序列。各种赋形剂，例如磷酸盐、PBS或Tris缓冲液、二醇、甘油、盐水、表面活性剂(例如，普流尼克或聚山梨酯)或其任何组合，可用于稳定药物制剂。另外，冷冻保护剂，例如醇，可以在冷冻或干燥条件下用作稳定剂。在一些实施方案中，基因疗法呈悬浮液、冷藏悬浮液或冷冻悬浮液提供。
在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的悬浮液具有约20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL或1000μL中的任一个的体积。在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的悬浮液具有约250μL的体积。在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的具有0.1至0.5mL、0.1至0.2mL、0.3至0.5mL、0.5-1.0mL、0.5-0.7mL、0.6至0.8mL、0.8至1mL、0.9至1.1mL、1.0至1.2mL或1.0至1.5mL的体积。在其它实施方案中，所述体积不超过0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL或1.5mL。在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的悬浮液具有约0.25mL的体积。
在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的悬浮液呈无菌过滤的冷冻悬浮液在具有即用塞子(例如，由氯丁基制成的塞子)的无菌即用小瓶(例如，0.5mL小瓶；例如Crystal
Figure BDA0003539340930001271
小瓶)中提供，并密封(例如，用无菌铝可撕开密封件(tear-offseal))。在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的悬浮液呈无菌过滤的冷冻悬浮液在无菌的即用小瓶(例如，0.5mL小瓶；例如Crystal
Figure BDA0003539340930001272
小瓶)中提供，所述小瓶具有即用塞子(例如，由氯丁基制成的塞子)，并密封(例如，用无菌铝可撕开密封件)，其中所述小瓶含有0.1至0.5mL、0.1至0.2mL、0.2至0.3mL、0.3至0.4mL或0.4mL至0.5mL体积的药物制剂的悬浮液。在一些实施方案中，如本文公开的药物制剂的悬浮液呈无菌过滤的冷冻悬浮液在具有即用塞子(例如，由氯丁基制成的塞子)的无菌即用小瓶(例如，0.5mL小瓶；例如Crystal
Figure BDA0003539340930001273
小瓶)中提供，并密封(例如，用无菌铝可撕开密封件)，其中所述小瓶含有约0.25mL体积的药物制剂的悬浮液。
在一些实施方案中，本文公开的药物制剂被设计、工程化或改造为经由玻璃体内或视网膜下注射施用于灵长类动物(例如，非人灵长类动物和人类受试者)。在一些实施方案中，配制包含rAAV颗粒的药物制剂用于玻璃体内注射至个体的眼睛中，所述rAAV颗粒包含编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的核酸序列。在一些实施方案中，将药物组合物配制或重构成允许玻璃体内注射不超过约或不超过25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL、200μL、210μL、220μL、230μL、240μL或250μL中任一个的体积的浓度。在一些实施方案中，单位剂量的药物制剂包含不超过约或不超过25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL、200μL、210μL、220μL、230μL、240μL或250μL中的任一个体积。在一些实施方案中，本文公开的方法包括玻璃体内注射约25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL、200μL、210μL、220μL、230μL、240μL或250μL中的任一个体积的编码抗VEGF试剂(例如，AAV2.7m8)的药物制剂的溶液或悬浮液，所述药物制剂包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码抗-VEGF试剂(例如，阿柏西普)的核酸序列。在一些实施方案中，本文公开的方法包括玻璃体内注射约30μL或约100μL体积的药物制剂的溶液或悬浮液，所述药物制剂包含rAAV(例如AAV2.7m8)和编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的核酸序列。在一些实施方案中，本文公开的方法包括玻璃体内注射约30μL体积的药物制剂的溶液或悬浮液，所述药物制剂包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的核酸序列。在一些实施方案中，本文公开的方法包括玻璃体内注射约100μL体积的药物制剂的溶液或悬浮液，所述药物制剂包含rAAV(例如，AAV2.7m8)和编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的核酸序列。
在一些实施方案中，包含本文描述的抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)转基因的核酸序列的AAV2.7m8颗粒是基因治疗药物制剂的组分。在一些实施方案中，使用如本文所述的包含7m8变体衣壳蛋白的任何血清型的rAAV颗粒制备冷冻悬浮液或冷冻干燥的或冻干的制剂组合物。在一些实施方案中，基因疗法配制为冷藏或冷冻的悬浮液。在一些实施方案中，rAAV颗粒为rAAV2。在一些实施方案中，药物制剂的冻干悬浮液包含rAAV2，其包含7m8变体衣壳蛋白和编码抗VEGF试剂(例如，阿柏西普)的DNA序列。在一些实施方案中，悬浮液是冷藏的或冷冻的。
在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过玻璃体内(IVT)注射。对于IVT注射，rAAV颗粒可以以药物制剂(例如，如本文所述)的悬浮液形式递送。首先，将局部麻醉剂施用到眼睛表面，随后施用眼用抗菌溶液。在有或没有仪器的情况下，保持眼睛张开，并且在直接观察下，用短、窄针(例如30号针)将rAAV颗粒通过巩膜注射到个体的一只眼睛和/或对侧眼睛的玻璃体腔中。通常，可以通过IVT注射将约25μL至约250μL(例如，约25μL、约30μL、约40μL、约50μL、约60μL、约70μL、约80μL、约90μL、约100μL、约110μL、约120μL、约130μL、约140μL、约150μL、约160μL、约170μL、约180μL、约190μL、约200μL、约210μL、约220μL、约230μL、约240μL或约250μL中的任一个)的rAAV颗粒混悬液递送至眼睛。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约100μL的体积。在一些实施方案中，单位剂量的rAAV颗粒包含约30μL的体积。在一些实施方案中，IVT注射与玻璃体液移除组合进行。在一些实施方案中，可以进行玻璃体切除术，并且通过输注rAAV颗粒悬浮液(例如，约4mL的rAAV颗粒悬浮液)来代替全部体积的玻璃体凝胶。使用合适孔径(例如20号至27号)的套管进行玻璃体切除术，其中通过从输注套管输注液体(例如盐水、等渗溶液、rAAV颗粒悬浮液)来代替所除去体积的玻璃体凝胶。IVT施用通常耐受良好。在手术结束时，有时在注射部位有轻微的发红。偶尔存在触痛，但大多数患者没有报告任何疼痛。在该过程之后不需要眼贴或眼罩，并且活动不受限制。有时，开处方抗生素滴眼剂几天以帮助预防感染。
在一些实施方案中，药物制剂是单位剂量(例如，治疗有效剂量)，其经由IVT注射施用至个体(例如，人类或非人灵长类动物)的一只眼睛和/或对侧眼睛，用于治疗特征在于异常(例如过度)血管生成或新血管形成的眼部疾病或病症。在一些实施方案中，药物制剂包含如本文别处进一步详细描述的单位剂量(例如，治疗有效剂量)。在一些实施方案中，向受试者施用的单位剂量(例如，治疗有效剂量)的病毒载体(例如，本文公开的rAAV载体)的体积不超过约25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL、55μL、60μL、65μL、70μL、75μL、80μL、85μL、90μL、95μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL、200μL、210μL、220μL、230μL、240μL或250μL中的任一个，包括这些值之间的任何范围。最小化施用于受试者的单位剂量的体积可以避免或减轻眼压的变化和与IVT注射相关的其他副作用(例如，眼内压升高、炎症、刺激或疼痛)。
适合眼部使用的药物制剂包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液、悬浮液或分散液的无菌粉末。对于玻璃体内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和/或等渗剂，例如甘油。在某些实施方案中，药物制剂是无菌的且流动性达到可存在容易注射性或注射能力的程度。在某些实施方案中，药物制剂在制造和储存条件下是稳定的，并且被保存以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。在一些实施方案中，药物组合物可以包括等渗剂，例如盐或甘油。在一些实施方案中，将表面活性剂或稳定剂加入药物组合物中以防止聚集。
在一些实施方案中，药物制剂含有赋形剂或载体。载体是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其任意组合。例如，通过使用涂层如卵磷脂，通过在分散的情况下维持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂如聚山梨酯(例如吐温TM、聚山梨酯20、聚山梨酯80)、十二烷基硫酸钠(月桂基硫酸钠)、月桂基二甲基氧化胺、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、聚乙氧基化醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇、辛苯聚醇(Triton X100TM)、N,N-二甲基月桂基胺-N-氧化物、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、聚氧乙烯10月桂基醚、Brij 721TM、胆汁盐(脱氧胆酸钠、胆酸钠)、普流尼克酸(pluronicacids)(F-68，F-127)、聚氧乙烯蓖麻油(CremophorTM)、壬基苯酚乙氧基化物(TergitolTM)、环糊精和乙基苄索氯铵(HyamineTM)可以保持合适的流动性。通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、甲酚、硫柳汞等，可以实现实现防止微生物的作用。在许多实施方案中，药物制剂中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和/或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现内部组合物的延长吸收。在一些实施方案中，药物载体包括磷酸钠、氯化钠、聚山梨醇酯和蔗糖。在一些实施方案中，药物制剂包含表面活性剂，例如非离子表面活性剂，如聚山梨酯、泊洛沙姆或普流尼克。在一些实施方案中，加入非离子表面活性剂减少了药物组合物中的聚集。
本文还提供包含至少一种本文所述的药物制剂的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含药物制剂的冷冻悬浮液(例如，小瓶中的一个单位剂量)。在一些实施方案中，试剂盒包含本文公开的冻干或冷冻干燥的药物制剂(例如，小瓶中的一个单位剂量)和用于溶解、稀释和/或重构冻干的药物组合物的溶液。在一些实施方案中，用于重构或稀释的溶液呈预填充注射器提供。在一些实施方案中，试剂盒包含含有rAAV(例如，AAV2.7m8)的冷冻干燥或冻干的药物组合物和用于将药物组合物重构至所需浓度或体积的溶液。在一些实施方案中，试剂盒包括缓冲液，其有助于防止在重构本文公开的药物组合物时聚集。在一些实施方案中，药物组合物在预填充注射器中提供。在一些实施方案中，试剂盒包括双室注射器或容器，其中一个室含有用于溶解或稀释药物组合物的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒包括用于注射的注射器。在一些实施方案中，在施用之前过滤重构的溶液。在一些实施方案中，试剂盒包括用于在施用于患者之前过滤重构的药物组合物的过滤器或过滤器注射器。在一些实施方案中，试剂盒包含药物制剂的悬浮液，所述药物制剂包含如本文公开的rAAV颗粒，其呈无菌过滤的冷冻悬浮液在具有即用塞子(例如，由氯丁基制成的塞子)的无菌即用小瓶(例如，0.5mL小瓶；例如Crystal
Figure BDA0003539340930001311
小瓶)中提供，并密封(例如，用无菌铝可撕密封件)。在一些实施方案中，试剂盒包含药物制剂的悬浮液，所述药物制剂包含如本文公开的rAAV颗粒，其呈无菌过滤的冷冻悬浮液在具有即用塞子(例如，由氯丁基制成的塞子)的无菌即用小瓶(例如0.5mL小瓶；例如Crystal
Figure BDA0003539340930001312
小瓶)中提供，并密封(例如，用无菌铝可撕密封件)，其中小瓶含有0.1至0.5mL、0.1至0.2mL、0.2至0.3mL、0.3至0.4mL或0.4mL至0.5mL体积的药物制剂的悬浮液。在一些实施方案中，试剂盒包含药物制剂的悬浮液，所述药物制剂包含如本文公开的rAAV颗粒，其呈无菌过滤的冷冻悬浮液在具有即用塞子(例如，由氯丁基制成的塞子)的无菌即用小瓶(例如0.5mL小瓶；例如Crystal
Figure BDA0003539340930001313
小瓶)中提供，并密封(例如，用无菌铝可撕密封件)，其中小瓶含有约0.25mL体积的药物制剂的悬浮液。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含使用说明书；例如，用本文公开的rAAV颗粒治疗眼新血管疾病的说明书。
眼新血管疾病
在一个方面，本公开内容提供用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法。在另一方面，本公开内容提供用于减少患有眼新血管疾病的个体的眼中的视网膜流体的方法。
在一些实施方案中，眼新生血管疾病是年龄相关性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成糖尿病性视网膜病、增殖性糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病、糖尿病性视网膜水肿或其任意组合。在一些实施方案中，眼新生血管疾病是继发于年龄相关性黄斑变性(AMD)的活动性脉络膜新血管形成(CNV)。
在一些实施方案中，眼新血管疾病是复发性和/或持续性wAMD。在一些实施方案中，眼新血管疾病是AMD继发的活动性中央凹下CNV。在一些实施方案中，AMD继发的活动性凹下CNV占总病变大小的≥50％。在一些实施方案中，AMD继发的活动性中央凹下CNV占总病变尺寸的≥50％，具有在荧光血管造影(FA)上渗漏、在光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)上流体、和/或在彩色眼底照相上视网膜下出血的证据。在一些实施方案中，AMD继发的活动性中央凹下CNV占总病变尺寸的≥50％，具有在荧光血管造影(FA)上渗漏、在光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)上流体、和/或在彩色眼底照相上视网膜下出血的证据，并且整个病变的尺寸不超过12个黄斑光凝研究视盘区。在一些实施方案中，在施用单位剂量的本公开内容的rAAV颗粒之前，基于ETDRS字母评估，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛显示78-25(例如，小于约78、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30或约25中的任一个)的最佳矫正视力(BCVA)。在一些实施方案中，在施用单位剂量的本公开内容的rAAV颗粒之前，基于ETDRS字母评估，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛显示出超过约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100中的任一个的最佳矫正视力(BCVA)。
在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体在一只眼睛和/或对侧眼睛中具有息肉状脉络膜血管病变(PCV)。
在一些实施方案中，ETDRS字母评估在约0.5米、约1米、约2米、约3米或约4米进行。在一些实施方案中，ETDRS字母评估在约4米进行。
在一些实施方案中，在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约最后12周(例如，约3个月或约4个月)内，个体接受至少一种使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗(例如，至少一次、至少两次、至少三次、至少四次、至少5次或更多次治疗)。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前约最近12周(例如，约3个月或约4个月)内，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中接受2或3次使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在一些实施方案中，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中接受至少约1、至少约5、至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120或更多次使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在一些实施方案中，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中计算的抗-VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果和/或阿柏西普)的注射间隔为约2周、约3周、4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周或更长。在一些实施方案中，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中计算的抗VEGF(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗和/或阿柏西普)的注射间隔为约5-7周、约4-10周、约4-7周或约4-6周。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的AV颗粒之前至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天或至少约20天，个体的一只眼睛和/或对侧眼眼睛中接受使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前约7天、约10天或约14天，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛接受使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在一些实施方案中，先前治疗包括使用抗VEGF试剂的眼内、视网膜下或玻璃体内注射。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是阿柏西普。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前最近约12个月期间，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛接受1至20次(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次中的任一次)使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前最近约12个月期间，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛接受约9次或约10次使用抗VEGF试剂(例如，贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普)的先前治疗。
在一些实施方案中，个体对使用抗VEGF试剂的先前治疗表现出有意义的响应。在一些实施方案中，抗VEGF试剂是阿柏西普、其功能变体或其功能片段。在一些实施方案中，抗VEGF试剂包含含有与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前，个体的一只眼睛和/或对侧眼睛中表现出对先前抗VEGF治疗(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)的有意义的反应。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中在初始诊断时观察到中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，在抗-VEGF治疗之后至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天或更多天中的任一时间观察到中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)减少≥30％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％中的任一个)，则确定个体对先前抗VEGF治疗(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)具有有意义的响应。在一些实施方案中，如果与在一只眼睛和/或对侧眼睛中施用先前的抗-VEGF治疗之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，在抗-VEGF治疗之后约7天、约10天或约14天中的任一时间观察到中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)减少≥30％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％中的任一个)，则确定个体对先前抗VEGF治疗(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)具有有意义的响应。
在一些实施方案中，通过SD-OCT测定在一只眼睛和/或对侧眼睛中中央亚视场厚度和/或中心视网膜厚度。中央亚视场厚度是跨越ETDRS格栅的中心亚视场(以凹处为中心的1mm直径圆形)的视网膜的平均厚度。
在一些实施方案中，如果与施用抗VEGF试剂的先前治疗之前的中央亚视场厚度和/或中心视网膜厚度相比，观察到中央亚视场厚度和/或中心视网膜厚度减少≥20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％中的任一个)，则确定个体对用于眼新血管疾病的抗VEGF试剂(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)的先前治疗具有有意义的响应。在一些实施方案中，如果与施用抗VEGF试剂的先前治疗之前的视网膜前的中央亚视场厚度和/或中心视膜厚度相比，施用抗VEGF试剂的先前治疗之后至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天或更多天的任一时间观察到中央亚视场厚度和/或中心视膜厚度减少≥20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的任一个)，则确定个体对抗VEGF试剂(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)的先前治疗具有有意义的响应。在一些实施方案中，如果与施用抗VEGF试剂的先前治疗之前的中央亚视场厚度和/或中心视网膜厚度相比，在施用使用抗VEGF试剂的先前治疗之后约7天、约10天或约14天观察到中央亚视场厚度和/或中心视网膜厚度的减少≥20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％中的任一个)，则确定个体对用于眼新血管疾病的抗VEGF试剂的先前治疗具有有意义的响应。在一些实施方案中，通过SD-OCT测定一只眼睛和/或对侧眼睛中中央亚视场厚度和/或中心视网膜厚度。在一些实施方案中如果在一只眼睛和/或对侧眼睛中抗-VEGF治疗之后观察到CST正常化且没有观察到血管渗出物，则确定个体对用于眼新血管疾病的抗-VEGF试剂(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)的先前治疗具有有意义的响应。标准化指对于该类患者正常的CST值(例如，基于年龄、性别等)。
在一些实施方案中，如果与施用抗-VEGF治疗(例如，阿柏西普)之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，在抗-VEGF治疗之后至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天或更多天中的任一时间观察到中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)减少≥20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％中的任一个)，则确定个体对用于眼新血管疾病的先前抗VEGF治疗(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)具有有意义的响应，如通过SD-OCT在一只眼睛和/或对侧眼睛中测定的。在一些实施方案中，如果与施用抗-VEGF治疗(例如，阿柏西普)之前的中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)相比，在抗-VEGF治疗之后约7天、约10天或约14天观察到中心视网膜厚度(CRT)或中央亚视场厚度(CST)减少≥20％(例如，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％中的任一个)，则确定个体对用于眼新血管疾病的先前抗VEGF治疗(例如，阿柏西普、其功能变体或其功能片段)具有有意义的响应，如通过SD-OCT在一只眼睛和/或对侧眼睛中测定的。
在一些实施方案中，个体没有接受眼新血管疾病的先前治疗。在一些实施方案中，个体没有接受在一只眼睛和/或对侧眼睛中用于眼新血管疾病的先前治疗。在一些实施方案中，个体没有接受过先前的抗VEGF治疗。在一些实施方案中，个体没有接受在一只眼睛和/或对侧眼睛中先前的抗VEGF治疗。在一些实施方案中，个体没有接受先前的阿柏西普治疗。在一些实施方案中，个体没有接受在一只眼睛和/或对侧眼睛中先前的阿柏西普治疗。
在一些实施方案中，根据本文描述的方法治疗的眼部疾病或病症是糖尿病性黄斑水肿。糖尿病性黄斑水肿(DME)是由于流体从黄斑内的血管渗漏引起的糖尿病中的视网膜肿胀。黄斑是视网膜的中心部分，其是富含视锥的小区域，视锥是检测色彩并且白天视觉所依赖的专门的神经末梢。随着黄斑水肿的发展，中心视野的中部或仅在中心视野的侧面发生模糊。由糖尿病性黄斑水肿的视力丧失可在数月的时间内发展，并使其不可能清楚地聚焦。DME的常见症状是视力模糊、飞蚊症、双视，如果不治疗，最终会失明。在一些实施方案中，本文公开的方法和药物组合物用于治疗DME。在一些实施方式中，通过测量屈光或视力(例如，使用ETDRS字母的BCVA)评估DME的治疗。在一些实施方案中，在使一只眼睛和/或对侧眼睛散瞳之前，从约4米的距离开始测量视力。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前相比，在施用单位剂量的rAAV颗粒之后，个体在ETDRS评分中损失少于15个字母，则认为视力得到保持。在一些实施方案中，通过SD-OCT和/或OCT-A评估DME的治疗。在一些实施方案中，通过使用SD-OCT测量中央亚视场厚度和/或黄斑体积评估DME的治疗。在一些实施方案中，通过在施用单位剂量的rAAV颗粒(例如，阿柏西普救援治疗)之后施用的抗VEGF试剂(例如阿柏西普)治疗的次数评估DME的治疗。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量rAAV颗粒之前(例如，在第1天)和施用单位剂量的rAAV颗粒之后约3周(例如，在第4周)记录的两次CST测量值中较低的测量值相比，通过SD-OCT评估，出现中央亚视场厚度(CST)＞50μm，则在施用单位剂量rAAV颗粒之后施用一次或多次阿柏西普救援治疗。在一些实施方案中，如果与施用单位剂量的rAAV颗粒之前(例如，在第1天)和施用单位剂量的rAAV颗粒之后约3周(例如在第4周)记录的两次BCVA测量结果中的较高的测量结果相比，由于DME疾病活性恶化而BCVA中损失＞5个字母，则在施用单位剂量的rAAV颗粒之后施用一次或多次阿柏西普救援治疗。在一些实施方案中，与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的DRSS相比，使用糖尿病性视网膜病严重程度量表(DRSS)，例如使用超宽视野彩色眼底照相，评价DME的治疗。在一些实施方案中，通过发生威胁视力的并发症(例如，前段新血管形成、糖尿病性黄斑水肿、高风险PDR发展、玻璃体出血或牵引性视网膜脱离)评价DME的治疗。在一些实施方案中，通过超宽视野成像和临床检查评估威胁视力的并发症。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起糖尿病性视网膜病变严重程度量表(DRSS)的2步或3步改善。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起糖尿病性视网膜病变严重程度量表(DRSS)的2步改善。在一些实施方案中，向个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起糖尿病性视网膜病变严重程度量表(DRSS)的3步改善。
在一些实施方案中，根据本文所述方法治疗的眼部疾病或障碍是视网膜静脉阻塞。视网膜静脉阻塞是将血液从视网膜运走的小静脉的阻塞。视网膜是内眼后部的组织层，其将光图像转换成神经信号并将其传送到脑部。视网膜静脉阻塞最常由动脉硬化(动脉粥样硬化)和血块形成引起。视网膜中较小静脉(分支静脉或BRVO)的阻塞通常发生在其中已经由于动脉粥样硬化而增厚或硬化的视网膜动脉跨越并在视网膜静脉上施加压力的位置。视网膜静脉阻塞的症状可以包括一只眼睛的全部或部分中的突然模糊或视力丧失。
在一些实施方案中，根据本文所述方法治疗的眼部疾病或眼障碍是脉络膜新血管形成(CNV)，也称为湿性年龄相关性黄斑变性(wAMD)。脉络膜新生血管可涉及来源于脉络膜的新血管的生长破坏布鲁赫膜(Bruch membrane)进入视网膜下色素上皮(RPE下)或视网膜下腔，这可能是视力丧失的主要原因。CNV可造成中心视觉的突然恶化，在几周内可引人注意到。其它症状可包括色彩障碍和视物变形症(其中直线呈现波浪状的变形)。新血管出血可加速CNV症状的发作。CNV也可以包括感觉到眼后的压力。
AMD的晚期“湿”形式(新血管或渗出性)经常可引起患者中心视力快速且经常显著的丧失。在AMD的湿性形式中，脉络膜新生血管形成并发展为血管网络，其可在视网膜色素上皮下生长且穿过视网膜色素上皮。由于这伴随有血浆渗漏和/或出血进入视网膜下腔，如果这发生在黄斑中，则可能存在严重的中心视觉突然丧失。本公开内容涵盖AMD、湿性AMD的治疗或预防。在一些实施方案中，如本文公开的方法和药物组合物用于治疗AMD。
在一些实施方案中，本文描述的方法用于预防或治疗受试者的眼部疾病或病症，所述受试者已经接受用贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗、法瑞昔单抗、阿比斯帕培果、康柏西普(conbercept)、OPT-302、KSI-301、可注射的舒尼替尼马来酸盐(GB-102)、PAN-90806(PanOptica)和/或阿柏西普的先前治疗。在一些实施方案中，本文描述的方法用于预防或治疗对用贝伐单抗、布鲁单抗、雷珠单抗和/或阿柏西普的治疗有响应的眼部疾病或病症。
在一些实施方案中，在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前至少1天、至少1周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少30个月、至少36个月、至少42个月、至少48个月、至少54个月、至少60个月、至少66个月、至少72个月、至少78个月、至少84个月、至少90个月、96个月、至少102个月、至少108个月、至少114个月、至少120个月、至少126个月、至少132个月或更长时间，诊断为患有眼新血管疾病。
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用各种实施例。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例来提供。对本文所述的实例的各种修饰对于本领域的普通技术人员将是显而易见的，并且本文所定义的一般原理可以在不背离各种实施方案的精神和范围下应用于其它实施例和应用。因此，各种实施例不意欲限于本文描述和显示的实例，而是应符合与权利要求书一致的范围。
实施例
实施例1：在6×1011 vg/眼睛剂量下，新血管性(湿性)年龄相关性黄斑变性中AAV2.7m8-阿柏西普的开放标记1期研究
该实施例描述AAV2.7m8-阿柏西普(一种含有VEGF抑制剂阿柏西普和AAV2.7m8蛋白衣壳的rAAV载体)用于治疗具有脉络膜新血管形成的年龄相关性黄斑变性(AMD)(湿性AMD；wAMD)的开放标记1期研究。
I.研究目的
A.主要目的
本研究的主要目的是评估在患有wAMD的受试者中，AAV2.7m8-阿柏西普的单一玻璃体内(IVT)注射的安全性和耐受性。
主要终点
该研究的主要终点是眼睛和全身性不良事件(AE)的类型、严重程度和发生率。
B.次要目的
这些研究的次要目的是：
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对最佳矫正视力(BCVA)的影响。
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对中央亚视场厚度(CST)(也称为中心视网膜厚度(CRT))的影响。
·评估从第4周至第104周对救援疗法的需要。
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对视网膜内流体(IRF)和视网膜下流体(SRF)的存在的影响。
·评价在基线时患有色素上皮脱离(PED)的患者中，AAV2.7m8-阿柏西普对PED消退的影响。
次要终点
该研究的次要终点是：
·与基线相比，BCVA随时间推移从基线的平均变化，如通过ETDRS字母随时间推移从第8天至第104周评估的。
·与基线相比，随时间推移具有从基线≥15个ETDRS字母的BCVA增加的的受试者的百分比，如从第8天到第104周评估的。
·与基线相比，随时间推移具有从基线≤15个ETDRS字母的BCVA降低的的受试者的百分比，如从第8天到第104周评估的。
·与基线相比，CST和黄斑体积随时间推移从基线的平均变化，如从第8天至第104周评估的。
·随时间推移阿柏西普注射的平均次数，如从第4-104周评估的。
·随时间推移需要阿柏西普注射的受试者的百分比，如从第4-104周评估的。
·随时间推移不具有IRF的受试者的百分比，如从第8天至第104周评估的。
·随时间推移不具有SRF的受试者的百分比，如从第8天至第104周评估的。
·在基线时患有PED的受试者中，随时间推移不具有PED的受试者的百分比，如从第8天至第104周评估的。
II.研究对象
本研究中的受试者被诊断为患有继发年龄相关性黄斑变性(AMD)的活动性脉络膜新血管形成(CNV)，具有最近对抗VEGF治疗起反应的历史，并且需要频繁注射抗VEGF疗法。
仅选择一只眼睛作为研究期间的研究眼睛。如果两只眼睛都满足所有的纳入和排除标准，则选择筛选时具有最差评估的BCVA的眼睛作为研究眼睛。如果两只眼睛都满足所有的纳入和排除标准，并且两只眼睛BCVA值相同，则受试者选择他/她的非主视眼睛进行治疗，或者默认选择右眼作为研究眼睛。
A.纳入标准
符合以下纳入标准的受试者参与该研究：
·男性或女性受试者，年龄≥50岁。
·研究眼睛具有占总病变尺寸≥50％的AMD继发的活动性视网膜中央凹下CNV的先前或当前证据：
ο荧光素血管造影(FA)渗漏，光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)上的流体，或彩色眼底照片上视网膜下出血；以及
ο病变的整个尺寸不超过12个黄斑光凝研究视盘区域。
·受试者处于用于wAMD的活性抗VEGF治疗，在筛选前4个月内最少注射2次。
·筛选就诊时(阿柏西普注射之前)研究眼睛的视力：
οBCVA ETDRS为78-25。
·非研究眼睛的视力：
οBCVA ETDRS为≥35，
·研究者证实了有意义的抗VEGF响应，定义为：
ο中央亚场厚度从初始诊断减少≥30％，如使用SD-OCT评估的；或
ο中央亚场厚度从筛选时减少≥20％，如使用SD-OCT评估的；或
οCST的正常化，且没有可观察到的血管渗出。
为了证实抗VEGF响应的目的，在用AAV2.7m8-阿柏西普给药之前的第1天就诊时，由研究者确认VEGF响应性。确定没有有意义的抗VEGF响应的受试者筛选失败，并且不参与该研究。
B.排除标准
满足以下排除标准的受试者不参与本研究：
中和抗体
·尽管在血清和玻璃体液中的针对AAV的中和抗体(NAb)的水平之间没有确定的相关性(Lukason et al.,(2011)Mol Ther 19(2):260-265)，但是作为预防措施，针对AAV2.7m8载体的NAb筛选受试者。在用AAV2.7m8-阿柏西普给药前6个月内具有文献记载的抗AAV2.7m8中和抗体滴度水平＞1:125的受试者被排除在本研究之外。
CNV病变
·以下CNV病变特征的已知历史或证据：:
ο研究眼睛的中央凹中心的纤维化或萎缩、视网膜上皮撕裂或任何阻止视力改善的病症。
ο瘢痕形成或纤维化占总病变区域的＞50％。
ο病变尺寸＞12个黄斑光凝研究视盘面积(30.5mm2)，包括血液、瘢痕和新血管形成，如通过荧光素血管造影术(FA)评估的。
ο视网膜出血占总病变区域的≥50％，或者在研究眼睛中央中凹下存在尺寸大于≥1个视盘面积(如果血液在视网膜中央凹下，则视网膜中央凹被可见的CNV以270度包围)的血液。
眼部病症(视网膜/后眼)
·在施用AAV2.7m8-阿柏西普时在研究眼睛中的显著视网膜前膜或玻璃体黄斑牵引(VMT)综合征或在研究眼睛中的全厚度黄斑孔病史(Gass 2期及以上)。
·研究眼睛中非wAMD的视网膜疾病的历史，包括糖尿病性视网膜病(在任一只眼睛中)、视网膜静脉阻塞、葡萄膜炎、疑似视网膜血管瘤增生、息肉状脉络膜病变或由于其他原因(例如眼组织胞浆菌病、创伤或病理性近视)引起的CNV，或眼睛中的任何其他血管疾病(不排除玻璃体或外周视网膜的良性病症)。
·研究眼睛中视网膜脱离(修复或未修复)的历史。
其它病症(非视网膜)
·研究眼睛中的显著非视网膜疾病或介质不透明的已知病史或证据，其可在研究过程中损伤视力，需要手术和/或妨碍视网膜的正确观测或成像(例如，中心角膜瘢痕形成、显著白内障、角膜营养不良、巩膜软化)。
·在给药AAV2.7m8-阿柏西普时研究眼睛中不受控制的高眼压或青光眼(定义为尽管用抗青光眼药物治疗，但眼内压[IOP]＞22mmHg)或在筛选时使用＞2种降IOP药物。
·在给药AAV2.7m8-阿柏西之前4周内任一眼睛的眼部或眼周感染活动或病史。
眼科手术/程序
·在给药AAV2.7m8-阿柏西普的6个月内对研究眼睛的任何先前的眼内或眼周手术，或在给药AAV2.7m8-阿柏西普的6个月内任何计划的重大手术操作。在给药AAV2.7m8-阿柏西普之前的＞1个月的眼睑手术不是排除标准。n.
·研究眼睛中玻璃体切除术、小梁切除术或其它过滤性手术的历史。
·在给药AAV2.7m8-阿柏西普之前3个月内的钇铝石榴石(YAG)后囊切开术。
·用光动力疗法或视网膜激光用于治疗wAMD的任何先前治疗和研究眼睛的区域中的任何先前治疗性辐射。
一般/全身性病症
·除非指定，否则给药6个月内以下心血管疾病中的任一种的历史或证据：
ο严重心脏病(例如，纽约心脏协会[New York Heart Association，NYHA]功能性III或IV类)历史或不稳定型心绞痛的临床证据。
ο急性冠状动脉综合征，心肌梗塞或冠状动脉血管再形成。
ο需要持续性治疗的室性快速性心律失常，或不受控制的心律失常。
ο尽管在给药之前的筛选期内使用降BP–药物，但仍不受控制的高血压，定义为平均收缩压(SBP)≥160mmHg或平均舒张压(DBP)≥100mmHg。
ο脑血管意外或短暂性局部缺血发作的历史。
·任何持续性出血障碍或国际标准化比值(INR)＞3.0的历史。使用阿司匹林或其它抗凝血剂(例如，因子Xa抑制剂)不是排除标准。在筛选周期期间重复INR以确认满足合格标准。
·在给药AAV2.7m8-阿柏西普之前的筛选周期内，不受控制的糖尿病(HbA1c＞7.0％)的证据。
·在过去5年之内除了以下(如果充分治疗)之外的恶性肿瘤历史：
ο皮肤的局部基底细胞癌或鳞状细胞癌。
ο子宫颈或乳房的原位癌。
ο乳头状、非侵袭性膀胱癌
ο1期和2期的前列腺癌，其观察结果在临床上由持续6个月的稳定的前列腺-特异性抗原(PSA)的指示。
ο完全缓解至少2年或认为外科手术治愈的任何其它癌症。
·阳性HIV、乙型肝炎或丙型肝炎(除非文献记载的治愈方法治疗)。
·在给药AAV2.7m8-阿柏西普之前36小时内，基于临床检查和/或温度＞38.5℃，任何类型的全身性活性侵袭的证据或怀疑都被研究者认为具有临床显著的。
·对以下疾病已知的严重过敏：
ο在血管造影中使用的荧光素染料或荧光素钠(可允许能够治疗的轻度过敏性)；或
ο阿柏西普
·在研究期间怀孕、哺乳或打算怀孕的女性。
·在研究者看来损害受者的安全性的其他显著的实验室异常或医学病症。
药物
·在给药AAV2.7m8-阿柏西普之前5个半衰期内使用全身性抗炎类固醇或免疫抑制剂药物(除了方案规定的泼尼松之外)。允许吸入或局部用类固醇和非类固醇抗炎药(NSAID)。
·接受以下中的任一个：
ο在给药AAV2.7m8-阿柏西普之前的30天内或5个半衰期(以较长的为准)内的研究用药品。
ο先前基因疗法。
III.研究用药品
研究用药品(IMP)，AAV2.7m8-阿柏西普，是一种重组的复制缺陷型腺相关病毒(rAAV)载体，其含有由AAV2衣壳上的体内定向进化演化而衍生的AAV2.7m8蛋白衣壳(Dalkara et al.,(2013)Sci Transl Med 5(189):189ra76；US2014/0364338)。AAV2.7m8-阿柏西普携带在遍在嵌合启动子控制下的阿柏西普cDNA的密码子-最优化版本的表达盒(图1A)(参见WO2018170473A1)。在Sf9细胞中使用杆状病毒表达载体系统制备AAV2.7m8-阿柏西普，其中使用两种不同的杆状病毒，一种编码AAV2 Rep和AAV2.7m8 Cap蛋白的基因，另一种编码人阿柏西普cDNA表达盒。
AAV2.7m8-阿柏西普以无菌过滤、冷冻悬浮液形式提供在含有0.25mL IMP的无菌即用型0.5mL Crystal Zenith小瓶中，如表1所示配制。
表1:用于群组1的AAV2.7m8-阿柏西普研究药品的制剂。
Figure BDA0003539340930001471
IV.研究设计
A.剂量和施用方法
群组1
以100μL的注射体积，以6×1011 vg/眼睛的剂量向群组1中的受试者施用单一IVT注射的AAV2.7m8-阿柏西普。
将AAV2.7m8-阿柏西普小瓶从≤60℃的冷冻储存器中取出并在室温下解冻。经由IVT注射施用AAV2.7m8-阿柏西普。使用聚维酮碘的无菌技术，以及局部或结膜下麻醉。基于机构标准护理给出注射后护理和药物方案。
B.研究就诊
筛选(第-15天至-7天)
如图1B所示，根据标准护理，受试者在第-15至-7天(例如第-14至-7天)的筛选期间，接受2mg阿柏西普的单一IVT注射。受试者接受常规机构标准注射后护理。
研究第1天
在研究第1天(在IVT注射阿柏西普之后7至15天，例如7至14天)，在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前，研究对象经历SD-OCT研究以证实它们对抗VEGF疗法有响应。由研究者确认抗VEGF响应性。如上所述(参见纳入标准)，只有确认具有有意义的抗VEGF响应的受试者有资格入选本研究。
对抗VEGF疗法起反应的受试者依次入选研究组，并在研究眼睛中接受单次AAV2.7m8-阿柏西普IVT注射。如上所述，在研究期间仅选择一只眼睛作为研究眼睛。
AAV2.7m8-阿柏西普后施用
受试者在第3和8天，在第2、4、6和8周期间，以及此后每4周(即第12、16、20和24周)返回，进行临床评价和治疗(如果需要)。在第24周进行群组1的安全性和功效分析。
从第4周开始，如果根据再治疗标准有疾病活性增加的证据(参见下文)，则受试者有资格接受阿柏西普2mg IVT的救援注射。以下中的任一个的存在可确保恢复2mg IVT阿柏西普进行的标准抗VEGF治疗：
·通过SD-OCT观察到的来自基线和视网膜内或视网膜下流体的BCVA(使用ETDRS方案)损失≥10个字母并且由研究者判断为BCVA损失的原因。
·中央亚视场厚度从基线的增加＞75μm，如通过SD-OCT评估的。
·存在黄斑变性引起的威胁视力的出血。
在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后第52周再次评价受试者的安全性和功效。随访期持续至施用AAV2.7m8-阿柏西普之后第104周。
C.皮质类固醇方案
为了降低注射后眼部炎症的可能风险，向受试者施用预防性皮质类固醇方案(例如，泼尼松)，并且密切监测载体的眼部和全身耐受性。
向群组1中的受试者施用预防性13天口服皮质类固醇方案，从60mg/天的泼尼松开始，从AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前3天(第-3天)至该治疗之后3天，持续共6天。随后，使用7天逐渐减少的泼尼松。口服泼尼松方案的概述提供在表2中。
表2：口服泼尼松方案
研究天数 总天数 每天的泼尼松剂量
第-3至+3天 6 60mg
第4-6天 3 40mg
第7-8天 2 20mg
第9-10天 2 10mg
第11天 0 停止
设计在AAV2.7m8-阿柏西普IVT注射之前开始免疫抑制(即，泼尼松)，以限制暴露于衣壳抗原时的免疫响应。受试者根据13天方案自行施用泼尼松。
在研究的第2-24周期间，受试者根据需要接受局部或口服皮质类固醇(泼尼松)。
D.禁止药物和治疗
在研究期间，禁止以下药物：
·任何全身性抗VEGF试剂，包括贝伐单抗。
·根据该研究中的救援抗-VEGF注射标准，除了研究药物或阿柏西普注射剂2mg之外研究眼睛中的任何抗-VEGF试剂。
·研究眼睛中的IVT类固醇。
·免疫抑制药物。允许全身性、吸入或局部类固醇和NSAID。
·使用及参与任何其它研究性研究。
·如果临床指示且计划在IVT施用之后＞90天和/或在最后一次注射阿柏西普之后＞7天进行，则可以进行在研究眼睛中的白内障手术。
·在非研究眼睛中发展AMD的受试者可以接受在非研究眼睛中的标准护理疗法。
E.用于群组1的研究设计的概述
六名受试者入选到群组1中。
以6×1011vg/眼睛的剂量向群组1中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。在向群组内随后5名受试者(受试者2-6)给药之前，入选群组1中的第一名(哨兵)受试者接受AAV2.7m8-阿柏西普的IVT注射，并且评价29天。
用于群组1的研究设计的概述提供在表3中。
表3：用于群组1的研究设计的概述
群组 AAV2.7m8-阿柏西普的剂量 皮质类固醇方案
群组1 6×10<sup>11</sup> vg/眼睛 预防性口服泼尼松方案
F.研究持续时间
对于每名受试者，受试者参与研究的持续时间108周。这包括4周的筛选期和另外的104周研究期。
在研究完成或中止时，如果适合，向受试者提供参与长期随访研究的机会以进一步评估该基因疗法的安全性。
V.研究评估
A.一般身体检查和生命体征
收集并记录每个受试者的相关病史和眼科史。一般的身体检查包括身高(仅在筛选时)、体重和生命体征。
生命体征由血压、脉搏率测量结果、体温和呼吸率组成。获得每个受试者的12导联心电图(ECG)。进行以下临床实验室和抗体测试：化学、全血计数(CBC)、凝血研究、尿分析、HIV或肝炎的血清学证据、及妊娠测试。
在第104周、研究结束(EOS)和/或早期中止随访时，身体检查评估自从筛查检查开始受试者的身体条件是否发生变化。
B.免疫响应和阿柏西普表达
测量总的抗AAV2.7m8抗体。使用通过割点评估的基于报道基因的转导干扰分析来测定受试者血清中的中和抗-AAV2.7m8抗体。
使用基于ELISA的割点抗体分析，测量血清中针对抗阿柏西普抗体的体液免疫响应。
收集血清，以测定阿柏西普蛋白的存在。
使用ELISPOT分析测量针对AAV2.7m8衣壳蛋白和阿柏西普蛋白的细胞免疫。
C.全面眼科检查和其它评估方法
研究评估包括眼科检查、眼内压(IOP)和间接检眼镜检查。
眼科检查由眼睛和附件的外部检查、眼睑/瞳孔反应性的常规筛查(包括，但不限于眼睑下垂、异常瞳孔形状、瞳孔不相等、对光的反应异常和传入瞳孔缺陷)和裂隙灯检查(眼睑、结膜、角膜、晶状体、虹膜、前房)组成。裂隙灯检查是检查前眼结构，并且用于对任何发现进行分级。如果在任一次就诊时，在裂隙灯检查期间注意到任何发现，则由研究者对严重程度分级，并且将发现描述为临床显著或临床上不显著。
使用Goldmann压平眼压计或Tono-penTM进行IOP的测量。在任何IVT注射之前以及在眼睛散瞳之前，进行IOP测量。第1天就诊需要注射前和注射后(在注射之后30分钟)IOP测量。
散瞳间接检眼镜检查法检查包括评估玻璃体、视神经、外周视网膜和视网膜血管的后段异常。如果在检眼底检查法期间注意到任何发现，则在任何就诊时，由研究者对严重程度分级，并且将发现描述为临床显著的或非临床显著的。第1天的就诊需要注射前和注射后间接检眼镜检查法评估。
光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)
使用SD-OCT，通过干涉条纹图案的光谱分析获得以反向散射光的量度和延迟编码的深度解析组织结构信息。
荧光素血管造影术
使用荧光素血管造影术确认研究入选的患者合格性，用于评估CNV病变生长的功效，以及用于评价与基线相比的渗漏。
数码彩色眼底摄影
获取视网膜、视神经盘和黄斑的彩色眼底图像。
光学相干断层扫描血管造影(OCT-A)
使用OCT-A成像(扫频光源或光谱域)获得视网膜和脉络膜的体积、三维图以及关于血流的信息。
屈光和视力
在研究点，由培训且认证的视力检查员测量屈光和BCVA。在眼睛散瞳之前，在4米的起始距离处测量视力。
D.安全评估
为了减少与IVT施用AAV2.7m8-阿柏西普相关的风险，在IVT AAV2.7m8-阿柏西普施用当天和之后的后处理密切监测受试者。
通过收集AE、生命体征、身体和眼睛检查、ECG、妊娠测试和实验室评价来评估AAV2.7m8-阿柏西普的安全性。
在研究的前8周进行受试者的密切监测，随后进行安全性常规安全性评估，此后进行功效评估。所有受试者在每次研究就诊时通过早期治疗糖尿病性视网膜病研究(ETDRS)字母评估测试其视力，并使用标准护理阿柏西普IVT注射作为救援治疗。
根据以下量表对AE的严重程度或强度进行评级：
·轻度：AE是值得注意的，但不会显著地妨碍受试者的日常活动。
·中度：AE降低或妨碍正常的日常活动，但不使人丧失能力。
·重度：AE使人丧失能力并导致不能进行正常的日常活动。
经施用研究治疗后104周评估安全性。在研究结束(EOS)就诊完成时，提议受试者参与长期扩展研究以进一步评估转基因表达的安全性和持久性。
E.功效评估
通过以下测量方法评价AAV2.7m8-阿柏西普在治疗wAMD中的功效。关键的评估时间点是在24周。BCVA和SD-OCT的基线值是指在阿柏西普注射前，在第-15至-7天(例如第-14至-7天)筛选就诊期间获得的值。使用基线值进行比较分析。
主要通过表示为ETDRS评分(正确读取的字母数)的BCVA评估视力(Vitale etal.,(2016)JAMA Ophtalmol 134(9):1041-1047)。如果与基线相比，受试者在ETDRS评分中损失少于15个字母，则分类为视力维持。计算的终点包括从基线的平均变化、与基线相比增加至少15个字母的百分比、以及与基线相比损失15个或更多个字母的百分比。
使用标准技术进行FA以评估CNV病变，从而评价与基线相比的渗漏。
使用经认可的设备和标准技术进行SD-OCT，以评价与基线值相比的视网膜厚度(例如，中心视网膜厚度或中央亚视场厚度)、黄斑体积和流体(例如，视网膜下流体和视网膜内流体)的存在。
测定从第4周至第104周，随时间推移每个受试者在AAV2.7m8-阿柏西普治疗后给予的阿柏西普注射次数。此外，测定在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗后进行第一次阿柏西普注射的时间和不需要阿柏西普救援治疗的受试者的比例。
测定从第4周至第104周，随时间推移不具有IRF的受试者的比例。
测定从第4周至第104周，随时间推移不具有SRF的受试者的比例。
测定在基线具有PED的受试者中，从第4周至第104周随时间推移不具有PED的受试者的比例。
F.统计学
安全性群体包括接受AAV2.7m8-阿柏西普并根据接受的剂量分析的所有受试者。
按照群组概述所有其它安全性参数。使用监管活动医学词典(MedicalDictionary for Regulatory Activities，MedDRA，第21版)分类编码AE，得到每个事件的优选术语(PT)和系统器官类别(SOC)。分别列出导致研究退出的SAE和AE。
功效分析包括所有受试者。评价功效分析终点，并且将按照群组计算描述统计学。关键评估时间点是在24周。根据接受的剂量和总体剂量评估功效。
VI.结果
A.受试者特征
所有入选到群组1中的六名受试者均诊断患有wAMD。在入选时，受试者具有对抗VEGF治疗的高需求(例如，需要频繁的抗VEGF治疗)、约20/50的功能性视力、一些过量的中央亚视场厚度(通过OCT)，并且正在接受抗VEGF治疗的常规IVT注射并对治疗起响应。所有受试者的疾病特征和治疗历史提供在表4-5中。
如表4所示，在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前约一年(受试者5)至约十年或更长时间(受试者4)之间，群组1中的受试者被诊断患有wAMD。研究对象在研究眼睛中接受广泛范围的先前抗VEGF IVT注射，从7次(对象5)到109次(对象4)先前注射。计算的在本研究之前的平均抗VEGF IVT注射间隔范围为每4周至每10周。在筛选入选本研究中之前的四个月内，所有受试者接受2或3次抗VEGF注射。在开始研究前，在筛选抗VEGF注射之后7天(受试者1-3)或14天(受试者4-6)，向受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普。
表4：群组1中受试者的基线特征
Figure BDA0003539340930001541
表5：群组1中研究对象的疾病特征和治疗历史
Figure BDA0003539340930001542
Figure BDA0003539340930001551
B.安全性
在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后的24周期间，没有发生SAE，也没有任何满足剂量限制性毒性(DLT)标准的AE。没有观察到药物相关的非眼睛AE。在所有受试者中观察到眼部炎症，并且可用局部类固醇控制。此外，没有观察到血管炎、视网膜炎或脉络膜炎。观察到十九只眼睛AE，认为其可能与AAV2.7m8-阿柏西普潜在相关，14个是轻度的，5个是中度的(2个AE是中间葡萄膜炎，1个AE是玻璃体细胞，2个AE是前房细胞)。一名患者具有两个前房细胞事件(一个轻度事件和一个中度事件)。在早期随访期间，经常观察到对局部皮质类固醇或口服皮质类固醇有响应的轻度至中度眼内炎症。OCT图像显示在大多数受试者中持久性液体的消退，没有恶化的迹象。视力通常是稳定的。直至第24周与AAV2.7m8-阿柏西普相关的所有安全性事件的概述提供在表6中。
表6：所有与AAV2.7m8-阿柏西普相关的安全性事件
Figure BDA0003539340930001561
所有受试者从第-3天开始接受60mg的口服泼尼松以6天，随后是泼尼松的7天递减过程。眼细胞炎症的临床评估显示在AAV2.7m8-阿柏西普后的早期没有发生临床上显著的炎症。此外，如图6所示，当受试者接受类固醇滴眼剂时，没有观察到恶化或新的炎症。到第24周，前房细胞炎症消退或改善。观察到的细胞炎症通常是轻度的。图6中显示的房水细胞计数类别是基于葡萄膜炎命名标准(SUN)准则(Jabs,DA et al.,J Ophthalmol.2005；140:509–516)，而玻璃体细胞计数类别是基于国家卫生研究所(NIH)指南。
总体而言，安全性评估表明AAV2.7m8-阿柏西普耐受良好，未报道DLT或SAE。所有安全性事件都是轻度至中度的，并且大多数是炎症相关的。对AE的继续随访显示平均视力保持稳定，并且不需要抗VEGF救援注射。因此，结果表明，先前需要频繁抗VEGF注射的wAMD患者中以6×1011 vg/眼睛的剂量作为单一IVT注射施用的AAV2.7m8-阿柏西普具有可接受的安全性特征。
C.功效
在AAV2.7m8-阿柏西普施用之后，基于OCT评估，所有六名受试者都显示疾病活性的稳定化。如图2A-2L所示，在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前和之后采集的OCT图像表明，强解剖学响应在群组1中的所有六名受试者中都是明显的。例如，在受试者1(例如，比较图2A和2B)、受试者2(例如，比较图2C和2D)、受试者3(例如，比较图2E和2F)、受试者4(例如，比较图2G和2H)和受试者5(例如，比较图2I和2J)中，视网膜下流体用标准护理抗VEGF治疗仍持续存在，但是在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后消退且保持消退。受试者6表现出与息肉状脉络膜血管病变(PCV)一致的视网膜形态(图2K)，并且尽管在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗后仍持续存在一些流体，但没有疾病进展的迹象(图2L)。此外，如图3所示，没有一名受试者显示中央亚视场厚度(CST)增加，并且观察到平均降低-52.7μm(90％CI-86.5，-18.8)。CST的增加指示wAMD的疾病进展。重要的是，没有一名受试者被施用或需要任何标准护理阿柏西普救援注射(“救援注射”)。
在整个研究中，基于ETDRS字母评估测量所有受试者中的最佳矫正视力(BCVA)。如图4所示，群组1中的所有受试者都是稳定的，其中平均减少-2个字母(90％CI-9.1，5.1)。
在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后34周的中值随访时间，OCT成像中没有受试者显示疾病再活化的迹象(图7A-7B)。此外，在至多44周的随访期期间的任何时间点，没有受试者需要任何救援抗VEGF IVT注射，并且没有受试者符合再治疗标准。最后，在超过24周的额外随访期期间，BCVA得以保持(即，没有患者损失或增加超过10个ETDRS字母)，在第24周观察到的解剖学改善(即，视网膜下和视网膜内流体的消退，以及CST的降低)得以维持，并且没有出现安全性问题。
将在34周的中值随访时间评价的安全性和功效结果的概述提供在表7中。将在44周的中值随访时间评价的功效结果的概述提供在表8中。一名患者经历了与研究治疗无关的黄斑脱离视网膜脱离。对于该患者，使用在脱离之前的最后观察计算表8中显示的CST和BCVA平均值和范围。
表7：在34周的中值随访时间的安全性和功效结果的概述
值
中值随访，周 34.0
随访(最小，最大)，周 28,44
3级不良事件，n 0
严重不良事件，n 0
剂量-限制性毒性，n 0
从基线的平均BCVA变化，ETDRS字母 -1.5
从基线的BCVA变化(最小，最大)，ETDRS字母 -9,+5
救援注射的总数，n 0
表8:在44周的中值随访时间的功效结果的概述
值
从基线的平均BCVA变化，ETDRS字母 –1.8
从基线的BCVA变化(最小，最大)，ETDRS字母 –7,+7
从基线的平均CST变化μm –18.5
从基线的CST变化(最小，最大),μm –75,+32
救援注射的总数，n 0
将在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后，在44周(范围40-52周)的中值随访时间的功效结果的补充分析概述提供在表9中。
表9：在40-52周的随访时间(中值44周)的功效结果的概述
Figure BDA0003539340930001581
Figure BDA0003539340930001591
分析细胞炎症事件和给予每个受试者的类固醇治疗，直至52周的随访时间。如图8所示，除了第3天之外，受试者1和5不具有细胞反应。在研究的第二个6个月，两个受试者开始局部类固醇治疗用于房水细胞(AC)光斑和后粘连。两个受试者都接受局部类固醇和散瞳滴眼剂，受试者1已经停止接受局部类固醇滴眼剂。受试者2和6显示早期发作的炎症直到施用AAV2.7m8-阿柏西普之后的第一个月，伴有AC响应和一些玻璃体细胞溢出。在用局部类固醇治疗之后，两个受试者的炎症消退。两个受试者继续每天两次滴眼剂滴眼(BID)。在局部类固醇停止之后(直到施用AAV2.7m8-阿柏西普之后2-3个月)，受试者3和4经历更延迟的细胞炎症发作。这些受试者的炎症对局部类固醇有响应。受试者3已经停止接受局部类固醇滴眼剂。受试者4经历不相关的视网膜脱离，并且正在接受BID滴眼剂。
总之，炎症是低等级的，没有报道早期临床显著的炎症。所有炎症都对局部类固醇有反应，且具有随时间推移消退的趋势。炎症主要由房水细胞过程驱动。
图9A-9B显示了受试者1-6在随访40-52周的OCT成像。OCT成像上没有受试者显示疾病再活化的迹象，并且BCVA和解剖学改善得到维持。此外，没有受试者需要任何救援抗VEGF IVT注射或符合再治疗标准。
D.结论
用于wAMD的当前标准护理疗法是抗-VEGF IVT注射，其通常需要长期进行，约每4-8周。对于患者、护理者和健康护理系统，采用该方案的顺应性很困难，导致次优给药和由于治疗不足而导致的视力丧失。
本实施例中呈现的结果显示AAV2.7m8-阿柏西普提供改善视网膜解剖学和稳定视力的明显益处，同时显示可接受的安全性特征。特别地，患者在研究期间保持视力，并且AAV2.7m8-阿柏西普显示是安全的和良好耐受的，其中观察到的炎症通常是轻度的并且对类固醇滴眼剂有响应。
注意到本研究的群组1中的受试者先前需要频繁的抗VEGF注射(表4)以减缓或预防其疾病的进展，然而，在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后，在本研究期间不需要抗VEGF救援注射。
注意到在经历标准护理抗VEGF治疗的受试者的OCT扫描中存在视网膜下流体超过20周，并且在筛选阿柏西普IVT注射之后持续1-2周。即使受试者已经接受反复治疗，但该流体仍然存在，并且因此对抗-VEGF蛋白的标准护理IVT推注是难治性的。出乎意料地，这种难治性SRF在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后消退，这是临床前研究无法预测的结果。
以6×1011 vg/眼睛的剂量给予AAV2.7m8-阿柏西普观察到的安全性和功效引起该1期研究的继续，以评价以较低剂量和与局部皮质类固醇一起给予AAV2.7m8-阿柏西普的安全性和功效，如实施例2中描述的。
实施例2：在新血管(湿性)年龄相关性黄斑变性中在低于6×1011 vg/眼睛的剂量和与局部皮质类固醇一起使用的AAV2.7m8-阿柏西普的开放标记1期研究
下列实施例描述了实施例1中描述的1期研究的继续，以评价以低于6×1011 vg/眼的剂量和与局部皮质类固醇一起施用的AAV2.7m8-阿柏西普在患有wAMD的受试者中的安全性和功效。
I.研究目的和终点
主要目的、次要目的以及主要和次要终点如实施例1的第I部分中描述的。
II.研究对象
本研究的研究对象如实施例1的第II部分中描述的。III. 研究用药品
研究用药品是AAV2.7m8-阿柏西普，如实施例1的第III部分中详细描述的和如图1A中描绘的，不同在于改变AAV2.7m8-阿柏西普的浓度以便保持合适的注射体积，如下表10中描述的。
表10：用于群组2-4的AAV2.7m8-阿柏西普研究用药品的制剂
AAV2.7m8-阿柏西普的浓度 注射体积
群组2 6×10<sup>12</sup> vg/mL 30μL
群组3 6×10<sup>12</sup> vg/mL 30μL
群组4a 6×10<sup>12</sup> vg/mL 100μL
群组4b 6×10<sup>11</sup> vg/mL 100μL
IV.研究设计
A.剂量和施用方法
如实施例1的第IV部分中描述的施用如下所述剂量的AAV2.7m8-阿柏西普。
研究群组2-4
群组2：六名诊断患有wAMD的受试者入选群组2。在预防性口服泼尼松方案下，以2×1011 vg/眼睛的剂量2向群组2中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。
群组3：九名诊断患有wAMD的受试者入选群组3。在预防性局部皮质类固醇方案下，以2×1011 vg/眼睛的剂量2向群组3中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。
群组4：九名诊断患有wAMD的受试者入选群组4。如果群组2和3中的大多数受试者中观察到需要救援疗法的脉络膜新血管渗出的迹象，则在局部皮质类固醇方案，以6×1010vg/眼睛的剂量3向群组4的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射(群组4b)。如果群组2和3中的大多数受试者中没有观察到需要救援疗法的脉络膜新血管渗出的迹象，则在局部皮质类固醇方案下，以6×1011 vg/眼睛的剂量1向群组4的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射(群组4a)。
B.研究就诊
研究就诊是如实施例1的第IV部分和图1B中描述的。
C.皮质类固醇方案
向群组2中的受试者施用如实施例1中对于群组1详细描述的预防性13天口服皮质类固醇方案：
群组2：在预防性13天口服皮质类固醇方案下，以2×1011 vg/眼睛的剂量2向群组2中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射，在AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前3天和之后3天开始60mg泼尼松，共6天。随后是7天泼尼松逐渐减少。用于群组2的口服泼尼松方案的概述提供在实施例1的表2中。
如下所述，向群组3和4中的受试者施用逐渐减少的局部皮质类固醇(二氟泼尼酯0.05％滴剂)的预防性方案：
群组3：在预防性局部4周逐渐减少的皮质类固醇方案下，以2×1011 vg/眼睛的剂量2向群组3中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。
群组4：在可以由治疗医师决定延长的预防性局部4周逐渐减少的皮质类固醇方案下，以6×1010 vg/眼睛的剂量3向群组4中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。在可以由治疗医师决定延长的预防性局部4周逐渐减少的二氟泼尼酯方案下，以6×1011vg/眼睛的剂量3向群组4中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。
局部二氟泼尼酯方案的概述提供在下表11A中。
表11A:局部二氟泼尼酯方案的概述
Figure BDA0003539340930001621
也可向群组3和4中的受试者施用6周预防性皮质类固醇方案，其可由治疗医师决定延长。6周预防性皮质类固醇方案的概述提供在表11B中。
表11B.6周二氟泼尼酯方案的概述
Figure BDA0003539340930001622
Figure BDA0003539340930001631
设计在暴露于AAV2.7m8-阿柏西普IVT注射之后立即引发引发免疫抑制以限制暴露于衣壳抗原时的免疫响应。在注射AAV2.7m8-阿柏西普的当天(第1天，注射后)开始，受试者在1周内每天4次向治疗的眼睛的结膜囊自行施用一滴二氟泼尼酯0.05％溶液(2.5μg二氟泼尼酯)。随后是第二周每天3次，第三周每天2次，和第四周每天1次。可以由治疗医师决定延长逐渐减少的皮质类固醇方案。
D.禁止药物和治疗
本研究的禁止药物和治疗如实施例1的第IV部分中描述的。
E.用于群组2-4的研究设计的概述
用于群组2-4的研究设计的概述提供在表12中。
表12：用于群组2-4的研究设计的概述
Figure BDA0003539340930001632
F.研究持续时间
受试者参与本研究的持续时间如实施例1的第IV部分中描述的。
V.研究评估
在本研究中进行的评估如实施例1的第V部分中描述的。此外，从房水液和玻璃体液中取样。
房水液样品
在筛选(在阿柏西普注射之前)和第1天(在AAV2.7m8-阿柏西普注射之前)，第12、24、36、52、76、88、104周，以及在任何需要第一次阿柏西普(Eylea)救援治疗的就诊或早期终止时获得房水液样品。分析房水液样品的阿柏西普、VEGF-A和NAb的浓度。
玻璃体液样品
在进行玻璃体切除术的研究期间的任何时间点获得玻璃体液样品。主要分析玻璃体液样品的阿柏西普浓度。分析剩余样品的VEGF-A浓度。
VI.结果
A.受试者特征
记录所有受试者的疾病特征和治疗历史。具体地，记录新血管AMD诊断的日期或年份、研究眼睛中先前抗VEGF注射的次数、计算的先前抗VEGF注射间隔平均值、筛选之前4个月内接受的抗VEGF注射的次数、筛选阿柏西普IVT剂量的日期和AAV2.7m8-阿柏西普注射的日期。
B.安全性
在IVT AAV2.7m8-阿柏西普施用当天和此后的后处理时密切监测受试者。
通过收集AE、生命体征、身体和眼睛检查、ECG、妊娠测试和实验室评价来评估AAV2.7m8-阿柏西普的安全性。
评估所有受试者中AE、SAE和DLT的发生率、严重程度和与治疗的关系。
评估所有受试者的眼内炎症的发生率、严重程度和与治疗的关系。
通过表示为ETDRS评分(正确读取的字母数)的BCVA评估所有受试者的视力(Vitale et al.,(2016)JAMA Ophtalmol 134(9):1041-1047)。
监测所有受试者中抗VEGF救援注射的需要。
测定受试者的血清中预先存在的抗AAV NAb水平与AE、SAE和DLT之间的相关性的存在。
评估类固醇预防(局部或口服)对AE、SAE、DLT和眼内炎症的发生和消退的作用。
用标准护理阿柏西普IVT注射液作为救援治疗。
C.功效评价
评估所有受试者中的疾病稳定性。在实施研究治疗之前和之后，测量视网膜厚度、中央亚视场厚度、流体和其它解剖学特征(例如，通过OCT成像)。
通过以下测量方法评价AAV2.7m8-阿柏西普在治疗wAMD中的功效。关键的评估时间点是在24周。BCVA和SD-OCT的基线值是指在阿柏西普注射前，在第-15至-7天(例如第-14至-7天)筛选就诊期间获得的值。使用基线值进行比较分析。
主要通过表示为ETDRS评分(正确读取的字母数)的BCVA评估视力(Vitale etal.,(2016)JAMA Ophtalmol 134(9):1041-1047)。如果与基线相比，受试者在ETDRS评分中损失少于15个字母，则分类为视力维持。计算的终点包括从基线的平均变化、与基线相比增加至少15个字母的百分比、以及与基线相比损失15个或更多个字母的百分比。
使用标准技术进行FA以评估CNV病变，从而评价与基线相比的渗漏。
使用经认可的设备和标准技术进行SD-OCT，以评价与基线值相比的视网膜厚度(例如，中心视网膜厚度或中央亚视场厚度)、黄斑体积和流体(例如，视网膜下流体和视网膜内流体)的存在。
测定从第4周至第104周，随时间推移每个受试者在AAV2.7m8-阿柏西普治疗后给予的阿柏西普注射次数。此外，测定在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗后进行第一次阿柏西普注射的时间和不需要阿柏西普再治疗的受试者的比例。
测定从第4周至第104周，随时间推移不具有IRF的受试者的比例。
测定从第4周至第104周，随时间推移不具有SRF的受试者的比例。
测定在基线具有PED的受试者中，从第4周至第104周随时间推移不具有PED的受试者的比例。
实施例3：在新血管(湿性)年龄相关性黄斑变性中，在低于6×1011 vg/眼睛的剂量下且与局部皮质类固醇一起使用的AAV2.7m8-阿柏西普的开放标记1期研究的结果
该实施例描述实施例2中描述的1期研究的结果，该研究评估在患有wAMD的受试者中，以低于6×1011 vg/眼睛的剂量和与局部皮质类固醇一起施用AAV2.7m8-阿柏西普的安全性和功效。
结果
群组2
群组2中受试者的基线特征提供在表13中。
表13.群组2中的受试者的基线特征
Figure BDA0003539340930001661
如实施例2中所述，采用预防性13天口服皮质类固醇方案，群组2中的受试者以2×1011 vg/眼睛的剂量2施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射，在AAV2.7m8-阿柏西普治疗之前3天和之后3天开始60mg的泼尼松，共6天。随后是7天泼尼松逐渐减少。用于群组2的口服泼尼松方案的概述提供在实施例1的表2中。
如图10所示，在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后24周，群组2中的受试者的BCVA稳定，其中平均减少-4.8个ETDRS字母。此外，如图11所示，受试者在OCT上显示出改善的中心视网膜厚度，CST平均降低27.8μm。六个受试者中的四个(66％)在24周的随访时间未接受救援抗VEGF注射。
分析了细胞炎症事件和对每个受试者给予的类固醇治疗，直至24周的随访时间。如图12所示，炎症对局部类固醇有响应。受试者4和5没有临床相关的细胞炎症(受试者5在第20周具有＜5个AC细胞)并且不需要类固醇治疗。受试者2和3显示1/2+的房水细胞和玻璃体细胞等级，或在房水中观察到1-5个细胞，且在玻璃体中观察到1-10个细胞，其在短期局部类固醇疗程之后消退。受试者1在停止口服类固醇之后具有早期炎症性响应，其对类固醇滴眼剂快速响应；受试者保持每天四次使用类固醇滴眼剂(QID)。受试者6具有AC细胞响应，其在BID滴剂时恶化且在QID滴剂时消退。房水细胞级级类别是基于葡萄膜炎命名标准(SUN)准侧(Jabs，DA等人，Ophthalmol.2005；140:509-516)。玻璃体细胞级类别是基于国家卫生研究所(NIH)指南。
总之，炎症通常是轻度的。口服类固醇在某些受试者中不能提供足够长的覆盖范围。然而，所有炎症事件都对局部类固醇有响应。
在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后24周的OCT成像显示解剖学改善和视力(BCVA)的维持。如图13A-13B所示，受试者1、2、4和6显示出流体的消退。受试者3接受3次阿柏西普注射，所有这些都是由于视网膜流体的10个BCVA字母的损失引起的。受试者5接受3次救援阿柏西普注射，所有均是由于CST增加75μm引起的。
在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后第24周，六个受试者中的四个没有接受任何抗VEGF救援注射。如图14的游泳道图所示，受试者3和5在24周随访期间各自接受三次抗VEGFIVT注射。
总之，群组2在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后24周的结果显示AAV2.7m8-阿柏西普具有强效。特别地，在不需要救援抗VEGF注射的受试者中，平均BCVA得到维持，并且视网膜解剖学和CST得以改善。此外，AAV2.7m8-阿柏西普是安全的和耐受性良好的，具有对类固醇滴眼剂有响应的低等级炎症。
实施例4：新血管(湿性)年龄相关性黄斑变性中AAV2.7m8-阿柏西普的开放标记1期研究结果的概述
本实施例提供实施例1-3中描述的AAV2.7m8-阿柏西普用于治疗具有脉络膜新血管形成的年龄相关性黄斑变性(AMD)的开放标记1期研究结果的概述。
安全性
群组1直至第44周的中值随访时间和群组2直至第24周的随访时间可获得的结果显示AAV2.7m8-阿柏西普耐受性良好。特别地，没有报道AAV2.7m8-阿柏西普或程序相关的严重不良事件。此外，没有报道AAV2.7m8-阿柏西普相关的全身性不良事件或符合剂量限制性毒性标准的不良事件。AAV2.7m8-阿柏西普相关的不良事件是轻度(71％)或中度(29％)。通常报道轻度炎症，并且对类固醇滴眼液有响应。没有报道血管炎、视网膜炎或脉络膜炎。报道了一个与AAV2.7m8-阿柏西普无关的自发性自发性人工晶状体视网膜脱离的严重不良事件。手术修复视网膜脱离，并且受试者保持随访。
功效
群组1直至第44周的中值随访时间和群组2直至第24周的随访时间可获得的结果显示AAV2.7m8-阿柏西普具有强功效。在群组1中，没有受试者施用抗VEGF救援注射。在群组2中，六个受试者中的四个没有施用抗VEGF救援注射。总之，在群组1和2中12个受试者中的10个(83％)未施用抗VEGF救援注射，平均BCVA得到保持，且平均CST得到改善。
将群组1和2可获得的安全性和功效结果的概述提供在表14中。
表14.群组1和2中受试者的安全性和功效结果的概述。
Figure BDA0003539340930001681
Figure BDA0003539340930001691
实施例5：新血管(湿性)年龄相关性黄斑变性中AAV2.7m8-阿柏西普的开放标记1期研究的其他结果
本实施例描述了实施例1-4中描述的1期研究的群组1、2和3的结果，其评估在患有wAMD的受试者中AAV2.7m8阿柏西普的单一玻璃体内注射的安全性和功效。提供群组1在60周(范围52-64周围)的中值随访时间、群组2在36周(32-40周的范围)的中值随访时间、群组3在至多20周的随访时间的安全性和功效结果。
结果
以6×1011 vg/眼睛的剂量向群组1中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。以2×1011 vg/眼睛的剂量向群组2中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。也向群组1和2中的受试者施用预防性口服泼尼松方案(参见表2)。
采用6周预防性局部皮质类固醇方案，以2×1011 vg/眼睛的剂量向群组3中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射(参见表11B)。局部皮质类固醇方案由以下组成：与施用AAV2.7m8-阿柏西普的同一天(在IVT注射AAV2.7m8-阿柏西普之后施用)开始每天四次施用皮质类固醇滴眼剂(0.05％的二氟泼尼酯[2.5μg])持续3周，随后是3周逐渐减少剂量，其由每天三次皮质类固醇滴眼剂持续一周(TID持续一周)，随后每天两次施用皮质类固醇滴眼剂持续一周(BID持续1周)，随后每天一次施用皮质类固醇滴眼剂持续一周(QD持续1周)组成。
受试者特征
将群组1、2和3中受试者的基线受试者特征提供在表15中。
表15.群组1-3中的受试者的基线特征
Figure BDA0003539340930001701
如表15所示，群组1-3中的受试者以前需要频繁的抗VEGF注射以保持视力。群组1-3中的受试者的基线特征是良好平衡的，具有类似的年龄、类似的的先前抗VEGF注射平均值和类似的用于保持所有群组具有约65个ETDRS字母的相对高基线视力的频繁注射的需要(例如，在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前的那一年中超过9次注射)。根据平均值，群组3中的受试者较年轻，并且自从初始诊断以来具有较少的先前抗VEGF注射，以及较厚的平均基线CST。
安全性结果
如表16所示，在群组1-3中，没有发生AAV2.7m8-阿柏西普或程序相关的严重不良事件(SAE)。此外，没有观察到AAV2.7m8-阿柏西普相关的全身性不良事件(AE)。发生了与研究治疗无关的视网膜脱离SAE，并通过手术修复和消退(先前的白内障摘除和人工晶状体植入是关键的危险因素)。两个受试者具有已小腿的眼内压(IOP)升高的不良事件。一个受试者具有两个轻度IOP升高事件(最高IOP为24mmHg)，两者都用
Figure BDA0003539340930001712
滴眼剂治疗。第二个受试者服用
Figure BDA0003539340930001713
治疗眼高压，并且IOP AE在治疗没有变化的情况下在一个月内自发消退。
群组3(施用类固醇滴眼剂预防)的受试者具有低数量的眼睛不良事件。
表16.群组1、2和3中的不良事件
Figure BDA0003539340930001711
如图15A-15C所示，在群组1-3中常见主要影响前段且对局部类固醇有响应的轻度和低级炎症。没有观察到血管炎、视网膜炎或脉络膜炎的临床或荧光素(后极的荧光素血管造影术)证据。
继续用局部类固醇处理群组1中的三个受试者，但仅1个受试者具有任何炎性细胞的证据。受试者2每天一次使用局部类固醇；受试者4每天两次使用局部类固醇；和受试者6每天一次使用局部类固醇。总之，群组1中没有受试者曾经具有高于2+的炎性细胞计数。此外，群组1中的受试者仅在一个时间点具有2+的炎性细胞计数。
继续用局部类固醇处理群组2中的两个受试者，且具有轻度炎性细胞的证据。受试者1每天一次使用局部类固醇，和受试者6每天一次使用局部类固醇。受试者1和6具有高达3+炎性细胞计数的一些突破性炎症(breakthrough inflammation)，但两个受试者均用局部类固醇治疗快速消退。
向群组3中的受试者施用6周预防性类固醇滴眼方案。这种方案使早期眼睛炎症最小化(图15C)。也继续用局部类固醇处理群组3中的某些受试者。群组3中的受试者3正在每天四次接受局部类固醇。受试者5不再接受局部类固醇，但之前以如下施用局部类固醇：在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后每天四次持续3周，随后每天两次持续一周，随后从第5周开始每天四次持续一周且然后从每天三次持续一周降低至每天两次持续一周，随后降低至每天一次持续一周。群组3的受试者7-9继续进行6周的预防性类固醇滴眼剂方案。除了所描述的预防性类固醇方案之外，受试者6在用AAV2.7m8-阿柏西普治疗后住院治疗慢性阻塞性肺病(COPD)，并开出口服类固醇处方。发现COPD与AAV2.7m8-阿柏西普不相关。
功效
图16A显示对于群组1中的受试者从基线至第52周的平均BCVA(ETDRS字母)。在60周的中值随访时间(范围为52-64周)时，群组1中的受试者具有-2.7个字母的从基线的平均BCVA变化，且100％的受试者(6/6)未接受救援抗-VEGF注射。在第44周和第48周的平均BCVA的显著降低应归于一个受试者经历视网膜脱离的SAE。图16B显示群组1中的受试者从基线至第52周的平均CST(μm)。在60周的中值随访时间(范围52-64周)，群组1中的受试者具有-26.2μm的从基线的平均CST变化。
图17A显示群组2中受试者从基线至第36周的平均BCVA(ETDRS字母)。在36周的中值随访时间(范围32-40周)，群组2中的受试者具有-2.8字母的从基线的平均BCVA变化，且67％的受试者(4/6)没有接受救援抗-VEGF注射。未接受救援抗-VEGF注射的受试者具有+2.3字母的从基线的平均BCVA变化。图17B显示群组2中受试者从基线至第36周的平均CST(μm)。在36周的中值随访时间(范围32-40周)，群组2中的受试者具有-40.8μm的从基线的平均CST变化。另外，未接受救援抗-VEGF注射的受试者具有-30.0μm的从基线的平均CST变化。总之，在群组2中，CST改善保持至第36周。
图18A显示了对于群组3中的五个受试者从基线至第20周的平均BCVA(ETDRS字母)。在20周的随访时间，来自群组3的五个受试者具有+6.8个字母的从基线的平均BCVA变化，并且来自群组3的五个受试者中的80％(4/5)未接受救援抗VEGF注射。未接受救援抗VEGF注射的受试者具有+8.8字母的从基线的平均BCVA变化。总之，群组3中的五个受试者中，BCVA至第20周得到改善(即，群组3中的五个受试者平均改善6.8个字母)。图18B显示群组3中的五个受试者从基线至第20周的平均CST。在20周的随访时间，来自群组3的五个受试者具有-137.8μm的从基线的平均CST变化。此外，未接受救援抗VEGF注射的受试者具有-149.8μm的从基线的平均CST变化。总之，在群组3的五个受试者中，平均CST至第20周得到改善，其中CST显著降低(即，群组3中的五个受试者平均降低137.8μm)。
如图19中的游泳道图所示，在60周(范围52-64周)的中值随访时间，群组1中没有受试者接受救援抗VEGF注射。群组2中的受试者3和5各自接受4次抗VEGF拯救注射(阿柏西普)。群组3中的受试者3接受2次抗VEGF救援注射(阿柏西普)。
受试者案例研究
在基线时，群组1中的受试者4(62岁男性)已经接受109次先前的抗VEGF注射(在AAV2.7m8-阿柏西普施用之前的最后12个月内为次)，并且即使频繁进行抗VEGF注射仍具有持续性视网膜下流体(图20A)。如图20B所示，在受试者4中观察到在筛选IVT阿柏西普注射之后视网膜下流体的一些减少。在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后，视网膜下流体继续消退，并且视网膜至第12周为干燥的。这种作用持续，且没有流体复发的迹象，直到受试者经历在第44周时诊断的涉及黄斑的无关视网膜脱离。由于涉及黄斑，视力降低，并且受试者经历了成功的使用玻璃体切割术和气泡的视网膜脱离修复手术。然而，由于气泡，在第48周OCT成像是不可能的，并且受试者不能阅读视力表上的任何字母。随着气泡溶解，视力改善，并且没有湿性AMD疾病活动或流体复发的迹象。眼底地形图由于视网膜脱离而稍微改变，并且中央凹中心已经人工定位以匹配在第44、52和60周，在图20B中呈现的视网膜厚度图中的术前参考扫描。在第60周，视网膜保持干燥，视力在基线(BCVA)的10个字母内，受试者保持无救援注射。
在基线时，群组3中的受试者5(82岁男性)已经接受19次先前的抗VEGF注射(在AAV2.7m8-阿柏西普施用之前的最后12个月内9次)，并且即使频繁进行抗VEGF注射仍具有持续性视网膜下流体(图21A)。如图21B所示，受试者5对筛选抗VEGF注射显示出响应性，然而，视网膜下流体在2周内恢复。因此，受试者5是对抗VEGF治疗有响应但需要频繁注射以保持流体离开的受试者的实例。基于受试者5的历史，该受试者将需要每月(例如，约每4周一次)进行推注抗VEGF注射。然而，在AAV2.7m8-阿柏西普施用之后一周，视网膜下流体没有增加，并且在AAV2.7m8-阿柏西普施用之后第12、16和20周没有观察到液体。这些结果证明，通过单次施用AAV2.7m8-阿柏西普改变了受试者5中疾病的病程。
讨论
本实施例中描述的结果显示AAV2.7m8-阿柏西普在群组1、2和3组中耐受性良好且显示强效。特别地，这些结果显示单次剂量的AAV2.7m8-阿柏西普降低了群组1、2和3中受试者的抗VEGF注射负荷。
群组1中的受试者(以6×1011 vg/眼睛的剂量施用AAV2.7m8-阿柏西普)的结果表明在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后1年和更长时间没有受试者需要抗-VEGF救援注射，因此证实了AAV2.7m8-阿柏西普的功效的长期耐受性。另外，群组2和3中的大部分受试者(以2×1011vg/眼睛的剂量(比群组1低3倍的剂量)施用AAV2.7m8-阿柏西普)也保持无抗VEGF救援注射。
总之，在群组1-3中施用AAV2.7m8-阿柏西普的17个受试者(包括群组3的随后20周的5个受试者)中，14名(82％)保持无抗VEGF救援注射，保持平均BCVA，并且具有平均CST的改善。
来自群组1-3的结果还显示与AAV2.7m8-阿柏西普相关的所有不良事件是轻度至中度的，并且在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后观察到的眼睛炎症是低等级的并且对类固醇滴眼剂有响应。此外，群组3中的施用6周预防性类固醇滴眼剂方案的受试者显示出最小的炎症，因此证实6周预防性类固醇滴眼剂方案在最小化早期眼部炎症方面是有效的。没有观察到血管炎、视网膜炎或脉络膜炎的事件。
实施例6：患有糖尿病性黄斑水肿的受试者中AAV2.7m8-阿柏西普的2期、多中心、随机、双盲、活性控制研究
本实施例描述了2期、多中心、随机、双盲、活性控制研究，其评价了患有糖尿病性黄斑水肿的受试者中AAV2.7m8-阿柏西普的单一玻璃体内(IVT)注射的耐久性。
I.研究目的和终点
A.主要目的
本研究的主要目的是评估AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射的耐久性。
B.次要目的
该研究的次要目的包括：
·评估AAV2.7m8-阿柏西普的安全性和耐受性。
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对黄斑水肿的作用。
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对最佳矫正视力(BCVA)的作用。
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对糖尿病性视网膜病严重程度量表(BCVA)评分的作用。
·评估对救援阿柏西普(2mg IVT)的需要。
·评估在AAV2.7m8-阿柏西普施用之前的先前给药阿柏西普(2mg IVT)的作用。
·评价AAV2.7m8-阿柏西普对威胁视力的并发症(前段新血管形成、玻璃体出血或牵引性视网膜脱离)的发展的作用。
C.主要终点
本研究的主要终点是研究眼中糖尿病性黄斑水肿(DME)疾病活动恶化的时间，如通过以下任一者的发生所定义：
·与在第1天或第4周记录的两次CST测定结果中较低的相比，由SD-OCT评估的中央亚视场厚度(CST)的增加＞50μm。
·与在第1天或第4周记录的两次BCVA测量结果中较高的相比，由于DME疾病活性恶化引起BCVA的损失＞5个字母。
D.次要终点
本研究的次要终点是基于研究眼睛的测量结果(除非另有说明)，并且包括：
·眼睛和非眼睛不良事件(AE)的发生率和严重程度。
·随时间推移至第48周，CST和黄斑体积从基线的变化。
·随时间推移至第48周，BCVA从基线的变化。
·在研究期间，随时间推移的研究眼睛中救援阿柏西普(2mg IVT)的频率。
·随时间推移至第48周，DRSS评分的2步和3步改善的发生率。
·随时间推移至第48周，DRSS评分的2步和3步恶化的发生率。
·随着时间的推移至第48周，威胁视力的并发症(前段新血管形成、玻璃体出血或任何其它高风险增殖性糖尿病性视网膜病(DR)或牵引性视网膜脱离)的发生。
·随时间推移至第48周，CST<300μm的发生率。
·随时间推移至第第48周，经由身体检查、眼睛检查、成像和实验室评价获得的临床上显著结果的发生率。
·包括随时间推移至第48周的通过身体检查、眼睛检查、成像和实验室评估的临床重要发现。
II.研究人群
A.纳入标准
在研究眼睛中接受至多2次抗VEGF疗法的先前注射的最近诊断患有DME(即，在筛选的6个月之内的DME诊断)的受试者，如果他们满足以下纳入标准，则包括在该研究中：
·年龄≥18岁。
·1型或2型糖尿病。
·由涉及糖尿病性黄斑水肿的中心引起的视力损伤。
·筛选时的视力：
ο研究眼睛：BCVA 78至50个ETDRS字母，包括端值(近似斯内伦等效值20/32至20/100)。
ο非研究眼睛：BCVA 35个ETDRS字母或更多(近似斯内伦等效值为20/200或更好)
·使用Heidelberg
Figure BDA0003539340930001771
在筛选就诊时研究眼睛的CST≥325μm，具有涉及中心的IRF(中心1mm)
·测定的研究眼睛中视力下降主要由DME引起。
·在自从筛选的6个月内初始DME诊断。
·研究眼睛中至多2次抗VEGF的先前注射(0、1或2)。
ο如果已经向研究眼睛施用先前抗-VEGF，则必须具有有意义的CST响应(例如，≥10％降低)且对抗-VEGF没有不良反应(例如，炎症)。
·研究眼中最后一次抗VEGF注射和第1天随机分组之间最小60天间隔。
B.排除标准
·将满足任一个以下标准的受试者从该研究排除：
·在随机分组之前的6个月之内，所记录的抗-AAV2.7m8中和抗体滴度＞1:125。
·先前眼睛基因疗法。
·对血管造影术中使用的阿柏西普、皮质类固醇或荧光素染料或荧光素钠的过敏史(可允许能够治疗的轻度过敏)。
·在给药6个月内以下心血管疾病中的任一种的病史或证据：
ο严重心脏病(例如，纽约心脏协会[New York Heart Association，NYHA]功能性III或IV类)或不稳定型心绞痛的临床证据。
ο急性冠状动脉综合征，心肌梗塞或冠状动脉血管再形成、脑血管意外(CVA)、短暂性缺血发作(TIA)
ο需要持续性治疗的室性快速性心律失常，或不受控制的心律失常。
ο不受控制的高血压，定义为尽管在筛选期内使用降BP药物，但是收缩压(SBP)＞160mmHg或舒张压(DBP)＞100mmHg。如果需要降BP的药物，则受试者在随机分组之前应当连续使用稳定剂量的相同药物30天。
·任何持续性出血疾病的病史。使用阿司匹林或其它抗凝血剂(例如，因子Xa抑制剂)不是排除标准。
·不受控制的糖尿病，定义为HbA1C＞10％；或者在随机分组之前的3个月内糖尿病性酮酸中毒的病史；或者在最近3个月内开始强化胰岛素疗法(泵或多次每天注射)或者在随后3个月内计划这样多。
·需要用全身性类固醇或免疫抑制治疗(例如，甲氨蝶呤、阿达木单抗)的全身性自身免疫性疾病的病史。
·已知会引起黄斑水肿的全身性药物(例如，芬戈莫德(fingolomod)、他莫昔芬、氯喹/羟氯喹)或任何先前的全身性抗-VEGF疗法。
·已知对HIV或活性病毒性肝炎呈阳性(除非在丙型肝炎的治疗之后证实痊愈)；已知的梅毒病史
·已知的重度肾损伤，如估计的CrCl＜30mL/min(通过Cockcroft-Gault计算)所指示的；在研究周期期间需要或预期需要血液透析。
·在随机分组之前的1周之内任何发热性疾病。
另外，将在研究眼睛中满足任一项以下眼睛排除标准的受试者从该研究排除：
·在筛选时高风险增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)，定义为：任何玻璃体或视网膜前出血；在临床检查时，在等效于标准ETDRS7视野的区域之内，在别处的新血管形成>1/2-视盘区域，或者在临床检查时，视盘的新血管形成＞1/3视盘区域。
·研究眼睛中的任何先前聚焦或栅格激光光凝或任何先前全视网膜光凝(PRP)。
·在随机分组之前的60天之内任何抗-VEGF疗法(允许至多2次先前的抗-VEGF注射，但是其不能在先前60天之内进行)。
·前段新血管形成(例如，虹膜新血管形成[NVI]或新生血管性青光眼[NVG])、显著玻璃体出血、维管增生或牵引性视网膜脱离的病史。
·在临床检查或OCT时，认为有助于黄斑水肿或视觉障碍的中央凹的结构异常(例如，致密的硬渗出物、色素异常、中央凹萎缩、玻璃体黄斑牵引或视网膜前膜)的检查证据。
·研究眼睛中除了糖尿病性视网膜病之外的视网膜疾病的病史，包括年龄相关性黄斑变性(在任一眼睛中)、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、病理性近视等。
·除了DME之外的任何当前眼睛疾病或其病史，所述眼睛疾病可以降低视觉改善的可能性，混淆黄斑的评估或在研究期间需要医学或外科手术(例如，显著的白内障、黄斑牵引)，或在后囊下白内障的任何证据。
·在第一天之前的3个月之内白内障摘除或钇铝石榴石(YAG)囊切开术的病史。
·研究眼睛中视网膜脱离(修复或未修复)的病史。
·小梁切除术或青光眼分流或微创青光眼手术(MIGS)的病史。
·玻璃体切除术或其它过滤性手术的病史。
·无晶状体或存在前房眼内晶体。
·在随机分组时，研究眼睛中的不受控制的眼高压或青光眼(定义为尽管用抗青光眼药物治疗，IOP＞22mmHg)或目前使用＞2种类降IOP药物。
·用于任何眼睛病症的眼内或眼周类固醇治疗的任何病史(例如，IVTTriesence、Iluvien或Ozurdex)
·在诗选之前的90天周期内的屈光手术
·先前穿透性角膜移植、内皮角膜成形或眼睛辐射。
·任何先前的玻璃体视网膜手术。
此外，将在研究眼睛或非研究眼睛(即“对侧眼睛”)中满足任一项以下眼睛排除标准中的受试者从该研究排除：
·除了已经消退的轻度预期手术后炎症之外的葡萄膜炎或眼内炎症(轻微等级或更高)的任何病史。
·与局部类固醇施用相关的IOP升高的病史。
·眼睛单纯疱疹病毒(HSV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)或巨细胞病毒(CMV)(包括病毒性葡萄膜炎、视网膜炎或角膜炎)的已知病史。
·外眼感染(包括结膜炎、睑板腺囊肿或显著睑缘炎)的证据。
·眼弓形体病的病史。
III.研究设计
A.研究治疗
这是一项用于评价AAV2.7m8-阿柏西普的单次0.10mL IVT注射的功效、安全性和耐受性的多中心、随机化、双盲、对照、平行组研究。研究AAV2.7m8-阿柏西普的两个剂量。
在筛选的6个月内具有初始诊断DME且接受至多2次抗-VEGF疗法的先前注射的受试者有资格入选。
·将约33名合格的受试者随机分组以接受两个剂量的AAV2.7m8-阿柏西普(6×1011vg/眼睛或2×1011vg/眼睛)之一，或随机分组以接受用先前阿柏西普注射的假眼睛注射。将指定接受AAV2.7m8-阿柏西普的受试者进一步随机分组以接受前述的阿柏西普或假眼睛注射。研究组概述如下：
·组1(n＝6)：受试者接受6×1011vg/眼睛的剂量的AAV2.7m8-阿柏西普及前述阿柏西普给药。
·组2(n＝6)：受试者接受6×1011vg/眼睛的剂量的AAV2.7m8-阿柏西普，不接受前述阿柏西普给药。
·组3(n＝2)：受试者接受2×1011vg/眼睛的剂量的AAV2.7m8-阿柏西普及前述阿柏西普给药。
·组4(n＝2)：受试者接受2×1011vg/眼睛的剂量的AAV4.7m8-阿柏西普，不接受前述阿柏西普给药。
·组5(n＝9)：受试者仅接受阿柏西普(活性对照)
为了保持遮掩治疗分配方案，在第一天分配到不接受前述阿柏西普的组中或者在第8天分配到不接受aav2.7m8-阿柏西普的组中的受试者在相应就诊时接受假眼睛注射。每个受试者仅一只眼睛选择作为研究眼睛。如果两只眼睛都合格，则选择具有BCVA恶化的眼睛作为研究眼睛。
AAV2.7m8-阿柏西普和阿柏西普两者都经由IVT注射施用。如果存在活性炎症，则不进行IVT注射。使用用聚维酮碘的无菌技术和局部或结膜下麻醉。假眼睛注射程序是在相同条件下进行的，但是用没有针的空注射器(使用钝端)压抵眼睛以模拟注射。
该研究中各组的概述提供在表17中。
表17.研究组
Figure BDA0003539340930001811
Figure BDA0003539340930001821
在第1天和第8天指定的IVT注射之后，在第2周、第4周和然后每4周直至第1天之后的第48周(例如，第8周、第12周、第16周等)随访所有受试者。为了保持遮掩，在整个研究期间，受试者和进行评估的人员均不知道治疗分配方案。
在随机分组之后对所有受试者随访48周。
研究设计的概述提供在图29中。
B.预防性局部类固醇方案
从第1天开始，向所有受试者施用二氟泼尼酯(0.05％；例如Durezol)的预防性7周局部皮质类固醇方案。指示受试者每天四次自行施用二氟泼尼酯(QID)持续4周(即，从第1天至第28天)，随后每天三次(TID)持续1周(即，7天)，随后每天两次(BID)持续1周(即，7天)，和最后每天一次(QD)持续1周(即，7天)。在存在活性炎症的情况下，没有开始逐渐减少。如果出现炎症的迹象，则延长该方案。二氟泼尼酯方案的概述提供在表18中。
表18.二氟泼尼酯方案
研究天数 总天数 每天的二氟泼尼酯施用
第1至28天 28 4次
第29至35天 7 3次
第36至42天 7 2次
第43至49天 7 1次
第50天 0 停止-如果没有炎症的迹象
C.救援治疗
从第8周开始，如果满足以下中的任一项，则受试者接受救援阿柏西普(2mg IVT)：
·与在第1天或第4周记录的两个CST测量值中较低的相比，通过SD-OCT评估的CST增加＞50μm。
·与在第1天或第4周记录的两次BCVA测量结果中较高的相比，由于DME疾病活性恶化引起BCVA的损失＞5个字母。
在不具有活性炎症的眼睛中不注射阿柏西普。在救援阿柏西普注射之间需要最少21天。
D.药物和治疗
在研究期间，禁止以下药物：
·任何全身性抗VEGF试剂，包括贝伐单抗。
·已知会引起黄斑水肿的全身性药物(例如，芬戈莫德(fingolomod)、他莫昔芬、氯喹/羟氯喹)。
·在研究眼睛中除了研究药物或阿柏西普IVT2 mg之外的任何抗VEGF试剂。
·研究眼睛中的IVT类固醇(例如，Ozurdex或Illuvien Triesence)
·全身性免疫抑制药物(例如，静脉内类固醇、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环孢素、阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普)。允许吸入或局部类固醇和NSAID。
在研究眼睛中发展高风险PDR的受试者在接受救援阿柏西普之后接受全视网膜光凝(PRP)。
具有视觉上显著的白内障的受试者没有入选研究，但是如果在研究期间发生白内障，则如果临床指示且计划在AAV2.7m8-阿柏西普施用之后＞90天和/或在最后一次注射阿柏西普之后＞7天，则可以在研究眼睛中进行白内障手术。
在对侧(非研究)眼睛中发展DME的受试者可以接受标准护理治疗。
IV.研究评估
A.一般体检和生命体征
在筛选和研究结束(EOS)或早期终止访问时进行一般体检(PE)。其由全身外观、神经、HEENT(头、眼、耳、鼻、喉)、颈、心血管、呼吸道、腹部、四肢、皮肤、体重和身高的身体系统检查组成。在EOS或早期终止就诊时，身体检查评估自从筛查检查以来受试者的身体条件是否发生任何变化。根据需要进行靶向体检以评价AE。
生命体征包括血压、脉搏率、体温和呼吸率。在筛选和EOS或早期终止就诊时对每个受试者进行12导联心电图(ECG)。
B.实验室测试、载体表达和免疫响应
进行以下临床实验室测试，用于研究：化学、全血细胞计数、HbA1C、尿分析和HLA-B27基因分型。
收集受试者的样品(血液和/或房水液)以测量以下各项：
·针对AAV2.7m8的总抗体：在ELISA测定中测量总抗AAV2.7m8抗体的血清。
·针对AAV2.7m8的中和抗体：在基于细胞的测定中测量用于中和抗AAV2.7m8抗体的血清。
·抗阿柏西普抗体：在ELISA测定中测量针对阿柏西普的体液免疫应答的血清。
·阿柏西普蛋白表达：收集血清和房水液样品，用于在MesoScale Discovery测定中测量阿柏西普蛋白的存在。
·细胞介导的免疫应答：在ELISPOT分析中测量针对AAV2.7m8衣壳蛋白和阿柏西普蛋白的细胞免疫。
C.全面眼科检查
研究评估包括眼科检查、眼内压(IOP)和间接检眼镜检查。
眼科检查由眼睛和附件的外部检查、眼睑/瞳孔反应性的常规筛查(包括，但不限于眼睑下垂、异常瞳孔形状、瞳孔不相等、对光的反应异常和传入瞳孔缺陷)和裂隙灯检查(眼睑、结膜、角膜、晶状体、虹膜、前房)组成。裂隙灯检查是检查前眼结构，并且用于对任何发现进行分级。如果在任一次就诊时，在裂隙灯检查期间注意到任何发现，则由研究者对严重程度分级，并且将发现描述为临床显著或临床上不显著。
使用Goldmann压平眼压计或Tono-penTM进行IOP的测量。在整个研究期间对每个受试者使用相同的IOP测量方法。在整个研究期间使用相同的方法，在任何IVT注射之前以及在眼睛散瞳之前，进行IOP测量。第1天和第8天就诊需要注射前和注射后(在注射之后30分钟)IOP测量。
散瞳间接检眼镜检查法检查包括评估玻璃体、视神经、外周视网膜和视网膜血管的后段异常。如果在检眼底检查法期间注意到任何发现，则在任何就诊时，由研究者对严重程度分级，并且将发现描述为临床显著的或非临床显著的。第1天和第8天的就诊需要注射前和注射后间接检眼镜检查法评估。
D.屈光和视力
测量屈光和BCVA。在眼睛散瞳之前，在4米的起始距离处测量视力测量结果。
E.成像
光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)是一种干涉测量技术，其通过干涉条纹图案的光谱分析提供以反向散射光的量度和延迟编码的深度解析组织结构信息。如果受试者在研究随机分组之前的就诊时接受抗VEGF注射，则收集来自那些就诊的OCT并递送至中央读取中心。
光学相干断层扫描血管造影术(OCT-A)是一种提供视网膜和脉络膜的体积、三维图以及关于血流信息的成像技术。存在两种类型的OCT-A，扫频和光谱域。在可用的地方使用扫频源成像。如果扫频源仪器不可用，而光谱域仪器可用，则使用光谱域仪器。
随后用于收集视网膜、视盘和黄斑的超宽视野眼底数字照相图像的标准化程序。此外，虹膜的照片是在散瞳之前拍摄的。
随后是使用染料示踪法检查视网膜循环和血管通透性的标准化程序。这包括将荧光素钠注射到体循环中，之后通过用波长490nm的蓝光照射视网膜之后发射的荧光进行数字照相来获得血管造影照片。
F.实验室、生物标记和其它生物样本
收集房水液样品并对其分析阿柏西普、VEGF-A、中和抗体(NAb)和其它生物标志物的水平。获得玻璃体液样品并对其分析阿柏西普浓度和其它生物标志物。
G.安全性
在研究治疗实施之后，报道了所有临床显著不良事件(AE)。随访每个受试者直到a)在最后一次研究访视之后30天AE报告期结束，或b)任何正在进行的研究治疗相关AE和/或严重AE(SAE)直到消退或稳定。除非判断为比受试者病症所预期的更严重，否则任何与DME相关的临床显著的安全性评估都不报告为AE或SAE。将研究中疾病的进展捕获作为功效结果。
该研究的特别关注的不良事件包括：
·威胁视力的不良事件：如果不良事件满足以下标准中的一个或多个，则将其视为是威胁视力的：
ο引起与先前访视相比，BCVA减少≥30个字母。
ο需要手术或医学介入(即，常规手术、玻璃体切除术)以预防永久性视力损失。
ο引起严重的眼内炎症(即，眼内炎、4+前房细胞/光斑、或4+玻璃体细胞)。
所有上述列出的威胁视力的不良事件都被报告为严重不良事件，列出了该事件的潜在原因(如果已知的话)作为主要事件术语。
H.功效
通过以下测量评估AAV2.7m8阿柏西普在治疗DME中的功效。BCVA和SD-OCT端点的基线值指是当施用阿柏西普IVT或假眼睛注射时，在第1天访视时采集的预处理测量结果。
·BCVA：主要经由表示为ETDRS评分(正确读取字母的数量)评估视力。如果与基线相比，受试者的ETDRS评分损失少于15个字母，则分类为视力维持。所计算的终点包括从基线的平均变化、与基线相比增加至少15个字母的百分比和与基线相同损失15个或更多个字母的百分比。
·中央亚视场厚度：使用经批准的装置和标准技术进行SD-OCT，以评价与基线值相比的厚度和流体。终点包括CST和黄斑体积。
·阿柏西普再治疗：在AAV2.7m8-阿柏西普治疗之后随时间推移得到的阿柏西普注射的发生率和计时。
·对于每个时间点，使用超宽视野彩色眼底照相测定糖尿病性视网膜病严重程度量表(DRSS)，并且与第一天进行比较。
·威胁视力的并发症(前段新血管形成、糖尿病性黄斑水肿、高风险PDR发展、玻璃体出血或牵引性视网膜脱离)，如通过超宽视野成像和临床检查测定的。
I.统计分析
主要分析群体包括在第8天接受研究治疗(AAV2.7m8-阿柏西普IVT或假眼注射)的所有随机受试者。通过治疗组描述性地概述所有安全性和功效变量。提供连续变量的平均值、标准偏差(SD)、中值和范围；并且提供类别变量的频率计数和百分比。平均值和百分比的置信区间以90％和95％水平提供。使用Kaplan-Meier存活分析以导出第一发生DME疾病恶化的中间值。使用用于复发性事件的统计学模型概述在研究期间每个受试者接受的所有救援阿柏西普(2mg IVT)。绘制平均累积注射次数的随时间推移平均累积函数(MCF)曲线。使用用于重复性测量的混合作用模型(MMRM)来探索随时间推移对于BCVA和CST变化的治疗作用。使用用于类别结果的一般混合模型探索随时间推移对于DRSS变化的治疗作用。对于所有受试者随访24周之后进行期中分析(IA)。
实施例7：新血管(湿性)年龄相关性黄斑变性中AAV2.7m8-阿柏西普的开放标记1期研究的其他结果
该实施例描述在实施例1-5中描述的1期研究的群组1、2、3和4的结果，用于评估患有wAMD的受试者中AAV2.7m8-阿柏西普的单一玻璃体内注射的安全性和功效。提供了群组1在72周(范围64-84周)的中值随访时间、群组2在52周(范围52-56周)的中值随访时间、群组3在36周(范围20-40周)的中值随访时间和群组4在4周(范围2-8周)的中值随访时间的安全性和功效结果。
结果
以6×1011 vg/眼睛的剂量向群组1中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。以2×1011 vg/眼睛的剂量向群组2中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。也向群组1和2中的受试者施用预防性口服泼尼松方案(参见表2)。
以2×1011 vg/眼睛的剂量向群组3中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。以6×1011 vg/眼睛的剂量向群组4中的受试者施用AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射。向群组3和4中的受试者施用6-周局部皮质类固醇方案(参见实施例5和表11B)。
受试者特征
群组1-4中的受试者的基线特征是良好平衡的，具有类似的年龄和平均先前的抗VEGF注射，以及类似的需要频繁注射以保持各群组中约65个ETDRS字母的基线视力。群组4中的一些受试者的诊断比其他群组中的受试者更新近，例如在施用AAV2.7m8-阿柏西普之前小于12个月，因此，先前抗-VEGF注射的平均次数较低。总之，群组1-4中的受试者具有良好视力，很难治疗，在频繁抗-VEGF注射治疗下具有一些流体。群组1-4中的受试者的基线受试者特征提供在表19中。
表19.群组1-4中的受试者的基线特征
Figure BDA0003539340930001881
安全性
没有出现死亡、治疗中止或AAV2.7m8-阿柏西普相关非眼睛不良事件。
当观察时，炎症对局部类固醇有响应且受其控制。没有观察到后部炎症的临床或荧光素(后极的荧光素血管造影术)证据。另外，没有出现血管炎、视网膜炎、脉络膜炎、血管闭塞或眼内炎。
所有AAV2.7m8-阿柏西普相关的眼睛不良事件是轻度的(78％)或中度的(22％)。
发生一个特别关注的不良事件(AESI)：复发性中度葡萄膜炎，并且被认为与AAV2.7m8-阿柏西普相关(群组1)。复发性中度葡萄膜炎AESI对类固醇滴眼剂有响应。另外，发生与治疗无关的眼睛严重不良事件(SAE))：视网膜脱离，并且以手术方式修复和消退(群组1)。
两个受试者具有已消退的眼内压(IOP)升高的轻度不良事件。来自群组1的一个受试者具有两个轻度IOP升高事件(最高IOP为24mmHg)，两者都用
Figure BDA0003539340930001892
滴眼剂治疗。第二个受试者服用
Figure BDA0003539340930001893
治疗眼高压，并且IOP不良事件在治疗没有变化的情况下在一个月内自发消退。
总之，AAV2.7m8-阿柏西普是耐受性良好的，并且不存在由AAV2.7m8-阿柏西普引起的全身性不良事件。
该研究的群组1-4中的安全性结果的概述提供在表20中。
表20.群组1-4中的不良事件
Figure BDA0003539340930001891
Figure BDA0003539340930001901
通过MedDRA优先术语报道群组1-4中发生的AAV2.7m8-阿柏西普相关不良事件，提供在表21中。
表21.群组1-4中通过优先术语道的AAV2.7m8-阿柏西普相关AE
Figure BDA0003539340930001902
Figure BDA0003539340930001911
通过MedDRA优先术语报道的≥2个事件的频率发生的眼睛不良事件提供在表22中。
表22.通过优先术语报道的眼睛AE(≥2个事件)
Figure BDA0003539340930001912
通过MedDRA优先术语报道的≥2个事件的频率发生的非眼睛不良事件提供在表23中。
表23.通过优先术语报道的非眼睛AE(≥2个事件)
Figure BDA0003539340930001921
该研究的群组1-4中观察到的眼睛和非眼睛重度、轻度和中度相反事件的概述提供在表24中。
表24.群组1-4中的不良事件
Figure BDA0003539340930001922
Figure BDA0003539340930001931
如图22A-22D所示，当观察时，炎症主要在前段，且对局部类固醇有响应且受其控制。没有观察到后部炎症的证据，并且不存在血管炎的病例。
如图22A所示，群组1中的两个先前使用QD类固醇滴眼剂的受试者(受试者2和6)在中止滴眼剂之后没有活性炎症。受试者2在中止之后发生复发性中度葡萄膜炎，并且重新开始类固醇滴眼剂。炎症得到改善，且受试者恢复逐渐减少类固醇滴眼剂。在数据切割时，受试者4正在接受类固醇滴眼剂BID，并且在视网膜脱离手术之后具有轻微炎症。受试者6没有接受任何类固醇滴眼剂，并且没有炎症。总之，群组1中的受试者的炎症消退，6个受试者中仅2个在数据切割时继续使用类固醇滴眼剂治疗。群组1的结果表表明所有受试者都对局部类固醇有响应，并且在数据切割时倾向于逐渐减少类固醇。
在群组2中，6个受试者中的4个没有炎症，并且6个受试者中的2个在数据切割时接受类固醇滴眼剂(图22B)。受试者3在白内障手术之后约46周接受局部类固醇。在数据切割时，受试者1接受类固醇滴眼剂QD，并且受试者6具有轻度炎症，继续使用类固醇滴眼剂。总之，群组2中的受试者的炎症消退，其中所有受试者都在数据切割时超过52周(1年)里程碑。超过52周(1年)里程碑的所有受试者中正在消退。
在群3中，9个受试者中的6个在数据切割时是无炎症的(图22C)，并且全部都超过20周里程碑。在数据切割时，受试者2、3和4接受类固醇滴眼剂。由于可能与亚临床炎症相关的瞳孔散瞳不良和后粘连，受试者4在第24周开始durezol治疗BID。9个受试者中的3个在数据切割时继续接受类固醇滴眼剂。.
如图22D所示，群组4中的受试者已经显示用类固醇滴眼剂具有最小至零的早期炎症，与群组3观察到的结果一致。受试者1、2和3患有前部炎症，并且在数据切割时继续接受类固醇滴眼剂。.
与向群组1和3施用口服类固醇方案(图22A-22B)相比，向群组3和4施用6周预防性局部类固醇方案显示更少活性炎症的证据(图22C-22D)。
功效
图23A显示群组1中的受试者从基线直至第72周的平均BCVA(ETDRS字母)。在72周(范围64-84周)的中值随访时间，群组1中的受试者具有-3.2个字母的从基线的平均BCVA变化，并且100％的受试者(6/6)没有接受救援抗-VEGF注射。在第44和48周的平均BCVA的显著降低是由于一个受试者经历视网膜脱离的SAE引起的。总之，群组1中的受试者的BCVA评分保持稳定直至第72周。图23B显示群组1中的受试者从基线直至第72周的平均CST(μm)。在72周的中值随访时间(范围64-84周)，群组1中的受试者具有-21.0μm的从基线的平均CST变化。总之，群组1中的CST测量显示所有受试者的解剖结构都保持直至第72周。在图23B中，在第68和72周观察到的误差线的下降和变化是由于排除了1个一直具有非常厚视网膜的受试者。
图24A显示群组2中受试者从基线直至第52周的平均BCVA(ETDRS字母)。在52周的中值随访时间(范围52-56周)，群组2中的受试者具有-2.0个字母的从基线的平均BCVA变化，且50％的受试者(3/6)没有接受救援抗-VEGF注射。未接受救援抗-VEGF注射的受试者具有+0个字母的从基线的平均BCVA变化。总之，群组2中的受试者的BCVA评分保持稳定超过52周。图24B显示群组2中受试者从基线直至第52周的平均CST(μm)。在52周的中值随访时间(范围52-56周)，群组2中的受试者具有-24.8μm的从基线的平均CST变化。另外，未接受救援抗-VEGF注射的受试者具有-8.3μm的从基线的平均CST变化。总之，群组2中的受试者的CST测定结果表明解剖学保持超过52周。.
图25A显示群组3中受试者从基线直至第20周的平均BCVA(ETDRS字母)。在36周的中值随访时间(范围20-40周)，群组3中的受试者具有+4.0个字母的从基线的平均BCVA变化，且来自群组3的78％(7/9)的受试者没有接受救援抗-VEGF注射。未接受救援抗-VEGF注射的受试者具有+6.4个字母的从基线的平均BCVA变化。总之，群组3中的受试者的BCVA评分得到改善。图25B显示群组3中的受试者从基线直至第20周的平均CST(μm)。在36周的中值随访时间(范围20-40周)，群组3中的受试者具有-118.6μm的自基线的平均CST变化。此外，未接受救援抗VEGF注射的受试者具有-152.7μm的从基线平均CST变化。总之，群组3中的所有9名受试者中平均CST得到持续改善。
如图26中的泳道图所示，在72周(范围64-84周)的中值随访时间，群组1中没有受试者接受救援抗VEGF注射。在群组2(52周的中值随访时间；范围52-56周)，受试者2接受一次抗-VEGF救援注射(阿柏西普)，并且受试者3和5个字接受六次抗-VEGF救援注射(阿柏西普)。在群组3(36周的中值随访时间；范围20-40周)，受试者2接受一次抗VEGF拯救注射(阿柏西普)，受试者3接受四次抗VEGF拯救注射(阿柏西普)。总之，群组2-3中15个受试者中的10个保持无救援注射。总之，即使在某些群组中进行救援注射，抗VEGF注射负荷也有显著降低。
在群组1-3的受试者中观察到年化抗VEGF注射率的实质性降低(图27A-27B)。特别地，群组1中没有受试者接受任何救援抗VEGF注射(100％降低)，并且群组2和3中的受试者的组合的年均抗-VEGF注射的率降低87％(图27A)。
案例研究
在基线时，群组3中的受试者5(82岁男性，右眼患有wAMD)先前接受19次抗VEGF注射(在AAV2.7m8-阿柏西普施用之前的最近12个月9次)。即使每5周频繁注射抗VEGF，受试者5仍具有持续性视网膜下流体(图28A)。图28A中的厚度图中心的白色区域反映了非常厚的黄斑。
如图28B所示，受试者5在计划的AAV2.7m8-阿柏西普注射之前2周接受筛查阿柏西普注射。受试者5对筛查阿柏西普注射显示良好的响应，具有IRF的消退和SRF的改善。因此，受试者5对抗VEGF治疗有响应，但需要非常频繁地注射以保持不存在流体。AAV2.7m8-阿柏西普注射之后一周，流体得到改善。如果该受试者仅接受推注阿柏西普注射，则流体将在4-5周内开始重现，并且OCT图像将看起来像类似基线OCT图像，具有明显的流体。然而，如图28B所示，在AAV2.7m8-阿柏西普注射之后12周、16周、20周、28周和36周，没有流体且视力得到改善。因此，在受试者5中，AAV2.7m8-阿柏西普注射液通过消除对注射的需要、改善视力和控制疾病活性解决了治疗负担。这些结果证明，通过单次施用AAV2.7m8-阿柏西普改变了受试者5的疾病病程。
讨论
本实施例中描述的结果显示AAV2.7m8-阿柏西普在所有群组(n＝30)中持续具有良好耐受性并具有有利的安全性特征。所有AAV2.7m8-阿柏西普相关的眼睛不良事件都是轻度(78％)或中度(22％)，并且眼睛炎症(当观察到时)对类固醇滴眼剂有响应。
另外，该实施例中描述的结果表明AAV2.7m8-阿柏西普具有强的和持久的功效。
观察到明显的剂量响应，其中所有以6×1011 vg/眼睛的剂量施用AAV2.7m8-阿柏西普的受试者保持无救援抗VEGF注射，15个以2×1011 vg/眼的剂量施用AAV2.7m8-阿柏西普的受试者中的10个保持无救援抗VEGF注射。群组1中的所有受试者(6×1011 vg/眼睛的剂量)在施用AAV2.7m8-阿柏西普之后保持无救援注射超过15个月。
该实施例中描述的结果还显示AAV2.7m8-阿柏西普的单一IVT注射引起年化抗VEGF注射率的实质性降低。平均BCVA通常保持得到改善且平均CST通常得到改善。
来自群组4的结果显示类固醇滴眼剂的6周预防性方案在最小化早期眼睛炎症方面是有效的，与群组3中观察到的结果一致。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和实施例详细地描述了本公开内容，但是说明书和实施例不应当被解释为限制本公开内容的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地通过引用整体并入。

Claims (106)

1.一种用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法，所述方法包括向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的约6×1011个载体基因组(vg)或更少的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其中所述个体为人类，并且其中所述rAAV颗粒包含：
a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和
b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在所述衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述患有眼新血管疾病的个体的眼睛中的视网膜流体减少。
3.一种用于减少患有眼新血管疾病的个体的眼睛中的视网膜流体的方法，所述方法包括向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒，其中所述个体为人类，并且其中所述rAAV颗粒包含：
a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和
b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在所述衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述个体在施用单位剂量的rAAV颗粒之前约12周内已经接受至少一种抗VEGF试剂的治疗。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中所述个体的一只眼睛中的视网膜流体的量或存在对使用抗VEGF试剂的先前治疗是难治性的。
6.权利要求4或权利要求5的方法，其中所述抗VEGF试剂为阿柏西普。
7.权利要求2-6中任一项的方法，其中所述一只眼睛中的视网膜流体减少了至少约60％。
8.权利要求2-7中任一项的方法，其中与向所述个体施用rAAV之前的所述个体的一只眼睛中的视网膜流体的水平相比，所述一只眼睛中的视网膜流体减少约80％。
9.权利要求2-8中任一项的方法，其中所述视网膜流体为视网膜下流体(SRF)或视网膜内流体(IRF)。
10.权利要求3-9中任一项的方法，其中所述单位剂量的颗粒为约6×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)或更少。
11.一种用于治疗个体中的眼新血管疾病的方法，所述方法包括：
(a)向所述个体的一只眼睛施用抗-VEGF试剂；和
(b)在施用所述抗VEGF试剂之后，向所述个体的一只眼睛施用约6×1011个载体基因组(vg)或更少的单位剂量的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其中所述个体为人类，并且其中所述rAAV颗粒包含：(i)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和
(ii)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在所述衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
12.权利要求11的方法，其包括在施用所述抗VEGF试剂之后约1周或约7天，向所述个体的一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。
13.权利要求11或权利要求12的方法，其包括在第1天向所述个体的一只眼睛施用所述抗-VEGF试剂，和在第8天向所述个体的一只眼睛施用所述单位剂量的rAAV颗粒。
14.权利要求11-13中任一项的方法，其中所述抗-VEGF试剂包含阿柏西普。
15.权利要求14的方法，其中所述阿柏西普是以约2mg的剂量通过玻璃体内注射施用。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒为在约6×1010至约6×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)之间。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒为在约6×1010至约2×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)之间。
18.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒为在约2×1011至约6×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)之间。
19.权利要求18的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒为约2×1011或约6×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。
20.权利要求19的方法，其中所单位剂量的rAAV颗粒为约2×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。
21.权利要求19的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒为约6×1011个载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。
22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述个体在对侧眼睛中具有眼新血管疾病的一种或多种症状。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其进一步包括向所述个体的对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒。
24.权利要求23的方法，其中向所述对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向所述一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至多约2周。
25.权利要求24的方法，其中：
(a)向所述对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在与向所述一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒的同一天；或
(b)向所述对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向所述一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后约1天至约14天之间。
26.权利要求24或权利要求25的方法，其中与向所述个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒相比，向所述个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含相同或更少的载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。
27.权利要求23的方法，其中所述向对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是在向所述一只眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约2周。
28.权利要求27的方法，其中与向所述个体的一只眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒相比，向所述个体的对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含更多的载体基因组/眼睛(vg/眼睛)。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述核酸包含SEQ ID NO：40的核酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。
31.权利要求1-30中任一项的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述多肽为阿柏西普。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述核酸进一步包含第一增强子区、启动子区5'UTR区、第二增强子区和腺苷酸化位点。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述核酸以5’至3’顺序包含：
(a)第一增强子区；
(b)启动子区；
(c)5'UTR区；
(d)编码多肽的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列；
(e)第二增强子区；和
(f)腺苷酸化位点；
并且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)。
35.权利要求33或权利要求34的方法，其中所述第一增强子区包含CMV序列，所述CMV序列包含SEQ ID NO：22的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
36.权利要求33-35中任一项的方法，其中所述启动子区包含CMV序列，所述CMV序列包含SEQ ID NO：23的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
37.权利要求34-36中任一项的方法，其中所述核酸编码多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：40的核酸序列或与其具有至少85％同一性的核酸序列。
38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的序列。
39.权利要求34-38中任一项的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的序列。
40.权利要求34-39中任一项的方法，其中所述多肽为阿柏西普。
41.权利要求33-40中任一项的方法，其中所述5'UTR区以5'至3'顺序包含TPL序列和eMLP序列，所述TPL序列包含SEQ ID NO：24的序列或与其具有至少85％同一性的序列，所述eMLP序列包含SEQ ID NO：25的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
42.权利要求33-41中任一项的方法，其中所述第二增强子区包含含有SEQ ID NO：26的序列或与其具有至少85％同一性的序列的完整EES序列。
43.权利要求33-42中任一项的方法，其中所述聚腺苷酸化位点包含含有SEQ ID NO：27的序列或与其具有至少85％同一性的序列的HGH聚腺苷酸化位点。
44.权利要求1-32中任一项的方法，其中所述核酸进一步包含(a)第一增强子区，其包含含有SEQ ID NO：22的序列或与其具有至少85％同一性的序列的CMV序列；(b)启动子区，其包含含有SEQ ID NO：23的序列或与其具有至少85％一致性的序列的CMV序列；(c)5'UTR区，其以5'至3'顺序包含TPL序列和eMLP序列，所述TPL序列包含SEQ ID NO：24的序列或与其具有85％同一性的序列，所述eMLP序列包含SEQ ID NO：25的序列或与其具有85％同一性的序列；(d)第二增强子区，其包含完整EES序列，所述完整EES序列包含SEQ ID NO：26的序列或与其具有至少85％同一性的序列；和(e)HGH多聚腺苷酸化位点，其包含SEQ ID NO：27的序列或与其具有至少85％同一性的序列。
45.权利要求1-44中任一项的方法，其中所述核酸包含SEQ ID NO：39的核酸序列或与其具有至少85％同一性的序列。
46.权利要求1-45中任一项的方法，其中所述AAV2衣壳蛋白包含插入在所述衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)，其中氨基酸残基编号对应于AAV2VP1衣壳蛋白。
47.权利要求1-46中任一项的方法，其中所述AAV2衣壳蛋白包含插入在包含SEQ IDNO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)。
48.权利要求1-47中任一项的方法，其中所述AAV2衣壳蛋白包含插入在包含SEQ IDNO：13的序列的AAV2 VP1的位置587和588之间的氨基酸序列LALGETTRPA(SEQ ID NO：1)。
49.权利要求1-46中任一项的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV2 VP1衣壳蛋白，其包含含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：38的序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的GH环。
50.权利要求1-49中任一项的方法，其中所述向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒是通过玻璃体内施用。
51.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒是以药物制剂的形式。
52.权利要求51的方法，其中所述药物制剂包含rAAV颗粒、氯化钠、磷酸钠和表面活性剂。
53.权利要求52的方法，其中所述药物制剂包含约150至约200mM的氯化钠、约1至约10mM的磷酸二氢钠、约1至约10mM的磷酸氢二钠、约0.0005％(w/v)至约0.005％(w/v)的泊洛沙姆188和约6×1013至约6×1010个载体基因组/mL(vg/mL)的rAAV颗粒，其中所述药物制剂具有约7.0至约7.5的pH。
54.权利要求53的方法，其中所述药物制剂包含约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠、约6×1012vg/mL的rAAV颗粒和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。
55.权利要求53的方法，其中所述药物制剂包含约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠、约2×1012vg/mL的rAAV颗粒和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。
56.权利要求53的方法，其中所述药物制剂包含约180mM的氯化钠、约5mM的磷酸二氢钠、约5mM的磷酸氢二钠、约6×1011vg/mL的rAAV颗粒和约0.001％(w/v)的泊洛沙姆188，其中所述药物制剂具有约7.3的pH。
57.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒为约25μL至约250μL的体积。
58.权利要求57的方法，其中向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含约100μL的体积。
59.权利要求57的方法，其中向一只眼睛和/或对侧眼睛施用的单位剂量的rAAV颗粒包含约30μL的体积。
60.权利要求1-59中任一项的方法，其中所述个体接受使用抗VEGF试剂对眼新血管疾病的先前治疗。
61.权利要求60的方法，其中在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用rAAV颗粒之前，所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛已经接受1次或2次抗-VEGF试剂的注射。
62.权利要求1-3或7-59中任一项的方法，其中所述个体没有接受使用抗VEGF试剂对眼新血管疾病的先前治疗。
63.权利要求60-62中任一项的方法，其中所述抗-VEGF试剂为阿柏西普。
64.权利要求1-63中任一项的方法，其中所述眼新生血管疾病是湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜新生血管形成、脉络膜新生血管形成糖尿病性视网膜病、增殖性糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、糖尿病性黄斑水肿、糖尿病性视网膜缺血、缺血性视网膜病变、糖尿病性视网膜水肿或其任意组合。
65.权利要求1-10或16-64中任一项的方法，其中所述单位剂量的rAAV颗粒与类固醇治疗组合施用。
66.权利要求65的方法，其中所述类固醇治疗为皮质类固醇治疗。
67.权利要求65或权利要求66的方法，其中所述类固醇治疗为全身性类固醇治疗。
68.权利要求65-67中任一项的方法，其中所述类固醇治疗为口服类固醇治疗。
69.权利要求65-68中任一项的方法，其中所述类固醇治疗为泼尼松治疗。
70.权利要求65或权利要求66的方法，其中所述类固醇治疗为局部类固醇治疗。
71.权利要求70的方法，其中所述类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。
72.权利要求65-71中任一项的方法，其中在向一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒之前、期间和/或之后施用所述类固醇。
73.权利要求70-72中任一项的方法，其中所述类固醇治疗是局部类固醇治疗，并且所述局部类固醇治疗是从施用单位剂量的rAAV颗粒起持续至多约4周、至多约6周或至多约8周的每日类固醇治疗。
74.权利要求73的方法，其中所述局部类固醇治疗包括在约第1周每天约四次施用局部类固醇，在约第2周每天约三次施用局部类固醇，在约第3周每天约两次施用局部类固醇，和在约第4周每天约一次施用局部类固醇；从施用所述单位剂量的rAAV颗粒开始和之后计时。
75.权利要求73的方法，其中所述局部类固醇治疗包括在施用单位剂量的rAAV颗粒之后每天约四次施用局部类固醇持续约3周，随后每天约3次施用局部类固醇持续约1周，随后每天约2次施用局部类固醇持续约1周，和随后每天约1次施用局部类固醇持续约1周。
76.权利要求73的方法，其中所述局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇持续约四周，随后每天约三次施用局部类固醇持续约1周，随后每天约两次施用局部类固醇持续约1周，和随后每天约一次施用局部类固醇持续约一周；从施用单位剂量的rAAV颗粒之前约一周开始计时。
77.权利要求11-64中任一项的方法，其进一步包括施用局部类固醇治疗。
78.权利要求77的方法，其中所述局部类固醇治疗为二氟泼尼酯治疗。
79.权利要求77或权利要求78的方法，其中所述局部类固醇治疗包括每天约四次施用局部类固醇持续约四周，随后每天约三次施用局部类固醇持续约1周，随后每天约两次施用局部类固醇持续约1周，和随后每天约一次施用局部类固醇持续约一周；从施用所述抗-VEGF试剂开始和之后计时。
80.权利要求71-79中任一项的方法的方法，其中所述局部类固醇包含约1μg至约3μg的剂量的二氟泼尼酯0.05％。
81.权利要求71-80中任一项的方法，其中所述局部类固醇包含约2.5μg的剂量的二氟泼尼酯0.05％。
82.权利要求1-81中任一项的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的维持或减少。
83.权利要求82的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视网膜厚度的减少。
84.权利要求83的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视网膜厚度相比，视网膜厚度的减少是至少约10％。
85.权利要求82-84中任一项的方法，其中视网膜厚度是中央亚视场厚度(CST)或中心视网膜厚度(CRT)。
86.权利要求1-85中任一项的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的维持或减小。
87.权利要求86的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起黄斑体积的减小。
88.权利要求87的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的黄斑体积相比，黄斑体积的减小是至少约10％。
89.权利要求1-88中任一项的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的维持或改善。
90.权利要求89的方法，其中与施用所述单位剂量的rAAV颗粒之前的视力相比，向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起视力的改善。
91.权利要求89或权利要求90的方法，其中视力是最佳矫正视力(BCVA)。
92.权利要求1-91中任一项的方法，其中向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起至少约50％的所述多个个体中不需要抗-VEGF救援治疗。
93.权利要求92的方法，其中在施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约20周、至少约36周、至少约52周、至少约56周或更长时间，至少约50％的所述多个个体不需要抗VEGF救援治疗。
94.权利要求1-91中任一项的方法，其中向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起至少约67％的所述多个个体不需要抗-VEGF救援治疗。
95.权利要求94的方法，其中在施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约20周、至少约36周、至少约52周、至少约60周、至少约64周或至少约66周，至少约67％的所述多个个体不需要抗VEGF救援治疗。
96.权利要求1-91中任一项的方法，其中向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起至少约78％的所述多个个体不需要抗-VEGF救援治疗。
97.权利要求96的方法，其中在施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约20周、至少约36周或更长时间，至少约78％的所述多个个体不需要抗VEGF救援治疗。
98.权利要求1-91中任一项的方法，其中向多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起100％的所述多个个体不需要抗-VEGF救援治疗。
99.权利要求98的方法，其中在施用单位剂量的rAAV颗粒之后至少约64周、至少约68周、至少约72周、至少约76周、至少约80周、至少约84周或更长时间，100％的所述多个个体不需要抗VEGF救援治疗。
100.权利要求1-99中任一项的方法，其中与施用单位剂量的rAAV颗粒之前的年化抗VEGF注射率相比，向所述多个个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起年化抗VEGF注射率降低至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％。
101.权利要求1-10、16-76或80-100中任一项的方法，其中所述眼新血管疾病为湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)。
102.权利要求1-3、11-64、77-83、85-87或89-91中任一项的方法，其中所述眼新血管疾病为糖尿病性黄斑水肿(DME)。
103.权利要求102的方法，其中向所述个体的一只眼睛和/或对侧眼睛施用单位剂量的rAAV颗粒引起糖尿病性视网膜病严重程度量表(DRSS)中的2步或3步改善。
104.用于治疗个体的眼新血管疾病的方法中的约6×1011个载体基因组(vg)或更少的单位剂量的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，所述方法包括向所述个体的一只眼睛施用所述单位剂量，其中所述个体为人类，并且其中所述rAAV颗粒包含：
a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和
b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在所述衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
105.用于减少个体的眼睛中的视网膜流体的方法中的单位剂量的rAAV颗粒，所述方法包括向所述个体的一只眼睛施用所述单位剂量，其中所述个体为人类，并且其中所述rAAV颗粒包含：
a)编码多肽且侧接AAV2反向末端重复序列(ITR)的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO：35的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列，和
b)AAV2衣壳蛋白，其包含插入在所述衣壳蛋白的位置587和588之间的氨基酸序列LGETTRP(SEQ ID NO：14)，其中所述氨基酸残基编号对应于AAV2 VP1衣壳蛋白。
106.根据权利要求104或权利要求105使用的单位剂量，其中所述方法进一步包括在施用所述单位剂量之前向所述个体的所述一只眼睛施用抗-VEGF试剂。
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