CN114350704B - 棉花肉桂醇脱氢酶基因在抗黄萎病中的应用 - Google Patents

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CN114350704B CN202210079555.4A CN202210079555A CN114350704B CN 114350704 B CN114350704 B CN 114350704B CN 202210079555 A CN202210079555 A CN 202210079555A CN 114350704 B CN114350704 B CN 114350704B
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本申请属于棉花基因工程技术领域，具体涉及若干棉花肉桂醇脱氢酶基因在抗黄萎病中的应用专利申请事宜。所述棉花肉桂醇脱氢酶基因包括：GhCAD43、GhCAD35、GhCAD45；所述棉花肉桂醇脱氢酶基因与黄萎病抗性正相关。基于相关进化分析的初步分析结果，发明人结合黄萎病菌感染情况下GhCADs表达响应情况，初步筛选确定了GhCAD43、GhCAD35和GhCAD45对黄萎病菌侵染具有较好响应表现。结合基因沉默和转基因技术，进一步证明这三个基因对于黄萎病抗性具有较好的作用效果。因而，这些结果将为黄萎病抗性新品种培育奠定良好的基因遗传资源基础。

Description

棉花肉桂醇脱氢酶基因在抗黄萎病中的应用
技术领域
本申请属于棉花基因工程技术领域，具体涉及若干棉花肉桂醇脱氢酶基因在抗黄萎病中的应用专利申请事宜。
背景技术
棉花作为纺织工业的主要原料之一，属于一种重要的经济作为。其中，陆地棉作为棉花主要栽培品种，贡献了约90%的棉纤维产量。但棉花栽种过程中，部分病虫害，尤其是黄萎病（Verticillium wilt）对棉花的生产造成了重要影响。
黄萎病（Verticillium wilt），是一种主要由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的一种土传真菌性病害，感染后，可导致棉花维管束堵塞受损，叶片失水、萎蔫、脱落等，并可最终引起植株死亡。因其防治困难，被称为棉花的“癌症”。
植物生理结构解剖结果表明，木质素是植物次生细胞壁的重要组成结构部分，在保持棉花直立、水分和水溶矿物质运输过程中具有重要作用。此外，在病原菌入侵植物初期，根中的木质素可以阻止病原菌的入侵从而起到第一层防御，同时病原菌的入侵也会进一步诱导植物合成木质素从而阻止病原菌的扩散。因而，根系中木质素在防止土壤中病原菌尤其是黄萎病菌的入侵和致病过程中具有“第一道防线”的重要作用。
生化机理分析机制表明，植物中木质素主要由三种基本单体（香豆醇、松柏醇、芥子醇）经过聚合反应生成，这三种单体在植物体内的合成通路已经基本清楚：植物细胞质内的木质素合成起始于苯丙氨酸代谢，苯丙氨酸经过一系列酶催化，即，经包括苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase, PAL)、肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamate-4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4-Coumarate: CoA ligase， 4CL)等生物酶参与，首先生成三种醛类物质（香豆醛、松柏醛和芥子醛），这三种醛再经过一类肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）的催化从而分别生成香豆醇、松柏醇、芥子醇。也即，肉桂醇脱氢酶CAD是木质素单体合成最后一步的关键酶，可直接影响植物细胞壁木质素含量情况。
近年来，利用系统生物学，尤其是代谢组学与全基因组和转录组关联分析等方法挖掘控制农艺性状的关键代谢产物和调控基因，已经成为有效的现代分子生物学研究手段。而鉴于黄萎病侵染过程中木质素含量对于抵抗黄萎病菌的重要防御作用，因此，针对性研究相关关键酶合成调控基因，可为培育高黄萎病抗性的棉花新种培育奠定一定技术基础。
发明内容
通过对棉花相关肉桂醇脱氢酶基因的克隆和初步研究，发明人发现三个肉桂醇脱氢酶基因GhCAD43、GhCAD35和GhCAD45对提高棉花黄萎病抗性具有较好效果，可为高黄萎病抗性的棉花新种培育奠定一定基因遗传资源基础。
本申请所采取的技术方案简述如下。
棉花肉桂醇脱氢酶基因在黄萎病抗性中应用，所述棉花肉桂醇脱氢酶基因包括：GhCAD43、GhCAD35、GhCAD45；
所述棉花肉桂醇脱氢酶基因与黄萎病抗性正相关；即：基因沉默后，植物易感染黄萎病，基因超表达后，可增强植物黄萎病抗性。
所述棉花肉桂醇脱氢酶基因在黄萎病抗性中应用，具体例如用于增强棉花或拟南芥对黄萎病抗性。
利用所述棉花肉桂醇脱氢酶基因的植物新品种培育方法，通过将棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD43、GhCAD35、GhCAD45中一个或几个进行超表达，从而增强植物对黄萎病抗性；所述植物例如为拟南芥或棉花。
针对所述棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD43的VIGS沉默用基因序列，360bp长度序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
ATTCATGGTTCTCTTGCCCGTCAGGTAGTGCATCCTGCAGACCTGTGTTTCAAGCTGCCAGACAATCTAAGCTTGGAAGAAGGAGCTATGTGTGAGCCCTTGAGTGTAGCGGTCCACGCTTGTCGCCGAGCTAATATCGGTCCAGAAACCAATGTGTTGGTCATGGGAGCAGGACCAATAGGTCTCGTTACACTTCTGGCAGCTCGTGCTTTCGGGGCACCTAGAATTGTCATTGTAGACGTGGACGACTATCGACTATCTGTTGCTAATAACCTCGGTGCCGATGGAGTTGTTAAAGTCTCAACAAATATGCAGGACATACCCGAAGAAGTTGAAAGAATATGTGAAGTGATGGGAGCA。
针对所述棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD35的VIGS沉默用基因序列，402bp长度序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
CTCTTATGTGCTGGAGTGACGGCTTATAGTCCCTTGAAGCAGTTCAATAACTCTGATAAGGCTATCAAGGCCGGAATTTTGGGGCTCGGCGGAGTCGGGCATTTGGCAGTGCTGATAGCAAAGGCAATGGGGCATCACGTAACCGTGATAAGTTCTTCAGAAAAGAAGAAAGTGGAGGCTTTAGAGCATTTGCACGCCGATGCTTTCCTTGTGAGCTCTAATGCGGCAGAGATGGAGGGAGCAGCAGCCAGCCTCGATTACATTCTCGACACTGTCCCCGCTTTCCATTCTCTGGAGCCTTACATTTCGCTTCTCAAAGCTGGTGGGAAGCTGATTTTTGTTGGGGTTTCCACTAAGCCCCTGCATTTCAACAATGATGAATTGATTTTAGGGAATAAATCA。
针对所述棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD45的VIGS沉默用基因序列，375bp长度序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：
ACTTCCATCTACCCTCTTGTTCCTGGTCACGAGATTGCCGGTGAAGTGACGGAGGTGGGAAGTAAGGTCCAAAAGTTCAAAGTTGGAGACCGTGTTGGGGTTGGGTGTCTGGTCGGGTCATGCCGTTCCTGCGATAGCTGCAAAGACAATCTTGAGAACTATTGCCCCAAAATGGTACTTACTTACGGAGCCAAGTACTATGATGGAACTATTACATACGGAGGCTACTCCGACACTATGGTTGCTGACGAGCACTTTAGTGTCCGCATACCTGATAACATGCCTCTTGATGCTGCCGCTCCACTGCTCTGTGCTGGGATTACAGTGTATAGTCCATTGAGATATTATGAACTCGATAGGCCTGGTTTGCACATC。
所述GhCAD43，其全长基因序列（1542bp），具体为：
ATGGGTAAAGGAGGGAAATCTCATCAAGAAGGTGAAGAAAACATGGCTGCTTGGCTCGTGGATCTTAACACCCTCAAAATTCAACCATTCAAGCTCCCTCCTCTTGGTATAACCCTTCGTTTTTCATTTTGGGCTCTTTTAGTTTGTTCCATTTATGGAGTTTATGAATTACCATTATGGTTTTAGATAAACCTTTTGTTTTTTTTTGTTTCTTATATATTGATTGATCACTTCTCTTTTTGTTGTGGGTGAATATAATTAAGGACCCCATGATGTGAGAGTTAGGATGAAAGCTGTTGGCATCTGTGGAAGTGATGTTCACTTTCTCAAGGTATGTTCTACATGTATCCATGTAACCATATGTATATAAATATATATGACCTTGTTTAACCCCGTGTGTGTGTGTGTAGACACTGAGGCTTGCAGATTTTGTGGTGAAAGAACCAATGGTGATAGGGCATGAGTGTGCTGGGATCATAGAGGAGATTGGAAGTGAAGTCAAGAATTTAGTGCCTGGTGACCGAGTGGCATTGGAACCAGGGATTGGTTGCTGGCGATGTGATCTTTGCAAGGAAGGTCGATACAATATATGCCCTGATATGAAGTTTTTCGCCACTCCACCGATTCATGGTTCTCTTGCCCGTCAGGTGAACCTATAAAGCTGCAATTTCAGCCTTGGTTCTACTCTGTTTATCCATATGACTAATAGTGTACAAGATTATTATTTTCAATGTAGGTAGTGCATCCTGCAGACCTGTGTTTCAAGCTGCCAGACAATCTAAGCTTGGAAGAAGGAGCTATGTGTGAGCCCTTGAGTGTAGCGGTCCACGCTTGTCGCCGAGCTAATATCGGTCCAGAAACCAATGTGTTGGTCATGGGAGCAGGACCAATAGGTCTCGTTACACTTCTGGCAGCTCGTGCTTTCGGGGCACCTAGAATTGTCATTGTAGACGTGGACGACTATCGACTATCTGTTGCTAATAACCTCGGTGCCGATGGAGTTGTTAAAGTCTCAACAAATATGCAGGTCCATATCATCAAGTTTTATGAGATATATATAATTAAATCATTGTCTGACTTTTTAAATGGTTTCAGGACATACCCGAAGAAGTTGAAAGAATATGTGAAGTGATGGGAGCAGTAGGAGTGCATGTAACCTTTGACTGTGCAGGCTTTAACAAAACAATGTCGACTGCTTTGAGTGCCACTCGAGCCGGTGGCAAGGTTTGCCTTGTTGGATTAGGCCATAACGAGATGACCGTCCCACTTACACCAGCTGCTGCTAGGTACTTATTTCAATGATTCATTTACTTGACTGTTGCCTGAAAATTAACCAGGATTGATTGCAGGGAGGTTGATATTATCGGGATATTCCGGTATAAGAACACTTGGCCTTTGTGCATTGAGCTTCTAAGAAGTGGTAAGATCGATGTGAAGCCACTGATAACTCACAGGTTCGGGTTTTCCCAGAAAGAGGTTGAAGAAGCTTTTGAAACTAGTGCTCGCGGCGGTGATGCCATTAAGGTCATGTTCAACCTGTGA。
其对应cDNA序列（1086bp）为：
ATGGGTAAAGGAGGGAAATCTCATCAAGAAGGTGAAGAAAACATGGCTGCTTGGCTCGTGGATCTTAACACCCTCAAAATTCAACCATTCAAGCTCCCTCCTCTTGGACCCCATGATGTGAGAGTTAGGATGAAAGCTGTTGGCATCTGTGGAAGTGATGTTCACTTTCTCAAGACACTGAGGCTTGCAGATTTTGTGGTGAAAGAACCAATGGTGATAGGGCATGAGTGTGCTGGGATCATAGAGGAGATTGGAAGTGAAGTCAAGAATTTAGTGCCTGGTGACCGAGTGGCATTGGAACCAGGGATTGGTTGCTGGCGATGTGATCTTTGCAAGGAAGGTCGATACAATATATGCCCTGATATGAAGTTTTTCGCCACTCCACCGATTCATGGTTCTCTTGCCCGTCAGGTAGTGCATCCTGCAGACCTGTGTTTCAAGCTGCCAGACAATCTAAGCTTGGAAGAAGGAGCTATGTGTGAGCCCTTGAGTGTAGCGGTCCACGCTTGTCGCCGAGCTAATATCGGTCCAGAAACCAATGTGTTGGTCATGGGAGCAGGACCAATAGGTCTCGTTACACTTCTGGCAGCTCGTGCTTTCGGGGCACCTAGAATTGTCATTGTAGACGTGGACGACTATCGACTATCTGTTGCTAATAACCTCGGTGCCGATGGAGTTGTTAAAGTCTCAACAAATATGCAGGACATACCCGAAGAAGTTGAAAGAATATGTGAAGTGATGGGAGCAGTAGGAGTGCATGTAACCTTTGACTGTGCAGGCTTTAACAAAACAATGTCGACTGCTTTGAGTGCCACTCGAGCCGGTGGCAAGGTTTGCCTTGTTGGATTAGGCCATAACGAGATGACCGTCCCACTTACACCAGCTGCTGCTAGGGAGGTTGATATTATCGGGATATTCCGGTATAAGAACACTTGGCCTTTGTGCATTGAGCTTCTAAGAAGTGGTAAGATCGATGTGAAGCCACTGATAACTCACAGGTTCGGGTTTTCCCAGAAAGAGGTTGAAGAAGCTTTTGAAACTAGTGCTCGCGGCGGTGATGCCATTAAGGTCATGTTCAACCTGTGA。
蛋白序列：
MGKGGKSHQEGEENMAAWLVDLNTLKIQPFKLPPLGPHDVRVRMKAVGICGSDVHFLKTLRLADFVVKEPMVIGHECAGIIEEIGSEVKNLVPGDRVALEPGIGCWRCDLCKEGRYNICPDMKFFATPPIHGSLARQVVHPADLCFKLPDNLSLEEGAMCEPLSVAVHACRRANIGPETNVLVMGAGPIGLVTLLAARAFGAPRIVIVDVDDYRLSVANNLGADGVVKVSTNMQDIPEEVERICEVMGAVGVHVTFDCAGFNKTMSTALSATRAGGKVCLVGLGHNEMTVPLTPAAAREVDIIGIFRYKNTWPLCIELLRSGKIDVKPLITHRFGFSQKEVEEAFETSARGGDAIKVMFNL。
所述GhCAD35，其全长基因序列（1449bp）为：
ATGGAGGGAAGAAGGGTCATTGGATGGGCTGCCAGAGATGTATCAGCACATCTTTCACCTTATTCATTCACTCTCAGGTTTCTAATTTCTTTCTCTTTTTCTCCCTCTCATCTTGCATCTCAAGTCTAAAAAATGATGAATGCTAATTGATGTTTCAATGCCATTATTGATAGGAAAACAGGTCCAGAAGATGTGGTGTTGAAGGTATTGTATTGTGGAGTAGATCACACTGATCTACACCAGATGAGGGGTGAGCTTATGCCCATCAACTACCCATTGGTTCCAGGGTAGGCCCCATGCAATCCTGTGTCGTTCATGATTCTTTATCCACCTTGTTTTCCCTATGTTTGTTCTCGGTTTTACTTTACCGGTCTTTGATATAGGCATGAAGTGGTGGGCGAGGTCGTGGAAGTGGGTTCAGAAGTAAACAAATTCAAGCTTGGAGACAAGGTTGGAGTTGGGTGCCTGGTAAGCTCTTGTGGGAAATGCTTGTCTTGCAACTCCAATAATGAACAGTACTGCAACCAGAGGGTCTTTACATATGGTGCCGTCAACAAAGATGGAACTCCCACTCATGGTGGCTTTTCTTCTGCCATGGTGGTTCATCAAAAGTAAGCAAGAATAAACCAGCACAAAGAGTACTAACTTTTGGAAGTACAATCCCTGGTAATTAACATTAGAGTGGATGCAGGTTTGTGGTGCAGATACCCGAGAAACTAGCACCAGAGCAGGCAGCACCGCTCTTATGTGCTGGAGTGACGGCTTATAGTCCCTTGAAGCAGTTCAATAACTCTGATAAGGCTATCAAGGCCGGAATTTTGGGGCTCGGCGGAGTCGGGCATTTGGCAGTGCTGATAGCAAAGGCAATGGGGCATCACGTAACCGTGATAAGTTCTTCAGAAAAGAAGAAAGTGGAGGCTTTAGAGCATTTGCACGCCGATGCTTTCCTTGTGAGCTCTAATGCGGCAGAGATGGAGGGAGCAGCAGCCAGCCTCGATTACATTCTCGACACTGTCCCCGCTTTCCATTCTCTGGAGCCTTACATTTCGCTTCTCAAAGCTGGTGGGAAGCTGATTTTTGTTGGGGTTTCCACTAAGCCCCTGCATTTCAACAATGATGAATTGATTTTAGGTATGCCAGCCAGATTTTCTGTTTAAGATCAAAAGAAAACTAACCAAACTTTTTTGTTCATTCGTTTATATATATAATTTGCAAGTAATTTGATTTACATTACTGTCATGCAATGCAGGGAATAAATCATTGACAGGGAGTTTCATAGGAAGCATGGAAGAAACACAGGAAATACTGGATTTTTGGGCAGAGAAGGGACTGAGTACAATGATAGAGGTGGTGAAGATGGATTATATAAACAAGGCTTTTGAGAGATTGGAGAGGAATGATGTGAGGTATAGATTTGTGCTGGAAGTTGCTGGAAGCAACCTTGAATGA。
的 cDNA序列（1059bp）：
ATGGAGGGAAGAAGGGTCATTGGATGGGCTGCCAGAGATGTATCAGCACATCTTTCACCTTATTCATTCACTCTCAGGAAAACAGGTCCAGAAGATGTGGTGTTGAAGGTATTGTATTGTGGAGTAGATCACACTGATCTACACCAGATGAGGGGTGAGCTTATGCCCATCAACTACCCATTGGTTCCAGGGCATGAAGTGGTGGGCGAGGTCGTGGAAGTGGGTTCAGAAGTAAACAAATTCAAGCTTGGAGACAAGGTTGGAGTTGGGTGCCTGGTAAGCTCTTGTGGGAAATGCTTGTCTTGCAACTCCAATAATGAACAGTACTGCAACCAGAGGGTCTTTACATATGGTGCCGTCAACAAAGATGGAACTCCCACTCATGGTGGCTTTTCTTCTGCCATGGTGGTTCATCAAAAGTTTGTGGTGCAGATACCCGAGAAACTAGCACCAGAGCAGGCAGCACCGCTCTTATGTGCTGGAGTGACGGCTTATAGTCCCTTGAAGCAGTTCAATAACTCTGATAAGGCTATCAAGGCCGGAATTTTGGGGCTCGGCGGAGTCGGGCATTTGGCAGTGCTGATAGCAAAGGCAATGGGGCATCACGTAACCGTGATAAGTTCTTCAGAAAAGAAGAAAGTGGAGGCTTTAGAGCATTTGCACGCCGATGCTTTCCTTGTGAGCTCTAATGCGGCAGAGATGGAGGGAGCAGCAGCCAGCCTCGATTACATTCTCGACACTGTCCCCGCTTTCCATTCTCTGGAGCCTTACATTTCGCTTCTCAAAGCTGGTGGGAAGCTGATTTTTGTTGGGGTTTCCACTAAGCCCCTGCATTTCAACAATGATGAATTGATTTTAGGGAATAAATCATTGACAGGGAGTTTCATAGGAAGCATGGAAGAAACACAGGAAATACTGGATTTTTGGGCAGAGAAGGGACTGAGTACAATGATAGAGGTGGTGAAGATGGATTATATAAACAAGGCTTTTGAGAGATTGGAGAGGAATGATGTGAGGTATAGATTTGTGCTGGAAGTTGCTGGAAGCAACCTTGAATGA。
蛋白序列（352AA）：
MEGRRVIGWAARDVSAHLSPYSFTLRKTGPEDVVLKVLYCGVDHTDLHQMRGELMPINYPLVPGHEVVGEVVEVGSEVNKFKLGDKVGVGCLVSSCGKCLSCNSNNEQYCNQRVFTYGAVNKDGTPTHGGFSSAMVVHQKFVVQIPEKLAPEQAAPLLCAGVTAYSPLKQFNNSDKAIKAGILGLGGVGHLAVLIAKAMGHHVTVISSSEKKKVEALEHLHADAFLVSSNAAEMEGAAASLDYILDTVPAFHSLEPYISLLKAGGKLIFVGVSTKPLHFNNDELILGNKSLTGSFIGSMEETQEILDFWAEKGLSTMIEVVKMDYINKAFERLERNDVRYRFVLEVAGSNLE。
所述GhCAD45，其全长基因序列（1515bp）为：
ATGACAAGATTGCCAGAAGAAGAGCACCCTAACAAGGCTTTTGGATGGGCTGCCAGAGACAGTTATGGTGTTCTCTCTCCCTTCAAATTTTCCAGAAGGTTTTCTTTTTTCTCCTTAAACTTTTTATCATTGCTCTGTCTTTGAATCAGTTCCCTTGTCAAAGGGTGTTTGATTGATGTGGGGTTTGACACTTGCAGGGCAACAGGTGAGAAGGATGTAGCCTTCAAGGTGCTTTATTGTGGGATTTGCCATTCTGATCTTCATATGGCCAAGAATGAATGGGGTACTTCCATCTACCCTCTTGTTCCTGGGTATGTTTTCCATTCTTATATTTTATATATATCAACTAACAATTTCCATGGATATATGCTAATACTACTTTGATGACAAAAAATTGACACATGCAACAATGAACCACAGTTTATTGGTCAACCTAAATAATATATATTGGATGCAGTCACGAGATTGCCGGTGAAGTGACGGAGGTGGGAAGTAAGGTCCAAAAGTTCAAAGTTGGAGACCGTGTTGGGGTTGGGTGTCTGGTCGGGTCATGCCGTTCCTGCGATAGCTGCAAAGACAATCTTGAGAACTATTGCCCCAAAATGGTACTTACTTACGGAGCCAAGTACTATGATGGAACTATTACATACGGAGGCTACTCCGACACTATGGTTGCTGACGAGCACTTTAGTGTCCGCATACCTGATAACATGCCTCTTGATGCTGCCGCTCCACTGCTCTGTGCTGGGATTACAGTGTATAGTCCATTGAGATATTATGAACTCGATAGGCCTGGTTTGCACATCGGTGTGGTTGGACTGGGTGGACTCGGTCATGTTGCAGTAAAATTTGCCAAGGCAATGGGGGTTAAAGTCACAGTGATCAGCACATCTCCGAATAAGAAGAAAGAAGCTTTGGAAAATCTTGGTGCAGATTCGTTTTTAGTCAGTCGAGACCAAGATCAACTTCAGGTTTATATGTTTTTCTTTCTTTCAATGATTTATTAATGAGGGGTTTTTTGTGAGTGTATATAAGTTTCTAAGTTCCTTATTTGGTGTATAGGGTGCCATTGGCACATTGGACGGAATCATAGACACAGTGTCAGCTCAACACCCTGTGCTGCCATTGCTTGCGCTGTTGAAGTCTCACGGGAAGCTTGTTCTTCTTGGTGCTCCAGAGAAACCACTTGAGTTGCCTGTGTTTCCTTTAATCCAAGGTAATGATCTGTTGCTAATATCTTTTCGTAAGAGTAATATGGGATCTCAAATTCCCCAAAGATATCTTAAATTAGAGTCATAATTGAGTGCAGGGAGGAAAGTAATAGGAGGAAGCTTGATCGGAGGGATGAAGGAAACTCAAGAGATGATTGATTTCGCAGCTAAACATGACGTAAAACCTGACATTGAAGTTATAGCTATGGATTATGTGAACACAGCTATGGAACGCCTTCTTAAAGCGGATGTCAAATATAGATTTGTGATCGACATTGGAAATACATTGAAAATTCATTCTTGA。
的cDNA序列（1086bp）：
ATGACAAGATTGCCAGAAGAAGAGCACCCTAACAAGGCTTTTGGATGGGCTGCCAGAGACAGTTATGGTGTTCTCTCTCCCTTCAAATTTTCCAGAAGGGCAACAGGTGAGAAGGATGTAGCCTTCAAGGTGCTTTATTGTGGGATTTGCCATTCTGATCTTCATATGGCCAAGAATGAATGGGGTACTTCCATCTACCCTCTTGTTCCTGGTCACGAGATTGCCGGTGAAGTGACGGAGGTGGGAAGTAAGGTCCAAAAGTTCAAAGTTGGAGACCGTGTTGGGGTTGGGTGTCTGGTCGGGTCATGCCGTTCCTGCGATAGCTGCAAAGACAATCTTGAGAACTATTGCCCCAAAATGGTACTTACTTACGGAGCCAAGTACTATGATGGAACTATTACATACGGAGGCTACTCCGACACTATGGTTGCTGACGAGCACTTTAGTGTCCGCATACCTGATAACATGCCTCTTGATGCTGCCGCTCCACTGCTCTGTGCTGGGATTACAGTGTATAGTCCATTGAGATATTATGAACTCGATAGGCCTGGTTTGCACATCGGTGTGGTTGGACTGGGTGGACTCGGTCATGTTGCAGTAAAATTTGCCAAGGCAATGGGGGTTAAAGTCACAGTGATCAGCACATCTCCGAATAAGAAGAAAGAAGCTTTGGAAAATCTTGGTGCAGATTCGTTTTTAGTCAGTCGAGACCAAGATCAACTTCAGGGTGCCATTGGCACATTGGACGGAATCATAGACACAGTGTCAGCTCAACACCCTGTGCTGCCATTGCTTGCGCTGTTGAAGTCTCACGGGAAGCTTGTTCTTCTTGGTGCTCCAGAGAAACCACTTGAGTTGCCTGTGTTTCCTTTAATCCAAGGGAGGAAAGTAATAGGAGGAAGCTTGATCGGAGGGATGAAGGAAACTCAAGAGATGATTGATTTCGCAGCTAAACATGACGTAAAACCTGACATTGAAGTTATAGCTATGGATTATGTGAACACAGCTATGGAACGCCTTCTTAAAGCGGATGTCAAATATAGATTTGTGATCGACATTGGAAATACATTGAAAATTCATTCTTGA。
蛋白序列（361AA）：
MTRLPEEEHPNKAFGWAARDSYGVLSPFKFSRRATGEKDVAFKVLYCGICHSDLHMAKNEWGTSIYPLVPGHEIAGEVTEVGSKVQKFKVGDRVGVGCLVGSCRSCDSCKDNLENYCPKMVLTYGAKYYDGTITYGGYSDTMVADEHFSVRIPDNMPLDAAAPLLCAGITVYSPLRYYELDRPGLHIGVVGLGGLGHVAVKFAKAMGVKVTVISTSPNKKKEALENLGADSFLVSRDQDQLQGAIGTLDGIIDTVSAQHPVLPLLALLKSHGKLVLLGAPEKPLELPVFPLIQGRKVIGGSLIGGMKETQEMIDFAAKHDVKPDIEVIAMDYVNTAMERLLKADVKYRFVIDIGNTLKIHS。
研究过程中，发明人通过将陆地棉基因组数据与现有模式植物拟南芥CAD基因组比对，结合CAD蛋白序的两个保守的结构域分析，即alcohol dehydrogenase GroES-like结构域（PF08240）和zinc-binding dehydrogenase (PF00107)，初步在陆地棉中共鉴定到了46个潜在的GhCAD基因。进一步通过构建系统进化树和进行系统进化分析，结果表明，46个GhCADs和18个拟南芥CADs可以分成I-V共5个分支，其中19个GhCADs与9个经典拟南芥CAD蛋白构成了分支I-III，另外27个GhCAD蛋白与9个非经典拟南芥CAD蛋白构成分支IV和V分支。其中，GhCAD43属于非典型CAD蛋白，而GhCAD35和GhCAD45则则分别属于分支I和III，属于经典的CAD蛋白。
基于相关进化分析的初步分析结果，发明人结合黄萎病菌感染情况下GhCAD表达响应情况，初步筛选确定了GhCAD43、GhCAD35和GhCAD45对黄萎病菌侵染具有较好响应表现。进一步结合基因沉默和转基因技术，进一步证明这三个基因对于黄萎病抗性具有较好的作用效果。而结合这一结果，可为黄萎病抗性棉花新品种培育奠定良好的基因遗传资源基础。
附图说明
图1为陆地棉CAD家族蛋白进化树构建，其利用18个拟南芥CAD蛋白和鉴定到的46个陆地棉潜在CAD成员进行系统进化树构建；图中：“★”指示具有典型CAD酶活的成员，“●”指示尚未确认CAD酶活性的非典型拟南芥CAD成员；GhCAD43位于第V分支，属于非典型CAD成员，黑色三角指示GhCAD43；GhCAD35和GhCAD45分别位于第I和III分支，属于典型CAD成员；系统进化树是使用MEGA10通过邻近并入标准和1000个重复引导值构建；
图2为不同黄萎病抗性陆地棉栽培种中PR10-11与GhCAD43基因在接种黄萎病菌18天后的表达分析；ZZM 2、Han 333、 GK 44和 GK 168为黄萎病抗性陆地棉栽培种，TM-1、Jimian 11、DH 966、Foster 6和 8891为黄萎病感性陆地棉栽培种；萌发两周的植株在接种黄萎病菌18天后取材进行定量PCR分析；
图3为不同黄萎病抗性陆地棉栽培种中PR10-5、GhCAD35、GhCAD45基因在接种黄萎病菌18天后的表达分析；
图4为不同黄萎病抗性陆地棉栽培种中PR10-5、GhCAD35、GhCAD45基因在接种黄萎病菌24小时的表达分析；萌发两周的植株在接种黄萎病菌24小时后取材进行定量PCR分析；
图5为GhCAD43在30天、60天、90天陆地棉植株的根茎叶组织的相对表达水平分析；
图6为 GhCAD35和GhCAD45在30天、60天、90天陆地棉植株的根茎叶组织的相对表达水平分析；
图7为 GhCAD43体外肉桂醇脱氢酶活性分析；(A-C) 分别指示GhCAD43体外催化松柏醛、芥子醛、香豆醛生成对应的松柏醇、芥子醇和香豆醇；C1-C6分别指示松柏醇、松柏醛、芥子醇、芥子醛、香豆醇和香豆醛；(D) Western blot指示体外纯化的GST-GhCAD43融合蛋白；
图8为GhCAD35和GhCAD45体外肉桂醇脱氢酶活性分析；(A-C) 分别指示GhCAD35和GhCAD45体外催化松柏醛、芥子醛、香豆醛生产对应的松柏醇、芥子醇和香豆醇；C1-C6分别指示松柏醇、松柏醛、芥子醇、芥子醛、香豆醇和香豆醛；(D) Western blot指示体外纯化的GST-GhCAD35和GST-GhCAD45融合蛋白；
图9为VIGS沉默GhCAD43陆地棉转基因植株增加对黄萎病的感病性；(A) TRV:00和TRV:GhCAD43 VIGS注射转基因材料在接种黄萎病菌18天后的感病情况；(B) TRV:00和TRV:GhCAD43 植株中GhCAD43的转录水平检测；(C) TRV:00和TRV:GhCAD43 VIGS注射转基因材料接种黄萎病菌18天后的病情指数统计；(D) TRV:00和TRV:GhCAD43 VIGS注射转基因材料接种黄萎病菌18天后的茎纵切观察；感病陆地棉栽培种ZZM 2作为VIGS注射背景材料；
图10为VIGS沉默GhCAD35和GhCAD45陆地棉转基因植株增加对黄萎病的感病性；(A) TRV:00、TRV:GhCAD35、TRV:GhCAD45 VIGS注射转基因材料在接种黄萎病菌18天后的感病情况；(B) TRV:00、TRV:GhCAD35、TRV:GhCAD45 VIGS注射材料在接种黄萎病菌18天后的病情指数统计（上）及茎纵切观察（下）；感病陆地棉栽培种ZZM 2作为VIGS注射背景材料；(C) TRV:00和TRV:CAD43 植株中GhCAD35和GhCAD45的转录水平检测；
图11为GhCAD43沉默陆地棉植株接种黄萎病菌前后的三种H、G、S木质素单体的定量检测；‘*’表示P < 0.05，‘**’表示P < 0.01 (Student’s t-test)；TRV:00和TRV:GhCAD43 VIGS注射材料在接种黄萎病菌48小时后进行木质素单体的检测；
图12为VIGS沉默GhCAD43陆地棉转基因植株侵染黄萎病后茎横切分析；图A为TRV:00和TRV:GhCAD43 VIGS注射材料在接种黄萎病菌18天后的茎部横切观察；UV指紫外光下的木质部自发光图像；phloroglucinol-HCl指间苯三酚染色的木质部区域；图B显示的图A中的局部放大图像，图B中的标尺指示木质部宽度，箭头指示木质部的导管；
图13为GhCAD35和GhCAD45沉默陆地棉植株接种黄萎病菌前后的三种H、G、S木质素单体的定量检测；TRV:00、TRV:GhCAD35、TRV:GhCAD45VIGS注射材料在接种黄萎病菌48小时后进行木质素单体的检测；
图14为VIGS沉默GhCAD35和GhCAD45陆地棉转基因植株侵染黄萎病后茎横切分析；图A为TRV:00、TRV:GhCAD35、TRV:GhCAD45 VIGS注射材料在接种黄萎病菌18天后的茎部横切观察；UV指紫外光下的木质部自发光图像；phloroglucinol-HCl指间苯三酚染色的木质部区域；图B显示的为图A中局部放大图像，图B中的标尺指示木质部宽度，箭头指示木质部的导管；
图15为拟南芥异源过表达GhCAD43的转基因材料增强对黄萎病的抗病性；其中：（A）拟南芥异源过表达GhCAD43转基因材料接种黄萎病菌后的发病情况；（B）拟南芥异源过表达GhCAD43转基因材料接种黄萎病菌后的病情指数统计；（C）拟南芥异源过表达GhCAD43转基因材料的GhCAD43基因的转录表达水平检测；
图16为拟南芥异源过表达GhCAD35和GhCAD45的转基因材料增强对黄萎病的抗病性；（A）拟南芥异源过表达GhCAD35和GhCAD45转基因材料接种黄萎病菌后的发病情况；（B）拟南芥异源过表达GhCAD35和GhCAD45转基因材料接种黄萎病菌后的病情指数统计；（C）拟南芥异源过表达GhCAD35和GhCAD45转基因材料的GhCAD35和GhCAD45基因的转录表达水平检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
4个抗黄萎病的陆地棉（Gossypium hirsutum）栽培种ZZM 2、Han 333、GK 44、GK168，5个黄萎病易感陆地棉栽培种TM-1、Jimian 11、DH 966、Foster 6和 8891，均由中国农业科学院棉花研究所提供；
棉花培育方式培育条件为：棉花种子在28℃培养箱中避光催芽2天后，萌发的种子采用土培法（营养土：蛭石=2：1）于温室中培养（28℃，16h光照/8 h黑暗）。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）Ws生态型，常用的模式植物研究材料，培育条件为：温度22 ± 1℃，光暗周期16 h/8 h，光照强度50 μmol·m-2·s-1。
黄萎病菌菌株V991，常用的黄萎病研究用菌株，可从公开渠道获得。
实施例1
前期研究分析过程中，鉴于肉桂醇脱氢酶CAD在木质素代谢过程中的重要作用，为研究分析陆地棉中CAD成员和其作用，发明人采用9个经典的拟南芥CAD蛋白和9个非经典的拟南芥CAD蛋白作为参考，通过与现有陆地棉基因组数据比对，并进一步结合CAD蛋白序的两个保守的结构域分析，即alcohol dehydrogenase GroES-like 结构域（PF08240）和zinc-binding dehydrogenase (PF00107)，基于同源比对方式，通过构建系统进化树（结果如图1所示）方式进行了初步的系统进行分析。
结果表明，对陆地棉中共鉴定到46个潜在的GhCAD基因。进一步的系统进化分析表明，46个GhCADs和18个拟南芥CADs可以分成I-V共5个分支，其中19个GhCADs与9个经典拟南芥CAD蛋白构成了分支I-III，另外27个GhCAD蛋白与9个非经典拟南芥CAD蛋白构成分支IV和V。其中GhCAD35和GhCAD45分别属于分支I和III，属于经典的CAD蛋白。而GhCAD43属于分支V的非典型CAD蛋白。
实施例2
为明确棉花中哪些GhCAD基因能够响应黄萎病菌侵染，因此，通过人工黄萎病菌侵染试验，结合实施例1中初步筛选分析结果，利用qRT-PCR检测技术，发明人对受黄萎病菌诱导的GhCAD基因进行了进一步筛选，具体试验过程和结果简介如下。
首先，选取4个抗黄萎病的陆地棉栽培种（ZZM 2, Han 333, GK 44和 GK 168）和5个黄萎病易感陆地棉栽培种（TM-1, Jimian 11, DH 966, Foster 6和 8891），待两周左右的棉花幼苗长出两片真叶时，用水轻柔地清洗根部，然后用吸水纸将根部水清除干净，对根进行同等程度的伤害处理；随后，将培养的黄萎病菌菌株V991菌液通过纱布过滤后，用ddH2O将孢子浓度调至1×107 CFU/mL，将上述伤害处理后棉花根系在菌液中浸泡1分钟，然后用新配营养土重新培养。18 d后观察发病情况并进行病情指数统计。
对照组，采用无菌水处理同步操作处理。
黄萎病病指统计时，将植物黄萎病病症的严重程度分为5个等级（0-4级）：0级代表无明显萎蔫或黄化症状；1级代表有0-25%（含25%）的真叶枯萎、黄化或脱落；2级代表有25-50%（含50%）的真叶枯萎、黄化或脱落；3级代表有50-75%（含75%）的真叶枯萎、黄化或脱落；4级代表有75-100%（含100%）的真叶枯萎、黄化或脱落。
病情指数计算公式如下：病情指数=[0×n0（0级的植株数）+1×n1（1级的植株数）+2×n2（2级的植株数）+3×n3（3级的植株数）+4×n4（4级的植株数）] ÷ [4×n总（0-4级所有植株总数）]。
黄萎病菌接种18天后，通过定量PCR (qRT-PCR)技术，检测分析不同材料茎组织中不同GhCADs的表达情况。试验过程中，选择先前报道的陆地棉中受黄萎病菌诱导的PR10-11（pathogenesis-related protein 10-11）基因、PR10-5（pathogenesis-related protein10-5）基因作为正对照（由于陆地棉中PR10属于病程相关蛋白，GhPR10是在侵病材料中相对表达量上调最高的PR基因，且可能同时参与SA和JA介导的抗病机制，因此选用陆地棉中PR10-5和PR10-11作为qRT-PCR过程中鉴定GhCADs是否属于与抗黄萎病直接相关的诱导型Maker基因的对照基因，关于这两个基因研究情况，具体可参见：Dowd et al., Geneexpression profile changes in cotton root and hypocotyl tissues in responseto infection with Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum，Molecular Plant-Microbe Interactions，2004；Steiner-Lange et al., Differential DefenseReactions in Leaf Tissues of Barley in Response to Infection byRhynchosporium secalis and to Treatment with a Fungal Avirulence GeneProduct，Molecular Plant-Microbe Interactions，2003）。
PCR过程中，植物总RNA提取参考RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN）说明书即可。RNA反转录参考HiScript® II Q Select RT SuperMix for qPCR（诺唯赞）说明书即可。
10 μL定量PCR的反应体系：cDNA 模板，1 μL（浓度，200 ng/μL）；基因上、下游引物，各0.5 μL；2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix ，5 μL；补充ddH2O至总体系10 μL；参考ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（诺唯赞）说明书，使用罗氏4800荧光定量PCR仪检测；PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、10s，60℃、10s，72℃、10s，45个循环；95℃、5s，65℃、1min；以管家基因GhUBQ7为内参基因。
部分荧光定量PCR所用引物序列具体设计如下：
GhUBQ7-F：5’-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3’，
GhUBQ7-R：5’-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3’；
GhCAD35-F：5’-CTTATGCCCATCAACTACCC-3’，
GhCAD35-R：5’-ACAAGAGCTTACCAGGCACC-3’；
GhCAD43-F：5’-CGTGGACGACTATCGACTATCT-3’，
GhCAD43-R：5’-CTTCGGGTATGTCCTGCATATT-3’；
GhCAD45-F：5’-GTGATCAGCACATCTCCGAATA-3’，
GhCAD45-R：5’-CCCTGAAGTTGATCTTGGTCTC-3’。
初步筛选结果表明GhCAD35、GhCAD45、GhCAD43三个基因具有进一步研究价值。部分筛选结果如图2、图3和图4所示。具体而言：
分析结果可以看出，基于PR10-11基因时，相对于对照组，在黄萎病菌处理的实验组中PR10-11在所有种质材料中的相对表达量呈显著上调趋势（图2）。其中GhCAD43基因表达变化趋势与PR10-11基本一致，除TM-1之外，GhCAD43在其它所有检测的陆地棉栽培种中都受到了黄萎病菌的显著诱导。这一结果表明GhCAD43可能参与了陆地棉对黄萎病的防御过程。
基于PR10-5基因时，相对于对照组，在黄萎病菌处理的实验组中PR10-5在所有种质材料中的相对表达量呈显著上调趋势。GhCAD35和GhCAD45基因表达变化趋势与PR10-5基本一致， GhCAD35和GhCAD45在所有检测的陆地棉栽培种中都受到了黄萎病菌的显著诱导。此外，黄萎病侵染早期GhCAD35和GhCAD45表达情况结果（图4）显示，GhCAD35和GhCAD45主要在抗性栽培种中受到了明显诱导，而感病栽培种中并没有观察到明显的诱导。这些结果表明，GhCAD35和GhCAD45同样可能参与了陆地棉对黄萎病的防御过程，但不同抗性品种之间受诱导表达速度也有一定区别。
进一步对GhCAD43在陆地棉的时空表达模式进行分析，以陆地棉生长周期内的三个主要生长发育时期为代表，即幼苗期、生长期和成熟期（分别以生长30 天、60天和90天为代表），以根、茎和叶代表陆地棉的主要组织样品，通过qRT-PCR鉴定GhCAD43的时空表达模式。结果如图5所示。分析可以看出，GhCAD43在生长初期的幼苗期根茎叶组织的表达量很低，但是在生长期和成熟期的根和茎组织的表达量显著上调。
而对GhCAD35和GhCAD45的时空表达模式分析表明（图6），GhCAD35和GhCAD45同样具有明显时空表达特异性，在幼苗时期，两个基因在根茎叶中都几乎不表达，但在生长期和成熟期表达量显著上调，其中：GhCAD35在60天材料的根茎叶组织表达较高，但到达成熟期后，其叶茎中的表达量明显降低，且在根中已几乎不再表达；而GhCAD45则仅在成熟期植株中的叶中表达较高，在其他生长阶段表达量则较低。
实施例3
在实施例2初步筛选结果基础上，发明人对筛选的GhCAD43、GhCAD35和GhCAD45蛋白进行了体外表达和酶活鉴定，具体试验过程和结果简介如下。
首先，以陆地棉基因组cDNA为模板，PCR克隆获得目的基因序列（GhCAD43、GhCAD35和GhCAD45），PCR克隆扩增中，具体引物序列如下：
6P1-GhCAD35-F：5’-GGGATCCCCGGAATTCATGGAGGGAAGAAGGGTCAT-3’，
6P1-GhCAD35-R：5’-GTCGACCCGGGAATTCTTCAAGGTTGCTTCCAGCAAC-3’;
6P1-GhCAD43-F：5’-GGGATCCCCGGAATTCATGGGTAAAGGAGGGAAATC-3’，
6P1-GhCAD43-R：5’-GTCGACCCGGGAATTCCAGGTTGAACATGACCTTA-3’；
6P1-GhCAD45-F：5’-GGGATCCCCGGAATTCATGACAAGATTGCCAGAAGA-3’，
6P1-GhCAD45-R：5’-GTCGACCCGGGAATTCAGAATGAATTTTCAATGTAT-3’。
随后，以pGEX6P1质粒为载体，将所克隆序列分别与其连接，分别构建重组载体pGEX6P1-GhCAD43、pGEX6P1-GhCAD35和pGEX6P1-GhCAD45载体。
再后，将所构建重组载体转化大肠杆菌BL21，接种到含氨苄抗性（50 μg/mL）的LB培养液中，37℃、200 rpm震荡培养至OD600 = 0.6-0.8左右时，加入10 mM的IPTG，转入16℃、160 rpm条件下培养20小时以进行诱导表达。
最后，将上述诱导表达结束后培养液4℃、4500 rpm离心15 分钟收集菌体，弃上清后，用破菌缓冲液重悬菌体，破碎仪破菌；再4℃、12000 rpm离心45 min，取上清，用含有与琼脂糖介质特异性偶联的谷胱甘肽（GST）柱子对重组蛋白进行纯化，并用Western印迹法检测并确认蛋白的表达。
未详述操作参考现有技术常规操作即可，不再赘述。
Western印迹检测结果如图7、图8所示。可以看出，成功获得了相关目的蛋白。
进一步地，将诱导纯化获得的目的蛋白（GhCAD43蛋白、GhCAD35和GhCAD45蛋白），分别在辅助因子NADPH的参与下，分别与底物松柏醛、芥子醛和香豆醛进行催化反应，然后通过高效液相色谱（HPLC）检测以是否能够生成相对应的产物松柏醇、芥子醇和香豆醇来定性断定目的蛋白是否具有肉桂醇脱氢酶（CAD）活性。
200 μL的酶活催化反应体系设计如下：50 mM Tris-HCl（pH=7.5），0.5 mM NADPH，0.1 mM底物（松柏醛，芥子醛，香豆醛），2.0 mM dithiothreitol（DTT），最后加入1.3 μg蛋白；充分混匀后，30℃条件下反应30 min，加入200 μL甲醇终止反应，通过0.22 μm孔径的有机相滤膜过滤，取200 μL加入液相小瓶，LC-MS检测（色谱柱型号为XBridge BEH C18 2.5 μm 3.0×150 mm XP）。
检测过程中，以松柏醛、芥子醛、香豆醛、松柏醇、芥子醇和香豆醇为标准品，结果如图7、图8所示。分析可以看出，GhCAD43、GhCAD35和GhCAD45对三种底物（松柏醛、芥子醛、香豆醛）均具有明显的催化活性，可以催化三种底物生产相应的松柏醇、芥子醇和香豆醇。也即，GhCAD43蛋白、GhCAD35和GhCAD45均具有显著的肉桂醇脱氢酶催化活性。
实施例4
基于前述试验结果，为进一步明确相关基因与陆地棉黄萎病抗性之间联系，基于VIGS沉默技术，发明人对相关基因进行了沉默，以考察相关目的基因的具体功能效果，具体试验过程及结果简介如下。
（一）沉默片段选择
根据前述相关GhCADs氨基酸序列，结合结构域和序列特异性，选取约含70-200个长度氨基酸对应的基因序列作为目的沉默片段。具体而言：
针对GhCAD43，沉默基因片段选择（360bp）为：
ATTCATGGTTCTCTTGCCCGTCAGGTAGTGCATCCTGCAGACCTGTGTTTCAAGCTGCCAGACAATCTAAGCTTGGAAGAAGGAGCTATGTGTGAGCCCTTGAGTGTAGCGGTCCACGCTTGTCGCCGAGCTAATATCGGTCCAGAAACCAATGTGTTGGTCATGGGAGCAGGACCAATAGGTCTCGTTACACTTCTGGCAGCTCGTGCTTTCGGGGCACCTAGAATTGTCATTGTAGACGTGGACGACTATCGACTATCTGTTGCTAATAACCTCGGTGCCGATGGAGTTGTTAAAGTCTCAACAAATATGCAGGACATACCCGAAGAAGTTGAAAGAATATGTGAAGTGATGGGAGCA。
针对GhCAD35，沉默基因片段序列（402bp）选择为：
CTCTTATGTGCTGGAGTGACGGCTTATAGTCCCTTGAAGCAGTTCAATAACTCTGATAAGGCTATCAAGGCCGGAATTTTGGGGCTCGGCGGAGTCGGGCATTTGGCAGTGCTGATAGCAAAGGCAATGGGGCATCACGTAACCGTGATAAGTTCTTCAGAAAAGAAGAAAGTGGAGGCTTTAGAGCATTTGCACGCCGATGCTTTCCTTGTGAGCTCTAATGCGGCAGAGATGGAGGGAGCAGCAGCCAGCCTCGATTACATTCTCGACACTGTCCCCGCTTTCCATTCTCTGGAGCCTTACATTTCGCTTCTCAAAGCTGGTGGGAAGCTGATTTTTGTTGGGGTTTCCACTAAGCCCCTGCATTTCAACAATGATGAATTGATTTTAGGGAATAAATCA。
针对GhCAD45，沉默片段（375bp）选择为：
ACTTCCATCTACCCTCTTGTTCCTGGTCACGAGATTGCCGGTGAAGTGACGGAGGTGGGAAGTAAGGTCCAAAAGTTCAAAGTTGGAGACCGTGTTGGGGTTGGGTGTCTGGTCGGGTCATGCCGTTCCTGCGATAGCTGCAAAGACAATCTTGAGAACTATTGCCCCAAAATGGTACTTACTTACGGAGCCAAGTACTATGATGGAACTATTACATACGGAGGCTACTCCGACACTATGGTTGCTGACGAGCACTTTAGTGTCCGCATACCTGATAACATGCCTCTTGATGCTGCCGCTCCACTGCTCTGTGCTGGGATTACAGTGTATAGTCCATTGAGATATTATGAACTCGATAGGCCTGGTTTGCACATC。
（二）与pTRV2载体连接
选择EcoR I、Kpn1作为酶切位点，将目的片段连接到pTRV2载体。
（三）制备转染液
将重组载体转入农杆菌GV3101，2-3 天后，挑取单菌落转入YEP培养液，28℃、220rpm条件下培养14小时左右，鉴定阳性后继续将菌液接种到200 mL YEP培养液进行扩繁，菌液孵育至OD600=1.2左右，常温下3800 rpm离心收集农杆菌，用VIGS侵染液将菌体重悬至OD600=0.8。
所述VIGS侵染液：每100 mL ddH2O中，加入1 mL 1 M的MgCl2、1 mL 1M的MES和200μL 100 mM的乙酰丁香酮（AS）。
同时，相同操作，将空载体pTRV2（作为阴性对照）、pTRV2-GhCLA（作为阳性对照）以及转化辅助质粒pTRV1分别转入GV3101，以同样的方法进行培养并将菌体重悬至OD600=0.8。
（四）转染和筛选
转染操作时，将含有pTRV1质粒的GV3101农杆菌分别与含有pTRV2、pTRV2-GhCLA、pTRV2-GhCAD43的GV3101农杆菌等浓度等体积混匀，常温静置3小时，注射生长7-10 d的棉花幼苗（两叶一心）子叶下表皮，过夜暗处理。
1-2周后阳性对照TRV:GhCLA新生组织出现白化症状，注射后2周时，取材沉默试验材料及TRV:00同一部位的新生组织，提取RNA，通过荧光定量PCR进行沉默鉴定。以目的基因相对表达水平降至TRV:00的30%以下作为成功沉默标准（不同基因，基因沉默标准不同，此处30%标准仅是基于工作经验和相关预实验所确定标准）。待基因成功沉默后，安排后续黄萎病菌侵染试验。
具体试验结果如图9、图10所示。分析可以看出，通过qRT-PCR分别检测沉默组中GhCAD43、GhCAD35、GhCAD45相对于空载体对照的表达量，其相对表达量均下调至30%以下，表明已经成功获得沉默材料。
进一步对沉默的VIGS材料接种1×107 CFU/mL孢子浓度的黄萎病菌V991，观察并统计了18 天后的发病情况。分析可以看出：
就GhCAD43基因而言：相对于对照组TRV:00，TRV:GhCAD43表现出不同程度的叶片萎蔫、黄化、枯萎和脱落，甚至整株坏死等典型的黄萎病症状。病情指数统计结果显示，TRV:00对照组80%以上幼苗病级为0，即无黄萎病症状，且没有病级3和4幼苗，病死率仅有5%左右，而TRV:GhCAD43组的病情指数显著高于对照组。挑取具有代表性的植株，显微镜观察茎杆纵切维管组织结构变化情况，发现TRV:00维管组织发育正常，呈鲜绿色，而TRV:GhCAD43的维管组织表现出明显的褐变。这些结果表明GhCAD43具有正向调控黄萎病抗性左右（即，GhCAD43基因表达量与黄萎病抗性正相关，表达量越高，黄萎病抗性越强）。
而就GhCAD35、GhCAD45基因而言，其结果与GhCAD43基因类似，即：相对于对照组TRV:00，TRV:GhCAD35 和TRV:GhCAD35表现出明显的叶片萎蔫、黄化、枯萎和脱落，甚至整株坏死等典型的黄萎病症状。病情指数统计结果显示，TRV:00对照组80%以上幼苗病级为0，即无黄萎病症状，且没有病级3和4幼苗，病死率仅有5%左右，而TRV:GhCAD35 和TRV:GhCAD35组中0病级幼苗仅占30%左右，但是病级3和4幼苗的综合占比超过了50%，导致病死率逼近60%。挑取具有代表性的植株，显微镜观察茎杆纵切维管组织结构变化情况，发现TRV:00维管组织发育正常，呈鲜绿色，而TRV:GhCAD35 和TRV:GhCAD35的维管组织表现出明显的褐变。这些结果表明GhCAD35和GhCAD45同样正调控黄萎病抗性。
为进一步明确上述黄萎病抗性是否与木质素含量相关，发明人对VIGS沉默植株中木质素合成情况进行了研究，具体情况简介如下。
分别取萎病菌侵染早期、侵病后48小时后VIGS沉默材料、TRV:00d侵病组和未侵病对照组茎杆组织样品材料，通过硫代酸解法将复杂的木质素聚合物解聚，最后获得含有G、S和H木质素单体的混合物，使用气相色谱串联质谱联用仪（GC-MS）将三种单体分离并检测，检测结果如图11、图13所示。
结果表明：对于TRV:00植株材料，侵染黄萎病显著诱导了木质素G单体和S单体的含量，增加值分别达到68.4%和57.9%，而对H单体没有显著影响；而在GhCAD43沉默的TRV:GhCAD43植株材料中，侵染黄萎病对木质素G单体和S单体的诱导显著削弱，其增加值分别仅为31.8%和30.3%。而在黄萎病侵染晚期（18天后），进一步通过比较TRV:GhCAD43和TRV:00植株材料是否侵染黄萎病后的茎组织横切变化情况显示（UV光照射下的自发荧光以及间苯三酚染色，图12），与未侵病材料相比，侵染黄萎病后的TRV:GhCAD43茎组织横切的木质部染色显著变薄，变浅，暗示木质素沉积显著降低。同时可以观察到在侵病的TRV:GhCAD43茎组织横切中，黄萎病菌在木质部的导管区域明显积聚。这些结果表明，GhCAD43正调控黄萎病菌侵染诱导的木质素合成和沉积过程，GhCAD43沉默材料中木质素合成受阻很可能导致了其对黄萎病的易感。
对GhCAD435、GhCAD445沉默的TRV:GhCAD43 、TRV:GhCAD45植株材料中，侵染黄萎病对木质素G单体和S单体的诱导显著削弱，在TRV:GhCAD35植株茎组织，其增加值分别仅为21.2%和10.2%，在TRV:GhCAD35植株茎组织，其增加值分别仅为13.2%和24.7%。而在黄萎病侵染晚期（18天后），通过比较侵染黄萎病后的茎组织横切变化情况（图14），与未侵病材料相比，侵染黄萎病后的TRV:GhCAD35 和TRV:GhCAD35茎组织横切的木质部染色显著变薄，变浅，暗示木质素沉积显著降低。同时可以观察到在侵病的TRV:GhCAD35 和TRV:GhCAD35茎组织横切中，黄萎病菌在木质部的导管区域明显积聚。这些结果表明，GhCAD35和GhCAD45正调控黄萎病菌侵染诱导的木质素合成和沉积过程，GhCAD35和GhCAD45沉默材料中木质素合成受阻很可能导致了其对黄萎病的易感。
需要说明的是，对植株茎横、纵切及染色操作，具体操作可参考如下：茎纵切：取侵病后18天的对照组和沉默组同一部位茎杆，用刀片从最大直径处进行纵切，然后用体式显微镜观察维管束褐变情况；茎横切：取棉花幼苗茎杆，使用刀片手动垂直横切，截面厚度约100-120 μm；注：所有沉默组都要与空载对照组横切位置保持一致，因为茎杆不同位置的木质化程度是不同的；刀片同一位置不能多次使用，应及时更换刀片，以防茎切片组织损伤，提高切片质量。
UV下观察木质素自发荧光：用细毛笔将切片轻轻的放于载玻片上，在切片上滴少量ddH2O，慢慢的盖上盖玻片，在明视野下调整好视野后，把荧光倒置显微镜设置为UV激发光，即可观察木质素自发荧光。
间苯三酚染色法（Phloroglucinol staining）观察木质部发育情况：将切片放于1%的间苯三酚溶液中浸泡3-5 min（实验组和对照的时间要保持一致）;用ddH2O轻轻的清洗之后，滴加20% HCl酸化；用滤纸清除多余的盐酸，以防损坏显微镜，制片后用倒置显微镜下观察。
木质素检测过程中，针对木质素单体提取和GC-MS检测操作，具体可参考如下：
每个样品称取10 ± 1 mg干燥的CWR（cell wall residue）粉末，移至2 mL用氮气吹过的HPLC玻璃小瓶；加入1 mL新鲜的反应混合液：2.5%醚合三氟化硼（三氟化硼乙醚）溶液和10%乙硫醇溶于新鲜的蒸馏二氧六环（v/v），密封后，将玻璃小瓶放于干燥的95 ℃金属浴上，反应4 h，每过一个小时手动搅拌一次，然后移至冰上15 min终止反应；
使用足够的0.4 M碳酸氢钠溶液将反应混合物pH值调至3到4之间（约0.3 mL，用pH试纸测定），将反应溶液转移至新的10 mL玻璃试管中，用2 mL ddH2O清洗HPLC玻璃小瓶，把冲洗液转移至10 mL玻璃试管，然后每个试管加入1 mg十七酸甲酯（1mg十七酸甲酯溶于1mL二氯甲烷）作为内参。
为了从含水混合物中提取反应产物，重新盖上试管，涡旋1 min，静置半小时以上，重复两次，将上层（水相）和下层（有机相和木质素分解产物）分离；用玻璃移液管移出1.5mL有机相，确保每个处理量相同，同时用塞有小棉纸巾塞的巴斯德吸管（用50 mg无水硫酸钠填充空隙）过滤，清除残留的水，然后转移至2 mL聚丙烯管中。
在50℃低压烘箱过夜，将所有样品集中浓缩干燥，用0.5 mL的二氯甲烷复苏；取50μL样品转移到微型离心管，并在上述同等条件下干燥1 h，分别加入50 μL吡啶和50 μL N-甲基-N-（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺进行衍生化，室温放置5 h以上，取1 μL上样量进行GC-MS分析。
GC-MS检测：使用气相色谱串联质谱联用仪NO.2019024275 （Xevo TQ-GC），选用30-m RTX5ms 0.25-mm内径的色谱柱，氦气作为载气，样品流速为1 mL/min，入口和探测器的温度设为250 ℃，色谱器表面温度设为130 ℃，保持3 min，在40 min内以3 ℃/min的速度将温度逐步提升至250 ℃，保持5 min后冷却。
实施例5
为进一步明确相关目的基因对黄萎病抗性效果，发明人将相关目的基因在拟南芥中进行了异源超表达，具体试验过程及结果简介如下。
（一）PCR扩增目的基因
以陆地棉cDNA为基因组为模板，PCR扩增目的基因；
GhCAD43的PCR扩增引物：
1300-GhCAD43-F：5’- GGGGCCCGGGGTCGACATGGGTAAAGGAGGGAAATC -3’
1300-GhCAD43-R：5’- GTATTTAAATGTCGACGCAGGTTGAACATGACCTTAA -3’
GhCAD35的PCR扩增引物：
1300-GhCAD35-F：5’- GGGGCCCGGGGTCGACATGGAGGGAAGAAGGGTCAT-3’
1300-GhCAD35-R：5’- GTATTTAAATGTCGACGTTCAAGGTTGCTTCCAGCAA-3’
GhCAD45的PCR扩增引物：
1300-GhCAD45-F：5’- GGGGCCCGGGGTCGACATGACAAGATTGCCAGAAGA-3’
1300-GhCAD45-R：5’- GTATTTAAATGTCGACGAGAATGAATTTTCAATGTAT-3’
（二）构建重组超表达质粒
以载体35S:GFP（pCAMBIA1300）为载体，利用Sal I酶切位点，通过一步克隆法，将步骤（一）中扩增所得目的基因克隆到具有潮霉素植物抗性的pCAMBIA1300-GFP质粒质粒上，分别构建重组超表达质粒：35S:GhCAD43:GFP、35S:GhCAD35-GFP和35S:GhCAD45-GFP。
（三）转染、与筛选超表达材料
将步骤（二）所得重组质粒转入农杆菌GV3101，筛选转化正确菌株，YEP液体培养基中30℃过夜培养后，4000 rpm 离心10 min收集细胞，重新悬浮在含有0.03% silwet-77的5%蔗糖MS溶液中，调节溶液的OD600在1.0左右作为侵染液；
采用浸花法（花序侵染法），选择生长4-6周含有大量未开放花芽的拟南芥植株，将拟南芥的花芽浸在含菌重悬液（侵染液）中45 s，过夜暗处理后重新放于培养室生长；
通过含有潮霉素抗性的MS培养基筛选出具有潮霉素抗性的T1代幼苗，对初步筛选所得阳性株取样并提取DNA，对每株T1代的DNA模板进行PCR扩增鉴定（正向检测引物取自GhCADs的CDSs 5’端序列，反向检测引物取自pCAMBIA1300-GFP载体上含有的在目的基因3’端的GFP标签序列；对PCR扩增产物进行电泳，在1000 bp位置出现明显条带，即可初步确认T1代植株已经成功转入有目的基因，进一步地，可进行测序鉴定，确保鉴定结果准确）。对鉴定正确植株继续培养收获种子（采用单株收种）后，继续栽种以获得纯合体（根据孟德尔遗传定律，在T3代植株中成功获得了不再性状分离的株系，即为纯合体转基因株系），并进行后续表型性状鉴定。
黄萎病抗性鉴定时：
将生长2周的纯合体转基因材料以及转化空载体35S:GFP对照组拟南芥植株，参考前述伤根侵染法操作，对根部接种1×107 CFU/mL孢子浓度的黄萎病菌V991。
2周后的感病表型如图15、图16所示。可以看出：
35S:GFP莲座叶中大部分叶片有明显的退绿、黄化表型，即黄萎病症状，而35S:GhCAD43:GFP莲座叶中仅有部分叶片出现退绿、黄化症状。对每组进行不少于16株的植物材料进行病级统计和病死率统计所示，35S:GFP具有最高病死率，达75%左右，与35S:GFP相比，35S:GhCAD43:GFP病死率显著降低，为65%左右。综合以上病症表型和病指统计的结果，说明GhCAD43过表达可以增强拟南芥对于黄萎病的抗性。
35S:GhCAD35-GFP和35S:GhCAD45-GFP材料具有类似表型，具体而言：而35S:GhCAD35-GFP和35S:GhCAD45-GFP莲座叶中仅有部分叶片出现退绿、黄化症状。对每组进行不少于16株的植物材料进行病级统计和病死率统计所示，35S:GFP具有最高病死率，达75%左右，而35S:GhCAD35:GFP和35S:GhCAD45:GFP病死率只有50%左右，与35S:GFP相比病情差异显著。综合以上病症表型和病指统计的结果，说明GhCAD35和GhCAD45过表达可以增强拟南芥对于黄萎病的抗性。
总体上，近年来，利用系统生物学，尤其是代谢组学与全基因组和转录组关联分析等方法挖掘控制农艺性状的关键代谢产物和调控基因，已经成为有效的现代分子生物学研究手段。本申请中，根据对黄萎病侵染过程中棉花根茎次生代谢产物积累变化情况，初步鉴定获得了能够调控黄萎病抗性的关键代谢产物及其合成调控基因。从而有助于从代谢角度解析调控棉花抗黄萎病的分子机制，为培育具有高黄萎病抗性的棉花新种质提供了新思路。
具体而言，本申请中，依据前期植物苯丙烷类代谢产物尤其是木质素在黄萎病早期侵染以及后期发病过程中作用研究，通过对棉花中相关GhCADs基因研究，可以更清楚的了解木质素合成在陆地棉抵御黄萎病入侵中的作用。进而可为利用分子遗传育种技术培育能够抵御黄萎病的陆地棉新品种奠定良好的基因资源基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
河南大学三亚研究院
<120> 棉花肉桂醇脱氢酶基因在抗黄萎病中的应用
<130> none
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 1
attcatggtt ctcttgcccg tcaggtagtg catcctgcag acctgtgttt caagctgcca 60
gacaatctaa gcttggaaga aggagctatg tgtgagccct tgagtgtagc ggtccacgct 120
tgtcgccgag ctaatatcgg tccagaaacc aatgtgttgg tcatgggagc aggaccaata 180
ggtctcgtta cacttctggc agctcgtgct ttcggggcac ctagaattgt cattgtagac 240
gtggacgact atcgactatc tgttgctaat aacctcggtg ccgatggagt tgttaaagtc 300
tcaacaaata tgcaggacat acccgaagaa gttgaaagaa tatgtgaagt gatgggagca 360
<210> 2
<211> 402
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 2
ctcttatgtg ctggagtgac ggcttatagt cccttgaagc agttcaataa ctctgataag 60
gctatcaagg ccggaatttt ggggctcggc ggagtcgggc atttggcagt gctgatagca 120
aaggcaatgg ggcatcacgt aaccgtgata agttcttcag aaaagaagaa agtggaggct 180
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gcagcagcca gcctcgatta cattctcgac actgtccccg ctttccattc tctggagcct 300
tacatttcgc ttctcaaagc tggtgggaag ctgatttttg ttggggtttc cactaagccc 360
ctgcatttca acaatgatga attgatttta gggaataaat ca 402
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 3
acttccatct accctcttgt tcctggtcac gagattgccg gtgaagtgac ggaggtggga 60
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tgccgttcct gcgatagctg caaagacaat cttgagaact attgccccaa aatggtactt 180
acttacggag ccaagtacta tgatggaact attacatacg gaggctactc cgacactatg 240
gttgctgacg agcactttag tgtccgcata cctgataaca tgcctcttga tgctgccgct 300
ccactgctct gtgctgggat tacagtgtat agtccattga gatattatga actcgatagg 360
cctggtttgc acatc 375

Claims (4)

1.棉花肉桂醇脱氢酶基因在植物黄萎病抗性中的应用，其特征在于，所述棉花肉桂醇脱氢酶基因包括：GhCAD43、GhCAD45；
所述棉花肉桂醇脱氢酶基因与黄萎病抗性正相关；即：基因沉默后，植物易感染黄萎病，基因超表达后，可增强植物黄萎病抗性；
所述GhCAD43，其基因序列为：
ATGGGTAAAGGAGGGAAATCTCATCAAGAAGGTGAAGAAAACATGGCTGCTTGGCTCGTGGATCTTAACACCCTCAAAATTCAACCATTCAAGCTCCCTCCTCTTGGTATAACCCTTCGTTTTTCATTTTGGGCTCTTTTAGTTTGTTCCATTTATGGAGTTTATGAATTACCATTATGGTTTTAGATAAACCTTTTGTTTTTTTTTGTTTCTTATATATTGATTGATCACTTCTCTTTTTGTTGTGGGTGAATATAATTAAGGACCCCATGATGTGAGAGTTAGGATGAAAGCTGTTGGCATCTGTGGAAGTGATGTTCACTTTCTCAAGGTATGTTCTACATGTATCCATGTAACCATATGTATATAAATATATATGACCTTGTTTAACCCCGTGTGTGTGTGTGTAGACACTGAGGCTTGCAGATTTTGTGGTGAAAGAACCAATGGTGATAGGGCATGAGTGTGCTGGGATCATAGAGGAGATTGGAAGTGAAGTCAAGAATTTAGTGCCTGGTGACCGAGTGGCATTGGAACCAGGGATTGGTTGCTGGCGATGTGATCTTTGCAAGGAAGGTCGATACAATATATGCCCTGATATGAAGTTTTTCGCCACTCCACCGATTCATGGTTCTCTTGCCCGTCAGGTGAACCTATAAAGCTGCAATTTCAGCCTTGGTTCTACTCTGTTTATCCATATGACTAATAGTGTACAAGATTATTATTTTCAATGTAGGTAGTGCATCCTGCAGACCTGTGTTTCAAGCTGCCAGACAATCTAAGCTTGGAAGAAGGAGCTATGTGTGAGCCCTTGAGTGTAGCGGTCCACGCTTGTCGCCGAGCTAATATCGGTCCAGAAACCAATGTGTTGGTCATGGGAGCAGGACCAATAGGTCTCGTTACACTTCTGGCAGCTCGTGCTTTCGGGGCACCTAGAATTGTCATTGTAGACGTGGACGACTATCGACTATCTGTTGCTAATAACCTCGGTGCCGATGGAGTTGTTAAAGTCTCAACAAATATGCAGGTCCATATCATCAAGTTTTATGAGATATATATAATTAAATCATTGTCTGACTTTTTAAATGGTTTCAGGACATACCCGAAGAAGTTGAAAGAATATGTGAAGTGATGGGAGCAGTAGGAGTGCATGTAACCTTTGACTGTGCAGGCTTTAACAAAACAATGTCGACTGCTTTGAGTGCCACTCGAGCCGGTGGCAAGGTTTGCCTTGTTGGATTAGGCCATAACGAGATGACCGTCCCACTTACACCAGCTGCTGCTAGGTACTTATTTCAATGATTCATTTACTTGACTGTTGCCTGAAAATTAACCAGGATTGATTGCAGGGAGGTTGATATTATCGGGATATTCCGGTATAAGAACACTTGGCCTTTGTGCATTGAGCTTCTAAGAAGTGGTAAGATCGATGTGAAGCCACTGATAACTCACAGGTTCGGGTTTTCCCAGAAAGAGGTTGAAGAAGCTTTTGAAACTAGTGCTCGCGGCGGTGATGCCATTAAGGTCATGTTCAACCTGTGA；
所述GhCAD45，其基因序列为：
ATGACAAGATTGCCAGAAGAAGAGCACCCTAACAAGGCTTTTGGATGGGCTGCCAGAGACAGTTATGGTGTTCTCTCTCCCTTCAAATTTTCCAGAAGGTTTTCTTTTTTCTCCTTAAACTTTTTATCATTGCTCTGTCTTTGAATCAGTTCCCTTGTCAAAGGGTGTTTGATTGATGTGGGGTTTGACACTTGCAGGGCAACAGGTGAGAAGGATGTAGCCTTCAAGGTGCTTTATTGTGGGATTTGCCATTCTGATCTTCATATGGCCAAGAATGAATGGGGTACTTCCATCTACCCTCTTGTTCCTGGGTATGTTTTCCATTCTTATATTTTATATATATCAACTAACAATTTCCATGGATATATGCTAATACTACTTTGATGACAAAAAATTGACACATGCAACAATGAACCACAGTTTATTGGTCAACCTAAATAATATATATTGGATGCAGTCACGAGATTGCCGGTGAAGTGACGGAGGTGGGAAGTAAGGTCCAAAAGTTCAAAGTTGGAGACCGTGTTGGGGTTGGGTGTCTGGTCGGGTCATGCCGTTCCTGCGATAGCTGCAAAGACAATCTTGAGAACTATTGCCCCAAAATGGTACTTACTTACGGAGCCAAGTACTATGATGGAACTATTACATACGGAGGCTACTCCGACACTATGGTTGCTGACGAGCACTTTAGTGTCCGCATACCTGATAACATGCCTCTTGATGCTGCCGCTCCACTGCTCTGTGCTGGGATTACAGTGTATAGTCCATTGAGATATTATGAACTCGATAGGCCTGGTTTGCACATCGGTGTGGTTGGACTGGGTGGACTCGGTCATGTTGCAGTAAAATTTGCCAAGGCAATGGGGGTTAAAGTCACAGTGATCAGCACATCTCCGAATAAGAAGAAAGAAGCTTTGGAAAATCTTGGTGCAGATTCGTTTTTAGTCAGTCGAGACCAAGATCAACTTCAGGTTTATATGTTTTTCTTTCTTTCAATGATTTATTAATGAGGGGTTTTTTGTGAGTGTATATAAGTTTCTAAGTTCCTTATTTGGTGTATAGGGTGCCATTGGCACATTGGACGGAATCATAGACACAGTGTCAGCTCAACACCCTGTGCTGCCATTGCTTGCGCTGTTGAAGTCTCACGGGAAGCTTGTTCTTCTTGGTGCTCCAGAGAAACCACTTGAGTTGCCTGTGTTTCCTTTAATCCAAGGTAATGATCTGTTGCTAATATCTTTTCGTAAGAGTAATATGGGATCTCAAATTCCCCAAAGATATCTTAAATTAGAGTCATAATTGAGTGCAGGGAGGAAAGTAATAGGAGGAAGCTTGATCGGAGGGATGAAGGAAACTCAAGAGATGATTGATTTCGCAGCTAAACATGACGTAAAACCTGACATTGAAGTTATAGCTATGGATTATGTGAACACAGCTATGGAACGCCTTCTTAAAGCGGATGTCAAATATAGATTTGTGATCGACATTGGAAATACATTGAAAATTCATTCTTGA。
2.如权利要求1所述棉花肉桂醇脱氢酶基因在黄萎病抗性中的应用，其特征在于，用于增强棉花或拟南芥对黄萎病抗性。
3.利用棉花肉桂醇脱氢酶基因的植物品种培育方法，其特征在于，所述植物品种中，超表达有棉花肉桂醇脱氢酶基因，所述棉花肉桂醇脱氢酶基因为：GhCAD43或GhCAD45；所述培育方法是通过对棉花肉桂醇脱氢酶基因GhCAD43或GhCAD45进行超表达，从而增强植物对黄萎病抗性；
所述GhCAD43，其基因序列为：
ATGGGTAAAGGAGGGAAATCTCATCAAGAAGGTGAAGAAAACATGGCTGCTTGGCTCGTGGATCTTAACACCCTCAAAATTCAACCATTCAAGCTCCCTCCTCTTGGTATAACCCTTCGTTTTTCATTTTGGGCTCTTTTAGTTTGTTCCATTTATGGAGTTTATGAATTACCATTATGGTTTTAGATAAACCTTTTGTTTTTTTTTGTTTCTTATATATTGATTGATCACTTCTCTTTTTGTTGTGGGTGAATATAATTAAGGACCCCATGATGTGAGAGTTAGGATGAAAGCTGTTGGCATCTGTGGAAGTGATGTTCACTTTCTCAAGGTATGTTCTACATGTATCCATGTAACCATATGTATATAAATATATATGACCTTGTTTAACCCCGTGTGTGTGTGTGTAGACACTGAGGCTTGCAGATTTTGTGGTGAAAGAACCAATGGTGATAGGGCATGAGTGTGCTGGGATCATAGAGGAGATTGGAAGTGAAGTCAAGAATTTAGTGCCTGGTGACCGAGTGGCATTGGAACCAGGGATTGGTTGCTGGCGATGTGATCTTTGCAAGGAAGGTCGATACAATATATGCCCTGATATGAAGTTTTTCGCCACTCCACCGATTCATGGTTCTCTTGCCCGTCAGGTGAACCTATAAAGCTGCAATTTCAGCCTTGGTTCTACTCTGTTTATCCATATGACTAATAGTGTACAAGATTATTATTTTCAATGTAGGTAGTGCATCCTGCAGACCTGTGTTTCAAGCTGCCAGACAATCTAAGCTTGGAAGAAGGAGCTATGTGTGAGCCCTTGAGTGTAGCGGTCCACGCTTGTCGCCGAGCTAATATCGGTCCAGAAACCAATGTGTTGGTCATGGGAGCAGGACCAATAGGTCTCGTTACACTTCTGGCAGCTCGTGCTTTCGGGGCACCTAGAATTGTCATTGTAGACGTGGACGACTATCGACTATCTGTTGCTAATAACCTCGGTGCCGATGGAGTTGTTAAAGTCTCAACAAATATGCAGGTCCATATCATCAAGTTTTATGAGATATATATAATTAAATCATTGTCTGACTTTTTAAATGGTTTCAGGACATACCCGAAGAAGTTGAAAGAATATGTGAAGTGATGGGAGCAGTAGGAGTGCATGTAACCTTTGACTGTGCAGGCTTTAACAAAACAATGTCGACTGCTTTGAGTGCCACTCGAGCCGGTGGCAAGGTTTGCCTTGTTGGATTAGGCCATAACGAGATGACCGTCCCACTTACACCAGCTGCTGCTAGGTACTTATTTCAATGATTCATTTACTTGACTGTTGCCTGAAAATTAACCAGGATTGATTGCAGGGAGGTTGATATTATCGGGATATTCCGGTATAAGAACACTTGGCCTTTGTGCATTGAGCTTCTAAGAAGTGGTAAGATCGATGTGAAGCCACTGATAACTCACAGGTTCGGGTTTTCCCAGAAAGAGGTTGAAGAAGCTTTTGAAACTAGTGCTCGCGGCGGTGATGCCATTAAGGTCATGTTCAACCTGTGA；
所述GhCAD45，其基因序列为：
ATGACAAGATTGCCAGAAGAAGAGCACCCTAACAAGGCTTTTGGATGGGCTGCCAGAGACAGTTATGGTGTTCTCTCTCCCTTCAAATTTTCCAGAAGGTTTTCTTTTTTCTCCTTAAACTTTTTATCATTGCTCTGTCTTTGAATCAGTTCCCTTGTCAAAGGGTGTTTGATTGATGTGGGGTTTGACACTTGCAGGGCAACAGGTGAGAAGGATGTAGCCTTCAAGGTGCTTTATTGTGGGATTTGCCATTCTGATCTTCATATGGCCAAGAATGAATGGGGTACTTCCATCTACCCTCTTGTTCCTGGGTATGTTTTCCATTCTTATATTTTATATATATCAACTAACAATTTCCATGGATATATGCTAATACTACTTTGATGACAAAAAATTGACACATGCAACAATGAACCACAGTTTATTGGTCAACCTAAATAATATATATTGGATGCAGTCACGAGATTGCCGGTGAAGTGACGGAGGTGGGAAGTAAGGTCCAAAAGTTCAAAGTTGGAGACCGTGTTGGGGTTGGGTGTCTGGTCGGGTCATGCCGTTCCTGCGATAGCTGCAAAGACAATCTTGAGAACTATTGCCCCAAAATGGTACTTACTTACGGAGCCAAGTACTATGATGGAACTATTACATACGGAGGCTACTCCGACACTATGGTTGCTGACGAGCACTTTAGTGTCCGCATACCTGATAACATGCCTCTTGATGCTGCCGCTCCACTGCTCTGTGCTGGGATTACAGTGTATAGTCCATTGAGATATTATGAACTCGATAGGCCTGGTTTGCACATCGGTGTGGTTGGACTGGGTGGACTCGGTCATGTTGCAGTAAAATTTGCCAAGGCAATGGGGGTTAAAGTCACAGTGATCAGCACATCTCCGAATAAGAAGAAAGAAGCTTTGGAAAATCTTGGTGCAGATTCGTTTTTAGTCAGTCGAGACCAAGATCAACTTCAGGTTTATATGTTTTTCTTTCTTTCAATGATTTATTAATGAGGGGTTTTTTGTGAGTGTATATAAGTTTCTAAGTTCCTTATTTGGTGTATAGGGTGCCATTGGCACATTGGACGGAATCATAGACACAGTGTCAGCTCAACACCCTGTGCTGCCATTGCTTGCGCTGTTGAAGTCTCACGGGAAGCTTGTTCTTCTTGGTGCTCCAGAGAAACCACTTGAGTTGCCTGTGTTTCCTTTAATCCAAGGTAATGATCTGTTGCTAATATCTTTTCGTAAGAGTAATATGGGATCTCAAATTCCCCAAAGATATCTTAAATTAGAGTCATAATTGAGTGCAGGGAGGAAAGTAATAGGAGGAAGCTTGATCGGAGGGATGAAGGAAACTCAAGAGATGATTGATTTCGCAGCTAAACATGACGTAAAACCTGACATTGAAGTTATAGCTATGGATTATGTGAACACAGCTATGGAACGCCTTCTTAAAGCGGATGTCAAATATAGATTTGTGATCGACATTGGAAATACATTGAAAATTCATTCTTGA。
4.如权利要求3所述利用棉花肉桂醇脱氢酶基因的植物品种培育方法，其特征在于，所述植物为拟南芥或棉花。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116162605B (zh) * 2022-08-18 2024-06-04 安徽农业大学 合成香叶醇的茶树肉桂醇脱氢酶及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999004012A1 (en) * 1997-07-18 1999-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of pathogen resistant plants
WO2012023111A1 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Basf Plant Science Company Gmbh Method of increasing resistance against fungal infection in transgenic plants by hcp-2-gene
CN106434694A (zh) * 2016-11-03 2017-02-22 河南大学 棉花GbDREB基因在抗黄萎病中的应用
CN106554964A (zh) * 2016-11-03 2017-04-05 河南大学 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用
CN110923250A (zh) * 2019-11-13 2020-03-27 中国农业科学院棉花研究所 棉花黄萎病抗性相关基因GhSDH1-1的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999004012A1 (en) * 1997-07-18 1999-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of pathogen resistant plants
WO2012023111A1 (en) * 2010-08-20 2012-02-23 Basf Plant Science Company Gmbh Method of increasing resistance against fungal infection in transgenic plants by hcp-2-gene
CN106434694A (zh) * 2016-11-03 2017-02-22 河南大学 棉花GbDREB基因在抗黄萎病中的应用
CN106554964A (zh) * 2016-11-03 2017-04-05 河南大学 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用
CN110923250A (zh) * 2019-11-13 2020-03-27 中国农业科学院棉花研究所 棉花黄萎病抗性相关基因GhSDH1-1的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GhODO1, an R2R3-type MYB transcription factor, positively regulates cotton resistance to Verticillium dahliae via the lignin biosynthesis and jasmonic acid signaling pathway;Yutao Zhu et al.;《Int J Biol Macromol 》;第15卷(第201期);第580-591页 *
Identification and Characterization of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Encoding Genes Involved in Lignin Biosynthesis and Resistance to Verticillium dahliae in Upland Cotton (Gossypium hirsutum L.);Haipeng Li et al.;《Frontiers in Plant Science》;第13卷;第1-17页 *
Lignin metabolism has a central role in the resistance of cotton to the wilt fungus Verticillium dahliae as revealed by RNA-Seq-dependent transcriptional analysis and histochemistry;Li Xu et al.;《Journal of Experimental Botany》;第62卷(第15期);第5607-5621页 *
PREDICTED: Gossypium hirsutum cinnamyl alcohol dehydrogenase 1-like (LOC107959681), mRNA NCBI Reference Sequence: XM_041103965.1;genbank;《genbank》;第1-2页 *
PREDICTED: Gossypium hirsutum probable mannitol dehydrogenase (LOC107925779), mRNA NCBI Reference Sequence: XM_016856504.2;genbank;《genbank》;第1-2页 *
PREDICTED: Gossypium hirsutum sorbitol dehydrogenase (LOC107947282), mRNA NCBI Reference Sequence: XM_016881876.2;genbank;《genbank》;第1-2页 *

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