CN114366754A

CN114366754A - Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用

Info

Publication number: CN114366754A
Application number: CN202111070681.5A
Authority: CN
Inventors: 李勇男; 黄健
Original assignee: Lanzhou University Second Hospital
Current assignee: Lanzhou University Second Hospital
Priority date: 2021-09-13
Filing date: 2021-09-13
Publication date: 2022-04-19

Abstract

本发明公开了一种Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明通过建立肺泡二型细胞A549的缺血再灌注模型，并结合高通量药物筛选方式，筛选出中一种天然化合物Reb B，Reb B可通过抑制线粒体凋亡途径显著增强A549细胞OGD/R的耐受性，为Reb B在缺血再灌注相关疾病中的临床应用提供理论依据。

Description

Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医疗技术领域，具体地说，涉及一种Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用。

背景技术

肺缺血/再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury，LIRI)已成为临床肺部手术术后并发症的明确原因之一。探讨针对性防治措施来减轻或避免缺血再灌注损伤发生一直是国内外研究的重点。就中医理论来讲，肺缺血/ 再灌注损伤表现为气虚血瘀，由于缺血而使局部气血供应不足，肺主气功能受到损伤，复灌时推动无力则气血流通不畅，积而成瘀，瘀久蓄毒，导致肺泡上皮和血管内皮细胞凋亡，甚至坏死。高通量药物筛选是目前新药研发的主要方式，筛选样品库是药物筛选的重要组成部分。

天然化合物样品库同组合化学合成样品库、药物衍生产物样品库相比，在化合物数量以及化合物多样性方面具有明显的优势。统计数据表明，目前一半以上的市售药品来自天然产物。1981年至2002年期间，美国食品药品管理局批准的新药中，四分之一以上是天然产物来源的衍生物，随着社会的发展，人们越来越关注化学药品给人类自身健康及生活环境带来的负面影响，回归自然、保护环境己成为处理人类和环境关系的潮流思想，天然药物的开发是新药研发的必然趋势，是目前新药研发领域重要的化合物来源。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用，Rebaudioside B(Reb B)可通过抑制线粒体凋亡途径显著增强A549细胞OGD/R的耐受性，为Reb B在缺血再灌注相关疾病中的临床应用提供理论依据。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一个方面，提供了一种Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用。

进一步地，Reb B的分子式为C₃₈H₆₀O₁₈，其化学结构为：

进一步地，Reb B能够降低肺泡二型细胞A549的缺血再灌注损伤。

进一步地，Reb B通过抑制线粒体凋亡途径在A549细胞OGD/R模型中发挥保护作用。

本发明的第二个发明，提供了一种用于制备治疗肺缺血再灌注损伤药物，包括Reb B。

进一步地，所述药物为粉剂、胶囊剂、注射剂或片剂。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

本发明通过建立肺泡二型细胞A549的缺血再灌注模型，并结合高通量药物筛选方式，筛选出中一种天然化合物Reb B，可明显增强A549细胞的缺血再灌注的耐受性，因此本发明可以为肺缺血再灌注的治疗提供一种具有临床应用价值的候选药物。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是高通量天然化合物筛选的流程图；

图2是A549细胞OGD12h/R12h模型上不同细胞活力的化合物百分比结果；

图3是Elisa法检测Caspase3活性结果图；

图4是Hoechst33258荧光染色法检测Reb B对A549细胞凋亡的影响；

图5是Western blot检测凋亡相关蛋白的表达结果。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

近年来，利用高通量合成小分子文库进行药物筛选，发现了大量新的活性分子。在初步筛选的基础上，加入二级筛选指标，最终筛选出具有显着疗效的先导化合物，可实施药物开发，重点验证分子机制，研究其生物过程机理。

本发明的目的在于通过高通量药物筛选，发现一种可增强肺缺血再灌注耐受性的天然化合物。经实验证明：Rebaudioside B可以有效地降低肺泡二型细胞A549的缺血再灌注损伤。

本发明为A549缺血再灌注模型提供了一种可抑制其凋亡的天然化合物，命名为莱鲍迪苷B(Rebaudioside B，Reb B)，分子式为C₃₈H₆₀O₁₈，是从甜叶菊(stevia rebaudianabertoni)的叶子中提取出来的一种天然化合物。 Rebaudioside B的水溶性较差，在室温条件下，它的水溶仅为0.01-0.02％。本发明首次将Rebaudioside B应用于A549缺血再灌注模型，通过一系列分子生物学手段验证发现，Rebaudioside B可明显抑制A549在缺血再灌注过程中的凋亡。

本发明利用A549肺泡上皮细胞建立氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型以模拟临床体外循环中肺缺血-再灌注损伤。采用CCK8法从2661个新型小分子化合物库中初步筛选出部分高活性药物，然后通过测定Caspase3活性进行二次筛选，确定最佳化合物莱鲍迪苷B(Reb B)。设置了莱鲍迪苷B(Reb B)的浓度梯度，并通过CCK8测定和Hoechest33258染色确定了合适的药物浓度。使用蛋白质印迹和RT-qPCR技术，检测了Bcl2、Bax、Caspase3 和Cleaved Caspase3的mRNA转录和蛋白质水平的表达。结果显示OGD/R 组促凋亡基因Bax和Caspase3的mRNA和蛋白表达水平高于OGD/R+Reb B 组。此外，抗凋亡基因Bcl2的mRNA和蛋白表达水平显著低于OGD/R+Reb B组。本发明研究发现Rebaudioside B(Reb B)可通过抑制线粒体凋亡途径显著增强A549细胞OGD/R的耐受性，为Reb B在缺血再灌注相关疾病中的临床应用提供理论依据。

实验方法

(一)A549肺泡上皮细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型的建立及分组

将对数生长期A549细胞的DMEM完全培养基更换成无糖无血清 DMEM培养基，并置于三气培养箱(1％O₂，5％CO₂)内孵育12h。随后将无糖无血清DMEM培养基再次更换为DMEM完全培养基，于常氧培养箱 (21％O₂，5％CO₂)内复氧处理24h。将细胞分为对照组(con)、OGD/R 组、OGD/D+Reb B组。

(二)高通量天然化合物库筛选

2661种天然化合物购自Selleck(美国)。将A549细胞接种于96孔板 (5×10³个/孔)中，待处于对数生长期时，建立氧糖剥夺/再灌注(OGD/R) 模型，并以每孔10μM的量将2661种化合物加入A549细胞中，实验结束后测定各孔CCK8吸光度值。

(三)CCK-8法检测细胞活力

A549细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型建立结束后，从培养箱中取出96孔板，弃去旧培养基，按每孔100μl将CCK8混合液加入96孔板，避光、37℃孵育30min，用酶标仪在450nm波长处测定吸光度值。

(四)测定A549细胞中caspase3活性

A549细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型建立结束后，收集细胞于 1.5mL EP管中，用预冷PBS洗涤2次，抽吸上清，每个EP管中加入细胞裂解液100μL，重悬，冰浴裂解30min,12000rpm，4℃离心15min。采用ELISA 试剂盒检测Caspase3含量，将各组样品Caspase3活性的相对比例与对照组进行比较。

(五)Hoechst33258染色检测A549细胞形态变化

A549细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型建立结束后，弃去培养液，加入4％多聚甲醛溶液固定15min，弃去固定液，用PBS溶液洗涤细胞3次，每次3min，最后加入500μlHoechst33258染液，染色8min，在荧光倒置显微镜下观察A549细胞核着色情况。

(六)Western blot检测A549细胞中各目标蛋白表达情况

A549细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型建立结束后，加入细胞裂解液提取A549细胞总蛋白，将蛋白样品进行加热煮沸和离心。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，电泳结束后，恒流200mA转膜90min，10％脱脂牛奶室温封闭1h，滴加一抗后置于4℃下过夜，次日滴加二抗室温孵育1h。加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。

实验结果

1、高通量天然化合物筛选

初筛通过测定各孔CCK8的细胞活力筛选出活性较高的化合物，复筛通过测定各孔caspase3活性确定出目标化合物，具体流程图见图1。

2、CCK8检测各组A549细胞增殖情况

CCK8检测结果表明，OGD/R组经98.8％化合物干预后A549细胞活力均低于90％，只有1.2％的化合物干预后细胞活力显著提高，见图2。

3、Elisa法检测Caspase3活性

从初筛中选择32种能使A549细胞OGD/R模型细胞活力高于90％的分子化合物作为二次筛选的对象。用Caspase3 ELISA试剂盒检测32种分子化合物处理A549细胞OGD/R模型中Caspase3的表达水平。从结果中发现，在甜菊叶中存在一种化合物Rebaudioside B(Reb B)，分子式为C₃₈H₆₀O₁₈，是甜菊叶中发现的甜菊醇苷(SGs)之一，其化学结构为：

Reb B处理A549细胞OGD/R模型的Caspase3水平显著低于A549细胞 OGD/R模型(图3；P＜0.001；OGD/R+Reb B组vs.OGD/R)。因此，选择 Rebaudioside B作为研究对象。

4、Hoechst 33258染色检测A549细胞形态变化。

对照组A549细胞核染色质分布均匀，整体呈均匀的淡蓝色荧光。与对照组相比，OGD/R组A549细胞核染色质固缩，并表现出不同程度的强蓝色荧光。与对照组相比，OGD/R组细胞凋亡率明显升高(图4，###P＜0.001； OGD/R组vs.对照组)。与OGD/R组相比，OGD/R+Reb B组细胞凋亡率明显降低(图4，###P＜0.001；OGD/R+Reb B组vs.OGD/R)。

5、Western blot检测凋亡相关蛋白的表达

为了研究Reb B是否在A549细胞OGD/R模型中发挥抗凋亡作用，通过 Westernblot检测线粒体途径中的蛋白表达(图5A)。Western blot结果显示，对照组、OGD/R组、OGD/R+Reb B组Caspase3蛋白的相对表达水平分别为 0.27±0.03、1.30±0.08和0.88±0.04。Cleaved Caspase3蛋白的相对表达水平分别为0.23±0.01、1.43±0.08和0.50±0.07。Bax/Bcl2蛋白的相对表达水平分别为0.66±0.06、1.26±0.11和0.74±0.02。与对照组相比，OGD/R组Caspase3、Cleaved Caspase3和Bax/Bcl2的表达率显著升高(图5B、5C、5D； ***P<0.001，***P<0.001，**P<0.01；OGD/R组与对照组)。Reb B干预后， Caspase 3和Cleaved Caspase3的表达显著低于OGD/R组(图5B和5C； ###P<0.001，##P<0.01；OGD/R+RebB组vs.OGD/R)，Bax/Bcl2无显著差异(图5D；P>0.05；OGD/R+Reb B组vs.OGD/R)。

结论

综上所述，本发明研究表明Reb B通过抑制线粒体凋亡途径在A549细胞OGD/R模型中发挥保护作用，该结果为Reb B在急性肺损伤中的治疗和临床应用奠定了理论基础。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种Reb B在制备治疗肺缺血再灌注损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reb B的分子式为C₃₈H₆₀O₁₈，其化学结构为：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reb B能够降低肺泡二型细胞A549的缺血再灌注损伤。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Reb B通过抑制线粒体凋亡途径在A549细胞OGD/R模型中发挥保护作用。

5.一种用于制备治疗肺缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，包括Reb B。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为粉剂、胶囊剂、注射剂或片剂。