JP2022522776A - 対側眼へのａａｖ遺伝子治療の逐次的硝子体内投与 - Google Patents
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Abstract
被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、医薬組成物のある単位用量を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、および医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップを含む方法が、提供される。一部の実施形態では、方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前の被験体からの試料においてｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルを測定するステップをさらに含む。
Description
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年３月４日に出願した米国特許仮出願第６２／８１３，５９７号および２０１９年４月２６日に出願した米国特許仮出願第６２／８３９，４５７号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１９年３月４日に出願した米国特許仮出願第６２／８１３，５９７号および２０１９年４月２６日に出願した米国特許仮出願第６２／８３９，４５７号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：６２７００２００１０４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年３月３日、サイズ：６２ＫＢ）。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：６２７００２００１０４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２０年３月３日、サイズ：６２ＫＢ）。
技術分野
本開示は、被験体における眼疾患および障害を処置する方法であって、例えばアフリベルセプトをコードする異種核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、およびｒＡＡＶを第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップを含む方法に関する。
本開示は、被験体における眼疾患および障害を処置する方法であって、例えばアフリベルセプトをコードする異種核酸配列を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、およびｒＡＡＶを第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップを含む方法に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく遺伝子送達ベクターは、様々な眼疾患および障害の処置に有望であることを実証してきた。しかし、ＡＡＶに基づく眼治療の投与は、いまだに難題である。例えば、網膜下注射されたＡＡＶは、霊長類の網膜における網膜色素上皮および光受容細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）に効率的に形質導入するが、この送達モードは、網膜裂孔、網膜剥離、および視力喪失を招くことがある網膜の穿刺を必然的に伴う。硝子体内（ＩＶＴ）ＡＡＶ注射は、網膜下注射よりも侵襲性が低いが、硝子体内送達されたウイルスベクターカプシドは、免疫特権のある網膜区画に限局されない。硝子体液中での適応免疫系へのＡＡＶカプシドエピトープの曝露は、中和抗体（「ｎＡｂ」）の発生を招き、これは有効なベクターの再投与を妨げる可能性がある。ある特定の眼疾患は、患者のそれぞれの眼に非同期的に発症することがある。これらの非同期的な眼疾患は、滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病性眼疾患（ＤＥＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、および未熟児網膜症を含む。したがって、被験体の眼の各々における眼疾患を逐次的時点で処置するための安全かつ有効な方法が当技術分野において必要とされている。
被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、（ｉ）医薬組成物の第１の単位用量を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、および（ｉｉ）医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップを含み、医薬組成物が、（ａ）抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、方法が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前の被験体からの試料においてｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前の被験体からの試料において抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸の発現レベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔は、少なくとも約２週間である。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔、少なくとも約４週間または約１カ月。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔は、少なくとも約６週間である。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔は、少なくとも約８週間または約２カ月である。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の各々は、約１Ｅ９～約３Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む。
一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の各々は、約１Ｅ１０～約１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む（すなわち、１眼あたり）。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の各々は、約１Ｅ１１～約１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む（すなわち、１眼あたり）。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の各々は、約２Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノム（すなわち、１眼あたり約２Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノム）を含む。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の各々は、約２Ｅ１１～約６Ｅ１２の間のベクターゲノム（すなわち、１眼あたり約２Ｅ１１～約６Ｅ１２の間のベクターゲノム）を含む。一部の実施形態では、第２の単位用量は、第１の単位用量より多い。一部の実施形態では、第２の単位用量は、第１の単位用量の約３００％（例えば、第１の単位用量の３倍（3-fold）または３倍（3 times））である。一部の実施形態では、第２の単位用量は、第１の単位用量の約３００％～約１０００％の間である。一部の実施形態では、第１の単位用量は、約６Ｅ１０ベクターゲノムを含み、第２の単位用量は、約１．８Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第１の単位用量は、約６Ｅ１１ベクターゲノムを含み、第２の単位用量は、約１．８Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第１の単位用量は、約２Ｅ１１ベクターゲノムを含み、第２の単位用量は、約６Ｅ１１～約２Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第１の単位用量は、約２Ｅ１２ベクターゲノムを含み、第２の単位用量は、約６Ｅ１２～約２Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の体積は、各々、約１００μＬ以下である。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量の体積は、各々、約５０μＬ以下である。
被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、医薬組成物の単位用量を被験体の片側の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップを含み、医薬組成物が、（ａ）抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含み、被験体が、ＩＶＴ注射による対側眼への医薬組成物の先行単位用量の投与を受けたものである、方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、対側眼への先行単位用量の投与後かつ片側の眼への単位用量の投与前の被験体からの試料においてｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、対側眼への先行単位用量の投与後かつ片側の眼への単位用量の投与前の被験体からの試料において抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸の発現レベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１Ｅ１０～約１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約２Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約２Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、先行単位用量は、約１Ｅ１０～約１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含んでいた。一部の実施形態では、先行単位用量は、約２Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含んでいた。一部の実施形態では、先行単位用量は、約２Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含んでいた。一部の実施形態では、片側の眼に投与される単位用量は、対側眼に投与された先行単位用量より多い。一部の実施形態では、単位用量は、先行単位用量の少なくとも約３００％である。一部の実施形態では、単位用量は、先行単位用量の約３００％～約１０００％の間である。一部の実施形態では、先行単位用量は、約６Ｅ１０ベクターゲノムを含んでいたが、単位用量は、約１．８Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、先行単位用量は、約６Ｅ１１ベクターゲノムを含んでいたが、単位用量は、約１．８Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、先行単位用量は、約２Ｅ１１ベクターゲノムを含んでいたが、単位用量は、約６Ｅ１１～約２Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、先行単位用量は、約２Ｅ１２のベクターゲノムを含んでいたが、単位用量は、約６Ｅ１２～約２Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、先行単位用量の投与と単位用量の投与との間の時間間隔は、少なくとも約２週間である。一部の実施形態では、先行単位用量の投与と単位用量の投与との間の時間間隔は、少なくとも約４週間または約１カ月である。一部の実施形態では、先行単位用量の投与と単位用量の投与との間の時間間隔は、少なくとも約６週間である。一部の実施形態では、先行単位用量の投与と単位用量の投与との間の時間間隔は、少なくとも約８週間または約２カ月である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してペプチド挿入を含むバリアントカプシドタンパク質を含み、ペプチド挿入は、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号３）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号６）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号７）、ＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号９）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１０）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号１１）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号１２）から選択されるアミノ酸配列を有し、挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０および６１１に対応するアミノ酸の間の位置におけるまたは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置における２つの隣接アミノ酸間に位置する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１３の５８７位と５８８位との間に挿入されたアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）を含むバリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ２粒子である。一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質は、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、改変配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含み、改変配列は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、改変配列は、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号３７）を含み、アミノ酸残基番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応する。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質であるかまたはＡＡＶ５とＡＡＶ２のハイブリッドカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３９）を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４０または配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４２または配列番号４３に記載のカプシド配列を含む。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、またはラニビズマブである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトである。一部の実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素性上皮細胞である。一部の実施形態では、眼疾患または障害は、脈絡膜新生血管、滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、またはＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症である。一部の実施形態では、眼疾患または障害は、脈絡膜新生血管または滲出型ＡＭＤである。一部の実施形態では、被験体は、ヒトである。一部の実施形態では、被験体は、抗ＶＥＧＦ剤の投与に対して応答性であり、抗ＶＥＧＦ剤は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトである。一部の実施形態では、被験体は、抗ＶＥＧＦ剤での眼疾患または障害の先行処置を受けた。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトであった。
本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、一部または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成することができることが理解されよう。本発明のこれらのおよび他の態様が当業者に明らかになる。本発明のこれらのおよび他の実施形態は、後続の詳細な説明によってさらに説明される。
参照による組み込み
特許出願および公表文献を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、それら全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
特許出願および公表文献を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、それら全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
図２Ｂは、０日目に右眼におよび５９日目に左眼にＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトをＩＶＴ投与した３匹のアフリカミドリザルの各々についての右眼の房水におけるアフリベルセプト発現の時間経過を示すグラフである。
図３Ｂは、０日目に右眼におよび５９日目に左眼にＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトをＩＶＴ投与した３匹のアフリカミドリザルの各々についての左眼の房水におけるアフリベルセプト発現の時間経過を示すグラフである。
本明細書に記載される方法、組成物およびキットは、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学および眼科的技法についての従来の技法および説明を利用することができる。そのような従来の技法は、被験体における網膜または視力の観察および分析、組換えウイルスのクローニングおよび増殖、医薬組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学のための方法を含む。好適な技法の具体的例証は、本明細書における実施例を参照することにより得ることができる。しかしながら、もちろん、同等の従来手順を使用することもできる。そのような従来の技法および説明は、標準的な実験マニュアル、例えば、Green, et al., Eds., Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV) (1999)；Weiner, et al., Eds., Genetic Variation: A Laboratory Manual (2007)；Dieffenbach, Dveksler, Eds., PCR Primer: A Laboratory Manual (2003)；Bowtell and Sambrook, DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual (2003)；Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis (2004)；Sambrook and Russell, Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2006)；およびSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002) （全てCold Spring Harbor Laboratory Pressからのもの）；Stryer, L., Biochemistry (4th Ed.) W. H. Freeman, N.Y. (1995)；Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” IRL Press, London (1984)；Nelson and Cox, Lehninger, Principles of Biochemistry, 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York (2000)；およびBerg et al., Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York (2002)において見つけることができ、これらの参考文献の全ては、それら全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される用語法は、特定の例を説明することを目的にしたものに過ぎず、限定することを意図したものでない。本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数形も含むように意図されている。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」、またはこれらの異表記が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のどちらかで使用される場合には、このような用語は、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的であるように意図されている。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義語であり、包括的または非限定的である。
本明細書における「または」へのいずれの言及も、別段の記述がない限り、「および／または」を包含するように意図されている。本明細書で使用される場合、用語「約」ある数は、その数の１０％を加えたまたは引いた、その数を指す。用語「約」ある範囲は、その最低値の１０％を引いたおよびその最大値の１０％を加えた、その範囲を指す。
用語「被験体」、「患者」、または「個体」は、霊長類、例えば、ヒトならびに非ヒト霊長類、例えばアフリカミドリザルおよびアカゲザル、を指す。一部の実施形態では、被験体はヒトである。
用語「処置する」、「処置すること」、「処置」、「好転させる(ameliorate)」または「好転させること」および他の文法的等価表現は、本明細書で使用される場合、眼疾患もしくは障害をまたは眼疾患もしくは障害の症状を緩和すること、和らげることまたは好転させること、眼疾患または障害のさらなる症状を防止すること、症状の基礎代謝原因を好転させることまたは防止すること、眼疾患または障害を阻害すること、例えば眼疾患または障害の発症を止めること、眼疾患または障害を軽減すること、眼疾患または障害の退行を生じさせること、あるいは眼疾患または障害の症状を停止させることを指し、かつ予防を含むように意図されている。これらの用語は、治療利益および／または予防利益を得ることをさらに含む。用語「治療利益」は、処置される眼疾患または障害の根絶または好転を指す。また、治療利益は、一部の実施形態では患者が依然として眼疾患または障害に罹患しているにもかかわらず、患者において改善が観察されるような、眼疾患または障害に関連する生理的症状の１つまたは複数についての根絶または好転により得られる。予防利益のために、医薬組成物は、眼疾患もしくは障害を発症するリスクがある患者に、または眼疾患もしくは障害の生理的症状の１つもしくは複数を訴える患者に、たとえ疾患または症状の診断が下されていなくても投与される。非同期的に疾患が発症した患者は、疾患がより進行した彼らの眼の処置から治療利益を、疾患があまり進行していない彼らの眼の処置から予防利益を得ることができる。
用語「投与する」、「投与すること」、「投与」およびこれらに類する用語は、本明細書で使用される場合、所望の生物学的作用部位への治療薬または医薬組成物の送達を可能にするために使用される方法を指すことができる。これらの方法は、眼への硝子体内または網膜下注射を含む。
用語「有効量」、「治療有効量」または「薬学的有効量」は、本明細書で使用される場合、処置される眼疾患または障害の症状の１つまたは複数をある程度軽減することになる、投与される少なくとも１つの医薬組成物または化合物の十分な量を指すことができる。医薬組成物の「有効量」、「治療有効量」または「薬学的有効量」は、単位用量（本明細書中の他の箇所でさらに詳細に説明される通り）としての場合、それを必要としている被験体に投与され得る。
用語「薬学的に許容される」は、本明細書で使用される場合、担体または希釈剤などの材料であって、本明細書で開示される化合物の生物活性または特性を消失させず、比較的非毒性である（すなわち、材料が個体に投与されたとき、それが、望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、それを含有する組成物の成分のいずれとも有害に相互作用することもない）材料を指すことができる。
用語「医薬組成物」、または単に「組成物」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの薬学的に許容される化学成分、例えば、これらに限定されないが、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、賦形剤およびこれらに類するものと必要に応じて混合された、生物活性化合物を指すことができる。
「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用される場合、標的細胞内へのまたは標的組織への形質導入のための、ＡＡＶ起源のものでないポリヌクレオチド配列（例えば、治療用導入遺伝子、例えばアフリベルセプト、をコードする核酸配列などの、ＡＡＶにとって異種であるポリヌクレオチド）を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの、一般には２つの、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接している。用語ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクター粒子とｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖状（ｓｓＡＡＶ）または自己相補型（ｓｃＡＡＶ）のどちらであってもよい。
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質を含む（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）ウイルス粒子、およびポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターを指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（例えば、標的細胞または標的組織に送達される導入遺伝子などの、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ｒＡＡＶベクター、したがってｒＡＡＶ粒子内に含有されているベクター、の産生を必然的に含む。
用語「パッケージング」は、本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子の組み立ておよびカプシド形成を生じさせる結果となり得る一連の細胞内事象を指すことができる。
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するおよび天然に存在しない両方のタンパク質（例えば、融合タンパク質）、ペプチド、これらの断片、変異体、誘導体およびアナログを包含することができる。ポリペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはポリマーであることがある。さらに、ポリペプチドは、１つまたは複数の明確に異なる活性を各々が有する、いくつかの異なるドメインを含むこともある。疑念を避けるために、「ポリペプチド」は、アミノ酸数２より大きい任意の長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチドバリアント」または単に「バリアント」は、配列がアミノ酸改変を含有する、ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、改変は、天然または野生型タンパク質などの参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配列または置換である。バリアントは、ある位置の単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変更された、１つまたは複数のアミノ酸点置換；１つまたは複数のアミノ酸が参照タンパク質の配列においてそれぞれ挿入または欠失される、１つまたは複数の挿入および／または欠失；ならびに／あるいはアミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端のどちらかまたは両方における短縮化を有することがある。バリアントは、参照タンパク質または未改変タンパク質と比較して、同じ生物活性を有することも、異なる生物活性を有することもある。
一部の実施形態では、バリアントは、例えば、その対応参照タンパク質に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のうちのいずれか１つの全配列相同性を有することができる。一部の実施形態では、バリアントは、野生型タンパク質に対して少なくとも約９０％の全配列相同性を有することができる。一部の実施形態では、バリアントは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の全配列同一性を示す。
本明細書で使用される場合、「組換え（の）」は、（１）その天然に存在する環境から除去された、（２）遺伝子が天然に見られるポリヌクレオチドの全てもしくは一部分を伴わない、（３）天然では連結されていないポリヌクレオチドに必要に応じて連結されている、または（４）天然に存在しない、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指すことができる。用語「組換え（の）」は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種の系により生物学的に合成されるポリヌクレオチドアナログ、ならびにそのような核酸によりコードされるタンパク質および／もしくはｍＲＮＡに関して使用され得る。したがって、例えば、微生物により合成されたタンパク質は、例えば、細胞内に存在する組換え遺伝子から合成されたｍＲＮＡから合成された場合、組換えタンパク質である。
用語「抗ＶＥＧＦ剤」は、内在性ＶＥＧＦおよび／もしくは内在性ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の活性もしくは機能、またはＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲ相互作用もしくは経路を、ｉｎ ｖｉｖｏで低減させること、それに干渉すること、それを破壊すること、遮断することおよび／または阻害することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多量体タンパク質、遺伝子産物、抗体、ヒトモノクローナル抗体、抗体断片、アプタマー、小分子、キナーゼ阻害剤、受容体もしくは受容体断片、または核酸分子を含む、任意の治療剤を含む。抗ＶＥＧＦ剤は、細胞、組織または被験体にｉｎ ｖｉｖｏで送達されたときに新しい血管の成長もしくは形成および／または浮腫または腫脹を低減させることができる、公知の治療剤のいずれか１つ、例えば、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、またはベバシズマブであり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、天然に存在する、天然に存在しない、または合成のものであることがある。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤を天然に存在する分子から誘導することができ、その後、それを改変してまたは変異させて抗ＶＥＧＦ活性を付与した。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、融合またはキメラタンパク質である。そのようなタンパク質中の、機能的ドメインまたはポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦを隔離することができるまたはＶＥＧＦＲデコイとして機能することができる融合またはキメラタンパク質を作製するための部分またはポリペプチドと人工的に融合される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、内在性ＶＥＧＦＲのそのリガンドとの相互作用を遮断する、融合またはキメラタンパク質である。
本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ」は、別段の要求がない限り、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆ、あるいはこれらの任意の組合せ、または任意の機能的断片もしくはバリアントを含むがそれらに限定されない、ＶＥＧＦの任意のアイソフォームを指すことができる。別段の要求がない限り、「ＶＥＧＦ」は、次のメンバーを含む、ＶＥＧＦファミリーの任意のメンバーを指すことができる：ＶＥＧＦ－Ａ、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ、またはこれらの任意の組合せ、機能的断片もしくはバリアント。本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ受容体」または「ＶＥＧＦＲ」または「ＶＥＧＦ－Ｒ」は、ＶＥＧＦＲ－１（またはＦｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（またはＦｌｋ－１／ＫＤＲ）、およびＶＥＧＦＲ－３（またはＦｌｔ－４）を含むがこれらに限定されない、ＶＥＧＦの受容体のいずれか１つを指すために使用することができる。ＶＥＧＦＲは、受容体の膜結合もしくは可溶性形態、または機能的断片または短縮化であり得る。抗ＶＥＧＦ剤の例としては、これらに限定されないが、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、またはこれらの任意の組合せ、バリアントもしくは機能的断片が挙げられる。
「動作可能に連結した／された／される」または「作動可能に連結した／された／される」または「カップリングした／された／される」は、エレメントが、期待された様式で動作することを可能にする関係にある、遺伝子エレメントの並置を指すことができる。例えば、プロモーターがコード配列の転写を開始させるのに役立つ場合、プロモーターは、コード配列に動作可能に連結されていることがある。この機能的関係が維持されるのであれば、プロモーターとコード領域との間に介在残基があってもよい。＋＋＋
用語「発現ベクター」または「発現構築物」または「カセット」または「プラスミド」または単に「ベクター」は、遺伝子産物をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有する、ＡＡＶまたはｒＡＡＶベクターを含む、任意のタイプの遺伝子構築物であって、配列をコードする核酸の一部または全てが、転写可能であり、遺伝子治療に適応する、遺伝子構築物を含むことができる。転写物をタンパク質に翻訳することができる。一部の実施形態では、転写物は、部分的に翻訳されるかまたは翻訳されない。ある特定の態様では、発現は、遺伝子の転写と、ｍＲＮＡの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。発現ベクターは、標的細胞におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に動作可能に連結された制御エレメントも含むことができる。制御エレメントと遺伝子（単数もしくは複数）の組合せであって、それらが発現のために作動可能に連結されている組合せは、「発現カセット」と呼ばれることもあり得、これらの多数が当技術分野において公知であり、入手可能であるか、または当技術分野において入手可能である成分からこれらを容易に構築することができる。
用語「異種（の）」は、実体が比較されることになるその実体の残りの部分とは遺伝子型的に明確に異なる実体を指すことができる。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子操作技法によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドであり得る。その天然コード配列から除去されたプロモーターであって、天然には連結された状態で見られないコード配列に動作可能に連結されているプロモーターは、異種プロモーターであり得る。
本明細書で使用される場合、「７ｍ８」は、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）を指す。
「７ｍ８バリアント」は、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）がカプシドタンパク質の溶媒露出ＧＨループに挿入されている、任意の血清型のものであり得る、ｒＡＡＶを指す。
７ｍ８がｒＡＡＶ２に挿入されている場合（ＡＡＶ２．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＶＰ１、の５８７位と５８８位との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ１に挿入されている場合（ＡＡＶ１．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ５に挿入されている場合（ＡＡＶ５．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５と５７６との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ６に挿入されている場合（ＡＡＶ６．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ７に挿入されている場合（ＡＡＶ７．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のアミノ酸５８９と５９０との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ８に挿入されている場合（ＡＡＶ８．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ９に挿入されている場合（ＡＡＶ９．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間に挿入されている。７ｍ８がｒＡＡＶ１０に挿入されている場合（ＡＡＶ１０．７ｍ８とも呼ばれる）、アミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）は、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質のＧＨループに、例えば、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質のアミノ酸５８９と５９０との間に挿入されている。
概要
ＩＶＴ注射後に標的網膜細胞に効率的に形質導入するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）の能力は、様々な網膜疾患を処置するために、光受容細胞、網膜色素上皮および網膜内層に治療用遺伝子をうまく移入するために活用されている。硝子体内（ＩＶＴ）ＡＡＶ投与は、安全かつ適便な網膜送達方法であるが、ベクターカプシドに対する中和抗体（ｎＡｂ）は網膜下注射後よりもＩＶＴ注射後に生成される可能性が高いことが示唆されている。滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）などの、ある特定の眼疾患が、個体の眼の両方に非同期的に発症し得ることを考えると、第１の眼へのＡＡＶのＩＶＴ投与後に生成されるｎＡｂは、例えば個体の対側眼への、治療用遺伝子移入の効率を低下させる可能性があり、効率的ベクター再投与を妨げる可能性があるという懸念がある。本明細書で提供される方法は、被験体の第１の眼へのｒＡＡＶ２に基づくベクターのＩＶＴ投与後の免疫（例えば、中和抗体または「ｎＡｂ」）の発生が、被験体の対側眼へのＩＶＴ注射によるベクターの投与後の形質導入を完全に遮断しないという、本出願人の発見に基づく。
ＩＶＴ注射後に標的網膜細胞に効率的に形質導入するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）の能力は、様々な網膜疾患を処置するために、光受容細胞、網膜色素上皮および網膜内層に治療用遺伝子をうまく移入するために活用されている。硝子体内（ＩＶＴ）ＡＡＶ投与は、安全かつ適便な網膜送達方法であるが、ベクターカプシドに対する中和抗体（ｎＡｂ）は網膜下注射後よりもＩＶＴ注射後に生成される可能性が高いことが示唆されている。滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）などの、ある特定の眼疾患が、個体の眼の両方に非同期的に発症し得ることを考えると、第１の眼へのＡＡＶのＩＶＴ投与後に生成されるｎＡｂは、例えば個体の対側眼への、治療用遺伝子移入の効率を低下させる可能性があり、効率的ベクター再投与を妨げる可能性があるという懸念がある。本明細書で提供される方法は、被験体の第１の眼へのｒＡＡＶ２に基づくベクターのＩＶＴ投与後の免疫（例えば、中和抗体または「ｎＡｂ」）の発生が、被験体の対側眼へのＩＶＴ注射によるベクターの投与後の形質導入を完全に遮断しないという、本出願人の発見に基づく。
処置方法
被験体における眼疾患もしくは障害を処置する、眼疾患もしくは障害の進行を緩徐化する、および／または眼疾患もしくは障害を防止する方法であって、（ｉ）医薬組成物の第１の単位用量を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、および（ｉｉ）医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップを含み、医薬組成物が、（ａ）抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、方法が、本明細書で提供される。
被験体における眼疾患もしくは障害を処置する、眼疾患もしくは障害の進行を緩徐化する、および／または眼疾患もしくは障害を防止する方法であって、（ｉ）医薬組成物の第１の単位用量を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、および（ｉｉ）医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップを含み、医薬組成物が、（ａ）抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、方法が、本明細書で提供される。
一部の実施形態では、方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前の被験体からの試料においてｒＡＡＶに対する中和抗体（ｎＡｂ）のレベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、血清試料、硝子体液試料、または房水試料である。一部の実施形態では、ｎＡｂのレベルを測定するステップは、ｒＡＡＶに対する中和抗体（ｎＡｂ）の効力を測定することを含む。一部の実施形態では、中和効力は、ｒＡＡＶ感染力がｎＡｂの非存在と比較して５０％低下されたｎＡｂ（例えば、血清ｎＡｂ）の濃度（すなわち、ＩＣ５０）と定義される、阻害濃度（ＩＣ）により定量される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子感染力は、ｒＡＡＶによって容易に形質導入される細胞型、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞、において細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定される。一部の実施形態では、ＩＣ５０は、ｎＡｂ含有試料がｒＡＡＶ粒子感染力の５０％低下を引き起こすために必要な希釈倍率として表される。例えば、ｎＡｂ含有試料が、ｒＡＡＶ感染力の５０％低下を引き起こすために１：５００希釈を必要とした場合、ＩＣ５０を５００と表すことができる。一部の実施形態では、ＩＣ５０は、約６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１２５または１００のうちのいずれか１つ未満である。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０週間のうちのいずれか１つ、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月のうちのいずれか１つ、または少なくとも約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０、１５もしくは２０年のうちのいずれか１つであり（これらの値の間の任意の範囲を含む）、被験体からの試料におけるｒＡＡＶに対する中和抗体（ｎＡｂ）のレベルを測定するステップは、この時間間隔内に行なわれる。
一部の実施形態では、第１の時点の後かつ第２の時点の前の被験体からの試料においてｒＡＡＶに対するｎＡｂのレベルを測定するステップは、カットポイントｎＡｂアッセイを用いて遂行される。カットポイントアッセイでは、被験試料により引き起こされるｒＡＡＶ感染力の阻害のレベルが、所定のカットポイントと比較され、このカットポイントより上では、試料がｎＡｂに対して陽性であると決定され、このカットポイントより下では試料が陰性であると決定される。カットポイントは、ｒＡＡＶナイーブ集団から採取された被験試料の所定のパーセンテージ（例えば、９５％）が入るレベル未満のレベルに設定される。
一部の実施形態では、方法は、第１の時点の後かつ第２の時点の前の被験体からの試料において抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸の発現レベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、硝子体液試料または房水試料である。一部の実施形態では、核酸の発現レベルは、抗ＶＥＧＦ剤をコードするｍＲＮＡの存在量（例えば、相対存在量）を決定することにより測定される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの存在量（例えば、相対存在量）は、ノーザンブロット、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または当技術分野において公知の他の方法によって決定される（例えば、定量される）。一部の実施形態では、核酸の発現レベルは、核酸によりコードされる抗ＶＥＧＦ剤の存在量（例えば、相対存在量）を決定することにより測定される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の存在量（例えば、相対存在量）は、ウェスタンブロット、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、または当技術分野において公知の他のイムノアッセイによって決定される（例えば、定量される）。一部の実施形態では、第１の時点と第２の時点との間の時間間隔は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０週間のうちのいずれか１つ、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月のうちのいずれか１つ、または少なくとも約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０、１５もしくは２０年のうちのいずれか１つであり（これらの値の間の任意の範囲を含む）、被験体からの試料における抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸の発現レベルを測定するステップは、この時間間隔内に行なわれる。
一部の実施形態では、第１および第２の単位用量は、各々、治療有効用量、例えば、標的細胞（例えば、網膜細胞）への核酸（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸）の効率的送達を確実にするのに十分な用量である。一部の実施形態では、第１の単位用量および第２の単位用量は、同じであり、例えば、約１Ｅ９～約３Ｅ１３の間のベクターゲノム、約１Ｅ１０～約１Ｅ１３の間のベクターゲノム、約１Ｅ１１～約１Ｅ１３の間のベクターゲノム、約１Ｅ１０～約３Ｅ１２の間のベクターゲノム、または約２Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、第２の単位用量は、第１の単位用量より多く、例えば、第１の単位用量の少なくとも約１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％または３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％または１０００％のうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。例えば、一部の実施形態では、第２の単位用量は、第１の単位用量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、３．２５倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍または１０倍のうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、第１の単位用量は、約６Ｅ１０ベクターゲノムを含み、第２の単位用量は、約１．８Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第２の単位用量は、約１．８Ｅ１１ベクターゲノムまたは約６Ｅ１１ベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第１の単位用量は、約２Ｅ１１ベクターゲノムを含み、第２の単位用量は、約６Ｅ１１～約２Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、第２の単位用量は、約６Ｅ１１ベクターゲノムまたは約２Ｅ１２ベクターゲノムを含む。単位用量に関するさらなる詳細は、本明細書中の他の箇所で提供される。一部の実施形態では、第１の単位用量の体積は、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０μＬのうちのいずれか１つ以下である。一部の実施形態では、第２の単位用量の体積は、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０μＬのうちのいずれか１つ以下である。
被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、医薬組成物の単位用量を被験体の片側の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップを含み、医薬組成物が、（ａ）治療用タンパク質、例えば抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤、をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含み、被験体が、ＩＶＴ注射による対側眼への医薬組成物の先行単位用量の投与を受けたものである、方法も本明細書で提供される。
一部の実施形態では、方法は、対側眼への医薬組成物の投与後かつ片側の眼への医薬組成物の投与前の被験体からの試料においてｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、血清試料、硝子体液試料、または房水試料である。一部の実施形態では、ｎＡｂのレベルを測定するステップは、ｒＡＡＶに対する中和抗体（ｎＡｂ）の効力を測定することを含む。一部の実施形態では、中和効力は、ｒＡＡＶ感染力がｎＡｂの非存在と比較して５０％低下されたｎＡｂ（例えば、血清ｎＡｂ）の濃度（すなわち、ＩＣ５０）と定義される、阻害濃度（ＩＣ）により定量される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子感染力は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定される。一部の実施形態では、ＩＣ５０は、ｎＡｂ含有試料がｒＡＡＶ粒子感染力の５０％低下を引き起こすために必要な希釈倍率として表される。例えば、ｎＡｂ含有試料が、ｒＡＡＶ感染力の５０％低下を引き起こすために１：５００希釈を必要とした場合、ＩＣ５０を５００と表すことができる。一部の実施形態では、ＩＣ５０は、約６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０または２００のうちのいずれか１つ未満である。一部の実施形態では、医薬組成物の先行単位用量を対側眼に投与するステップと医薬組成物の単位用量を片側の眼に投与するステップとの間の時間間隔は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０週間のうちのいずれか１つ、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月のうちのいずれか１つ、または少なくとも約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０、１５もしくは２０年のうちのいずれか１つであり（これらの値の間の任意の範囲を含む）、被験体からの試料におけるｒＡＡＶに対する中和抗体（ｎＡｂ）のレベルを測定するステップは、この時間間隔内に行なわれる。一部の実施形態では、被験体からの試料中のｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルは、本明細書中の他の箇所で説明されるカットポイントｎＡｂアッセイによって測定される。
一部の実施形態では、方法は、対側眼への医薬組成物の投与後かつ片側の眼への医薬組成物の投与前の被験体からの試料において抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸の発現レベルを測定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、試料は、硝子体液試料または房水試料である。一部の実施形態では、核酸の発現レベルは、抗ＶＥＧＦ剤をコードするｍＲＮＡの存在量（例えば、相対存在量）を決定することにより測定される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの存在量（例えば、相対存在量）は、ノーザンブロット、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、または当技術分野において公知の他の方法によって決定される（例えば、定量される）。一部の実施形態では、核酸の発現レベルは、核酸によりコードされる抗ＶＥＧＦ剤の存在量（例えば、相対存在量）を決定することにより測定される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の存在量（例えば、相対存在量）は、ウェスタンブロット、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、または当技術分野において公知の他のイムノアッセイによって決定される（例えば、定量される）。一部の実施形態では、医薬組成物の先行単位用量を対側眼に投与するステップと医薬組成物の単位用量を片側の眼に投与するステップとの間の時間間隔は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０週間のうちのいずれか１つ、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月のうちのいずれか１つ、または少なくとも約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、１０、１５もしくは２０年のうちのいずれか１つであり（これらの値の間の任意の範囲を含む）、被験体からの試料における抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸の発現レベルを測定するステップは、この時間間隔内に行なわれる。
一部の実施形態では、単位用量は、治療有効用量、例えば、標的細胞（例えば、網膜細胞）への核酸（例えば、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸）の効率的送達を確実にするのに十分な用量である。一部の実施形態では、先行単位用量は、治療有効用量であった。一部の実施形態では、単位用量および先行単位用量は、同じであり、例えば、約１Ｅ９～約３Ｅ１３の間のベクターゲノム、約１Ｅ１０～約１Ｅ１３の間のベクターゲノム、約１Ｅ１１～約１Ｅ１３の間のベクターゲノム、約１Ｅ１０～約３Ｅ１２の間のベクターゲノム、または約２Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、単位用量は、先行単位用量より多く、例えば、先行単位用量の少なくとも約１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％または３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％または１０００％のうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。例えば、一部の実施形態では、単位用量は、先行単位用量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、３．２５倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍または１０倍のうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、先行単位用量は約６Ｅ１０ベクターゲノムを含んでいたが、単位用量は、約１．８Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１．８Ｅ１１ベクターゲノムまたは約６Ｅ１１ベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、先行単位用量は、約２Ｅ１１ベクターゲノムを含んでいたが、単位用量は、約６Ｅ１１～約２Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約６Ｅ１１ベクターゲノムまたは約２Ｅ１２ベクターゲノムを含む。単位用量に関するさらなる詳細は、本明細書中の他の箇所で提供される。一部の実施形態では、単位用量の体積は、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０μＬのうちのいずれか１つ以下である。一部の実施形態では、先行単位用量の体積は、約１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０μＬのうちのいずれか１つ以下であった。
一部の実施形態では、眼疾患または障害を処置するために被験体に投与されるｒＡＡＶ粒子は、バリアントカプシドタンパク質を含み、バリアントカプシドタンパク質は、対応する親カプシドタンパク質と比較してカプシドタンパク質ＧＨループ内へのペプチドの挿入を含み、挿入は、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号３）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号６）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号７）、ＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号９）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１０）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号１１）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号１２）から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、挿入部位は、配列番号１３に記載のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５７０～６１１内にあるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置である。一部の実施形態では、眼疾患または障害を処置するために被験体に投与されるｒＡＡＶ粒子は、配列番号１３の５８７位と５８８位との間に挿入されたアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）を含むｒＡＡＶ２粒子である。配列番号１３のアミノ酸配列は、下記に提供される：
一部の実施形態では、眼疾患または障害を処置するために被験体に投与されるｒＡＡＶ粒子は、下記に提供される配列番号４６のアミノ酸配列を含むｒＡＡＶ２粒子である：
一部の実施形態では、眼疾患または障害を処置するために被験体に投与されるｒＡＡＶ粒子は、バリアントカプシドタンパク質を含み、バリアントカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してペプチド挿入を含み、ペプチド挿入は、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号３）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号６）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号７）、ＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号９）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１０）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号１１）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号１２）から選択されるアミノ酸配列を有し、挿入部位は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０および６１１に対応するアミノ酸の間の位置におけるまたは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置における２つの隣接アミノ酸間に位置する。
一部の実施形態では、眼疾患または障害を処置するために被験体に投与されるｒＡＡＶ粒子は、バリアントカプシドタンパク質を含み、バリアントカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号１）を含み、アミノ酸残基番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応する。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質であるかまたはＡＡＶ５とＡＡＶ２のハイブリッドカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、「ＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質」または「ＡＡＶ２．５Ｔバリアント」は、米国特許第９，４４１，２４４号に記載されているＡＡＶ２およびＡＡＶ５からの領域を含有するハイブリッドカプシドを指し、前記参考特許文献の開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ２．５Ｔは、網膜下送達されたときに網膜に形質導入することができるが、硝子体内注射されたときには形質導入できない。ＡＡＶ２．５Ｔ形質導入は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を豊富に含む内境界膜（ＩＬＭ）により遮断され得る。ＡＡＶ２．５Ｔの表面露出ドメインは、ＡＡＶ５の表面露出ドメインと、ＡＡＶ２．５Ｔのａａ５８２（ＡＡＶ５のａａ５８１）におけるＡのＴへの単一置換を除いて同一であり、この変異は、ＡＡＶ５の典型的なシアル酸受容体結合に影響を与えることなく哺乳動物細胞における感染力を増加させるようである。ＡＡＶ５およびＡＡＶ２．５Ｔは、無視できるほどわずかなヘパリン硫酸結合を有し、その一方で、ＡＡＶ２は、ヘパリン硫酸に対して高い親和性を有する。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶである。一部の実施形態では、「ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ」または「ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶバリアント」は、バリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶバリアントを指し、このバリアントカプシドタンパク質は、ループ置換バリアントを含み、このループ置換バリアントは、ＡＡＶ２．５Ｔ、親ＡＡＶカプシドタンパク質、と比較してアミノ酸残基５７０～５７９にアミノ酸ループ配列ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含む。本願の方法とともに使用することができる組換えアデノ随伴ウイルスベクターに関するさらなる詳細は、本明細書中の他の箇所で提供される。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、またはラニビズマブである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトである。
一部の実施形態では、網膜細胞は、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素性上皮細胞である。
一部の実施形態では、眼疾患または障害は、異常な（例えば、過剰な）血管新生または新生血管を特徴とする。一部の実施形態では、眼疾患または障害は、例えば、脈絡膜新生血管、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、もしくはＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、または被験体における異常な（例えば、過剰な）新生血管を特徴とする任意の他の関連眼疾患もしくは障害である。一部の実施形態では、眼疾患または障害は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））での処置に対して応答性である疾患または障害である。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、現行の標準治療に対して応答性であるまたはＤＭＥ患者におけるＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥもしくはＤＲのための承認されている治療法のうちの少なくとも１つ、例えば、アフリベルセプト注射、ラニビズマブ注射、ブロルシズマブ注射、もしくはベバシズマブ注射に対して応答性である、眼疾患または障害を処置するために使用される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちのいずれか１つの相同性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を、網膜細胞に送達することができるベクターを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、カプシドタンパク質ＶＰ１（例えば、配列番号１３に記載のもの）の５８７位と５８８位との間に挿入されたアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）を含むバリアントカプシドタンパク質と、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちのいずれか１つの相同性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターｒＡＡＶ２バリアント、および薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むバリアントカプシドタンパク質と、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちのいずれか１つの相同性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターｒＡＡＶ２バリアント、および薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態では、核酸は、アフリベルセプトをコードする。
一部の実施形態では、医薬組成物は、ループ置換バリアントを含むバリアントカプシドタンパク質であって、ループ置換バリアントが、ＡＡＶ２．５Ｔ、親ＡＡＶカプシドタンパク質、と比較してアミノ酸残基５７０～５７９にアミノ酸ループ配列ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３）を含むバリアントカプシドタンパク質と、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のうちのいずれか１つの相同性）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクターｒＡＡＶ２．５Ｔバリアント、および薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態では、核酸は、アフリベルセプトをコードする。アフリベルセプトのタンパク質配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋデータベース、受託番号ＤＢ０８８８５で公開されている。一部の実施形態では、アフリベルセプトは、米国特許出願公開第２０１４／０３７１４３８号において開示されているような、タンパク質をコードする核酸配列を指す（例えば、図６を参照されたい）。
一部の実施形態では、ベクター（例えば、組換えアデノ随伴ウイルスベクター）により送達される核酸によりコードされるアフリベルセプト（またはその機能的断片もしくはその機能的バリアント）は、第１の眼および対側眼の標的細胞（例えば、網膜細胞）において治療用量で発現される。一部の実施形態では、アフリベルセプトは、第１の眼へのＩＶＴ注射による投与後、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月のうちのいずれか１つにわたって、または１２カ月より長く、例えば、少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５もしくは２０年にわたって（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む）、第１の眼および対側眼において治療用量で発現される。一部の実施形態では、アフリベルセプトは、対側眼へのＩＶＴ注射による投与後、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２カ月のうちのいずれか１つにわたって、または１２カ月より長く、例えば、少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５もしくは２０年うちのいずれか１つにわたって（これらの値のいずれかの間の任意の範囲を含む）、第１の眼およびその対側眼において治療用量で発現される。
一部の実施形態では、被験体は、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、アフリカミドリザルもしくはアカゲザル）である。一部の実施形態では、被験体は、アフリベルセプトでの処置に対して応答性である。一部の実施形態では、被験体は、アフリベルセプトでの前処置を受けていた（例えば、先行処置を受けていた）。ヒトの眼の体積は、非ヒト霊長類（例えば、アフリカミドリザル）の眼の体積のおおよそ２倍であり、ヒトの第１の眼に投与される用量（例えば、ベクターゲノムの数）は、非ヒト霊長類の第１の眼に投与される用量（例えば、ベクターゲノムの数）の約２倍であり、ヒトの第２の（対側）眼に投与される用量（例えば、ベクターゲノムの数）は、非ヒト霊長類の第２の（例えば、対側）眼に投与される用量（例えば、ベクターゲノムの数）の約２倍である。
単位用量／治療有効用量
一部の実施形態では、単位用量は、ベクター（例えば、ウイルスベクター）の治療有効量を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、例えば抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸の、標的細胞（例えば、網膜細胞）への効率的送達を確実にするのに十分な量である。一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）が、治療効果を生じさせるレベルで標的細胞（例えば、網膜細胞）に送達され、そこに発現されることを確実にするのに十分な量である。抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）での処置の例示的な治療効果としては、これらに限定されないが、眼疾患の１つもしくは複数の症状の発症の防止もしくは遅延、疾患の症状の経過の変更、眼疾患の１つもしくは複数の症状の進行の緩徐化、または眼疾患の１つもしくは複数の症状の逆転が挙げられる。本明細書中の他の箇所で説明される眼疾患の進行をモニタリングする方法は、周知であり、広く使用されている。
一部の実施形態では、単位用量は、ベクター（例えば、ウイルスベクター）の治療有効量を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、例えば抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸の、標的細胞（例えば、網膜細胞）への効率的送達を確実にするのに十分な量である。一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）が、治療効果を生じさせるレベルで標的細胞（例えば、網膜細胞）に送達され、そこに発現されることを確実にするのに十分な量である。抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）での処置の例示的な治療効果としては、これらに限定されないが、眼疾患の１つもしくは複数の症状の発症の防止もしくは遅延、疾患の症状の経過の変更、眼疾患の１つもしくは複数の症状の進行の緩徐化、または眼疾患の１つもしくは複数の症状の逆転が挙げられる。本明細書中の他の箇所で説明される眼疾患の進行をモニタリングする方法は、周知であり、広く使用されている。
一部の実施形態では、単位用量（例えば、治療有効量）は、被験体に投与されるベクターゲノムの数として表される。一部の実施形態では、ウイルスベクターの単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０１０～約２×１０１０の間、約２×１０１０～約３×１０１０の間、約３×１０１０～約４×１０１０の間、約４×１０１０～約５×１０１０の間、約５×１０１０～約６×１０１０の間、約６×１０１０～約７×１０１０の間、約７×１０１０～約８×１０１０の間、約８×１０１０～約９×１０１０の間、約９×１０１０～約１０×１０１０の間、約１×１０１１～約２×１０１１の間、約２×１０１１～約３×１０１１の間、約３×１０１１～約４×１０１１の間、約４×１０１１～約５×１０１１の間、約５×１０１１～約６×１０１１の間、約６×１０１１～約７×１０１１の間、約７×１０１１～約８×１０１１の間、約８×１０１１～約９×１０１１の間、約９×１０１１～約１０×１０１１の間、約１×１０１２～約２×１０１２の間、約２×１０１２～約３×１０１２の間、約３×１０１２～約４×１０１２の間、約４×１０１２～約５×１０１２の間、約５×１０１２～約６×１０１２の間、約６×１０１２～約７×１０１２の間、約７×１０１２～約８×１０１２の間、約８×１０１２～約９×１０１２の間、約９×１０１２～約１０×１０１２の間、約１×１０１３～約２×１０１３の間、約２×１０１３～約３×１０１３の間、約３×１０１３～約４×１０１３の間、約４×１０１３～約５×１０１３の間、約５×１０１３～約６×１０１３の間、約６×１０１３～約７×１０１３の間、約７×１０１３～約８×１０１３の間、約８×１０１３～約９×１０１３の間、または約９×１０１３～約１０×１０１３の間のベクターゲノムである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。
一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約２．１×１０１２ベクターゲノムである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約２×１０１２～約６×１０１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１０１０～約１０１３の間、約１０１０～約１０１１の間、約１０１１～約１０１２の間、約１０１２～約１０１３の間、約１０１３～約１０１４の間、約２×１０１１～約４×１０１１の間、約３×１０１１～約５×１０１１の間、約４×１０１１～約６×１０１１の間、約５×１０１１～約７×１０１１の間、約６×１０１１～約８×１０１１の間、約７×１０１１～約９×１０１１の間、約８×１０１１～約１０×１０１１の間、約１×１０１２～約３×１０１２の間、約２×１０１２～約４×１０１２の間、約３×１０１２～約５×１０１２の間、約４×１０１２～約６×１０１２の間、約５×１０１２～約７×１０１２の間、約６×１０１２～約８×１０１２の間、約７×１０１２～約９×１０１２の間、約８×１０１２～約１０×１０１２の間、約１×１０１３～約５×１０１３の間、約５×１０１３～約１×１０１４の間、約１０１２～約５×１０１２の間、または約５×１０１２～約１×１０１３の間のベクターゲノムである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８またはＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０１０～約１×１０１３の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０９～約１×１０１４ベクターゲノムである。
一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０１０～約１×１０１１ベクターゲノムである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０８～約１×１０１５ベクターゲノムである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ベクターゲノムのうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、１×１０８～１×１０１５ベクターゲノムである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、多くとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ベクターゲノムのうちのいずれか１つである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１０～１０１２の間、１０１２～１０１３の間、１０１１～１０１３の間、１０１２～１０１３の間、１０１２～１０１４の間、１０１１～１０１４の間、１０１１～１０１５の間、１０１２～１０１５の間、１０１３～１０１４の間、１０１４～１０１５の間、１０１５～１０１６の間、１０１６～１０１７の間、１０１７～１０１８の間、１０１８～１０１９の間、または１０１９～１０２０の間のベクターゲノムである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。
一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～３×１０１０の間、３×１０１０～４×１０１０の間、４×１０１０～５×１０１０の間、５×１０１０～６×１０１０の間、６×１０１０～７×１０１０の間、７×１０１０～８×１０１０の間、８×１０１０～９×１０１０の間、９×１０１０～１０×１０１０の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～３×１０１１の間、２×１０１１～２．５×１０１１の間、２．５×１０１１～３×１０１１の間、３×１０１１～４×１０１１の間、４×１０１１～５×１０１１の間、５×１０１１～６×１０１１の間、６×１０１１～７×１０１１の間、７×１０１１～８×１０１１の間、８×１０１１～９×１０１１の間、９×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～２×１０１２の間、２×１０１２～３×１０１２の間、２．５×１０１２～３×１０１２の間、３×１０１２～４×１０１２の間、４×１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～６×１０１２の間、６×１０１２～７×１０１２の間、７×１０１２～８×１０１２の間、８×１０１２～９×１０１２の間、９×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間、または９×１０１３～１０×１０１３の間のベクターゲノムである。
一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、２．１×１０１１～２．１×１０１２ベクターゲノムの間である。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、１０１０～１０１３の間、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１２～１０１３または１０１３～１０１４の間のベクターゲノムである。
一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効量）は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～４×１０１０の間、３×１０１０～５×１０１０の間、４×１０１０～６×１０１０の間、５×１０１０～７×１０１０の間、６×１０１０～８×１０１０の間、７×１０１０～９×１０１０の間、８×１０１０～１０１１の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～１×１０１３の間、７×１０１２～１×１０１３の間、８×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～４×１０１３の間、１×１０１３～３×１０１３の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間、または８×１０１３～１×１０１４の間のベクターゲノムである。
一部の実施形態では、ベクターゲノムの単位用量（例えば、治療有効量）は、例えば、被験体に投与される医薬組成物中に存在するウイルスベクターの凝集を回避するために、本明細書に記載される値の低い方の範囲から選択される。一部の実施形態では、ベクターゲノムの単位用量（例えば、治療有効量）は、例えば、標的細胞への治療用導入遺伝子の効率的送達を確実にするために、本明細書に記載される値の高い方の範囲から選択される。一部の実施形態では、単位用量（例えば、治療有効用量）は、硝子体内注射に関連する有害作用、例えば、眼内圧上昇、炎症、刺激または疼痛を低減することができる、より小さい注射体積を可能にするために、本明細書に記載される値の高い方の範囲から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１Ｅ１０、約１．５Ｅ１０、約２Ｅ１０、約２．５Ｅ１０、約３Ｅ１０、約３．５Ｅ１０、約４Ｅ１０、約４．５Ｅ１０、約５Ｅ１０、約５．５Ｅ１０、約６Ｅ１０、約６．５Ｅ１０、約７Ｅ１０、約７．５Ｅ１０、約８Ｅ１０、約８．５Ｅ１０、約９Ｅ１０、約９．５Ｅ１０、約１Ｅ１１、約１．５Ｅ１１、約２Ｅ１１、約２．５Ｅ１１、約３Ｅ１１、約３．５Ｅ１１、約４Ｅ１１、約４．５Ｅ１１、約５Ｅ１１、約５．５Ｅ１１、約６Ｅ１１、約６．５Ｅ１１、約７Ｅ１１、約７．５Ｅ１１、約８Ｅ１１、約８．５Ｅ１１、約９Ｅ１１、約９．５Ｅ１１、約１Ｅ１２、約１．３Ｅ１２、約１．５Ｅ１２、約２Ｅ１２、約２．１Ｅ１２、約２．３Ｅ１２、約２．５Ｅ１２、約２．７Ｅ１２、約２．９Ｅ１２、約３Ｅ１２、約３．１Ｅ１２、約３．３Ｅ１２、約３．５Ｅ１２、約３．７Ｅ１２、約３．９Ｅ１２、約４Ｅ１２、約４．１Ｅ１２、約４．３Ｅ１２、約４．５Ｅ１２、約４．７Ｅ１２、約４．９Ｅ１２、約５Ｅ１２、約５．１Ｅ１２、約５．３Ｅ１２、約５．５Ｅ１２、約５．７Ｅ１２、約５．９Ｅ１２、約６Ｅ１２、約６．１Ｅ１２、約６．３Ｅ１２、約６．５Ｅ１２、約６．７Ｅ１２、約６．９Ｅ１２、約７Ｅ１２、約７．１Ｅ１２、約７．３Ｅ１２、約７．５Ｅ１２、約７．７Ｅ１２、約７．９Ｅ１２、約８Ｅ１２、約８．１Ｅ１２、約８．３Ｅ１２、約８．５Ｅ１２、約８．７Ｅ１２、約８．９Ｅ１２、約９Ｅ１２、約９．１Ｅ１２、約９．３Ｅ１２、約９．５Ｅ１２、約９．７Ｅ１２、約９．９Ｅ１２、約１．０１Ｅ１３、約１．０３Ｅ１３、約１．０５Ｅ１３、約１．０７Ｅ１３、約１．０９Ｅ１３、約１．１Ｅ１３、約１．１５Ｅ１３、約１．２Ｅ１３、約１．２５Ｅ１３、約１．３Ｅ１３、約１．３５Ｅ１３、約１．４Ｅ１３、約１．４５Ｅ１３、約１．５Ｅ１３、約１．５５Ｅ１３、約１．６Ｅ１３、約１．６５Ｅ１３、約１．７Ｅ１３、約１．７５Ｅ１３、約１．８Ｅ１３、約１．８５Ｅ１３、約１．９Ｅ１３、約１．９５Ｅ１３、約２．０Ｅ１３、約２．５Ｅ１３、約３．０Ｅ１３、約３．５Ｅ１３、約４．０Ｅ１３、約４．５Ｅ１３、約５．０Ｅ１３、約５．５Ｅ１３、約６．０Ｅ１３、約６．５Ｅ１３、約７．０Ｅ１３、約７．５Ｅ１３、約８．０Ｅ１３、約８．５Ｅ１３、約９．０Ｅ１３、約９．５Ｅ１３、または約１Ｅ１４ベクターゲノムであり（これらの値の間の任意の範囲を含む）、Ｅは、べき乗の基数１０の略語であり、ｘＥｙは、基数１０のｙ乗／指数を掛けたｘを指す。一部の実施形態では、単位用量は、約１Ｅ９～約３Ｅ１３のベクターゲノムの間、約１Ｅ１０～約１Ｅ１３のベクターゲノムの間、約１Ｅ１１～約１Ｅ１３のベクターゲノムの間、約１Ｅ１０～約３Ｅ１２のベクターゲノムの間、または約２Ｅ１２～約６Ｅ１２のベクターゲノムの間である（例えば、それらを含む）。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの単位用量（例えば、治療有効量）は、感染多重度（ＭＯＩ）として表される。一部の場合には、ＭＯＩは、異種核酸（例えば、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸）が送達される標的細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比を指す。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、１×１０６のＭＯＩである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のうちのいずれか１つのＭＯＩである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０８～約１×１０１５の間のＭＯＩである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のうちのいずれか１つの値以下のＭＯＩである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えば、ｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～４×１０１０の間、３×１０１０～５×１０１０の間、４×１０１０～６×１０１０の間、５×１０１０～７×１０１０の間、６×１０１０～８×１０１０の間、７×１０１０～９×１０１０の間、８×１０１０～１０１１の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～１×１０１３の間、７×１０１２～１×１０１３の間、８×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～４×１０１３の間、１×１０１３～３×１０１３の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間、または８×１０１３～１×１０１４の間のＭＯＩである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの単位用量（例えば、治療有効量）は、ｐｆｕ（プラーク形成単位）として表される。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０８～約１×１０１２ｐｆｕの間である。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、最少約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１または１×１０１２ｐｆｕのうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶ２．７ｍ８）の単位用量（例えば、治療有効量）は、約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１または１×１０１２ｐｆｕのうちのいずれか１つである（これらの値の間の任意の範囲を含む）。
一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、硝子体液において治療用タンパク質（例えば、抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト）の発現を引き起こして、約０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．５、０．９５または１．０μｇ／ｍｌ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つの濃度を得るために十分な量である。一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、網膜において治療用タンパク質（例えば、抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト）の発現を引き起こして、少なくとも約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５または１．０μｇ／ｍｌ（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度を得るために十分な量である。一部の実施形態では、ウイルスベクターの治療有効量は、脈絡膜において治療用タンパク質（例えば、抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト）の発現を引き起こして、約０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．５、０．９５または１．０μｇ／ｍｌ（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つの濃度を得るために十分な量である。
一部の実施形態では、被験体に投与されるウイルスベクターの用量（例えば、単位用量）は、被験体への用量の投与が、眼疾患または障害の少なくとも１つの症状を低減する、停止させる、または防止する場合、治療上有効である。異常な（例えば、過剰な）血管新生を特徴とする眼疾患または障害の場合、そのような症状は、これらに限定されないが、例えば、視覚の歪み（例えば、色覚障害、霧視、中心視力低下）および視力喪失を含む。一部の実施形態では、被験体に投与されるウイルスベクターの用量（例えば、単位用量）は、被験体への用量の投与が疾患の１つまたは複数の臨床的特徴の維持、部分的消散または完全消散をもたらす場合、治療上有効である。例えば、被験体に投与されるウイルスベクターの用量（例えば、単位用量）は、被験体への用量の投与が、（ａ）光干渉断層撮影（ＯＣＴ）により測定した眼疾患の完全消散、部分的消散または維持、（ｂ）最良矯正視力の増加および／または維持（例えば、ＥＤＴＲＳ視力チャート、アムスラーグリッドなどにより評価される）、（ｃ）蛍光眼底撮影（ＦＡ）によって測定した過蛍光の維持または低減をもたらす場合、治療上有効である。
標的細胞に導入遺伝子を送達する例示的ベクター
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする異種核酸の標的細胞（例えば、網膜細胞）への送達は、任意の好適なベクター（「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」とも呼ばれる）を使用して行なわれる。一部の実施形態では、ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、異種核酸を含み、その異種核酸を標的細胞に送達することができる、巨大分子または分子の複合体である。一部の実施形態では、標的細胞は、網膜細胞、例えば、網膜を構成する細胞型のいずれか、例えば、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素性上皮細胞である。一部の実施形態では、標的細胞は、核酸分子または遺伝子が送達される任意の細胞である。一部の実施形態では、異種核酸は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする。一部の実施形態では、ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、硝子体内注射（ＩＶＴ）による被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）の眼への投与のために製剤化されるまたはそのような投与に適応する医薬組成物中に存在する。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする異種核酸の標的細胞（例えば、網膜細胞）への送達は、任意の好適なベクター（「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」とも呼ばれる）を使用して行なわれる。一部の実施形態では、ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、異種核酸を含み、その異種核酸を標的細胞に送達することができる、巨大分子または分子の複合体である。一部の実施形態では、標的細胞は、網膜細胞、例えば、網膜を構成する細胞型のいずれか、例えば、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素性上皮細胞である。一部の実施形態では、標的細胞は、核酸分子または遺伝子が送達される任意の細胞である。一部の実施形態では、異種核酸は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする。一部の実施形態では、ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、硝子体内注射（ＩＶＴ）による被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）の眼への投与のために製剤化されるまたはそのような投与に適応する医薬組成物中に存在する。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスもしくはレンチウイルスまたはハイブリッドウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルスベクター）は、強力な真核生物プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたは構成的プロモーター）に作動可能に連結されている異種核酸（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸）を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルスベクター）は、少なくとも１つの（例えば、１つより多くの）核酸分子を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの（例えば、１つより多くの）核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡである。一部の実施形態では、ウイルスベクター（例えば、組換えウイルスベクター）は、ＤＮＡとＲＮＡの両方を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、例えば、イントロン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、終結配列およびこれらに類するものを含む、転写物（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤の転写物）である。一部の実施形態では、ＤＮＡは、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードし、必要に応じて、プロモーター配列、ＵＴＲ、終結配列およびこれらに類するものをさらに含む。一部の実施形態では、ベクターは、異種核酸（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸）をその異種核酸が発現される標的細胞（例えば、網膜細胞）に送達することができる、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態では、異種核酸の発現は、標的組織において治療効果を発揮する。
一部の実施形態では、ベクターは、被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）において複製欠損であるように変更されたアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する組換えウイルスベクターである。一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態では、異種核酸（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸）は、標的細胞ゲノム（例えば、網膜細胞ゲノム）と一体化し、その結果、標的細胞において、例えば抗ＶＥＧＦ剤（例えばアフリベルセプト）の、長期発現をもたらす。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、異種核酸（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸）を含むプラスミドまたは他の染色体外遺伝子エレメントを、標的細胞（例えば、網膜細胞）に送達する。
ＡＡＶまたはｒＡＡＶは、非エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。ｒＡＡＶは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、ｒＡＡＶを、複製がアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびＣＭＶをはじめとするヘルパーウイルスに依存性になるように作製することができる。野生型（ｗｔ）ＡＡＶへの曝露は、いずれかのヒトの病理を引き起こすことに関連付けられていることも、いずれかのヒトの病理を引き起こすことが公知であることもなく、一般集団に多く見られ、そのためＡＡＶまたはｒＡＡＶは、遺伝子治療に好適な送達系とされる。抗ＶＥＧＦ剤、例えばアフリベルセプト、の送達のために遺伝子治療に使用されるＡＡＶおよびｒＡＡＶは、任意の血清型のものであり得る。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物および方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、およびこれらの任意のハイブリッドまたはキメラＡＡＶを含む、任意の好適なＡＡＶ血清型の使用を提供する。一部の実施形態では、使用される血清型は、ウイルスの指向性、または目的の標的細胞に対する感染力に基づく。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸配列を硝子体内または網膜下注射によって被験体の眼または網膜細胞に送達するために、ＡＡＶ２またはｒＡＡＶ２が使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）の核酸配列を被験体の網膜細胞に送達するために、ｒＡＡＶ２．７ｍ８が使用される。
一部の実施形態では、被験体において網膜細胞に対する形質導入を増加させるためにまたは網膜細胞への遺伝子送達の標的化を増加させるために、標的細胞、例えば網膜細胞、に対する感染力が増加したバリアントカプシドタンパク質を含む、ＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス、粒子またはビリオンが使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質ＧＨループ／ループＩＶにおけるアミノ酸改変を含む。一部の実施形態では、改変の部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループ／ループＩＶの、溶媒がアクセス可能な部分である。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶの説明については、例えば、van Vliet et al. (2006) Mol. Ther. 14:809；Padron et al. (2005) J. Virol. 79:5047；およびShen et al. (2007) Mol. Ther. 15:1955を参照されたい。７ｍ８バリアントをはじめとする、いくつかのＡＡＶカプシドバリアントが、公知である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してカプシドタンパク質のＧＨループ内への５アミノ酸～１１アミノ酸、例えば７アミノ酸配列、の挿入を含む、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含み、このバリアントカプシドタンパク質は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子による網膜細胞に対する感染力と比較して、網膜細胞に対する感染力の増加をもたらす。一部の実施形態では、次のアミノ酸配列のいずれか１つをカプシドタンパク質のＧＨループ内に挿入することができる：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号３）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号６）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号７）、ＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号９）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１０）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号１１）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号１２）、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１４）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１５）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１６）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１７）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１８）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１９）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号２０）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号２１）。一部の実施形態では、配列番号１～１２および１４～２１に記載のアミノ酸配列のいずれか１つが、ｒＡＡＶのＶＰ１カプシドタンパク質の溶媒露出ＧＨループ内に挿入される。例えば、ＩＶＴ注射後の、網膜細胞への目的の核酸の形質導入を促進するために、カプシドタンパク質のＧＨループに挿入することができるアミノ酸配列に関するさらなる詳細は、ＷＯ２０１２１４５６０１において提供されており、前記参考特許文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、アフリベルセプトを含むｒＡＡＶ．７ｍ８が遺伝子治療に使用される。
一部の実施形態では、次のアミノ酸配列：ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号３）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号６）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号７）、ＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号９）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１０）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号１１）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号１２）、ＬＧＥＴＴＲＰ（配列番号１４）、ＮＥＴＩＴＲＰ（配列番号１５）、ＫＡＧＱＡＮＮ（配列番号１６）、ＫＤＰＫＴＴＮ（配列番号１７）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号１８）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号１９）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号２０）、およびＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号２１）のうちのいずれか１つを、遺伝子治療に使用するためのｒＡＡＶバリアントを生成するために次の位置に挿入することができる：ＡＡＶ２カプシドタンパク質の５８７位と５８８位との間、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５と５７６との間、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間、またはＡＡＶ１０カプシドタンパク質のアミノ酸５８９と５９０との間。
一部の実施形態では、遺伝子治療に使用されるバリアントカプシドタンパク質を含むＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス、粒子またはビリオンは、硝子体内投与されたとき、その天然、野生型および／または親カプシドタンパク質を含む対応するウイルスベクターと比較して、次の特性の１つまたは複数を示す：１）網膜細胞に対する感染力の増加、２）指向性の変更、３）ヘパリンおよび／またはヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび／または内境界膜（ＩＬＭ）への結合の増加、ならびに４）感染し、および／またはＩＬＭを横断して治療用遺伝子産物を送達する能力の増加。一部の実施形態では、遺伝子治療に使用されるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号３７）を含み、アミノ酸残基番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応する。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、Ｘ１Ｘ２ＨＫＦＫＳＧＤＸ３（配列番号３８）を含み、アミノ酸残基番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応し、配列式中のＸ１～３は、独立して、任意のアミノ酸であり得る。一部の実施形態では、Ｘ１～３の各々は、独立して、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される。一部の実施形態では、各Ｘ１～３の各々は、独立して、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳおよびＴから選択される。一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｌである。一部の実施形態では、Ｘ２は、Ａである。一部の実施形態では、Ｘ３は、Ａである。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変配列を含み、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３９）、配列番号３９との少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有する配列、配列番号３９との少なくとも８０％または少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、あるいは配列番号３９内の４つもしくはそれより多くの、５つもしくはそれより多くの、６つもしくはそれより多くの、７つもしくはそれより多くの、８つもしくはそれより多くの、または９つもしくはそれより多くの連続するアミノ酸を有する配列を含み、アミノ酸残基番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応する。一部の実施形態では、改変配列は、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３９）を含む。
一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ１０）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶカプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質（配列番号４０）のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質のバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ハイブリッドカプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２とＡＡＶ５のハイブリッドである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔであるか、またはＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔであるか、またはＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質である。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質であるか、またはＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質（配列番号４１）に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するそのバリアントである。一部の実施形態では、親ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質であるか、またはＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質（配列番号４１）に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するそのバリアントである。
一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４０または配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４０または配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４２（ＡＡＶ５．ＬＳＶ１ ＶＰ１）または配列番号４３（ＡＡＶ２．５Ｔ．ＬＳＶ１ ＶＰ１）に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４２または配列番号４３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４２または配列番号４３を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４２を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４３を含む。配列番号４０、４１、４２および４３のアミノ酸配列は、下記に提供される：
一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４４（ＡＡＶ５．ＬＳＶ１ ＶＰ２）または配列番号４５（ＡＡＶ５．ＬＳＶ１ ＶＰ３）に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４４または配列番号４５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するカプシド配列を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４４または配列番号４５を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４４を含む。一部の実施形態では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４５を含む。配列番号４４および４５のアミノ酸配列は、下記に提供される：
上記ではＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質に対応するアミノ酸番号付けを使用してカプシドタンパク質のアミノ酸改変（特異的アミノ酸置換および挿入を含む）に言及したが、これらのアミノ酸改変のいずれかを、他の血清型のＡＡＶのカプシドタンパク質内に、例えば、ＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のものに対応する位置に、導入することもできることは、理解されよう。ＡＡＶタンパク質配列は、有意な相同性および同様のアミノ酸番号付けを共有するため、当業者は、上記でＡＡＶ５ ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３について具体的に説明したものに対応する、他のＡＡＶ血清型におけるアミノ酸残基を、容易に決定することができる。親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数の置換を含む改変配列（例えば、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号３７））を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質、および遺伝子治療におけるそれらの使用に関するさらなる詳細は、米国特許出願第６２／８３９，５４８号および米国特許出願第６２／９２３，９２４号において詳述されており、これらの参考特許文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする異種核酸は、異種核酸の転写を開始させるプロモーターの転写制御下にある。一部の実施形態では、プロモーターは、「強力な」または構成的に活性なプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、またはコネキシン３６（または「Ｃｘ３６」）プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、標的化されない細胞への潜在的毒性または望ましくない効果を低減させるために特異的組織または細胞、例えば網膜細胞、において活性化される組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスを生成するために使用される組換えウイルスおよび／またはプラスミドは、他の転写または調節エレメント、例えば、ポリＡ（ポリアデニル化）配列、非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、または終結配列を含む。一部の実施形態では、２つもしくはそれより多くのタンパク質の共発現を可能にする、または多重遺伝子もしくはポリシストロニックｍＲＮＡを生じさせる、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または同様のエレメントを使用して、ベクターまたはプラスミドから１つより多くの遺伝子が発現される。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ、および／またはｒＡＡＶを生成するために使用されるプラスミドは、次の核酸エレメントの１つまたは複数を含む：第１のＩＴＲ配列、プロモーター配列、イントロン配列、第１のＵＴＲ配列、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする異種核酸、第２のＵＴＲ配列、ポリＡ配列、および第２のＩＴＲ配列。一部の実施形態では、リンカー配列が、核酸エレメントのうちの２つまたはそれより多くの間に挿入される。一部の実施形態では、治療用ポリペプチドをコードする異種核酸は、アフリベルセプト（またはその機能的断片もしくは機能的バリアント）をコードする。
一部の実施形態では、自己相補型ベクター（ｓｃ）を使用することができる。自己相補型ＡＡＶベクターの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、Wu, Hum Gene Ther. 2007, 18(2):171-82により提供されているように、ウイルス第二鎖ＤＮＡ合成の必要を回避することができ、導入遺伝子タンパク質のより高い発現率をもたらすことができる。
一部の態様では、抗ＶＥＧＦ剤導入遺伝子（例えば、アフリベルセプト導入遺伝子）とともに使用するのに最も最適な血清型およびプロモーターの選択を可能にするために、いくつかのＡＡＶベクターが生成され得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、標的細胞（例えば、網膜細胞）における導入遺伝子（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤）の発現増強のためのポリヌクレオチドカセットを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、５’から３’へ順に、（ａ）ＣＭＶ配列（配列番号２２）を含む第１のエンハンサー領域、（ｂ）ＣＭＶ配列（配列番号２３）を含むプロモーター領域、（ｃ）５’から３’へ順にＴＰＬおよびｅＭＬＰ配列（それぞれ、配列番号２４および配列番号２５）を含む５’ＵＴＲ領域、（ｄ）ペプチドまたはポリペプチド（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤）をコードするコード配列、（ｅ）完全ＥＥＳ配列（配列番号２６）を含む第２のエンハンサー領域、ならびに（ｆ）ＨＧＨポリアデニル化部位（配列番号２７）を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号２８～３２から選択される１つもしくは複数の配列、またはその配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドカセットの５’アームは、配列番号３３、または配列番号３３に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチドカセットの３’アームは、配列番号３４、または配列番号３４に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。配列番号２２～３４の核酸配列は、下記に提供される：
標的細胞（例えば、網膜細胞）における導入遺伝子（例えば、アフリベルセプトなどの抗ＶＥＧＦ剤をコードする導入遺伝子）の発現増強のためのさらなるポリヌクレオチドカセットは、ＷＯ２０１８／１７０４７３において開示されており、この参考特許文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ベクターは、網膜細胞（例えば、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素性上皮細胞）などの特異的細胞に対してより高い感染力を示す、標的化されたベクター、特に、標的化されたｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）である。本開示における使用のためのベクターは、被験体において低い毒性および／または低い免疫原性を示すもの、ならびに被験体、例えばヒト患者、において治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）を発現するものを含むことができる。当技術分野において公知の任意の好適な方法を、例えば本明細書中の他の箇所で説明される医薬組成物の調製のために、組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）の生化学的精製において使用することができる。組換えＡＡＶウイルスを細胞から直接回収することができ、または細胞を含む培養培地から回収することができる。様々な生化学的手段、例えば、ゲル濾過、濾過、クロマトグラフィー、親和性精製、密度勾配超遠心分離またはサイズ排除法を使用して、ウイルスを精製することができる。一部の実施形態では、ウイルスは、凍結乾燥される。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、７ｍ８バリアントカプシドタンパク質、またはｒＡＡＶ２．７ｍ８と、被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）における抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト、またはその機能的断片もしくは機能的バリアント）をコードする核酸配列とを含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶバリアント（例えば、７ｍ８バリアント）の網膜細胞感染力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％である。一部の実施形態では、網膜細胞に対する感染力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、５％～１００％の間、５％～９５％の間、５％～９０％の間、５％～８５％の間、５％～８０％の間、５％～７５％の間、５％～７０％の間、５％～６５％の間、５％～６０％の間、５％～５５％の間、５％～５０％の間、５％～４５％の間、５％～４０％の間、５％～３５％の間、５％～３０％の間、５％～２５％の間、５％～２０％の間、５％～１５％の間、５％～１０％の間の増加である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶバリアントの網膜細胞感染力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍である。
一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、１０倍～１００倍の間、１０倍～９５倍の間、１０倍～９０倍の間、１０倍～８５倍の間、１０倍～８０倍の間、１０倍～７５倍の間、１０倍～７０倍の間、１０倍～６５倍の間、１０倍～６０倍の間、１０倍～５５倍の間、１０倍～５０倍の間、１０倍～４５倍の間、１０倍～４０倍の間、１０倍～３５倍の間、１０倍～３０倍の間、１０倍～２５倍の間、１０倍～２０倍の間、または１０倍～１５倍の間である。
一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、２倍～２０倍の間、２倍～１９倍の間、２倍～１８倍の間、２倍～１７倍の間、２倍～１６倍の間、２倍～１５倍の間、２倍～１４倍の間、２倍～１３倍の間、２倍～１２倍の間、２倍～１１倍の間、２倍～１０倍の間、２倍～９倍の間、２倍～８倍の間、２倍～７倍の間、２倍～６倍の間、２倍～５倍の間、２倍～４倍の間、または２倍～３倍の間である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるカプシドタンパク質のアミノ酸改変は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子の、被験体の眼のＩＬＭを横断する能力と比較して、霊長類またはヒト被験体の眼の内境界膜（ＩＬＭ）を横断する能力の増加をもたらすことができる。一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の増加である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、５％～１００％の間、５％～９５％の間、５％～９０％の間、５％～８５％の間、５％～８０％の間、５％～７５％の間、５％～７０％の間、５％～６５％の間、５％～６０％の間、５％～５５％の間、５％～５０％の間、５％～４５％の間、５％～４０％の間、５％～３５％の間、５％～３０％の間、５％～２５％の間、５％～２０％の間、５％～１５％の間、または５％～１０％の間の増加である。
一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍である。
一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、１０倍～１００倍の間、１０倍～９５倍の間、１０倍～９０倍の間、１０倍～８５倍の間、１０倍～８０倍の間、１０倍～７５倍の間、１０倍～７０倍の間、１０倍～６５倍の間、１０倍～６０倍の間、１０倍～５５倍の間、１０倍～５０倍の間、１０倍～４５倍の間、１０倍～４０倍の間、１０倍～３５倍の間、１０倍～３０倍の間、１０倍～２５倍の間、１０倍～２０倍の間、または１０倍～１５倍の間である。
一部の実施形態では、ＩＬＭを横断する能力の増加は、対応する親または非改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、２倍～２０倍の間、２倍～１９倍の間、２倍～１８倍の間、２倍～１７倍の間、２倍～１６倍の間、２倍～１５倍の間、２倍～１４倍の間、２倍～１３倍の間、２倍～１２倍の間、２倍～１１倍の間、２倍～１０倍の間、２倍～９倍の間、２倍～８倍の間、２倍～７倍の間、２倍～６倍の間、２倍～５倍の間、２倍～４倍の間、または２倍～３倍の間である。
標的細胞への送達のための例示的抗ＶＥＧＦ剤
一部の実施形態では、遺伝子治療は、硝子体内（ＩＶＴ）注射によって被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）に投与したときに抗ＶＥＧＦ剤をコードまたは発現する核酸配列を含む導入遺伝子を送達するために使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸配列を含む、本明細書に記載されるカプシドバリアント（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むｒＡＡＶは、被験体への硝子体内投与時に網膜細胞に抗ＶＥＧＦ剤遺伝子の配列を送達するために使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝子治療および硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする遺伝子は、その機能的断片または機能的バリアントを指す。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の「機能的断片」および／または「機能的バリアント」は、被験体に投与されたときに治療効果を生じさせることができる、抗ＶＥＧＦ剤の断片またはバリアントを指す。
一部の実施形態では、遺伝子治療は、硝子体内（ＩＶＴ）注射によって被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）に投与したときに抗ＶＥＧＦ剤をコードまたは発現する核酸配列を含む導入遺伝子を送達するために使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸配列を含む、本明細書に記載されるカプシドバリアント（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むｒＡＡＶは、被験体への硝子体内投与時に網膜細胞に抗ＶＥＧＦ剤遺伝子の配列を送達するために使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝子治療および硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする遺伝子は、その機能的断片または機能的バリアントを指す。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の「機能的断片」および／または「機能的バリアント」は、被験体に投与されたときに治療効果を生じさせることができる、抗ＶＥＧＦ剤の断片またはバリアントを指す。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、内在性ＶＥＧＦおよび／もしくは内在性ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の活性もしくは機能、またはＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲ相互作用もしくは経路を、ｉｎ ｖｉｖｏで低減させること、それに干渉すること、それを破壊すること、遮断することおよび／または阻害することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多量体タンパク質、遺伝子産物、抗体、ヒトモノクローナル抗体、抗体断片、アプタマー、キナーゼ阻害剤、受容体もしくは受容体断片、または核酸分子を含む、任意の治療剤である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、細胞、組織または被験体にｉｎ ｖｉｖｏで送達されたときに新しい血管の成長もしくは形成および／または浮腫または腫脹を低減させることができる、公知の治療剤のいずれか１つ、例えば、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、またはベバシズマブである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、天然に存在する、天然に存在しない、または合成のものである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤を天然に存在する分子から誘導することができ、その後、それを改変してまたは変異させて抗ＶＥＧＦ活性を付与した。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、融合またはキメラタンパク質である。そのようなタンパク質中の、機能的ドメインまたはポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦを隔離することができるまたはＶＥＧＦＲデコイとして機能することができる融合またはキメラタンパク質を作製するための部分またはポリペプチドと人工的に融合される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、内在性ＶＥＧＦＲがそのリガンドと相互作用するのを遮断する、融合またはキメラタンパク質である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ベバシズマブである。ベバシズマブ（Ｃａｓ登録番号２１６９７４－７５－３；Ｄｒｕｇｂａｎｋ受託番号ＤＢ００１１２）は、全てのＶＥＧＦ－Ａアイソフォームに結合し、ＶＥＧＦ－Ａを阻害することにより血管新生を遮断する、組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。Los, M.; Roodhart, J.M. L.; Voest, E. E. (2007). "Target Practice: Lessons from Phase III Trials with Bevacizumab and Vatalanib in the Treatment of Advanced Colorectal Cancer". The Oncologist. 12 (4): 443-50；Shih, T; Lindley, C (November 2006). "Bevacizumab: an angiogenesis inhibitor for the treatment of solid malignancies." Clinical therapeutics. 28 (11): 1779-802。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ラニビズマブである。ラニビズマブ（ＣＡＳ登録番号３４７３９６－８２－１；ＤｒｕｇＢａｎｋ受託番号ＤＢ０１２７０）は、組換えヒト化ＩｇＧ１カッパアイソタイプモノクローナル抗体断片（Ｆａｂ）であり、全てのＶＥＧＦ－Ａアイソフォームに、ベバシズマブより高い親和性で結合する。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ブロルシズマブである。ブロルシズマブ（ＣＡＳ登録番号１５３１５８９－１３－５）は、高い親和性で全てのＶＥＧＦ－Ａアイソフォームに結合するヒト化単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトである。アフリベルセプトのアミノ酸配列は、当技術分野において公知である：Ｃ４３１８Ｈ６７８８Ｎ１１６４Ｏ１３０４Ｓ３２、ＦＤＡ固有成分識別子（ＵＮＩＩ）は、１５Ｃ２ＶＬ４２７Ｄである。アフリベルセプトのアミノ酸配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋデータベース、受託番号ＤＢ０８８８５で入手可能である：
アフリベルセプトの核酸配列（配列番号３６）は、図６で提供される。
本明細書で使用される場合、「アフリベルセプト」は、上記で確認されるアフリベルセプトアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のもしくはそれより高い、または１００％の相同性を有するポリペプチドもしくはタンパク質配列、またはその機能的断片もしくはバリアントもしくは変異体を指す。相同性は、機能的断片；挿入、欠失、置換を含む配列；偽断片；偽遺伝子；スプライスバリアント；または人工最適化配列を含むがこれらに限定されない、２つの配列間のアラインメントの残基の保存％を指す。
一部の実施形態では、アフリベルセプトのアミノ酸配列は、配列番号３５のアフリベルセプトアミノ酸配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％相同である。一部の実施形態では、本明細書で開示される遺伝子治療またはｒＡＡＶに使用される核酸配列は、上記で確認されるアフリベルセプトアミノ酸配列の対応するｃＤＮＡ配列と比較され、アフリベルセプトの核酸配列（配列番号３６）間の少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％配列相同性を示す。一部の実施形態では、アフリベルセプトは、アフリベルセプトと（例えば、その二次、三次および四次構造またはコンフォメーションの点で）少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％空間的に相同である。一部の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物および方法のアフリベルセプトは、標準治療で使用されるアフリベルセプト（例えば、二次、三次および四次構造またはコンフォメーション）と多くとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％空間的に相同である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶに基づく遺伝子治療に含まれる場合の、アフリベルセプト遺伝子産物またはアフリベルセプト導入遺伝子は、本明細書で開示のカプシドバリアント（例えば、７ｍ８バリアント）を含むものであり、配列番号３５の上記アミノ酸配列に対してまたはアフリベルセプトの対応するｃＤＮＡ配列（例えば、配列番号３６と比較して遺伝子治療に使用されるアフリベルセプト配列のｃＤＮＡ）間で、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％の相同性を有するタンパク質、融合タンパク質またはポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および医薬組成物は、アフリベルセプトの機能的断片、またはそのバリアントもしくは変異体を含む。一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその活性、発現、安定性および／または溶解度を増強するように改変またはコドン最適化される。
一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、そのアミノ酸配列から誘導される。一部の実施形態では、アフリベルセプトの配列核酸は、被験体におけるその発現を向上させるためにコドン最適化される。
コドン最適化は、当技術分野において公知の任意の方法で達成することができる。コドン最適化は、目的の標的または宿主細胞、例えばヒト網膜細胞、における遺伝子の発現増強のために、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つのコドンまたはそれより多いコドン、約２つのコドンまたはそれより多いコドン、約３つのコドンまたはそれより多いコドン、約４つのコドンまたはそれより多いコドン、約５つのコドンまたはそれより多いコドン、約１０個のコドンまたはそれより多いコドン、約１５個のコドンまたはそれより多いコドン、約２０個のコドンまたはそれより多いコドン、約２５個のコドンまたはそれより多いコドン、約５０個のコドンまたはそれより多いコドン、約１００個のコドンまたはそれより多いコドン）を、天然アミノ酸配列を維持しながら宿主細胞においてより使用頻度の高いまたは最も使用頻度の高いコドンで置換することにより、核酸配列を改変するプロセスを指す。コドン使用頻度表は、容易に入手することができ、例えば、ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ｃｏｄｏｎ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ－ｔａｂｌｅにおけるＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｔａｂｌｅ Ｔｏｏｌ；ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｋａｚｕｓａ（ｄｏｔ）ｏｒ（ｄｏｔ）ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／におけるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ：およびNakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を含む。
アフリベルセプトは、１１５ｋＤａ融合タンパク質であり、グリコシル化されていることもある。アフリベルセプトは、ヒトＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２の細胞外ＶＥＧＦ受容体配列に融合されたＩｇＧ骨格を含み、その天然または内在性受容体より大きい親和性でＶＥＧＦ－Ａに結合することにより、可溶性デコイ受容体のように機能する。例えば、Stewart MW. Aflibercept (VEGF Trap-eye): the newest anti-VEGF drug. Br. J. Ophthalmol. 2012 Sep;96(9):1157-8を参照されたい。ＶＥＧＦに対するアフリベルセプトの高い親和性は、天然または内在性ＶＥＧＦ受容体のその後の結合および活性化に干渉するか、またはそのような結合および活性化を妨げる。ＶＥＧＦ活性の低下は、血管新生および血管透過性の減少を招き得る。アフリベルセプトによる胎盤増殖因子ＰＩＧＦおよびＶＥＧＦ－Ｂの阻害もまた、異常な（例えば、過剰な）血管新生および／または新生血管を特徴とする眼疾患または障害の処置に寄与し得る。ＰＩＧＦは、血管新生に関連付けられており、滲出型ＡＭＤなどの、ある特定の眼疾患または障害は、ＰＩＧＦレベルの上昇を伴い得る。ＶＥＧＦ－Ｂ過剰発現は、血液網膜関門の破壊および網膜血管新生を伴い得る。したがって、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、およびＰＩＧＦの阻害は、全て、アフリベルセプトの有効性に寄与し得る。
一部の実施形態では、アフリベルセプトの核酸配列は、霊長類またはヒト被験体における発現のため最適化される。アフリベルセプトアミノ酸配列に対応する合成遺伝子の構築は、文献、例えば、Kanda A, Noda K, Saito W, Ishida S. Aflibercept Traps Galectin-1, an Angiogenic Factor Associated with Diabetic Retinopathy. Scientific Reports 5:17946 (2015)（「ＶＥＧＦ－ＴｒａｐＲ１Ｒ２（アフリベルセプトに対応する）ｃＤＮＡがＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）により合成遺伝子として生成された」と記載している）に記載されている。アフリベルセプトの入手可能なアミノ酸配列を考慮すると、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、本明細書に記載される遺伝子治療またはｒＡＡＶにおいて使用するためのアフリベルセプトのｃＤＮＡを生成することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶ２．７ｍ８がアフリベルセプトのための遺伝子治療または送達系として使用される。ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトは、ｒＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１の５８７位と５８８位との間への７ｍ８挿入と、アフリベルセプトをコードする核酸配列とを含む、ｒＡＡＶ２を指す。
眼疾患または障害
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、各々の眼に非同期的に生じる眼疾患または障害の処置における使用に好適である。非同期的に生じ得る（先ず片側の眼に生じ、後に第２の眼において生じるか、または第２の眼には全く生じない）疾患の例としては、緑内障、ｗＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥ、ＤＲなどが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、両眼の同時処置が実行不可能である、得策でない、および／または安全でない、眼疾患または障害の処置における使用に好適である。一部の実施形態では、本明細書に記載の７ｍ８バリアント（例えば、ｒＡＡＶ２．７ｍ８）を含む任意の血清型のｒＡＡＶ粒子またはその医薬組成物は、例えば、異常な（例えば、過剰な）新生血管が各々の眼において非同期的に生じる、眼の異常な（例えば、過剰な）新生血管に関連する眼疾患または障害を処置するために、または少なくとも部分的に好転させるために、使用される。一部の実施形態では、カプシドバリアントタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子は、ヒト被験体の眼に抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアント）を送達するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、各々の眼に非同期的に生じる眼疾患または障害の処置における使用に好適である。非同期的に生じ得る（先ず片側の眼に生じ、後に第２の眼において生じるか、または第２の眼には全く生じない）疾患の例としては、緑内障、ｗＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥ、ＤＲなどが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、両眼の同時処置が実行不可能である、得策でない、および／または安全でない、眼疾患または障害の処置における使用に好適である。一部の実施形態では、本明細書に記載の７ｍ８バリアント（例えば、ｒＡＡＶ２．７ｍ８）を含む任意の血清型のｒＡＡＶ粒子またはその医薬組成物は、例えば、異常な（例えば、過剰な）新生血管が各々の眼において非同期的に生じる、眼の異常な（例えば、過剰な）新生血管に関連する眼疾患または障害を処置するために、または少なくとも部分的に好転させるために、使用される。一部の実施形態では、カプシドバリアントタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子は、ヒト被験体の眼に抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト、その機能的断片またはバリアント）を送達するために使用される。
抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブ、アフリベルセプトなど）での処置が承認されている眼疾患または障害としては、例えば、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、およびＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および医薬組成物は、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／またはアフリベルセプトが承認されているまたは適応となる眼疾患または障害を防止または処置するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子治療（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８に基づく遺伝子治療）は、ＣＮＶ、滲出型ＡＭＤ、萎縮型ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、ＲＶＯ後の黄斑浮腫、およびＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症を含むがこれらに限定されない、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／またはアフリベルセプトに対して応答性である眼疾患または障害を処置または防止するために使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子治療は、新生血管またはＣＮＶを特徴とする任意の眼疾患または障害を処置または防止するために使用される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法およびキットは、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、血管新生関連疾患、がん、自己免疫疾患、感染性疾患生物およびこれらに類するものなどの、疾患の処置のためのものである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される眼疾患または障害は、糖尿病性黄斑浮腫である。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、黄斑内の血管からの流体の漏出に起因する、糖尿病の際の網膜の腫脹である。黄斑は、網膜の中心部分であり、色を検出する特化した神経終末である錐体が豊富な小領域であり、昼間視力は錐体に依存する。黄斑浮腫が発症すると、中心視野の中央またはそのすぐ横でぼやけが起こる。糖尿病性黄斑浮腫による視力低下が数カ月かけて進行し、明瞭に焦点を合わせることを不可能にし得る。ＤＭＥの一般的な症状は、霧視、飛蚊症、複視であり、処置せずにおくと最終的には失明する。一部の実施形態では、本明細書で開示の方法および医薬組成物は、ＤＭＥを処置するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される眼疾患または障害は、網膜静脈閉塞症である。網膜静脈閉塞症は、網膜から血液を運び出す小静脈の遮断である。網膜は、光の像を神経シグナルに変換して脳に送る、眼内の背部にある組織の層である。網膜静脈閉塞症は、ほとんどの場合、動脈の硬化（アテローム性動脈硬化症）および血餅形成によって引き起こされる。網膜におけるより小さい静脈（分枝静脈またはＢＲＶＯ）の遮断は、多くの場合、アテローム性動脈硬化症により肥厚または硬化した網膜動脈が交差し、網膜静脈に圧力をかける場所で起こる。網膜静脈閉塞の症状は、片側の眼の全体または一部における突然のぼやけまたは視力喪失を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される眼疾患または障害は、滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）としても公知の、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）である。脈絡膜新生血管は、ブルッフ膜の破断によって脈絡膜から生じる新たな血管の、網膜色素上皮下（ｓｕｂ－ＲＰＥ）または網膜下腔への成長を伴うことがあり、失明の主な原因であり得る。ＣＮＶは、数週間以内に顕著な、突然の中心視力悪化を生じさせ得る。他の症状としては、色覚障害および変視症（直線が波うって見える歪み）を挙げることができる。新たな血管の出血は、ＣＮＶの症状の開始を加速し得る。ＣＮＶは、眼の奥の圧迫感も含み得る。
進行した「滲出型」形態（新生血管性または滲出性）のＡＭＤは、あまり見られないが、患者における中心視力の急速かつ多くの場合大幅な低下を引き起こし得ることが多い。滲出型形態のＡＭＤの場合、脈絡膜新生血管が形成され、発達して、網膜色素上皮の下でそしてそれを通り抜けて成長し得る血管網になる。これは、網膜下腔への血漿の漏出および／または出血を伴うので、黄斑において起こった場合、突然の重度の中心視力の低下が起こる可能性がある。用語「ＡＭＤ」は、他に指定がなければ、萎縮型ＡＭＤまたは滲出型ＡＭＤのいずれかであり得る。本開示は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤおよび／または萎縮型ＡＭＤの処置または防止を企図している。一部の実施形態では、本明細書で開示の方法および医薬組成物は、ＡＭＤを処置するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／またはアフリベルセプトでの処置に対して応答性である眼疾患または障害を防止または処置するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／またはアフリベルセプトでの先行処置を受けた被験体における眼疾患または障害を防止または処置するために使用される。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および医薬組成物、すなわち、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）を含むＡＡＶ遺伝子治療は、カラー眼底撮影に従ってＣＮＶ形成後にグレードＩＶ病変のパーセンテージにより測定した場合、ビヒクルまたは緩衝液対照と比較して、新生血管またはＣＮＶの少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％低減をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法および医薬組成物、すなわち、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）を含むＡＡＶ遺伝子治療は、カラー眼底撮影に従ってＣＮＶ形成後にグレードＩＶ病変のパーセンテージにより測定した場合、例えば、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）とまたは遺伝子療法に基づかない抗ＶＥＧＦ剤と同等である、新生血管またはＣＮＶの低減をもたらす。一部の実施形態では、ＣＮＶの低減、または治療効果は、遺伝子治療に基づかない抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）、または抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）のタンパク質溶液での投与と比較して、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）を含む遺伝子治療の投与でのほうが長く続く。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子治療（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）の治療効果は、単回硝子体内注射後に少なくとも１年、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれより長い年数にわたって続く。一部の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、内在性ＶＥＧＦおよび／またはＰＩＧＦを阻害または隔離する。
医薬組成物
抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードする核酸配列を含む１つまたは複数の活性成分、例えばＡＡＶ２．７ｍ８ベクターと、１つまたは複数の賦形剤、担体、安定剤または増量剤とを含む医薬組成物（例えば、医薬製剤）が、本明細書で提供される。医薬組成物は、所望の治療または予防効果を達成するための硝子体内（ＩＶＴ）注射によるヒト患者への投与に好適である。
抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードする核酸配列を含む１つまたは複数の活性成分、例えばＡＡＶ２．７ｍ８ベクターと、１つまたは複数の賦形剤、担体、安定剤または増量剤とを含む医薬組成物（例えば、医薬製剤）が、本明細書で提供される。医薬組成物は、所望の治療または予防効果を達成するための硝子体内（ＩＶＴ）注射によるヒト患者への投与に好適である。
一部の実施形態では、例えば、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードする核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８ベクターを含む医薬組成物は、再構成された均質な溶液として供給される。一部の実施形態では、溶液は、懸濁物である。一部の実施形態では、溶液は、等張性である。他の実施形態では、例えば、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードする核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８ベクターを含む医薬組成物は、凍結乾燥形態で供給され、患者への投与の前に再構成される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードするｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含む凍結乾燥医薬組成物を、被験体への投与の前に緩衝液で再構成する、緩衝液に溶解または可溶化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、そのような凍結乾燥医薬組成物は、次のうちの１つまたは複数を含む：抗凍結剤、界面活性剤、塩、安定剤、またはこれらの任意の組合せ。
一部の実施形態では、医薬組成物は、均質溶液である。一部の実施形態では、均質溶液は、充填済み注射器に入れて供給される。一部の実施形態では、医薬組成物は、懸濁物として供給される。一部の実施形態では、懸濁物は、溶液である。一部の実施形態では、懸濁物は、冷蔵される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、被験体に医薬を（例えば、ＩＶＴ注射によって）投与する前に、確実に活性成分を溶液に溶解するおよび／または均一に分布させるために、冷蔵懸濁物を室温に加温するおよび／または懸濁物を撹拌するステップをさらに含む。一部の実施形態では、懸濁物は、被験体への（例えば、ＩＶＴ注射による）投与の前に希釈される。一部の実施形態では、懸濁物は、充填済み注射器として供給される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、冷蔵懸濁物として提供される。一部の実施形態では、懸濁物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、界面活性剤、グリセロール、非イオン性界面活性剤、緩衝液、グリコール、塩、およびこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、塩酸および水酸化ナトリウムが、溶液のｐＨを調整するために使用される。一部の実施形態では、冷蔵懸濁物は、中性ｐＨであり、または約６．５～約７．５の間のｐＨである。一部の実施形態では、冷蔵懸濁物のｐＨは、やや塩基性である（例えば、約７．５、８、８．２、８．４、８．５または９（これらの値の間の任意の範囲を含む）のうちのいずれか１つのｐＨを有する）。一部の実施形態では、懸濁物または溶液のｐＨは、やや酸性である（例えば、約６．５、６．３、６．１、６、５．５または５（これらの値の間の任意の範囲を含む）のｐＨを有する）。一部の実施形態では、懸濁物は、溶液である。一部の実施形態では、懸濁物は、ミセルを含む。一部の実施形態では、懸濁物は、被験体への（例えば、ＩＶＴ注射による）投与の前に、撹拌される、および／または室温に加温される。
本明細書に記載される少なくとも１つの医薬組成物を含むキットも本明細書で提供される。一部の実施形態では、キットは、本明細書で開示される凍結乾燥またはフリーズドライ医薬組成物（例えば、バイアル内に１単位用量）と、凍結乾燥医薬組成物を溶解、希釈および／または再構成するための溶液とを含む。一部の実施形態では、再構成または希釈のための溶液は、充填済み注射器として供給される。一部の実施形態では、キットは、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むフリーズドライまたは凍結乾燥医薬組成物と、医薬組成物を所望の濃度または体積に再構成するための溶液とを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書で開示される医薬組成物の再構成時に凝集を防止するのに役立つ緩衝液を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、充填済み注射器に入れて提供される。一部の実施形態では、キットは、室の一方に医薬組成物を溶解または希釈するための緩衝液を含有する、二室式注射器または容器を含む。一部の実施形態では、キットは、注射のための注射器を含む。一部の実施形態では、再構成溶液は、投与の前に濾過される。一部の実施形態では、キットは、患者への投与の前に再構成医薬組成物を濾過するためのフィルターまたはフィルターシリンジを含む。
一部の実施形態では、保管安定性および取り扱いの適便性のために、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）と、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードする核酸配列とを含む医薬組成物は、被験体への投与の前に食塩水、緩衝液または水で再構成される凍結乾燥、フリーズドライまたは真空乾燥粉末として製剤化される。あるいは、医薬組成物は、水溶液、例えば、懸濁物または均質溶液として製剤化される。医薬組成物は、アフリベルセプトをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子を含有することができる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、ラニビズマブおよび／もしくはアフリベルセプト、またはその機能的断片もしくはバリアント）をコードする核酸配列を送達するために、異なるウイルスまたは送達系、例えば、ナノ粒子、または脂質に基づく複合体が使用される。様々な賦形剤、例えば、リン酸、ＰＢＳもしくはＴｒｉｓ緩衝液、グリコール、グリセロール、食塩水、界面活性剤（例えば、プルロニック（登録商標）もしくはポリソルベート）、またはこれらの任意の組合せを使用して、医薬組成物を安定化させることができる。加えて、アルコールなどの抗凍結剤を、凍結乾燥の凍結または乾燥条件下での安定剤として使用することができる。一部の実施形態では、遺伝子治療は、懸濁物または冷蔵懸濁物として提供される。
一部の実施形態では、本明細書で開示の抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）遺伝子治療を構成する凍結乾燥医薬組成物の懸濁物または再構成形態は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μＬの体積を有する。一部の実施形態では、本明細書で開示の抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）遺伝子治療を含む医薬組成物の懸濁物は、０．１～０．５ｍＬの間、０．１～０．２ｍＬの間、０．３～０．５ｍＬの間、０．５～１．０ｍＬの間、０．５～０．７ｍＬの間、０．６～０．８ｍＬの間、０．８～１ｍＬの間、０．９～１．１ｍＬの間、１．０～１．２ｍＬの間、または１．０～１．５ｍＬの間の体積を有する。他の実施形態では、体積は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５ｍＬ以下である。
一部の実施形態では、本明細書で開示される医薬組成物は、硝子体内または網膜下注射による霊長類（例えば、非ヒト霊長類およびヒト被験体）への投与のために設計される、操作される、またはそのような投与に適応する。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物は、被験体の眼への硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、多くとも約または多くとも２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μＬの体積の硝子体内注射を可能にする濃度に製剤化または再構成される。一部の実施形態では、医薬組成物の単位用量は、多くとも約または多くとも２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μＬの体積を含む。一部の実施形態では、本明細書で開示される処置の方法は、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）と、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードする核酸配列とを含む、約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０μＬの体積の溶液の硝子体内注射を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）導入遺伝子の核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８粒子は、遺伝子治療用医薬組成物の成分である。一部の実施形態では、本明細書に記載の７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を含む、任意の血清型のｒＡＡＶ粒子は、フリーズドライもしくは凍結乾燥医薬組成物またはその懸濁物を作製するために使用される。一部の実施形態では、遺伝子治療は、冷蔵懸濁物として製剤化される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ２である。一部の実施形態では、凍結乾燥医薬組成物または医薬組成物の懸濁物は、７ｍ８バリアントカプシドタンパク質と抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）をコードするＤＮＡ配列とを有するｒＡＡＶ２を含む。一部の実施形態では、懸濁物は、冷蔵される。
一部の実施形態では、医薬組成物は、異常な（例えば、過剰な）血管新生または新生血管を特徴とする眼疾患または障害の処置のためにＩＶＴ注射によって被験体（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）に投与される単位用量（例えば、治療有効用量）である。一部の実施形態では、医薬組成物は、本明細書中の他の箇所でさらに詳細に説明されるような単位用量（例えば、治療有効用量）を含む。一部の実施形態では、被験体に投与されるウイルスベクター（例えば、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクター）の単位用量（例えば、治療有効用量）の体積は、約５０、４０、３０、２０、１０または５μＬのうちのいずれか１つ以下である（これらの値の間の任意の範囲を含む）。被験体に投与される単位用量の体積を最小にすることは、眼圧の変化およびＩＶＴ注射に関連する他の有害作用（例えば、眼内圧上昇、炎症、刺激または疼痛）を除去または軽減することができる。
眼への使用に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液または水性分散物、および無菌注射用溶液、懸濁剤または分散物の即時調製用の無菌粉末を含む。硝子体内投与に好適な担体は、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、および／または等張剤、例えばグリセロールを含む。全ての実施形態における医薬組成物は、無菌でなければならず、容易に注射可能または注入可能である程度に流動性でなければならない。医薬組成物は、製造および保管条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。一部の実施形態では、医薬組成物は、等張剤、例えば、塩またはグリセロールを含むことがある。一部の実施形態では、凝集を防止するために界面活性剤または安定剤が医薬組成物に添加される。
一部の実施形態では、賦形剤は、担体である。担体は、例えば水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール、ならびにこれらに類するもの）ならびにこれらのあらゆる組合せを含有する、溶媒または分散媒である。例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散物の場合には必要粒径の維持により、ならびに界面活性剤、例えば、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ラウリルジメチルアミンオキシド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＴＡＢ）、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ７２１（商標）、胆汁酸塩（デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム）、プルロニック（登録商標）酸（Ｆ－６８、Ｆ－１２７）、ポリオキシルヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））、ノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標））、シクロデキストリンおよびエチルベンゼトニウムクロリド（Ｈｙａｍｉｎｅ（商標））の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、クレゾール、チメロサールおよびこれらに類するものにより達成することができる。多くの実施形態では、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。内部の組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、を組成物に含めることにより、もたらすことができる。一部の実施形態では、医薬担体は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート、およびスクロースを含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤、例えば、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマーまたはプルロニック（登録商標）を含む。一部の実施形態では、非イオン性界面活性剤の添加は、医薬組成物における凝集を低減させる。
製造物品およびキット
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用するための本明細書で開示される１つまたは複数の医薬組成物を含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、組換えウイルスベクター（例えば、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）の核酸配列を含むｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ２．７ｍ８）を含む。一部の態様では、キットは、凍結乾燥形態の医薬組成物と、被験体への投与の前にその医薬組成物を再構成するための溶液とを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書で提供される組換えウイルスと、本明細書中の他の箇所に記載される方法のいずれか１つに従って、医薬組成物のある単位用量を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するためのおよび医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するための指示とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用するための本明細書で開示される１つまたは複数の医薬組成物を含むキットが提供される。一部の実施形態では、キットは、組換えウイルスベクター（例えば、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、アフリベルセプト）の核酸配列を含むｒＡＡＶまたはｒＡＡＶ２．７ｍ８）を含む。一部の態様では、キットは、凍結乾燥形態の医薬組成物と、被験体への投与の前にその医薬組成物を再構成するための溶液とを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書で提供される組換えウイルスと、本明細書中の他の箇所に記載される方法のいずれか１つに従って、医薬組成物のある単位用量を第１の時点で被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するためのおよび医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するための指示とを含む。
一部の実施形態では、キットは、医薬組成物を投与するための薬学的に許容される賦形剤、緩衝液、溶液などを含む。一部の実施形態では、キットは、好適な操作パラメーターについての指示をラベルまたは別の添付物の形態でさらに含む。例えば、キットは、医薬組成物の単位用量（例えば、治療有効用量）を調製するためのおよび／または凍結乾燥組成物を再構成するための情報を医師または研究技術者に提供する標準的な指示を有することができる。一部の実施形態では、キットは、投与用のデバイス、例えば、注射器、フィルターニードル、延長チューブ、カニューレ、または医薬組成物の硝子体内注射を容易にするための他の器具をさらに含む。
一部の実施形態では、キットは、懸濁物もしくは冷蔵懸濁物の形態の医薬組成物、および注射器、および／または希釈用の緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットは、懸濁物または冷蔵懸濁物を含む充填済み注射器を含む。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作製および使用できるようにするために提示される。具体的なデバイス、技法および応用の説明は、単に例として提供される。本明細書に記載される実施例の様々な修飾形態が当業者にはすぐに分かるであろうし、本明細書で定義される一般的原理を、様々な実施形態の趣旨および範囲を逸脱することなく他の実施例および応用に適用することもできる。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載されるおよび示される実施例に限定されるように意図されたものではなく、特許請求の範囲と整合する範囲が与えられることになる。
（実施例１：非ヒト霊長類における対側眼へのＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプト遺伝子治療の逐次的硝子体内投与）
標的網膜細胞に効率的に形質導入するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）の能力は、様々な網膜疾患を処置するために、光受容細胞、網膜色素上皮および網膜内層に治療用遺伝子をうまく移入するために活用されている。硝子体内（ＩＶＴ）ＡＡＶ投与は、安全かつ適便な網膜送達方法であるが、ベクターカプシドに対する中和抗体（ｎＡｂ）は網膜下注射後よりもＩＶＴ注射後に生成される可能性が高いことが示唆されている。滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）などの、ある特定の眼疾患が、個体の眼の両方に発症し得ることを考えると、第１の眼へのＡＡＶのＩＶＴ投与後に生成されるｎＡｂは、例えば個体の対側眼への、治療用遺伝子移入の効率を低下させる可能性があり、有効なベクター再投与を妨げる可能性があるという懸念がある。
標的網膜細胞に効率的に形質導入するＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）の能力は、様々な網膜疾患を処置するために、光受容細胞、網膜色素上皮および網膜内層に治療用遺伝子をうまく移入するために活用されている。硝子体内（ＩＶＴ）ＡＡＶ投与は、安全かつ適便な網膜送達方法であるが、ベクターカプシドに対する中和抗体（ｎＡｂ）は網膜下注射後よりもＩＶＴ注射後に生成される可能性が高いことが示唆されている。滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）などの、ある特定の眼疾患が、個体の眼の両方に発症し得ることを考えると、第１の眼へのＡＡＶのＩＶＴ投与後に生成されるｎＡｂは、例えば個体の対側眼への、治療用遺伝子移入の効率を低下させる可能性があり、有効なベクター再投与を妨げる可能性があるという懸念がある。
下記の実験は、非ヒト霊長類（すなわち、Ｓｔ．Ｋｉｔｔｓアフリカミドリザル）の片側の眼におけるＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトの先行曝露の、対側眼における同じＡＡＶベクターの形質導入有効性に対する効果を評価するために行なった。ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトは、アフリベルセプトのコード配列を保有する、組換え、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ．７ｍ８）ベクターである。
手短に述べると、サル４匹を研究に選択した。研究開始前に、各サルを検査し、正常な細隙灯および眼底検査、カラー眼底写真（ＣＦＰ）、ならびに光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を有すると決定した。加えて、各サルは、研究前のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでＡＡＶ．７ｍ８中和抗体（ｎＡｂ）力価が陰性であると判明した。０日目に、サル３匹の右眼（すなわち、ＯＤ）に硝子体内注射（ＩＶＴ）によって２Ｅ１２ｖｇ ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトを投与し、サル１匹の両眼（すなわち、ＯＵ）にビヒクルを投与した。ヒトの眼の体積は、アフリカミドリザルの眼の体積のおおよそ２倍である。したがって、サルに投与した用量（２Ｅ１２ｖｇ／眼）は、体積：体積ベースで４Ｅ１２ｖｇ／眼に相当する。５９日目に、ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトＯＤを施したサル３匹の左眼（すなわち、ＯＳ）に２Ｅ１２ｖｇ ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトをＩＶＴ投与した。下記の表Ａを参照されたい。
表A:対側眼内へのAAV2.7m8-アフリベルセプトの時間をずらした投薬
表A:対側眼内へのAAV2.7m8-アフリベルセプトの時間をずらした投薬
硝子体液および房水試料を、研究の２８、５６、８４、１１２、１４０、１６８、１９６および２２４日目にサル４匹の各々から採取し、ＥＬＩＳＡによってアフリベルセプト発現について評価した。血清試料を並行して収集し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して７ｍ８カプシドと反応する中和抗体（ｎＡｂ）の存在について評価した。硝子体液および血漿のベースライン試料を研究の前に採取した。様々な眼組織におけるアフリベルセプト発現を、研究終了時（すなわち、２６４日目）、死後にＥＬＩＳＡによって決定した。
研究０日目にＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトを施したサル３匹の右眼の硝子体液および房水における平均アフリベルセプト発現の時間経過を図１Ａに示す。アフリベルセプトのこれらの発現レベルは、同じ用量についての過去のデータと一致する。図１Ｂは、研究５９日目にＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトを施したサル３匹の左眼（すなわち、後で投薬した眼）の硝子体液および房水における平均アフリベルセプト発現の時間経過を示す。左眼（後の用量のＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトを施した）におけるアフリベルセプト発現レベルは、ＩＶＴ後の同等の時点で右眼における発現レベルの約３分の１であった。左眼におけるこのような発現レベルは、脈絡膜新生血管の非ヒト霊長類モデルにおいて治療レベルのアフリベルセプトをもたらすことが示されている範囲内である。図１Ａは、図２Ａ（硝子体液）および２Ｂ（房水）に示されている３つの発現レベルの平均値を表す。図１Ｂは、図３Ａ（硝子体液）および３Ｂ（房水）に示されている３つの発現レベルの平均値を表す。
図４は、研究終了時（すなわち、２６４日目）の各サルの各眼内の網膜、脈絡膜および虹彩／毛様体におけるアフリベルセプトの発現レベルを示す。一般に、アフリベルセプトの発現は、網膜において最も高かった。アフリベルセプト発現は、ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトをＩＶＴによって投与した各サルの第１の眼（すなわち、ＯＤ）においてより高いことが判明した。
ＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトを投与したサル３匹の血清と硝子体液の両方においてＩＶＴ ＡＡＶ２．７ｍ８後のｎＡｂが増加した。図５Ａおよび５Ｂを参照されたい。より大きいｎＡｂ応答が、後で注射した眼（すなわち、ＯＳ）で観察された。血清ｎＡｂレベルは、想起免疫応答と一致して、各サルにおいて第２の眼への注射の約１カ月後（すなわち、約８４日目）にピークに達した。下の表Ｂは、図５Ａおよび５Ｂに示されているデータの定性的概要を提供する。
表B:様々な時点での血清および硝子体試料における
抗AAV2.7m8免疫グロブリン(IgG)の存在
表B:様々な時点での血清および硝子体試料における
抗AAV2.7m8免疫グロブリン(IgG)の存在
軽度の炎症が両眼で観察され（データを示さない）、第２の注射は、おそらく想起免疫応答に起因してより早期の発症をもたらした。眼の健康パラメーターをＨａｃｋｅｔｔ－ＭｃＤｏｎａｌｄ刺激および炎症スコアリングシステムによりスコア化した（例えば、Hackett, R. B. and McDonald, T. O. “Eye Irritation” in Dermatotoxicology, 4th edition, Marzulli, F. N. and Maibach, H. I. editors, Hemisphere Publishing Corp., Washington D.C. (1991)を参照されたい）。図７は、検出された炎症性角膜後面沈着物（「ＫＰ」）、硝子体細胞浸潤物、硝子体混濁、および房水細胞浸潤物のレベルを示すものであり、ＩＶＴ注射後に前房フレアは検出されなかった。（図７中の点線を伴う矢印は、注射の時点を示す）。眼の細隙灯検査中に硝子体混濁は、ほとんど乃至は全く検出されなかった。手短に述べると、前房フレアは、光線が前房を通過する際の光線が異常に見える状態である。このフレアは、眼房水中のタンパク質から反射される光に起因し、典型的には前房に炎症がある場合に見られる。房水および硝子体細胞浸潤物は、一般に、一過性かつ自己分解性であった。図７に概要が示されている眼科的効果は、ＡＡＶ２．７ｍ８の両側ＩＶＴ投与が、良好な耐容性を示し、重篤な有害作用がなかったことを示す。
網膜体積の増加および／または網膜の肥厚は浮腫を示し、その一方で、網膜の菲薄化は網膜細胞の喪失を示す。両側ＩＶＴ投与を施したサルの網膜厚および網膜体積を光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって評価した。図８に示されているように、ＡＡＶ２．７ｍ８で処置したサルでは右眼（第１のＩＶＴ注射を施した）と左眼（後でＩＶＴ注射を施した）の網膜厚にも網膜体積にも差がほとんど乃至は全くなかった。さらに、ＡＡＶ２．７ｍ８の両側ＩＶＴ投薬を施したサルの網膜厚にも網膜体積にも、ビヒクルを施したサルと比較して、差がほとんど乃至は全くなかった。
網膜組織切片をヘマトキシリン（核酸を染色する）およびエオシン（タンパク質を染色する）で染色して網膜の形態を評価し、細胞死が起こったかどうか、および／または免疫細胞が網膜に浸潤したかどうかを決定した。図９および下の表Ｃは、病変および血管周囲への浸潤物が最少であったことを示す。図９は、ＡＡＶ２．７ｍ８の両側ＩＶＴ投与が、サルの左（すなわち、後で投薬した）眼において強い免疫応答を惹起しなかったことも示す。
表C:網膜組織の病理組織学評価
病理組織学スコア化スケール:NVL=目に見える病変なし、グレード1=最少、グレード2=軽度、グレード3=中等度、グレード4=顕著、グレード5=重度。
表C:網膜組織の病理組織学評価
病理組織学スコア化スケール:NVL=目に見える病変なし、グレード1=最少、グレード2=軽度、グレード3=中等度、グレード4=顕著、グレード5=重度。
上で論じたデータは、片側の眼内へのＡＡＶ２．７ｍ８カプシドのＩＶＴ投与後の免疫の発生が、対側眼内への逐次投薬後の形質導入を完全に遮断しないことを実証した。両眼へのＡＡＶ２．７ｍ８－アフリベルセプトの時間をずらしたＩＶＴ投薬は、良好な耐容性を示し、血管周囲への浸潤物は最少であり、炎症は軽度であった。
明確な理解のために実例および実施例によって本開示をある程度詳細に説明したが、これらの説明および実施例を、本開示の範囲を限定するものと解釈すべきでない。本明細書に引用した全ての特許および科学文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。
Claims (63)
- 被験体における眼疾患または障害を処置する方法であって、
（ｉ）医薬組成物の第１の単位用量を第１の時点で前記被験体の第１の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップ、および
（ｉｉ）前記医薬組成物の第２の単位用量を第２の時点で前記被験体の対側眼にＩＶＴ注射によって投与するステップ
を含み、
前記医薬組成物が、
（ａ）抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む、方法。 - 前記第１の時点の後かつ前記第２の時点の前の前記被験体からの試料において前記ｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の時点の後かつ前記第２の時点の前の前記被験体からの試料において前記抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする前記核酸の発現レベルを測定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の時間間隔が、少なくとも約２週間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の時間間隔が、少なくとも約４週間または約１カ月である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の時間間隔が、少なくとも約６週間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の時点と前記第２の時点との間の時間間隔が、少なくとも約８週間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量および前記第２の単位用量の各々が、約１Ｅ９～約３Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量および前記第２の単位用量の各々が、約１Ｅ１０～約３Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量および前記第２の単位用量の各々が、１Ｅ１１～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量および前記第２の単位用量の各々が、２Ｅ１１～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記第２の単位用量が、前記第１の単位用量より多い、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の単位用量が、前記第１の単位用量の少なくとも約３００％である、請求項１２に記載の方法。
- 前記第２の単位用量が、前記第１の単位用量の約３００％～約１０００％の間である、請求項１２または１３に記載の方法。
- 前記第１の単位用量が、約６Ｅ１０ベクターゲノムを含み、前記第２の単位用量が、約１．８Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量が、約６Ｅ１１ベクターゲノムを含み、前記第２の単位用量が、約１．８Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量が、約２Ｅ１１ベクターゲノムを含み、前記第２の単位用量が、約６Ｅ１１～約２Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量が、約２Ｅ１２ベクターゲノムを含み、前記第２の単位用量が、約６Ｅ１２～約２Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量および前記第２の単位用量の体積が、各々、約１００μＬ以下である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の単位用量および前記第２の単位用量の体積が、各々、約５０μＬ以下である、請求項１７に記載の方法。
- 被験体における眼疾患または障害を処置する方法あって、
医薬組成物の単位用量を前記被験体の片側の眼に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって投与するステップを含み、
前記医薬組成物が、
（ａ）抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ＩＶＴ注射後に網膜細胞に感染することができるｒＡＡＶ粒子と、
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含み、
前記被験体が、ＩＶＴ注射による対側眼への前記医薬組成物の先行単位用量の投与を受けたものである、方法。 - 前記対側眼への前記先行単位用量の投与後かつ前記片側の眼への前記単位用量の投与前の前記被験体からの試料において前記ｒＡＡＶに対する中和抗体のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記対側眼への前記先行単位用量の投与後かつ前記片側の眼への前記単位用量の投与前の前記被験体からの試料において前記抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）剤をコードする前記核酸の発現レベルを測定するステップをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
- 前記単位用量が、１Ｅ９～３Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単位用量が、１Ｅ１０～３Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単位用量が、１Ｅ１１～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単位用量が、２Ｅ１１～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記先行単位用量が、１Ｅ９～３Ｅ１３の間のベクターゲノムを含んでいた、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量が、１Ｅ１０～３Ｅ１２の間のベクターゲノムを含んでいた、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量が、１Ｅ１１～１Ｅ１３の間のベクターゲノムを含んでいた、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量が、２Ｅ１１～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含んでいた、請求項３０に記載の方法。
- 前記片側の眼に投与される前記単位用量が、前記対側眼に投与された前記先行単位用量より多い、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単位用量が、前記先行単位用量の少なくとも約３００％である、請求項３２に記載の方法。
- 前記単位用量が、前記先行単位用量の約３００％～約１０００％の間である、請求項３２または３３に記載の方法。
- 前記先行単位用量は、約６Ｅ１０ベクターゲノムを含んでいたが、前記単位用量は、約１．８Ｅ１１～約６Ｅ１１の間のベクターゲノムを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量は、約６Ｅ１１ベクターゲノムを含んでいたが、前記単位用量は、約１．８Ｅ１２～約６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量は、約２Ｅ１１ベクターゲノムを含んでいたが、前記単位用量は、約６Ｅ１１～約２Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量は、約２Ｅ１２ベクターゲノムを含んでいたが、前記単位用量は、約６Ｅ１２～約２Ｅ１３の間のベクターゲノムを含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量の投与と前記単位用量の投与との間の時間間隔が、少なくとも約２週間である、請求項２１から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量の投与と前記単位用量の投与との間の時間間隔が、少なくとも約４週間または約１カ月である、請求項２１から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量の投与と前記単位用量の投与との間の時間間隔が、少なくとも約６週間である、請求項２１から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記先行単位用量の投与と前記単位用量の投与との間の時間間隔が、少なくとも約８週間または約２カ月である、請求項２１から３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してペプチド挿入を含むバリアントカプシドタンパク質を含み、前記ペプチド挿入が、ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）；ＬＡＮＥＴＩＴＲＰＡ（配列番号２）、ＬＡＫＡＧＱＡＮＮＡ（配列番号３）、ＬＡＫＤＰＫＴＴＮＡ（配列番号４）、ＫＤＴＤＴＴＲ（配列番号５）、ＲＡＧＧＳＶＧ（配列番号６）、ＡＶＤＴＴＫＦ（配列番号７）、ＳＴＧＫＶＰＮ（配列番号８）、ＬＡＫＤＴＤＴＴＲＡ（配列番号９）、ＬＡＲＡＧＧＳＶＧＡ（配列番号１０）、ＬＡＡＶＤＴＴＫＦＡ（配列番号１１）、およびＬＡＳＴＧＫＶＰＮＡ（配列番号１２）から選択されるアミノ酸配列を有し、挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０および６１１に対応するアミノ酸の間の位置におけるまたは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中の対応する位置における２つの隣接アミノ酸間に位置する、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、配列番号１３の５８７位と５８８位の間に挿入されたアミノ酸配列ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（配列番号１）を含むバリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ２粒子である、請求項４３に記載の方法。
- 前記バリアントカプシドタンパク質が、配列番号４６のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、改変配列を含むバリアントカプシドタンパク質を含み、前記改変配列が、親ＡＡＶカプシドタンパク質と比較してアミノ酸残基５７０～５７９内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、前記改変配列が、ＨＫＦＫＳＧＤ（配列番号３７）を含み、アミノ酸残基番号付けは、ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質に対応する、請求項１から４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記親ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ５カプシドタンパク質であるかまたはＡＡＶ５とＡＡＶ２のハイブリッドカプシドタンパク質である、請求項４６に記載の方法。
- 前記親ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔカプシドタンパク質である、請求項４６または４７に記載の方法。
- 前記親ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２．５Ｔ ＶＰ１カプシドタンパク質である、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変配列が、ＬＡＨＫＦＫＳＧＤＡ（配列番号３９）を含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号４０または配列番号４１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の相同性を有するカプシド配列を含む、請求項４６から５０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、配列番号４２または配列番号４３に記載のカプシド配列を含む、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＶＥＧＦ剤が、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、またはラニビズマブである、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトに対して少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトである、請求項５４に記載の方法。
- 前記網膜細胞が、光受容細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素性上皮細胞である、請求項１から５５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記眼疾患または障害が、脈絡膜新生血管、滲出型加齢性黄斑変性（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、またはＤＭＥを伴う糖尿病性網膜症である、請求項１から５６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記眼疾患または障害が、脈絡膜新生血管または滲出型ＡＭＤである、請求項５７に記載の方法。
- 前記被験体が、ヒトである、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記被験体は、抗ＶＥＧＦ剤の投与に対して応答性であり、前記抗ＶＥＧＦ剤がポリペプチドである、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトである、請求項６０に記載の方法。
- 前記被験体が、抗ＶＥＧＦ剤での前記眼疾患または障害の先行処置を受けた、請求項１から６１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトであった、請求項６２に記載の方法。
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