CN114350801B

CN114350801B - 一种尘肺病人早期筛查的mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114350801B
Application number: CN202210004780.1A
Authority: CN
Inventors: 李世峰; 蔡文臣; 刘舒鹏; 徐洪; 高学敏; 李耕旭; 范宇杭; 陈思
Original assignee: North China University of Science and Technology
Current assignee: North China University of Science and Technology
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114350801A

Abstract

本发明公开了一种尘肺病人早期筛查的mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用，属于医药医学技术领域。本发明提供一种尘肺病人早期筛查的mRNA的检测引物组和探针，包括下列中的一种或多种：(1)检测KIF3A基因的mRNA表达水平的引物组和探针；(2)检测IFT88基因的mRNA表达水平的引物组和探针；(3)检测ARL13B基因的mRNA表达水平的引物组和探针。本发明可以证明初级纤毛KIF3A、IFT88和ARL13B的mRNA任意一种或多种组合可作为尘肺病检测标志物，且具有客观性、特异性和准确性的特点，同时本发明提供的检测试剂盒对于尘肺病的早期筛查具有重大意义，具有极大的经济和社会价值。

Description

一种尘肺病人早期筛查的mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及医药医学技术领域，特别是涉及一种尘肺病人早期筛查的 mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用。

背景技术

尘肺病(矽肺)是最严重的职业病之一，也是占比最高的纤维化间质性肺疾病。近十年每年新发病例年均2万例左右，累计病例数已达90万例。平均每例患者患病后将造成的经济负担为207.5万元，由于缺乏有效地早期识别、进展监控和有效的治疗靶点，尘肺病群体生命质量下降、已经成为严重的公共卫生问题。

目前对矽肺的诊断主要依据是生产性粉尘接触史、排除其他肺部疾病和X射线结合确定分期，目前除了肺移植，没有阻断或者逆转矽肺纤维化进展的治疗方法，因此，患者尽早(0+期和I期)脱离职业环境是延缓病情进展、提高病人生活质量的重要干预措施。然而，矽肺早期(0+期和I 期)肺组织表现为巨噬细胞炎症反应为主，伴随形成较小的矽结节，该阶段结节常不典型，且与肺结核、肺部感染等疾病难以鉴别，此阶段患者极难确诊。因此，亟待寻求新的临床诊断方法。

目前，血液由于采样方便且能较好反映机体病理生理过程而成为疾病标志物的最好来源，但是要寻找特异性和准确性高，能用于矽肺早期筛查的血液标志物有一定难度。广泛的组学测序可以对生理状态或者是一个细胞表型有关的基因进行系统监控。测序和芯片技术以其通量高、数据输出和获取快捷等优势，在疾病机制探索、疾病诊断标记物的筛选和治疗靶点的挖掘中发挥了重要的作用。因此，本发明提出一种尘肺病人早期筛查的 mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用，以解决现有技术存在的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种尘肺病人早期筛查的mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明可以证明初级纤毛KIF3A、IFT88和ARL13B的mRNA任意一种或多种组合可作为尘肺病检测标志物，且具有客观性、特异性和准确性的特点。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种尘肺病人早期筛查的mRNA的检测引物组和探针，包括下列中的一种或多种：

(1)检测KIF3A基因的mRNA表达水平的引物组和探针：上游引物序列为SEQ ID NO：1，下游引物序列为SEQ ID NO：2，探针序列为SEQ ID NO：7；

(2)检测IFT88基因的mRNA表达水平的引物组和探针：上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4，探针序列为SEQ ID NO：8；

(3)检测ARL13B基因的mRNA表达水平的引物组和探针：上游引物序列为SEQ IDNO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6，探针序列为 SEQ ID NO：9。

进一步地，所述探针的5’端和3’端分别携带荧光基团FAM和淬灭基团NFQ-MGB。

本发明还提供一种用于尘肺病人早期筛查的mRNA的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述的检测引物组和探针。

本发明还提供根据所述的检测引物组和探针在制备筛查早期尘肺病产品中的应用。

进一步地，所述产品通过测定样本中KIF3A和/或IFT88和/或ARL13B 基因的mRNA表达水平以筛查早期尘肺病。

进一步地，所述产品包括通过荧光定量PCR来检测KIF3A和/或IFT88 和/或ARL13B基因的mRNA表达水平以筛查早期尘肺病的产品。

进一步地，所述产品包括以下使用方法：

步骤1：提取待测患者血清样本中的RNA，并以正常人血清样本为对照；

步骤2：以提取的RNA为模板，合成cDNA,利用所述的检测引物组和探针进行荧光定量PCR，分别检测待测患者和正常人血清样本中KIF3A和 /或IFT88和/或ARL13B基因的cDNA含量，并将所得结果进行比对；

步骤3：根据比对结果判断待测患者是否为早期尘肺病患者。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增体系包括：Premix Ex Taq(2×)10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、探针0.4μL、cDNA模板2μL、ROX Reference Dye II(50×)0.4μL、ddH₂O 6.4μL。

进一步地，若待测患者血清样本中KIF3A和/或IFT88和/或ARL13B 基因的表达水平高于对照，则判断为早期尘肺病患者。

本发明公开了以下技术效果：

本发明可以证明初级纤毛KIF3A、IFT88和ARL13B的mRNA任意一种或多种组合可作为尘肺病检测标志物，且具有客观性、特异性和准确性的特点，本发明提供的检测试剂盒灵敏度高、检测时间短，对于尘肺病的早期筛查具有重大意义，具有极大的经济和社会价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为KIF3A因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC曲线图；

图2为IFT88因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC曲线图；

图3为ARL13B因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC曲线图；

图4为KIF3A+IFT88联合因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC 曲线图；

图5为KIF3A+ARL13B联合因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC 曲线图；

图6为IFT88+ARL13B联合因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC 曲线图；

图7为KIF3A+IFT88+ARL13B联合因子作为检测指标检测I期尘肺病的ROC曲线图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

发明人以矽肺患者血液样本为研究对象，广泛的分析了纤毛相关蛋白与矽肺纤维化进程的相关性。发现ARL3B、IFT88和KIF3A的mRNA在矽肺患者血清中表达呈先增高后降低的变化。因此，本发明基于此现象，提出一种尘肺病人早期筛查的mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用，以解决现有技术中的不足之处。

实施例1

1、分离血清：

收集患者全血4mL，取2mL至另一离心管，离心机2000r/min离心10 分钟，分离血清，取血清分装至两离心管，剩余全血和两管血清置于-80℃备用(即每个病人取血保存三个离心管)。

2、外周血RNA的提取(采用BIOG血浆RNA提取试剂盒)：

(1)21mL洗涤液A中加入9mL无水乙醇备用。

(2)9mL洗涤液B中加入21mL无水乙醇备用。

(3)取无RNA酶的1.5mL离心管，加入200μL血清样本，4μL RNA Carrier混合均匀，再加入300μL裂解液及20μL消化液，漩涡震荡10秒，充分混匀，56℃水浴10分钟至完全裂解。

(4)加入1mL无水乙醇，轻轻倒混匀。

(5)将吸附柱放入收集管内，吸取760μL上述溶液转入吸附柱内，静置2分钟，12000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。

(6)将剩余760μL溶液转移至吸附柱内，重复步骤5。

(7)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液A至吸附柱内，12000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。

(8)将吸附柱放回收集竹内，加500μL洗涤液B至吸附柱内，12000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。

(9)将吸附柱放问收集管内，12000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液.

(10)取出吸附柱，放入新的无RNA酶的1.5mL离心管内，加入30-50 μL洗脱液，静置3分钟，12000rpm 4℃离心2分钟，收集RNA溶液。

(11)-80℃保存，或直接用于下步实验。

3、cDNA的合成：

(1)取2μL总RNA溶液，50倍稀释，经紫外分光光度仪测定OD(吸光度)，并检测OD_260/280≥1.8确定纯度；

(2)配置逆转录反应液(日本TOYOBO逆转录试剂盒)

表1逆转录反应体系

反应试剂	体积
		样品RNA	2μL(1μg)
5×RT缓冲液(25mM Mg²⁺)	4μL
		dNTP Mix(10mM each dNTP)	2μL
Oligo-dT Primer(10μm)	1μL
		RNase inhibitor(10U/μL)	1μL
Reverse Transcriptase Ace	1μL
		RNase-free H₂O	9μL
总体积	20μL

TIP:2μg RNA加入9μL RNase-free H₂O中后65℃加热5min，冰上 1min，随后再加入其他成分。

(3)反转录PCR条件

30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃冷却后，cDNA产物储存至-20℃备用。

4、样本定量检测：

以样本cDNA作为模板，采用Taqman反应法，在ABI Prism 7500实时荧光PCR扩增仪(包含配套分析软件)中进行反应，实时荧光PCR引物和探针序列如表2所示，反应体系见表3，PCR的扩增条件为：95℃预变性30s，PCR反应：95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行 45个循环。

表2实时荧光PCR引物和探针序列

表3实时荧光PCR反应体系

反应试剂	体积
		Premix Ex Taq(2×)	10μL
上游引物(10μM)	0.4μL
		下游引物(10μM)	0.4μL
探针(10μM)	0.4μL
		ROX Reference Dye II(50×)	0.4μL
模板	2μL
		dd H₂O	6.4μL
总体积	20μL

5、检测结果

用上述方法检测得到矽肺患者和正常人血液样本中靶基因KIF3A、 IFT88、ARL13B的表达量(与内参GAPDH进行归一化，即靶基因的读数- 内参GAPDH的读数)，靶基因在I期和II期患者血液中的含量显著升高，而III期患者血液中含量下降，结果见表4。

表4 KIF3A、IFT88、ARL13B基因的表达情况

*与对照组相比，p<0.05

6、KIF3A、IFT88、ARL13B因子用于检测I期尘肺病的敏感度、特异度和准确度

受试者工作特征(Receiver operatin characteristic，ROC)是用以评价标志物准确度的一种重要工具。可以得到的两个主要指标包括：敏感度 (sensitivity)，或真阳性率，评价其在选择特定疾病病人中的表现。在筛选测试中一般要求有高灵敏度以排除没有疾病的人；特异性(specificity)，或真阴性率，指示其在正确选择没有疾病的人中的能力。在诊断中一般要求有高特异性以获得较低的假阳性率。

组合检测采用多项测量指标的ROC曲线分析，基础是提高预测的敏感度、特异度、准确度。通过SPSS 26.0软件组合因子之间建立二元logistic 回归模型，得到联合预测因子，并以其为分析指标，建立图1-图3所示的一种或者图4-图7所示的组合的ROC曲线，确定标志物在区分正常人和I 期矽肺患者中的能力；其中横坐标为1-特异性，即假阳性率，纵坐标为灵敏度，即真阳性率。KIF3A、IFT88、ARL13B因子用于检测I期尘肺病的敏感度、特异度和准确度如表5所示：

表5 KIF3A、IFT88、ARL13B因子用于检测I期尘肺病的敏感度、特异度和准确度统计结果

因子	敏感度％	特异度％	准确度％
				KIF3A	95	80	91.50
IFT88	80	90	86.25
				ARL13B	85	70	80.75
KIF3A+IFT88	90	90	95.75
				KIF3A+ARL13B	95	80	91.50
IFT88+ARL13B	80	90	86.25
				KIF3A+IFT88+ARL13B	90	90	95.75

如表3和图1-图7所示，KIF3A、IFT88、ARL13B任意一种或一种以上标志物组合的灵敏度、特异性和准确度结果显示：KIF3A和IFT88组合的灵敏度、特异性和准确度分别为90％、90％和95.75％；P＜0.0001，有统计学意义；KIF3A和ARL13B组合的灵敏度、特异性和准确度与KIF3A 一致；KIF3A、IFT88、ARL13B联合诊断的灵敏度、特异性和准确度与 KIF3A和IFT88组合一致。

综上所示，KIF3A和IFT88组合有更高的灵敏度、特异性和准确度， KIF3A和IFT88组合联合诊断提高了诊断效能。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华北理工大学

<120> 一种尘肺病人早期筛查的mRNA检测引物组和探针、试剂盒及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtacttgaa ggctacaatg gga 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaccaaaaa tcttgtatca ccc 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaactcatt gctcctgtaa tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtgcaaaat cctttcccat at 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatgaacagg agcaggctga 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctctatttg ctcatgctcc at 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcatatgga caaaccggaa caggca 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttgctgcag gttatgattg gtgcgt 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aactcgatgg aaccagtggt ctggct 26

Claims

1.一种尘肺病人早期筛查的mRNA的检测引物组和探针在制备筛查早期尘肺病产品中的应用，其特征在于，所述检测引物组和探针由以下一种或多种组成：

（1）检测KIF3A基因的mRNA表达水平的引物组和探针：上游引物序列为SEQ ID NO：1，下游引物序列为SEQ ID NO：2，探针序列为SEQ ID NO：7；

（2）检测IFT88基因的mRNA表达水平的引物组和探针：上游引物序列为SEQ ID NO：3，下游引物序列为SEQ ID NO：4，探针序列为SEQ ID NO：8；

（3）检测ARL13B基因的mRNA表达水平的引物组和探针：上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6，探针序列为SEQ ID NO：9。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别携带荧光基团FAM和淬灭基团NFQ-MGB。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过测定样本中KIF3A和/或IFT88和/或ARL13B基因的mRNA表达水平以筛查早期尘肺病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过荧光定量PCR来检测KIF3A和/或IFT88和/或ARL13B基因的mRNA表达水平以筛查早期尘肺病的产品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品包括以下使用方法：

步骤2：以提取的RNA为模板，合成cDNA，利用所述的检测引物组和探针进行荧光定量PCR，分别检测待测患者和正常人血清样本中KIF3A和/或IFT88和/或ARL13B基因的cDNA含量，并将所得结果进行比对；

步骤3：根据比对结果判断待测患者是否为早期尘肺病患者。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增条件为：95℃预变性30s，95℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR扩增体系包括：2×Premix Ex Taq 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、探针0.4μL、cDNA模板 2μL、50×ROXReference Dye II 0.4μL、ddH₂O 6.4μL。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，若待测患者血清样本中KIF3A和/或IFT88和/或ARL13B基因的表达水平高于对照，则判断为早期尘肺病患者。