CN114354559A - 一种用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒及应用，包含有14种荧光编码微球，分别偶联了人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF十四种不同的单克隆抗体并以一定数量混合，还包含有生物素标记的配对检测抗体。本发明提供的试剂盒利用14种抗体提供了一组14色抗体组合方案，在多色流式细胞仪平台，运用本发明提供的试剂盒，实现单个样本的单管检测，通过生物信息学分析，即可对出凝血相关因子进行深度分析，可有效地监测体检者的出凝血功能及状态。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学、生物医学检测领域，具体涉及一种用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒及应用。
背景技术
血液凝固是一系列活化凝血因子的酶促反应过程，每个凝血因子都被其前因子所激活，最后生成纤维蛋白。凝血过程一般被分为内源性凝血途径和外源性凝血途径(其中包括凝血的共同途径)，两条途径分别有不同的启动方式及参加的凝血因子。两条凝血途径并不是各自完全独立，而是相互密切联系，在机体的整个凝血过程中发挥着不同的生理作用。这些参与血液凝固过程的相关凝血蛋白包括凝血因子纤维蛋白原FIB、II、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、PC、PS、ATIII和VWF等。通过检测凝血相关因子不仅可以提供机体出凝血功能及状态的重要提示，还可以诊断某些出血与血栓性疾病，相关检测指标亦可以在治疗过程中起到对病情及疗效的监测作用，具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于检测人体出凝血功能及状态的试剂盒，同时本发明还提供了所述试剂盒的制备方法以及所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
一种用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒，包含有14种荧光编码微球，分别偶联了人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF十四种不同的单克隆抗体并以一定数量混合，还包含有生物素标记的配对检测抗体。
其制备过程分为两步，第一步为将捕获抗体偶联至荧光编码微球上，结束后将微球混合均匀，密封避光保存；第二步为对配对的检测抗体进行生物素标记，并进行纯化富集，结束后将生物素标记抗体混合均匀，密封避光保存。
本发明还保护上述的用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒的制备方法，具体包括如下步骤：
1)通过EDC和NHS对荧光编码微球进行活化；
2)活化后的微球分别与不同浓度的人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF的十四种不同的单克隆捕获抗体进行偶联；
3)偶联完的微球用PBST进行洗涤，得到偶联了捕获抗体的荧光编码微球；
4)分别向配对的检测抗体中加入生物素试剂，进行化学偶联标记；
5)通过透析或离心超滤的方式进行标记后纯化和富集，得到生物素标记的配对检测抗体。
作为优选的方案，检测通道选择APC和APC-CY7通道进行荧光编码微球的高效分辨，选择PE通道对靶标物质的丰度进行检测，通道之间相互干扰小。
本发明还保护上述的试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用，能够同时进行多重免疫分析，无交叉反应干扰。
作为本发明所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用的优先实施方式，所述试剂盒用于检测人体出凝血功能及状态时，其检测样本来自人体外周血，所述人体包含各年龄段人群。
作为本发明所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用的优先实施方式，所述的试剂盒能够同时进行14重免疫分析，包括用于检测人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF。
作为本发明所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用的优先实施方式，所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态时包括以下步骤：
(1)分离外周血血浆；
(2)通过流式细胞仪检测样本外周血血浆抗体对应抗原的表达丰度；
(3)根据外周血中各凝血因子蛋白表达的丰度，使用算法进行降维分析及运算，确定检测样本的出凝血功能及状态。
本发明所述试剂盒应用于检测人体出凝血功能及状态时，使用的检测仪器优选但不限于荧光流式细胞仪。
作为本发明所述试剂盒在检测人体出凝血状态中的应用的优先实施方式，所述步骤(2)中流式细胞仪检测包括以下步骤：
1)进行仪器校准验证；
2)进行流式细胞仪的参数设置和通道电压调节；
3)进行上机检测，获取原始数据；
4)将数据导入相应计算软件中，进行数据分析，获得对应浓度结果并输出检测报告。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
出血与血栓性疾病是源于遗传性/获得性的因素导致体内止血或凝血功能减低、抗凝血或纤溶功能亢进，导致机体出血，反之则会引起血栓形成。出血与血栓性疾病常见于临床各科，因此及时准确的对患者进行临床诊断有着重要的意义。出血与血栓性疾病由于严重威胁人类健康，本发明的试剂盒通对外周血中凝血相关因子进行深度分析，建立机体出凝血功能及状态评分系统，评估机体出血或者血栓风险，辅助诊断某些疾病，分析发病机制，指导治疗，观察疗效及检测预后。本发明的试剂盒通过检测可以发现被检者是否存在出凝血功能及状态异常并评估其出血或血栓风险。
本发明提供的试剂盒利用14种抗体，提供了一组14色抗体组合方案，在多色流式细胞仪平台，运用本发明提供的试剂盒，实现单个样本的单管检测，通过生物信息学分析，即可对出凝血相关因子进行深度分析，可有效地监测体检者的出凝血功能及状态。采用本发明的试剂盒，通过静脉采集外周血即可快速、准确地对外周血中凝血相关因子进行深度分析；该试剂盒适用于各种情况的出凝血功能及状态监测。
采用本发明的试剂盒只需要简单操作，就能快速、准确地对其出凝血功能及状态进行深度分析，血液样本用量极少，每种抗体仅需要0.5μL～4μL的量即可准确测量，且测量数据的重复性再现性均很好；样本易得，报告周期短，检测时间、成本都有效降低，检测结果灵敏度高，特异性强。
具体实施方式
以下通过实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明提供的监测人体出凝血功能及状态的试剂盒，其测试方法适用于存在出血或血栓风险的人群。所述试剂盒应用流式细胞仪对外周血血浆蛋白表达丰度进行分析，并辅以生物信息学分析，对出凝血功能及状态进行评估。
本申请发明人通过对外周血血浆蛋白表达丰度进行分析，搭建了以人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF为基础的监测方案，荧光编码微球偶联捕获抗体进行靶标物质捕获，配对检测抗体进行生物素标记，通过生物素-链霉亲和素系统进行检测信号放大。利用流式仪检测了数百例健康人群的基础样本，建立了适合中国人的反映“出凝血功能及状态”模型，可准确评估出凝血功能及状态的相关性，从而判断其出血与血栓风险，指导临床治疗。
本发明中所使用的单克隆捕获抗体及配对的检测抗体为市售，例如但不限于美国Biolegend、BD、R&D等品牌。
本发明中所使用的生物素为市售，例如但不限于ThermoFisher，BD等品牌。
本申请发明人在大量试验研究基础上，对于出凝血功能及状态进行监测，建立相应的流式细胞术方案，通过标记的人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF共14种抗体组合对人体出凝血功能及状态进行测定。
本申请所述的人体出凝血功能及状态监测方法适用于各年龄段的人群，通过大量实验，确定试剂盒的最优配比，可以达到较高的灵敏度和检测特异性，检测效果达到预期；本发明提供的出凝血功能及状态监测模型建立时的样本取自健康人外周血；取200个健康人样本对其进行外周血出凝血因子对应抗原的表达丰度检测，通过统计学分析建立生物参考区间。
本发明利用所述试剂盒检测人体出凝血功能及状态时，首先检测健康人样本外周血出凝血相关因子。具体方法如下：
采用本发明中所述的试剂盒进行检测，本发明试剂盒包含有14种荧光编码微球分别偶联了人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF十四种不同的单克隆抗体并以一定数量混合，和生物素标记的配对检测抗体。
上述所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1)通过EDC和NHS对荧光编码微球进行活化。
2)活化后的微球分别与不同浓度的人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF的十四种不同的单克隆捕获抗体进行偶联。
3)偶联完的微球用PBST进行洗涤，得到偶联了捕获抗体的荧光编码微球。
4)分别向配对的检测抗体中加入生物素试剂，进行化学偶联标记。
5)通过透析或离心超滤的方式进行标记后纯化和富集，得到生物素标记的配对检测抗体。
所述试剂盒制备完成后，保存条件为为2～8℃，试剂盒需要注意避光保存。所述试剂盒制备完成后，对上述所述来自200个样本的人体外周血进行检测。优选地，采用流式细胞仪对待测样本进行检测，所述待测样本的流式检测制备包括以下步骤：
1)采集不少于100μL的人体外周血作为检测样本；样本采集后即刻检测，或者2～8℃冷藏，48h内检测；
2)向反应孔中加入混合捕获微球25μL；
3)将反应孔板置于磁性分离器上1min，甩掉上清；
4)向反应孔中加入混合检测抗体25μL、血浆样本25μL，37℃震荡60min；
5)重复步骤2，再用洗涤缓冲液洗涤3次；
6)向反应孔中加入50μL SA-PE，37℃震荡5min；
7)重复步骤4，最后每孔加入150μL洗涤缓冲液；
8)室温震荡30s后，在多色流式细胞仪、质谱流式细胞仪平台或液相悬浮芯片检测仪上进行检测。
本发明所述试剂盒的应用基于流式细胞仪，所述试剂盒用于检测凝血因子相关蛋白。通过所述200个样本的凝血因子的检测结果，即利用受试者14个抗体检测的相应蛋白表达丰度，进行降维分析及机器学习计算，建立出凝血功能及状态评分系统，用于为各类人群的出凝血功能及状态进行检测评估。
本发明还提供一种所述的试剂盒在用于监测人体出凝血功能及状态中的应用。
作为本发明所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用的优先实施方式，所述试剂盒在检测人体出凝血功能及状态时包括以下步骤：
(1)分离外周血血浆；
(2)通过流式细胞仪检测样本外周血血浆抗体对应抗原的表达丰度；
(3)根据外周血中各凝血因子蛋白表达的丰度，使用算法进行降维分析及运算，确定检测样本的出凝血功能及状态。
本发明所述试剂盒应用于检测人体出凝血功能及状态时，使用的检测仪器优选但不限于荧光流式细胞仪。
作为本发明所述试剂盒在检测人体出凝血状态中的应用的优先实施方式，所述步骤(2)中流式细胞仪检测包括以下步骤：
1)进行仪器校准验证；
2)进行流式细胞仪的参数设置和通道电压调节；
3)进行上机检测，获取原始数据；
4)将数据导入相应计算软件中，进行数据分析，获得对应浓度结果并输出检测报告。
优选地，上述所述试剂盒在用于监测人体出凝血状态中应用时，所述试剂盒可检测人体出凝血功能及状态，具体检测包括以下步骤：
1)通过流式细胞仪检测所述检测样品的人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF标记；
2)根据各个蛋白的表达情况，对照上述稳态模型，评估所述检测样本的出凝血功能及状态。
通过所述标记好的微球捕获血浆里的靶标物质，加入生物素标记的配对检测抗体和链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)后可以形成“捕获抗体微球-抗原-生物素标记的检测抗体-SA-PE”检测复合物。在多色流式细胞仪、质谱流式细胞仪平台或液相悬浮芯片检测仪上，通过两束不同波长的激光激发检测复合物，一束用于判定微球的种类，一束用于激发检测复合物中的PE荧光。PE荧光的强度与校准品或样品中的细胞因子标志物浓度正相关。利用校准品的浓度和PE荧光信号强度拟合形成浓度-荧光强度标准曲线，进而利用曲线方程分别计算出样本中的靶标浓度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒，其特征在于：包含有14种荧光编码微球，分别偶联了人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF十四种不同的单克隆抗体并以一定数量混合，还包含有生物素标记的配对检测抗体。
2.根据权利要求1所述的用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒，其特征在于：其制备过程分为两步，第一步为将捕获抗体偶联至荧光编码微球上，结束后将微球混合均匀，密封避光保存；第二步为对配对的检测抗体进行生物素标记，并进行纯化富集，结束后将生物素标记抗体混合均匀，密封避光保存。
3.权利要求1或2所述的用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
1)通过EDC和NHS对荧光编码微球进行活化；
2)活化后的微球分别与不同浓度的人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF的十四种不同的单克隆捕获抗体进行偶联；
3)偶联完的微球用PBST进行洗涤，得到偶联了捕获抗体的荧光编码微球；
4)分别向配对的检测抗体中加入生物素试剂，进行化学偶联标记；
5)通过透析或离心超滤的方式进行标记后纯化和富集，得到生物素标记的配对检测抗体。
4.根据权利要求3所述的用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒的制备方法，其特征在于：检测通道选择APC和APC-CY7通道进行荧光编码微球的高效分辨，选择PE通道对靶标物质的丰度进行检测，通道之间相互干扰小。
5.权利要求1或2所述的试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用，其特征在于：能够同时进行多重免疫分析，无交叉反应干扰。
6.根据权利要求5所述的试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用，其特征在于：能够同时进行14重免疫分析，包括用于检测人纤维蛋白原FIB、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、PC、PS、ATIII和VWF。
7.根据权利要求5所述的用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)分离外周血血浆；
(2)通过流式细胞仪检测样本外周血血浆抗体对应抗原的表达丰度；
(3)根据外周血中各凝血因子蛋白表达的丰度，使用算法进行降维分析及运算，确定检测样本的出凝血功能及状态。
8.根据权利要求5所述的用于监测人体出凝血功能及状态的试剂盒在检测人体出凝血功能及状态中的应用，其特征在于：使用的检测仪器为荧光流式细胞仪，包括以下步骤：
1)进行仪器校准验证；
2)进行流式细胞仪的参数设置和通道电压调节
3)进行上机检测，获取原始数据；
4)将数据导入相应计算软件中，进行数据分析，获得对应浓度结果并输出检测报告。
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