CN114344319A - 吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途,属于制药领域。本发明首次发现,吴茱萸苷能显著抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的炎症反应,促进细胞线粒体功能紊乱,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移。吴茱萸苷来源于天然植物翼首草,其细胞毒性小,安全性高。吴茱萸苷在制备免疫抑制剂类药物,以及预防和/或治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的抗炎药物中具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域,尤其涉及一种天然植物成分吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途。
背景技术
自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织或器官损害所引起的疾病。自身免疫性疾病是一种临床常见病,包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病、自身免疫性溶血贫血等40余种疾病。
类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病,其病程最终转归往往导致关节破坏,其显著特点是由免疫细胞参与的自身免疫调节紊乱。有研究报道,T细胞、巨嗜细胞及其各自的细胞因子在类风湿性关节炎病程中起着关键作用。还有研究报道,在类风湿性关节炎长期的病程中,成纤维样滑膜细胞起着主导的作用,这种作用甚至在疾病早期就已经体现出来,而这类成纤维样滑膜细胞正是类风湿性关节炎区别于其他非自身免疫性关节炎症的重要标志。
对自身免疫性疾病的治疗,一般需要长期应用免疫抑制剂。免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物,能抑制与免疫反应有关细胞(T细胞和B细胞等巨噬细胞)的增殖和功能,能降低抗体免疫反应。免疫抑制剂主要用于器官移植抗排斥反应和自身免疫病如类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病和自身免疫性溶血贫血等。目前临床主要采用的免疫抑制剂有环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、咪唑立宾、依维莫司、硫唑嘌呤、等。但是,长期使用这些药物,容易引起多种不良反应。例如,咪唑立宾容易引起胃肠道反应、血液系统障碍和过敏症状,偶见骨髓功能抑制和急性肾功能衰竭。依维莫司最常见的不良反应包括上呼吸道感染、鼻窦和耳部感染、口腔溃疡等。硫唑嘌呤引起的不良反应包括骨髓抑制、肝毒性、胃肠道毒性以及诱发肿瘤危险、引起粒细胞缺乏及血小板数量下降等。因此,开发出毒性小,安全性高的免疫抑制剂具有重要意义。
翼首草为川续断科匙叶翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)的干燥全草,具有用药历史悠久,药效确切等特点,为常用藏药。公元7世纪前的敦煌本吐蕃医学文献《长卷》详细记载了翼首草清瘟疫热毒,治新旧热毒、关节痛风、小肠疼痛等。藏医经典著作《四部医典》中列为上品,味苦、寒,有小毒,归肺肝经,具有治瘟疫,解毒,清心热作用。在藏医药上影响最大的药物学专著《晶珠本草》记载,翼首草解毒,清新旧热,清心热,治瘟病时疫、风湿性关节炎、肠绞痛等。《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药(第一册)收载有翼首草及其制剂相关标准。2010年版、2015年版、2020年版《中国药典》(一部)均收载了翼首草,具有解毒除瘟,清热止痢,祛风通痹的功效。据文献报道有超过200个藏医处方中应用翼首草,表明翼首草在藏医药中的应用极其广泛。
近年来对翼首草的化学分离研究发现,翼首草中的化学成分种类丰富及繁多,主要含有的成分为环烯醚萜苷类化合物和齐墩果烷型皂苷类化合物,除此之外,还含有酚酸类、木脂素类、脂肪酸类、生物碱类、挥发油类等成分。申请号为201210061157.6的中国专利申请公开了一种翼首草总苷提取物,该提取物中,总皂苷和总环烯醚萜苷的总含量不低于50%w/w;并且其中含有马钱苷0.45-0.78%w/w,齐墩果酸0.2-0.45%w/w,熊果酸0.65-1.1%w/w。该翼首草总苷提取物具有良好的抗炎镇痛作用,对机体特异性细胞免疫有一定的抑制效果,并且能够通过降低类风湿性关节炎的促炎症因子水平和提高机体抗氧化能力,有效地治疗类风湿性关节炎。
但是,该翼首草总苷提取物是由多种成分组成的混合物,其组成复杂,治疗类风湿性关节炎的活性成分不明确。从翼首草中提取出一种对类风湿性关节炎等自身免疫性疾病具有优异的治疗效果的具体化合物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然植物成分吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途。
本发明提供了吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途。
进一步地,所述药物为预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物。
进一步地,所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病或自身免疫性溶血贫血。
进一步地,所述药物能够抑制巨噬细胞的炎症反应。
进一步地,所述巨噬细胞为巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7。
进一步地,所述药物能够抑制成纤维样滑膜细胞的炎症反应。
进一步地,所述药物能够促进成纤维样滑膜细胞线粒体功能紊乱。
进一步地,所述药物能够促进成纤维样滑膜细胞凋亡和/或抑制成纤维样滑膜细迁移。
进一步地,所述药物能够促进成纤维样滑膜细胞的促凋亡蛋白表达,抑制成纤维样滑膜细胞的抗凋亡蛋白表达。
进一步地,所述成纤维样滑膜细胞为类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。
进一步地,所述药物是以吴茱萸苷为活性成分,加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
本发明首次发现吴茱萸苷具有以下作用:
吴茱萸苷具有优异的免疫抑制活性,能够用来制备免疫抑制剂类药物。实验结果表明,吴茱萸苷能够有效地减少LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7的炎症反应。
吴茱萸苷能明显抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞HFLS-RA中炎症介质NO,炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6,趋化因子MCP-1及基质金属蛋白酶MMP-1/3/9的表达,由此减弱HFLS-RA细胞的炎症反应。
吴茱萸苷能有效抑制HFLS-RA细胞线粒体ATP酶的活性,减慢有氧呼吸和无氧呼吸的速率,使HFLS-RA细胞中ATP产生速率大大减小。同时,破坏线粒体正常膜电位,使线粒体膜电位降低;使胞内ROS和Ca2+浓度增加,使MPTP活性增大,进而促进HFLS-RA细胞线粒体功能紊乱。
吴茱萸苷不仅能显著促进HFLS-RA细胞凋亡,还能显著抑制HFLS-RA细胞迁移。
吴茱萸苷能显著促进p-AMPK及Sirt1的表达,抑制IκB的降解,抑制NF-κB p65的磷酸化,抑制NF-KB的质核转移,促进促凋亡蛋白Bax表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,而促进HFLS-RA细胞的凋亡。
吴茱萸苷来源于天然植物翼首草,其细胞毒性小,安全性高,在制备免疫抑制剂类药物以及预防和/或治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的抗炎药物中具有广阔的临床应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1:吴茱萸苷对LPS诱导的RAW 264.7细胞中炎症因子的影响。A-C分别表示吴茱萸苷对LPS诱导的RAW 264.7细胞中TNF-α,IL-1β和IL-6含量的作用。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图2:吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中NO含量的影响。与LPS诱导组相比,各浓度吴茱萸苷能明显抑制NO的产生。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图3:吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中炎症因子的影响。A-C分别表示吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,与LPS诱导组相比,各浓度吴茱萸苷能明显抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的产生。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图4:吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中趋化因子MCP-1的影响。与LPS诱导组相比,各浓度吴茱萸苷能明显抑制MCP-1的产生。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图5:吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中基质金属蛋白酶的影响。A-C分别表示吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中总MMP-1、MMP-3和MMP-9的影响,与LPS诱导组相比,各浓度吴茱萸苷能明显抑制总MMP-1、MMP-3和MMP-9的产生。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图6:吴茱萸苷对离体线粒体肿胀度的影响。与CaCl2诱导组相比,40μM的吴茱萸苷能明显促进离体线粒体的肿胀程度。vs未处理组,#,p<0.05;vs CaCl2诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图7:吴茱萸苷对HFLS-RA细胞中ATP含量及ATP酶活性的影响。A表示吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA细胞产生ATP的速率,B-C分别表示吴茱萸苷显著抑制Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图8:吴茱萸苷对HFLS-RA细胞中实时ATP生成速率的影响。A-C表示吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA细胞线粒体呼吸和糖酵解产生ATP的速率。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图9:吴茱萸苷对HFLS-RA细胞的氧消耗速率(OCR)的影响。A表示吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA细胞的OCR,B-E分别表示吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA细胞的非线粒体呼吸,基础呼吸,最大呼吸和线粒体产生相关的呼吸,而E表示吴茱萸苷能明显促进HFLS-RA细胞质子漏。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图10:吴茱萸苷对HFLS-RA细胞外酸化率(ECAR)的影响。A-B表示吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA细胞的ECAR。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图11:吴茱萸苷促进线粒体功能紊乱。A-D分别表示吴茱萸苷能明显降低HFLS-RA细胞膜电位,促进线粒体产生ROS,使线粒体内Ca2+浓度增加,并使MPTP开放。E-H分别为四种免疫荧光的统计图。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图12:吴茱萸苷促进HFLS-RA细胞凋亡。A-B分别表示吴茱萸苷能明显增加HFLS-RA细胞的Hoechst 33324和TUNEL阳性细胞数。C-D分别为两种免疫荧光的统计图。n=3;vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图13:吴茱萸苷抑制LPS诱导的HFLS-RA细胞迁移。A-B表示与LPS诱导组相比,40μM吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA的迁移率。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图14:吴茱萸苷对AMPK/Sirt 1/NF-κB信号通路的影响。A为p-AMPK/AMPK,Sirt 1,IκB,p-p65/p65和β-actin的蛋白条带;B-G分别为各蛋白的相对表达量。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图15:吴茱萸苷对NF-κB p65质核转位的影响。A为质核中蛋白表达的条带;B-C分别为p65在质/核中的相对表达量。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图16:吴茱萸苷对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的影响。A为Bax、Bcl-2和β-actin的蛋白条带;B-D分别为各蛋白的相对表达量。vs未处理组,#,p<0.05;vs LPS诱导组,*,p<0.05;**,p<0.001。
图17:不同浓度的吴茱萸苷对HFLS-RA细胞活力的影响。vs未处理组,#,p<0.05;##,p<0.001。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
吴茱萸苷(简称CA)购自上海源叶生物科技有限公司,纯度≥95%。
实施例1吴茱萸苷的抗炎活性测试
(1)实验方法
2×104个/孔的RAW 264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷,使作用于细胞4h,随后加入LPS(脂多糖)溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后分别用小鼠TNF-α,IL-1β和IL-6检测试剂盒检测细胞培养上清中TNF-α,IL-1β和IL-6含量。
(2)实验结果
结果表明,10,20,40μM浓度的吴茱萸苷均能有效抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞产生TNF-α,IL-1β和IL-6三种炎症因子(图1)。
上述实验证明了吴茱萸苷能够有效地减少LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应。
实施例2吴茱萸苷对HFLS-RA细胞炎症反应的影响
1.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞中NO含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞(类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞)于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用NO检测试剂盒检测细胞培养上清中NO含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的NO含量的增加(图2)。
2.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞中IL-1β含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源IL-1β检测试剂盒检测细胞培养上清中IL-1β含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的IL-1β含量的增加(图3)。
3.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中IL-6含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源IL-6检测试剂盒检测细胞培养上清中IL-6含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的IL-6含量的增加(图3)。
4.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中TNF-α含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源TNF-α检测试剂盒检测细胞培养上清中TNF-α含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的TNF-α含量的增加(图3)。
5.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中MCP-1含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源MCP-1检测试剂盒检测细胞培养上清中MCP-1含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的MCP-1含量的增加(图4)。
6.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中总基质金属蛋白酶1(MMP-1)含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源总MMP-1检测试剂盒检测细胞培养上清中MMP-1含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的MMP-1含量的增加(图5)。
7.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中MMP-3含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源MMP-3检测试剂盒检测细胞培养上清中MMP-3含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的MMP-3含量的增加(图5)。
8.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞中MMP-9含量的影响
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM浓度的吴茱萸苷溶液,使作用于细胞4h,随后加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,24h后用人源MMP-9检测试剂盒检测细胞培养上清中MMP-9含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,10,20,40μM的吴茱萸苷均能有效抑制LPS引起的MMP-9含量的增加(图5)。
上述实验表明,吴茱萸苷能明显抑制HFLS-RA细胞中炎症介质NO,炎症因子TNF-α,IL-1β和IL-6,趋化因子MCP-1及基质金属蛋白酶MMP-1/3/9的表达,由此减弱HFLS-RA细胞的炎症反应。
实施例3吴茱萸苷对HFLS-RA细胞线粒体功能的影响
1.吴茱萸苷对离体线粒体肿胀度的影响
(1)实验方法
取昆明小鼠大脑组织,在10倍体积的预冷线粒体分离缓冲液中剪碎,PBS洗涤1次,冰浴匀浆,匀浆立即在4℃下,2000g/min离心3min;取上清再次2000g/min离心3min,弃去上清,沉淀用预冷的线粒体分离缓冲液重悬后12000g/min离心8min,所得棕色沉淀用预冷的线粒体分离缓冲液重悬,即可得纯化的线粒体。所得线粒体采用BCA蛋白测定法定量线粒体蛋白含量。将分离的线粒体用25℃肿胀缓冲液在稀释至每毫升溶液含100mg蛋白。按分组加入相应的药物,5min后空白组加入不含线粒体的肿胀缓冲液,其余组加入相同体积的100μMCaCl2。0~10min内每隔30s记录各样品在波长为540nm处吸光值,共20次。计算Δψm,Δψm越小,线粒体肿胀度越高,即线粒体MPTP开放越明显。
(2)实验结果
结果表明,10,20,40μM的吴茱萸苷均能促进离体线粒体MPTP的开放(图6)。
2.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞内ATP含量的作用。
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h,按照ATP检测试剂盒说明书检测各组细胞内ATP的含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM均能使HFLS-RA细胞内ATP含量降低(图7)。
3.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞内ATP合酶活性的作用。
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h,按照ATP检测试剂盒说明书检测各组细胞内ATP的含量。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM均能使HFLS-RA细胞内ATP酶活性降低(图7)。
4.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞实时ATP生成速率的作用
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于Seahorse XF24细胞培养板中贴壁过夜,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h后,将细胞培养板放置于Seahorse专用培养箱中孵育1h,按Seahorse XF实时ATP速率测定试剂盒说明书进行操作。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM既降低HFLS-RA细胞的实时线粒体ATP速率,也使糖酵解ATP生成速率降低(图8)。
5.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞的氧消耗速率(OCR)的影响
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于Seahorse XF24细胞培养板中贴壁过夜,别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h后,将细胞培养板放置于Seahorse专用培养箱中孵育1h,按Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒说明书进行操作。使用Seahorse专用数据分析软件对所得结果分析。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM使HFLS-RA细胞的基础呼吸,最大呼吸,ATP产生相关的呼吸和非线粒体消耗的呼吸速率均降低,同时,使其质子漏增加,这表明吴茱萸苷使HFLS-RA细胞氧消耗速率降低,促使线粒体功能紊乱(图9)。
6.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞外酸化率(ECAR)的影响
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于Seahorse XF24细胞培养板中贴壁过夜,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h后,将细胞培养板放置于Seahorse专用培养箱中孵育1h,按Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒说明书进行操作。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM显著降低HFLS-RA细胞外的酸化率,即使细胞的糖酵解速率降低(图10)。
7.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞膜电位(MMP)的影响。
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔玻底板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h,按照线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)说明书处理细胞后,立即使用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM均能使HFLS-RA细胞线粒体膜电位降低(图11)。
8.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞内活性氧(ROS)含量的影响。
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔玻底板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h,按照活性氧检测试剂盒说明书处理细胞后,立即使用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM均能使HFLS-RA细胞内ROS含量增加(图11)。
9.吴茱萸苷对LPS诱导的HFLS-RA细胞内Ca2+浓度的影响。
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔玻底板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h,按照钙离子荧光探针(Fluo3AM)检测试剂盒说明书处理细胞后,立即使用激光共聚焦显微镜进行拍摄。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM均能使HFLS-RA细胞内Ca2+浓度增加(图11)。
10.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞线粒体膜通透性转换孔(MPTP)的影响。
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔玻底板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h,按照线粒体通透性转换孔(MPTP)检测试剂盒说明书处理细胞后,立即使用激光共聚焦检测线粒体MPTP的开放情况。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷10,20,40μM均能使HFLS-RA细胞的MPTP开放(图11)。
上述实验结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷能有效抑制线粒体ATP酶的活性,减慢有氧呼吸和无氧呼吸的速率,使HFLS-RA细胞中ATP产生速率大大减小。同时,破坏线粒体正常膜电位,使线粒体膜电位降低;使胞内ROS和Ca2+浓度增加,使MPTP活性增大,进而促进HFLS-RA细胞线粒体功能紊乱。
实施例4吴茱萸苷对HFLS-RA细胞凋亡的影响
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔玻底板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h。按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst 33324检测试剂盒说明书及DAPI说明书对细胞进行TUNEL、Hoechst 33324及DAPI荧光染色,避光,立即于激光共聚焦显微镜下进行荧光拍摄。
(2)实验结果
凋亡荧光的统计结果均表明,10,20,40μM的吴茱萸苷明显促进HFLS-RA细胞凋亡,这与吴茱萸苷能显著促进线粒体功能紊乱有关(图12)。
实施例5吴茱萸苷对HFLS-RA细胞迁移的影响
(1)实验方法
2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔板中贴壁过夜后,分别加入无血清培养基配制的40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入无血清培养基配制的LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h。用无菌细胞刮在6孔板孔内间隔50mm划3条平行且笔直的划痕后,立即于倒置荧光显微镜下观察并拍照,37℃培养箱中孵育24h及48h后再于同一位置进行拍照。
(2)实验结果
结果表明,与LPS诱导组相比,吴茱萸苷40μM能显著抑制HFLS-RA细胞的迁移(图13)。
实施例6吴茱萸苷对HFLS-RA细胞中AMPK/p-AMPK,Sirt1,NF-κB p65/p-NF-κB等蛋白的影响。
1.抑制NF-κB p65的磷酸化
(1)实验方法
按对照组,LPS诱导组,吴茱萸苷(40μM)组,AMPK激动剂组(AICAR),吴茱萸苷(40μM)组+AICAR组,AMPK抑制剂组(Compound C,C.C),吴茱萸苷(40μM)组+Compound C组进行2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h。适量RIPA裂解液裂解细胞后,离心,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。各孔按30μg进行上样进行SDS-聚丙烯凝胶电泳,转膜,封闭,孵一抗及二抗,显影等步骤。
(2)实验结果
对蛋白条带进行灰度值统计,结果表明,吴茱萸苷能显著促进p-AMPK及Sirt1的表达,抑制IκB的降解,由此抑制NF-κB p65的磷酸化(图14)。
2.抑制NF-κB的质核转移
(1)实验方法
7×105个的HFLS-RA细胞于10×10cm培养皿中贴壁培养过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h。按分组收集细胞,按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分别提取核蛋白与胞浆蛋白。BCA法测定蛋白浓度后按上述方法进行Western Blot。
(2)实验结果
结果表明吴茱萸苷显著抑制NF-KB的质核转移,即抑制其的激活(图15)。
3.吴茱萸苷对HFLS-RA细胞中凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2的影响
(1)实验方法
按对照组,LPS诱导组,吴茱萸苷(40μM)组,AMPK激动剂组(AICAR),吴茱萸苷(40μM)组+AICAR组,AMPK抑制剂组(Compound C),吴茱萸苷(40μM)组+Compound C组进行分组。2×105个/孔的HFLS-RA细胞于6孔板中贴壁过夜后,分别加入10,20,40μM的吴茱萸苷溶液,药物作用4h后,加入LPS溶液,使其终浓度为1μg/ml,继续作用24h。适量RIPA裂解液裂解细胞后,离心,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度。各孔按30μg进行上样进行SDS-聚丙烯凝胶电泳,转膜,封闭,孵一抗及二抗,显影等步骤。
(2)实验结果
对蛋白条带进行灰度值统计,结果表明,吴茱萸苷明显促进促凋亡蛋白Bax表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,而促进HFLS-RA细胞的凋亡(图16)。
上述实验结果表明,吴茱萸苷能显著促进p-AMPK及Sirt1的表达,抑制IκB的降解,抑制NF-κB p65的磷酸化,抑制NF-KB的质核转移,促进促凋亡蛋白Bax表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,而促进HFLS-RA细胞的凋亡。
实施例7吴茱萸苷的安全性测试
(1)实验方法
2×104个/孔的HFLS-RA细胞于96孔板中贴壁过夜后,加入1,10,20,40,100,500μM的吴茱萸苷,作用24/48h后用CCK-8检测试剂盒检测各孔的OD值。
(2)实验结果
结果表明1,10,20,40,100,500μM的吴茱萸苷均对HFLS-RA细胞活力无抑制作用,即对该细胞无毒性作用(图17)。
综上,本发明提供了吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途。本发明首次发现,吴茱萸苷能显著抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的炎症反应,促进细胞线粒体功能紊乱,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移。吴茱萸苷来源于天然植物翼首草,其细胞毒性小,安全性高。吴茱萸苷在制备免疫抑制剂类药物,以及预防和/或治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的抗炎药物中具有广阔的临床应用前景。
Claims (10)
1.吴茱萸苷在制备抗炎药物和/或免疫抑制剂类药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述药物为预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于:所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、皮肤真菌病、膜肾球肾炎、炎性肠病或自身免疫性溶血贫血。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途,其特征在于:所述药物能够抑制巨噬细胞的炎症反应。
5.根据权利要求1-3任一项所述的用途,其特征在于:所述药物能够抑制成纤维样滑膜细胞的炎症反应。
6.根据权利要求1-3任一项所述的用途,其特征在于:所述药物能够促进成纤维样滑膜细胞线粒体功能紊乱。
7.根据权利要求1-3任一项所述的用途,其特征在于:所述药物能够促进成纤维样滑膜细胞凋亡和/或抑制成纤维样滑膜细迁移。
8.根据权利要求1-3任一项所述的用途,其特征在于:所述药物能够促进成纤维样滑膜细胞的促凋亡蛋白表达。
9.根据权利要求1-3任一项所述的用途,其特征在于:所述药物能够抑制成纤维样滑膜细胞的抗凋亡蛋白表达。
10.根据权利要求1-9任一项所述的用途,其特征在于:所述药物是以吴茱萸苷为活性成分,加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
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