CN114341614A - 无冲洗的快速病理学/细胞学 - Google Patents

无冲洗的快速病理学/细胞学 Download PDF

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斯蒂芬·Y·周
丁惟
孙瑜
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Abstract

除其他事项外，本发明的公开内容涉及使病理学和细胞学更快、更好和成本更低。本发明还涉及快速细胞内测定。

Description

无冲洗的快速病理学/细胞学
相关申请案的交叉引用
本申请要求于2019年4月28日提交的美国临时申请62/839,767和于2019年5月7日提交的美国临时申请62/844,701的权益，出于所有目的将这两个申请的全部内容并入本文。
技术领域
本发明的公开内容涉及改善病理学和细胞学。
背景技术
在生物和化学测定(例如诊断测试)中，通常需要快速且简单地染色和显现生物样品中的分析物。本发明提供用于实现这些目标的装置和方法。需要减少病理学和细胞学中的步骤、时间和成本。其中，本发明的公开内容涉及使病理学和细胞学更快、更好和成本更低。本发明还涉及快速细胞内测定。
发明内容
本发明的一个方面是进行快速病理学和细胞学而无需冲洗。特别地，本发明涉及在一个步骤中对样品中分析物进行分析(即检测和/或染色)而无需冲洗，孵育时间短(少于几分钟或60秒)和立即准备读取信号的装置和方法。
本发明的另一方面是通过放置具有均匀高度的间隔件的适形板来改善样品染色和成像。适形板可快速制备和染色组织，并允许对组织成像而无需冲洗。
本发明的另一个方面是通过将组织按压到远小于初始厚度的厚度，使用具有均匀高度的间隔件的适形板对组织进行染色和成像。
本发明的另一方面是使用均匀微间隔件的适形柔性板(即膜)来改善组织成像。
本发明的另一方面是进行检测细胞内分析物的快速均质细胞内测定，该测定比检测样品中细胞外相同分析物的测定灵敏得多。
在一些实施例中，本发明提供了染色组织的方法，包括在底板上放置待染色的组织切片，提供在其表面上具有100μm或更小的均匀高度的间隔件的柔性顶板，在组织表面上或在柔性顶板上沉积染色溶液，并将样品和染色溶液夹在柔性顶板和底板之间并将它们压在一起，其中顶部柔性板的柔性和间隔件之间的间隔被选择成使得顶部柔性板适形组织的表面。
在一些实施例中，本发明提供在不冲洗样品的情况下快速分析样品的病理学或细胞学的方法，其包括提供第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域，提供染色靶组织或细胞的染色溶液，将样品和染色溶液夹在第一和第二板之间以形成厚度为200μm或更小的薄层，以及将样品和染色溶液夹在第一和第二板之间以形成厚度为200μm或更小的薄层之后，以及在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下，使薄层成像以观察染色的靶组织或细胞，其中选择薄层的厚度和染色溶液在薄层中的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
在一些实施例中，本发明提供了用于分析不冲洗的样品的病理学的试剂盒，其包括第一板和第二板，每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域，和染色靶组织或细胞的染色溶液，其中第一和第二板将样品和染色溶液夹在厚度由两个样品接触区域之间的距离调节的薄层中，其中薄层在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下由成像器成像，并且其中选择两个样品接触区域之间的距离和薄层中染色溶液的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
在一些实施例中，本发明提供了用于分析不冲洗样品的样品的病理学的设备，其包括第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域，染色靶组织或细胞的染色溶液，和成像器，其中第一和第二板将样品和染色溶液夹在厚度由两个样品接触区域之间的距离调节的薄层中，其中成像器在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下使薄层成像，并且其中选择两个样品接触区域之间的距离和薄层中染色溶液的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
在一些实施例中，本发明提供了用于样品中细胞膜内分析物的快速均质检测的方法，其包括以下步骤：(a)提供第一板和第二板，每个在其表面上具有用于接触包含或疑似包含细胞内的分析物的细胞的样品的样品接触区域，(b)提供检测探针，检测探针(i)特异性结合分析物并且(ii)能够发射一定波长的光，(c)提供使细胞的膜对检测探针可渗透的透化试剂，其中在没有透化试剂的情况下，检测探针不能渗透到细胞中，(d)将样品、检测探针和透化试剂夹在第一板和第二板之间以形成厚度为200微米(μm)或更小的薄层，以及(e)在步骤(d)之后且不冲洗样品以去除未结合的检测探针的情况下，使薄层成像以检测具有结合至检测探针的分析物的细胞，其中薄层的厚度和薄层中检测探针的浓度经选择以使得，在薄层中，在步骤(e)的成像过程中，具有与细胞内分析物结合的检测探针的位置的信号可与不具有细胞的位置的信号区分开。在一些实施例中，步骤(e)的成像在步骤(d)的夹入之后300秒或更少进行。在一个实施例中，方法还包括定量(i)细胞内含有分析物的细胞和(ii)细胞内含有分析物的细胞的步骤。在另一个实施例中，方法还包括定量(i)细胞内含有分析物的细胞和(ii)细胞内含有分析物的细胞的步骤，和定量细胞内含有分析物的细胞相对于细胞总数的百分比的步骤。在又一个实施例中，由检测探针发射的光是荧光，并且该方法还包括(i)测量具有与检测探针结合的分析物的细胞的荧光强度，(ii)测量具有与检测探针结合的分析物的细胞的数目，以及(iii)通过将单位面积中具有结合至检测探针的分析物的细胞的总数与具有结合至检测探针的分析物的细胞的荧光强度的平均值相乘来计算总荧光强度。
在一些实施例中，本发明提供了快速制备和染色具有比最终厚度更厚的初始厚度的组织的方法，包括提供可相对于彼此移动的第一板和第二板，其中第二板在其表面上具有均匀高度的间隔件，将具有比间隔件高度更厚的厚度的组织样品放置在第一板上，将染色溶液沉积在第一板上或组织上，其中染色溶液将组织样品染色，并且将第一板放置在组织样品的顶部上并且将两个板压在一起以使组织样品形成薄层，其中组织样品层的最终厚度小于组织样品的初始厚度并且由间隔件和两个板调节。
在一些实施例中，本发明提供了一种改善组织表面的成像的方法，包括提供柔性板，提供具有均匀高度的间隔件，将间隔件和柔性板放置在待成像的组织的顶部上，其中间隔件的高度调节板和组织之间的距离，并且其中间隔件的高度为50μm(微米)或更小。在一个实施例中，均匀高度在2μm到20μm之间选择。在另一个实施例中，均匀高度为10μm。
在一些实施例中，第一和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，包括开放构造和闭合构造，其中一个或多个板在其表面上具有均匀高度的间隔件，其中在开放构造中，两个板完全或部分地分隔开，板之间的间隔不由间隔件调节，并且其中在闭合构造中，薄层的厚度由板和间隔件调节，并且样品表面与第二板表面之间的平均距离等于或小于200μm。
在一些实施例中，装置、试剂盒和方法还包括调节第一板和第二板之间的距离的间隔件。
在一些实施例中，选择薄层的厚度以使薄层中的一些细胞与其它细胞没有重叠或显著重叠。
在一些实施例中，将透化试剂涂覆在一个或多个板的表面上。
在一些实施例中，在将样品和透化试剂夹在两个板之间之前将透化试剂引入样品。
在一些实施例中，板还具有涂覆在其表面上的干染色剂，并且其中染色溶液是将干染色剂转移到样品中的转移液体。
在一些实施例中，在将样品和透化试剂夹在两个板之间之前将染色溶液引入样品。
在一个方面，本公开提供了一种方法，其包括获得板，板包括固定到其表面上的样品接触区域的一个或多个间隔件。在某些实施例中，方法包括将液体沉积到(i)样品接触区域和(ii)待成像表面中的至少一者上。在某些实施例中，方法包括使待成像的表面与一个或多个间隔件接触，从而将至少一部分液体压缩成由板和待成像的表面限定的基本上均匀厚度的层，其中层的均匀厚度由一个或多个间隔件的高度调节，并且其中一个或多个间隔件的高度小于约250微米(μm)。在某些实施例中，该方法包括对待成像的表面进行成像。
在另一方面，本公开提供了一种方法，其包括获得第一板和第二板，每个板包括固定到其表面上的样品接触区域的一个或多个间隔件。在某些实施例中，该方法包括将染色液沉积到(i)第一板的样品接触区域和(ii)待成像表面中的至少一个上。在某些实施例中，方法包括使第一板的一个或一个以上间隔件与待成像表面接触。在某些实施例中，方法包括在预定时间段之后将第一板与待成像表面分离。在某些实施例中，方法包括将成像液体沉积到(i)第二板的样品接触区域和(ii)待成像表面中的至少一者上。在某些实施例中，方法包括使第二板的一个或多个间隔件与待成像的表面接触，从而将至少一部分成像液体压缩成由第一板和待成像的表面限定的基本上均匀厚度的层，其中层的均匀厚度由一个或多个间隔件的高度调节，并且其中一个或多个间隔件的高度小于约250μm。在某些实施例中，该方法包括对待成像的表面进行成像。
在一个方面，本公开提供了一种用于分析组织样品的装置，该装置包括第一板；第二板；多个间隔件；和染色液，其中板可相对于彼此移动成不同的构造；一个或两个板是柔性的；每个板在其各自的内表面上具有用于接触染色液和/或含有或疑似含有靶分析物的组织样品的样品接触区域；一个或两个板包括与相应的板固定的间隔件；间隔件具有预定的基本上均匀的高度和预定的间隔件间距；并且间隔件中的至少一个在样品接触区域内部；其中这些构造之一是开放构造，其中：两块板部分或全部分离，板间的间距不受间隔件的调节，染色液和样品沉积在一块或两块板上；并且其中这些构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在染色液和样品的沉积之后在开放构造中配置的，并且在该闭合构造中：至少部分样品在两个板之间，至少部分染色液层在至少部分样品和第二板之间，其中至少部分染色液层的厚度由板、样品和间隔件调节，样品表面和第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小。
在一个方面，本公开提供了一种用于分析组织样品的装置，该装置包括第一板；第二板；多个间隔件；转移溶液；和染色液，其中板可相对于彼此移动成不同的构造；一个或两个板是柔性的；每个板在其各自的内表面上具有用于接触转移溶液和/或含有或疑似含有靶分析物的组织样品的样品接触区域；这些板中的一个或两个包括染色剂，该染色剂涂覆在对应的样品接触区域上并且被配置为用于在接触转移溶液时溶解在转移溶液中并且染色组织样品；一个或两个板包括与相应的板固定的间隔件；间隔件具有预定的基本上均匀的高度和预定的间隔件间距；并且间隔件中的至少一个在样品接触区域内部；其中这些构造之一是开放构造，其中：两块板部分或全部分离，板间的间距不受间隔件的调节，染色液和样品沉积在一块或两块板上；并且其中这些构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在染色液和样品的沉积之后在开放构造中配置的，并且在该闭合构造中：至少部分样品在两个板之间，至少部分转移溶液层在至少部分样品和第二板之间，其中至少部分转移溶液层的厚度由板、样品和间隔件调节，样品表面和第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小。
在一个方面，本公开提供了用于分析组织样品的方法，包括以下步骤：提供含有或疑似含有靶分析物的组织样品；提供染色液；提供第一板、第二板和间隔件，其中这些板相对于彼此可移动成不同的构造，一个或两个板是柔性的；每个板在其各自的内表面上具有用于接触染色液和/或组织样品的样品接触区域；一个或两个板包括与相应的板固定的间隔件；间隔件具有预定的基本上均匀的高度和预定的间隔件间距；并且间隔件中的至少一个在样品接触区域内部；当这些板处于开放构造时，将染色液和组织样品沉积在这些板中的一个或两个上，其中开放构造是这样的构造，其中这两个板是部分地或完全地分开的，这两个板之间的间距不受这些间隔件的调节，并且将样品和染色液沉积在这些板中的一个或两个上；将这两个板放在一起并且将这些板按压成闭合构造，其中按压包括并行地或顺序地对这些板中的至少一个板的一个区域进行适形按压以便将这些板按压在一起成闭合构造，其中适形按压在这些板上在样品的至少一部分上产生基本上均匀的压力，并且按压使样品的至少一部分在这些板的内表面之间横向地展开；并且其中这些构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在染色液和样品沉积在开放构造中之后配置的，并且在该闭合构造中：至少部分样品在两个板之间，至少部分染色液层在至少部分样品和第二板之间，其中至少部分染色液层的厚度由板、样品和间隔件调节，样品表面和第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小；以及当板处于闭合构造时分析靶分析物。
在一个方面，本公开提供了用于分析组织样品的方法，包括以下步骤：获得含有或疑似含有靶分析物和转移溶液的组织样品；获得第一板、第二板和间隔件，其中这些板相对于彼此可移动成不同的构造，一个或两个板是柔性的；每个板在其各自的内表面上具有用于接触染色液和/或疑似含有靶分析物的组织样品的样品接触区域；这些板中的一个或两个包括染色剂，该染色剂涂覆在对应的样品接触区域上并且被配置为用于在接触转移溶液时溶解在转移溶液中并且染色组织样品；一个或两个板包括与相应的板固定的间隔件；间隔件具有预定的基本上均匀的高度和预定的间隔件间距；并且间隔件中的至少一个在样品接触区域内部；当这些板处于开放构造时，将染色液和组织样品沉积在这些板中的一个或两个上，其中开放构造是这样的构造，其中这两个板是部分地或完全地分开的，这两个板之间的间距不受这些间隔件的调节，并且将样品和染色液沉积在这些板中的一个或两个上；将这两个板放在一起并且将这些板按压成闭合构造，其中按压包括并行地或顺序地对这些板中的至少一个板的一个区域进行适形按压以便将这些板按压在一起成闭合构造，其中适形按压在这些板上在样品的至少一部分上产生基本上均匀的压力，并且按压使样品的至少一部分在这些板的内表面之间横向地展开；并且其中这些构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在染色液和样品的沉积之后在开放构造中配置的，并且在闭合构造中：至少部分样品在两个板之间，至少部分染色液的层在至少部分样品和第二板之间，其中至少部分染色液层的厚度由板、样品和间隔件调节，并且样品表面和第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小；以及当板处于闭合构造时分析靶分析物。
在一个方面，本公开提供了用于分析组织样品的方法，包括以下步骤：提供含有或疑似含有靶分析物的组织样品；提供转移溶液和染色剂；提供第一板、第二板和间隔件，其中这些板相对于彼此可移动成不同的构造；一个或两个板是柔性的；每个板在其各自的内表面上具有用于接触组织样品的样品接触区域；这些板中的一个或两个包括染色剂，该染色剂涂覆在对应的样品接触区域上并且被配置为用于在接触转移溶液时溶解在转移溶液中以形成染色液并且染色组织样品；一个或两个板包括与相应的板固定的间隔件；间隔件具有预定的基本上均匀的高度和预定的间隔件间距；并且间隔件中的至少一个在样品接触区域内部；当这些板处于开放构造时，将组织样本沉积在这些板中的一个或两个上，其中开放构造是这样的构造，其中两个板是部分地或完全地分开的，两个板之间的间距不受这些间隔件的调节，并且将样品和染色液沉积在这些板中的一个或两个上；将这两个板放在一起并且将这些板按压成闭合构造，其中按压包括并行地或顺序地对这些板中的至少一个板的一个区域进行适形按压以便将这些板按压在一起成闭合构造，其中适形按压在这些板上在样本的至少一部分上产生基本上均匀的压力，并且按压使样本的至少一部分在这些板的内表面之间横向地展开；并且其中这些构造中的另一个是闭合构造，该闭合构造是在染色液和样品沉积在开放构造中之后配置的，并且在闭合构造中至少部分样品在两个板之间，至少部分染色液层在至少部分样品和第二板之间，其中至少部分染色液的厚度由板、样品和间隔件调节，样品表面和第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小；以及在没有冲洗的情况下，当板处于闭合构造时分析靶分析物。
在一个方面，本公开提供了一种用于分析组织样品的系统，包括本公开的任何实施例的装置；以及检测器，检测器被配置为检测均匀厚度的层中的靶分析物的信号。
在一个方面，本公开提供了用于组织分析测定的智能手机系统，其包括本公开的任何实施例的装置；以及移动通信装置，其包括用于检测和/或成像样品的一个或多个相机，用于接收和/或处理所检测的信号和/或样品的图像并且用于远程通信的电子器件、信号处理器、硬件和软件；以及适配器，该适配器被配置为容纳处于闭合构造的装置并且可接合到移动通信装置，其中当与移动通信装置接合时，适配器被配置为便于在闭合构造下检测和/或成像样品中的靶分析物。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中板中的一者或两者被配置为使得样品可在其上在开放构造下干燥，且其中样品包括选自由以下组成的组的体液：羊水、房水、玻璃体液、血液、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、气息、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出气冷凝物、皮脂、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿液及其任何组合。
根据本公开的实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中血液是全血、分级血液、血浆或血清。
根据本公开的实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中粘液是鼻引流或痰。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液具有在0.1至3.5mPa S范围内的粘度。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中板中的一者或两者的样品接触区域被配置为使得样品在开放构造下在板中的一者或两者上干燥，且其中样品包括血液涂片。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中板中的一者或两者的样品接触区域粘附到样品，并且其中样品是厚度在1-200μm范围内的组织切片。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中样品是石蜡包埋的。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中样品是固定的。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液包括能够固定样品的固定剂。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液包括阻断剂，其中阻断剂被配置为使样品中的非特异性内源物质不能与用于特异性标记靶分析物的检测试剂反应。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液包括能够去除样品中的石蜡的脱蜡剂。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液包括能够使组织样品中含有靶分析物的细胞透化的透化试剂。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液包括能够促进抗原修复的抗原修复剂。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中染色液包括特异性标记样品中的靶分析物的检测试剂。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中一个或两个板的样品接触区域包括含有阻断剂的存储位点，其中阻断剂被配置为使样品中的非特异性内源物质不能与用于特异性标记靶分析物的检测试剂反应。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中一个或两个板的样品接触区域包括存储位点，存储位点包含能够去除样品中的石蜡的脱蜡剂。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中一个或两个板的样品接触区域包括含有透化试剂的储存位置，透化试剂能够使含有靶分析物的组织样品中的细胞透化。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中一个或两个板的样品接触区域包括含有能够促进抗原修复的抗原修复剂的储存位置。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中一个或两个板的样品接触区域包括含有检测试剂的存储位点，检测试剂特异性地标记样品中的靶分析物。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中检测试剂包括选自以下组成的组的化合物：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、苯胺蓝WS、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、蔚蓝A、蔚蓝B、蔚蓝C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、C.I.甲酚紫、结晶紫、达罗红、曙红B、曙红Y、赤藓红、乙基曙红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、吉姆萨染色剂、苏木精、苏木精和曙红、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫、(亚甲基青莲)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红、橙G、橙II、地衣红、碱性副品红、四溴二氯荧光黄B、蛋白银S、派若宁B、派若宁、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert、瑞氏染色剂，以及它们的任意组合。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中这些板中的一者或两者在对应的样品接触区域上进一步包括选自下组成的组的细胞活力染料：碘化丙啶、7-AAD、台盼蓝、钙黄绿素紫AM、钙黄绿素AM、可固定的存活染料、SYTO9和其他核酸染料、刃天青和甲臜(MTT/XTT)和其他线粒体染料，以及它们的任何组合。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中检测试剂包括被配置为特异性结合样品中的靶分析物的抗体。
根据前述权利要求中任一项的装置、系统、智能手机系统或方法，其中检测试剂包括被配置为特异性结合样品中的DNA和/或RNA的寡核苷酸探针。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中检测试剂用报告分子标记，其中报告分子被配置为提供待读取和分析的可检测信号。
根据本公开的实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中信号选自由以下各项组成的组：选自光致发光、电致发光和电化学发光、光吸收、反射、透射、衍射、散射或扩散、表面拉曼散射的发光，选自电阻、电容和电感、磁弛豫的电阻抗以及它们的组合。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中板中的一者或两者的样品接触区域包括含有捕获剂的结合位点，其中捕获剂被配置为结合到样品中的细胞表面上的靶分析物并固定细胞。
根据本公开的任何实施例的方法，其中沉积步骤进一步包括以下步骤：在将染色液的剩余部分沉积在干燥样品的顶部上之前，在板中的一者或两者上沉积和干燥样品，并且其中样品包括在板中的一者或两者上干燥的血液涂片。
根据本公开的任何实施例的方法，其中沉积步骤进一步包括以下步骤：在将染色液沉积到板中的一者或两者上之前，将样品沉积并附着到板中的一者或两者上，其中板中的一者或两者的样品接触区域粘附到样品，并且其中样品是厚度在1-200μm范围内的组织切片。
本公开的任何实施例的方法，在分析步骤(e)之前，进一步包括：在闭合构造孵育样品一段时间，该时间长于检测试剂扩散穿过均匀厚度的层和样品所花费的时间。
本公开的任何实施例的方法，在分析步骤(e)之前，还包括在30-75℃范围内的预定温度下在闭合构造下孵育样品的步骤。
根据本公开的任何实施例的方法，其中染色液包括转移溶液。
根据本公开的任何实施例的智能手机系统，其中移动通信装置被配置为将测试结果传送到医疗专业人员，医疗设施或保险公司。
根据本公开的任何实施例的智能手机系统，其中移动通信装置还被配置为与医疗专业人员、医疗设施或保险公司通信关于受试对象的信息。
根据本公开的任何实施例的智能手机系统，其中移动通信装置被配置为从医疗专业人员接收处方，诊断或推荐。
根据本公开的任何实施例的智能手机系统，其中移动通信装置经由WIFI或蜂窝网络与远程位置通信。
根据本公开的任何实施例的智能手机系统，其中移动通信装置是移动电话。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中按压由人的手执行。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中一个板或两个板的内表面的至少一部分是亲水性的。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件间距是周期性的。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中样品是直接从受试对象到板的沉积，而不使用任何转移装置。
根据本发明的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中在样品在闭合构造下变形之后，当移除压缩力中的一些或全部时，样品维持相同的最终样品厚度。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件具有柱形形状和几乎均匀的横截面。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件间距(SD)等于或小于约120μm(微米)。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件间距(SD)等于或小于约100μm(微米)。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件距离(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×106μm3/GPa或更小。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件距离(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×105μm3/GPa或更小。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件具有柱形状、基本上平坦的顶表面、预定的基本上均匀的高度和预定的恒定间隔件间距，间隔件间距比分析物的尺寸大至少约2倍，其中间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于2MPa，其中填充因子是间隔件接触面积与总板面积的比率,并且其中，对于每个间隔件，该间隔件的横向尺寸与其高度的比率是至少1(一)。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件具有柱形状、基本上平坦的顶表面、预定的基本上均匀的高度和预定的恒定间隔件间距，间隔件间距比分析物的尺寸大至少约2倍，其中间隔件的杨氏模量乘以间隔件的填充因子等于或大于2MPa，其中填充因子是间隔件接触面积与总板面积的比率,并且其中，对于每个间隔件，该间隔件的横向尺寸与其高度的比率是至少1(一)。其中间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))是5×106μm3/GPa或更小。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中间隔件的间隔件间距与间隔件的平均宽度的比率为2或更大，并且间隔件的填充因子乘以间隔件的杨氏模量为2MPa或更大。
根据本公开的任何实施例的装置、试剂盒、系统、智能手机系统和方法，其中靶分析物是蛋白、肽、核酸、合成化合物或无机化合物。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品是选自以下的生物样品羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、分级血液、血浆或血清)、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、气息、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流液和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出气冷凝物、皮脂、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物以及尿液。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中件具有柱的形状，且柱的宽度与高度的比率等于或大于一。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中沉积在一个或两个板上的样品具有未知的体积。
根据本发明的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中间隔件具有柱的形状，且柱具有基本上均匀的横截面。
本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品用于检测，纯化和定量与某些疾病的阶段相关的化学化合物或生物分子。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品与传染病和寄生虫病、损伤、心血管疾病、癌症、精神障碍、神经精神障碍、肺部疾病、肾脏疾病和器质性疾病相关。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品涉及微生物的检测、纯化和定量。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品与来自环境(例如，水、土壤或生物样品)的病毒，真菌和细菌有关。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品与对食品安全或国家安全造成危害的化学化合物或生物样品(例如有毒废物、炭疽)的检测、量化有关。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品与医疗或生理监测中的生命参数的量化相关。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品与葡萄糖、血液、氧含量、总血细胞计数有关。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品与来自生物样品的特定DNA或RNA的检测和定量相关。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品涉及用于基因组分析的染色体和线粒体中的DNA中的遗传序列的测序和比较。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品涉及例如在药物的合成或纯化期间检测反应产物。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品是细胞、组织、体液和粪便。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品是蛋白、肽、核酸、合成化合物、无机化合物的检测中的样品。
根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统和方法，其中样品是人、兽医、农业、食品、环境和药物测试领域中的样品。
根据根据本公开的任何实施例的装置、系统、智能手机系统或方法，其中样品是生物样品，其选自血液、血清、血浆、鼻拭子、鼻咽洗液、唾液、尿液、胃液、脊髓液、泪液、粪便、粘液、汗液、耳垢、油、腺分泌物、脑脊液、组织、精液、阴道液、源自肿瘤组织的间质液、眼液、脊髓液、咽拭子、呼吸、毛发、手指甲、皮肤、活组织切片、胎盘液、羊水、脐带血、淋巴液、腔液、痰液、脓液、微生物群、胎粪、母乳、呼出冷凝物鼻咽洗液、鼻拭子、咽拭子、粪便样品、毛发、手指甲、耳垢、呼吸、结缔组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织、软骨、癌样品和骨。
附图说明
本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本发明的范围。附图没有完全按比例绘制。在给出实验数据点的图中，连接数据点的线仅用于指导数据的观察，而没有其他意义。
图1示出了本公开的实施例，其中包括间隔件的适形板适形于样品表面的形状。
图2.使用iMOST Q-CARD微体积实施例的实验步骤的示意性图。1.将口腔Q-tip刷拭活检或鸡胃活检组织(5mm×1mm)置于子卡或载玻片上；2.在X-板的柱子侧上滴加10ul(体积可基于组织的大小和柱子高度而变化)染色溶液；3.将X-板放在载玻片上，染色液朝下朝向组织；4.将X-板压在组织上，使染色溶液固定整片组织，并将组织铺展成微米级薄层(其厚度由柱高决定)；5.将iMOST Q-卡实施例在室温下放置1分钟并在显微镜下观察。(注：术语“Q-卡”和“QMAX卡”是可互换的。)
图3用Q-卡对口腔粘膜细胞(OMC)进行1步PAP染色的明视场显微镜图像。在实验中，Q-卡具有10μm的间隔件高度，具有30μm×40μm大小的柱尺寸和110μm×120μm周期的柱阵列。OMC细胞在图像中被染成红色。
图4.使用苏木精适形压薄鸡胃黏膜细胞学染色。最初，薄层单个鸡胃(上皮细胞)组织为约1mm厚。通过压薄，组织显著变薄并且一些位置具有与柱高度(10μm)几乎相同的高度。然而，被按压的细胞没有损坏。用蓝/紫色(左图)对鸡胃上皮细胞进行苏木精阳性染色(100×，左图)。在更高的放大倍率下，功能单元粘膜隐窝能够在绿色圆圈中可视化(右图)。
图5示出了(i)使用具有接触组织的间隔件的X-板的一步染色获得的荧光图像，和(ii)使用平板获得的荧光图像之间的比较。使用X-板的图像具有比平板更好的图像对比度和更清晰的图像。
图6.细胞内测定的说明。具有夹在两个板之间的细胞的样品，其中细胞在细胞内部含有分析物(即生物标记)，并且一些分析物在细胞外部。在一些实施例中，细胞内的分析物浓度与细胞外的分析物浓度具有相关性。
具体实施方式
以下详细描述通过示例而非限制的方式说明了本发明的一些实施例。本文使用的章节标题和任何副标题仅用于组织目的，而不应被解读为以任何方式限制所描述的主题。章节标题和/或副标题下的内容不限于章节标题和/或副标题，而是应用于本公开的整个描述。
任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解读为承认本权利要求书由于在先发明而无权先于这种出版物。此外，所提供的出版日期可不同于实际出版日期，其可能需要单独确认。
定义
术语“本公开”和“本发明”是可互换的。
术语“FAST”(全部以大写字母表示)是指本发明的“快速染色”，其包括但不限于本发明的所有快速染色装置和/或方法。术语“X-路径”和“FAST”是可互换的。
术语“使用Q-卡进行不使用任何冲洗的测定(包括病理学中的染色)”和“使用Q-卡进行不冲洗的测定(包括病理学中的染色)”是可互换的。
Q-卡的板的术语“在闭合构造中”和“处于闭合构造中”是可互换的。
术语“分析物”和“生物标记”是可互换的。
术语“透化”细胞是指使细胞允许大分子如抗体和/或核酸进入细胞内。
术语“多路复用”是使用多个探针。
术语“染色溶液”和“染色液”是可互换的。
术语第一和第二板的“内表面”是在闭合构造中彼此面对的表面。
术语“特异性结合”和“选择性结合”是指捕获剂/检测试剂优先结合存在于不同靶分子的异质混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用将区分样品中期望的(例如，活性的)和不期望的(例如，无活性的)靶分子，通常超过约10至100倍或更多(例如，超过约1000或10,000倍)。
必须指出，除非上下文明确地另外规定，例如，当用“单”这个词的时候，否则如本文和所附权利要求所使用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述”包括其复数指示物。例如，提及“一种分析物”包括单一分析物和多种分析物，提及“一种捕获剂”包括单一捕获剂和多种捕获剂，提及“一种检测试剂”包括单一检测试剂和多种检测试剂，提及“一种细胞”包括单一细胞和多种细胞。
1.不冲洗的快速病理学和细胞学
根据本发明的一个实施例，一种染色组织的方法，包括：
(a)在底板上放置待染色的组织切片；
(b)提供在其表面上具有100μm或更小的均匀高度的间隔件的柔性顶板；
(c)在组织表面上或在柔性顶板上沉积染色溶液；以及
(d)将样品和染色溶液夹在柔性顶板和底板之间并将它们压在一起；
其中顶部柔性板的柔性和间隔件之间的间隔被选择成使得顶部柔性板适形组织的表面。
在另一个实施例中，一种在不冲洗的情况下快速分析样品的病理学或细胞学的方法，包括：
(e)提供第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域；
(f)提供染色靶组织或细胞的染色溶液；
(g)将样品和染色溶液夹在第一和第二板之间以形成厚度为200μm或更小的薄层；以及
(h)在步骤(c)之后且在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下，对薄层成像以观察染色的靶组织或细胞；
其中选择薄层的厚度和染色溶液在薄层中的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
在一些实施例中，用于分析不冲洗的样品的病理学的试剂盒包括：
(a)第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域；以及
(b)染色靶组织或细胞的染色溶液；
其中第一和第二板将样品和染色溶液夹在厚度由两个样品接触区域之间的距离调节的薄层中；
其中薄层在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下由成像器成像；以及
其中选择两个样品接触区域之间的距离和薄层中染色溶液的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
在一些实施例中，用于分析不冲洗的样品的病理学的设备包括：
(a)第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域；
(b)染色靶组织或细胞的染色溶液；以及
(c)成像器
其中第一和第二板将样品和染色溶液夹在厚度由两个样品接触区域之间的距离调节的薄层中；
其中成像器在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下使薄层成像；以及
其中选择两个样品接触区域之间的距离和薄层中染色溶液的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
薄层厚度、孵育时间和背景信号。根据本发明，选择用于X-路径的薄层的厚度有几个原因。
(1)薄层很薄的厚度使染色溶液的厚度很薄，这减小了染色剂在染色溶液中的扩散距离，从而减小了扩散时间。这导致孵育时间较短和节约了着色剂用量，从而降低成本。
(2)薄层很薄的厚度还减少了由染色溶液中的未消耗的染色剂产生的背景信号。实验发现，薄层厚度越薄，背景信号越小，染色细胞的图像越清晰。
染色溶液中染色剂的浓度。根据本发明，选择用于X-路径的染色溶液中染色剂的浓度，使得对于给定的薄层厚度和在孵育结束时，染剂溶液中的大部分染色剂被消耗用于染色靶组织或细胞，而很少留在染色溶液中。这可以减少成像中的背景信号并且可以节省染色剂的成本。
根据本发明，在使用Q-卡的测定(包括染色)的一些实施例中，间隔件高度被配置为使测定具有5秒、10秒、20秒、30秒、60秒、90秒、120秒、180秒、300秒、600秒，或任何两个值之间的范围的染色饱和时间。在一些实施例中，间隔件具有0.5μm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm的高度，或任何两个值之间的范围。
在一些优选的实施例中，染色饱和时间为5秒、10秒、20秒、30秒、60秒，或任何两个值之间的范围。在一些优选的实施例中，间隔件具有0.5μm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm的高度，或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，间隔件为10μm高。
图1示出了本公开的实施例，其中包括间隔件的适形板适形于样品表面的形状。
图2.使用iMOST Q-CARD微体积实施例的实验步骤的示意性图。1.将口腔Q-tip刷拭活检或鸡胃活检组织(5mm×1mm)置于子卡或载玻片上；2.在X-板的柱子侧上滴加10ul(体积可基于组织的大小和柱子高度而变化)染色溶液；3.将X-板放在载玻片上，染色液朝下朝向组织；4.将X-板压在组织上，使染色溶液固定整片组织，并将组织铺展成微米级薄层(其厚度由柱高决定)；5.将iMOST Q-卡实施例在室温下放置1分钟并在显微镜下观察。(注：术语“Q-卡”和“QMAX卡”是可互换的。)
实施例1口腔粘膜细胞(OMC)的一步快速PAP染色
X-路径方法已经用于巴氏染色(也称为“PAP染色”)巴氏染色溶液，其包括：苏木精、伊红天青(伊红Y、浅绿SF、俾斯麦棕Y)、橙绿6、醇和水。
在实验中，使用人源新鲜口腔粘膜细胞(OMC)来证明使用Q-卡的一步、快速PAP染色。所使用的Q-卡其中一个板上具有作为间隔件的柱阵列，其中柱具有10μm的均匀高度，且柱阵列具有柱尺寸为30μm×40μm且周期为110μm×120μm的正方形晶格。
首先，通过拭子从受试对象口中取出上皮细胞。将细胞从拭子沉积到Q-卡的一个板上(无间隔件)，形成薄层。然后将5-10μl巴氏染色溶液滴在Q-卡的另一板(具有10μm间隔件的X-板)上，随后将两个板压在一起，将薄的上皮细胞层和染色溶液夹在中间并使它们变形为均匀的10μm厚的薄层。薄层很薄的厚度减少了染色剂扩散时间，并使染色在小于60秒内达到其饱和度，为成像做好准备。然后通过成像装置(例如实验室显微镜或基于智能手机的显微镜)对样品成像。
图3用Q-卡对口腔粘膜细胞(OMC)进行1步PAP染色的明视场显微镜图像。在实验中，Q-卡具有10μm的间隔件高度，具有30μm×40μm大小的柱尺寸和110μm×120μm周期的柱阵列。OMC细胞在图像中被染成红色。饱和染色孵育少于60秒并准备成像。
使用Q-卡对OMC进行Pap染色的另一个实例包括以下步骤：
1.获得了Q-卡装置；
2.用口腔拭子轻轻地收集口腔里的细胞；
3.首先将OMC拭子与100至200μl的PBS缓冲液在收集管中混合；
4.5ul的OMC PBS样品与5uL的PAP染色液在收集管中混合1分钟；
5.打开Q-卡，将10uL混合溶液滴在Q-卡上，闭合Q-卡并使用明视场成像系统观察，其包括显微镜和/或基于智能手机的显微镜系统。
6.使用图像处理软件分析图像，并给出表征每个细胞和细胞核的参数，包括细胞大小(C)和数目、细胞核大小(N)和数目、N/C比、形态、结构分布、细胞核分割和分类。
使用Q-卡对OMC进行Pap染色的另一个实例包括以下步骤：
1.获得了Q-卡装置；将部分pap染色溶液在Q-卡板之一上预干燥；2.用口腔拭子轻轻地收集口腔里的细胞；3.OMC拭子先与收集管中的缓冲液混合；4.打开Q-卡，将5-10ul收集管中的OMC样品滴在Q-卡上，等待60秒，并使用明视野成像系统观察，该系统包括显微镜和/或基于智能手机的显微镜系统。以及5.使用图像处理软件分析图像，并给出表征每个细胞和细胞核的参数，包括细胞大小(C)和数目、细胞核大小(N)和数目、N/C比、形态、结构分布、细胞核分割和分类。
实施例2子宫颈拭子和HPV的PAP(巴氏)染色
使用X-路径的Pap染色可用于Pap测试(也称为“Pap涂片”)，其是用于在患者子宫颈上发现可导致子宫颈癌的异常细胞的测试。Pap试验发现人乳头瘤病毒(HPV)引起的细胞变化。本发明可以使PAP试验的样品在单个步骤中和在约60秒内染色和制备，准备用于成像。可以通过拭子从患者的子宫颈收集细胞。
实施例3：痰液诊断肺结核
本发明的应用的一个实例是用于肺结核的快速诊断。在一些实施例中，本发明的装置和方法用于痰的涂片显微镜检术，以通过检测痰或类似样品中的TB细胞来检测结核分枝杆菌(TB)。用于本发明的染色包括但不限于：1)齐尔-尼尔森染色法(Ziehl–Neelsenstaining)，或所谓的快速酸染色，以将抗酸的分枝菌酸在细菌壁上染色；2)使用金胺-O或金胺-若丹明、核酸结合染料
Figure BDA0003439022770000141
Gold进行荧光酸快速染色。
常规涂片显微镜检术检测痰中TB的方法包括：1)齐尔-尼尔森染色法(Ziehl–Neelsen staining)，或所谓的快速酸染色，以将抗酸的分枝菌酸在细菌壁上染色。原则上，这种染色法包括三个主要步骤：染色、酸分化和复染。整个过程通常需要1h，10个步骤以上。2)使用金胺-O(AO)或金胺-若丹明的荧光酸快速染色。标准AO程序需要8个步骤，3次染色，22分钟以完成(标准AO色试剂盒包装说明书；Remel，Lenexa，KS)。
本方法将齐尔-尼尔森染色法和荧光酸快速染色程序缩短至如下1分钟。TB的齐尔-尼尔森染色法(酸快速染色)。
材料：
1.生痰或经消化去污染的痰；
2.Q-卡装置；
3.TB染色溶液包括卡波品红染色剂、酸性醇、亚甲蓝和水；
4.移动通信装置或显微镜。
程序：
1.将1-5ul经消化和去污染的痰样品滴在Q-卡装置的底部卡上；
2.将1:1v/v的染色溶液滴在Q-卡的X-板上；
3.闭合Q-卡并在室温下放置1分钟；
4.使用移动通信装置或显微镜进行观察。
结果：TB细菌将在移动通信装置或显微镜图像上显示亮红色，背景组织将显示蓝色。读取定量和阳性染色等级，并在1分钟内在移动通信装置上输出。
I.TB的FAST荧光酸快速染色。
材料：
1.生痰或经消化去污染的痰；
2.Q-卡装置；
3.TB染色溶液包括金胺若丹明、酸性醇、高锰酸钾和水；
4.移动通信装置或荧光显微镜。
程序：
1.将1-5ul经消化和净化的痰样品滴在Q-卡装置的底部卡上；
2.将1:1v/v的染色溶液滴在Q-卡的X-板上；
3.闭合Q-卡并在室温下放置1分钟；
4.使用IPHONE或显微镜进行观察。
结果：TB细菌应在移动通信装置或荧光显微镜图像上显示暗背景下的荧光红橙色。非耐酸生物不会发荧光或可能在移动通信装置或荧光显微镜图像上呈现浅黄色。使用软件读取定量和阳性染色等级，并在1分钟内在移动通信装置上输出。
另一个实例是使用X-路径和拭子样品从上皮细胞检测流感。
2.通过压薄快速制备和染色组织样品
本发明的另一个方面是快速制备和染色组织样品的方法，组织样品具有比用于染色和成像分析的最终厚度厚得多的初始厚度。实验发现，Q-卡可以将毫米厚的新鲜组织压成～10μm的膜，并且Q-卡的间隔件可以减少或避免对组织表面上的细胞的损伤。在通过Q-卡按压组织样品时，间隔件防止顶板(即，成像尺寸上的板)直接接触组织表面，并且组织样品的顶表面被染色溶液按压，这可以均匀施加到组织表面的压力并且避免固体板将产生的“热锅”(高压位置)。本发明允许在几分钟和几个步骤中切割、上样、染色和成像新鲜组织，而不需要冷冻样品、不需要精确切割，也不需要冲洗。
在本发明的一个实施例中，一种快速制备和染色具有比所述最终厚度更厚的初始厚度的组织的方法，包括：
(a)提供可相对于彼此移动的第一板和第二板，板在其表面上具有均匀高度的间隔件；其中第二板在其表面上具有均匀高度的间隔件；
(b)将厚度比间隔件高度厚的组织样品放置在第一板上；
(c)将染色溶液沉积在第一板上或组织上，其中染色溶液将组织样品染色；
(d)将第一板放置在组织样品的顶部上并且将两个板压在一起以使组织样品形成薄层，其中组织样品层的最终厚度小于组织样品的初始厚度并且由间隔件和两个板调节。
在样品制备和染色之后，样品准备好成像。在一些实施例中，在步骤(c)之后且在不冲洗样品以从样品去除染色溶液的情况下，对薄层成像以观察染色的组织，其中选择薄层的厚度和染色溶液在薄层中的浓度以在成像期间使得，薄层中的染色的靶组织或细胞可与薄层的其余部分区分开。
图4.使用苏木精适形压薄鸡胃黏膜细胞学染色。最初，薄层单个鸡胃(上皮细胞)组织为约1mm厚。通过压薄，组织显著变薄并且一些位置具有与柱高度(10μm)几乎相同的高度。然而，被按压的细胞没有损坏。用蓝/紫色(左图)对鸡胃上皮细胞进行苏木精阳性染色(100×，左图)。在更高的放大倍率下，功能单元粘膜隐窝能够在绿色圆圈中可视化(右图)。
在一些实施例中，选择薄层样品的最终厚度(由间隔件高度控制)以使染色时间(染色达到饱和的时间)小于60秒。
在一些实施例中，从步骤(d)完成到成像的时间为60秒或更少、120秒或更少、300秒或更少、600秒或更少、900秒或更少，或在任何两个值之间的范围。
在一些实施例中，间隔件与两个板分离，例如珠粒或纳米颗粒。在一些实施例中，珠粒在染色溶液中。在一些实施例中，间隔件预制在第二板的表面上。在一些实施例中，间隔件被制造在第二板的表面上并且是柱形的并且具有平坦的顶部。
在一些实施例中，活组织检查样品包括但不限于脱落细胞、脱落组织、软结缔组织、肌肉组织、肝组织、胃组织、小肠组织、大肠组织、肾组织、心脏组织、肺组织、骨髓组织、脑组织、皮肤组织、脂肪组织。
在一些实施例中，从生物物质上不精确地切割活检样品。不精确的切割意味着在切割时不能精确地控制样品的尺寸、厚度和大小。在一些实施例中，活组织检查样品是新鲜的，没有预处理如冷冻、化学处理等。
在一些实施例中，组织样品的初始厚度为1μm、5μm、10μm、30μm、50μm、100μm、500μm、1000μm、2000μm、3000μm、5000μm，或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，切割后组织样品的优选厚度为500μm、1000μm、2000μm、3000μm或任何两个值之间的范围。
在一些实施例中，切割后的组织样品的尺寸为0.01mm2、0.1mm2、0.5mm2、1mm2、2mm2、5mm2、10mm2、50mm2、100mm2、400mm2、1000mm2或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，切割后组织样品的优选尺寸为1mm2、2mm2、5mm2、10mm2、50mm2、100mm2、400mm2、1000mm2或任何两个值之间的范围。
在一些实施例中，施加到按压两个板以使组织样品变薄的力的压强具有0.1kg/cm2至50kg/cm2的压强范围。在一些实施例中，压强具有0.5kg/cm2至5kg/cm2的范围。在一些实施例中，压强为1kg/cm2至3kg/cm2。
在一些实施例中，按压后组织样品的最终厚度为0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、30μm、50μm、100μm、200μm、500μm或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，按压后组织样品的最终厚度为1μm、2μm、3μm、5μm、10μm，或任何两个值之间的范围。
表E1在具有10μm柱高的Q-卡中按压后组织厚度变化的实例
Figure BDA0003439022770000161
Figure BDA0003439022770000171
#来自剪刀或刀片切割
*估计数
Δ包括针和内窥镜活检
通过使用一个薄的适形板和间隔件快速染色用于成像的生物表面的实例。在一些实施例中，仅使用一个，但使用两个板，其中板被配置为适形样品表面的拓扑，其中通过控制间隔件间距(IDS)和增加板柔性来配置适形板。
间隔件高度为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、5μm、7μm、10μm，或任何两个值之间的范围。
活检样品厚度、按压力和间隔件高度的实例：
在一些实施例中，活检样品具有10μm至2000μm的原始厚度，装置具有1μm至50μm的间隔件高度，按压力为0.5kg/cm2至20kg/cm2；按压后，活检样品的平均厚度为1μm至100μm。
在一些实施例中，活检样品具有50μm至1000μm的原始厚度，装置具有5μm至30μm的间隔件高度，按压力为1kg/cm2至10kg/cm2；按压后，活检样品的平均厚度为5μm至50μm。
在一些实施例中，活检样品具有100μm至1000μm的原始厚度，装置具有2至10μm的间隔件高度，按压力为2kg/cm2至5kg/cm2；按压后，活检样品的平均厚度为2μm至20μm。
在一些实施例中，活检样品具有500μm至2000μm的原始厚度，装置具有2至30μm的间隔件高度，按压力为1kg/cm2至10kg/cm2；按压后，活检样品的平均厚度为2μm至50μm。
在一些实施例中，活检样品具有1000μm至2000μm的原始厚度，装置具有1至100μm的间隔件高度，按压力为0.5kg/cm2至15kg/cm2；按压后，活检样品的平均厚度为1μm至150μm。
在一些实施例中，活检样品的原始面积为1mm2至100mm2，装置的间隔件高度为5至50μm，按压力为0.5kg/cm2至20kg/cm2；按压后，活检样品具有100mm2至1000mm2的平均面积。
在一些实施例中，活检样品的原始面积为0.5mm2至10mm2，装置的间隔件高度为2至30μm，按压力为1kg/cm2至10kg/cm2；按压后，活检样品具有100mm2至400mm2的平均面积。
按压后活检样品上方间隔件的高度：在一些实施例中，按压后活检样品上方的间隔件的平均高度为0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、30μm、50μm，或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，在按压后，间隔件在活检样品上方的优选平均高度为1μm、2μm、3μm、5μm、10μm，或任何两个值之间的范围。
按压后活检样品内部间隔件的高度：
在一些实施例中，按压后活检样品内的间隔件的平均高度为0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、30μm、50μm，或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，按压后活检样品内间隔件的优选平均高度为1μm、2μm、3μm、5μm、10μm，或任何两个值之间的范围。
按压前试剂溶液的体积：在一些实施例中，没有添加液体试剂到装置中。在一些实施例中，将染色试剂印到装置的一个板上。在一些实施例中，在按压之前将液体试剂添加到第一板或活检样品或第二板上。在一些实施例中，添加到装置中的液体试剂的体积为0uL、1uL、2uL、3uL、5uL、10uL、20uL、30uL、50uL或任何两个值之间的范围。
柔性板的厚度乘以杨氏模量(hE)：在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且该柔性板的厚度乘以该柔性板的杨氏模量是在1GPa·μm至1000GPa·μm的范围内。
在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且该柔性板的厚度乘以该柔性板的杨氏模量是在10GPa·μm至500GPa·μm的范围内。
在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且该柔性板的厚度乘以该柔性板的杨氏模量是优选在20GPa·μm至150GPa·μm的范围内
在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且该柔性板的厚度乘以该柔性板的杨氏模量是优选在1GPa·μm to 20GPa·μm的范围内
间隔件高度：在一些实施例中，间隔件高度为0μm、1μm、2μm、3μm、5μm、10μm、20μm、30μm、50μm、100μm，或任何两个值之间的范围。
在一些实施例中，优选的间隔件高度是2μm、3μm、5μm、10μm、30μm或任何两个值之间的范围。在一些实施例中，优选的间隔件高度为2μm至50μm。在一些实施例中，优选的间隔件高度为2μm至30μm。在一些实施例中，优选的间隔件高度为5μm至10μm。在一些实施例中，优选的间隔件高度为10μm。
间隔件间距(ISD)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)：
在一些实施例中，间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×106μm3/GPa或更小。
在一些实施例中，间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为1×106μm3/GPa或更小。
在一些实施例中，间隔件间距(IDS)的四次方除以柔性板的厚度(h)和杨氏模量(E)(ISD4/(hE))为5×105μm3/GPa或更小。
柔性板厚度(h)：在一些实施例中，其中板是柔性板，并且柔性板的厚度为1μm至500μm。
在一些实施例中，其中板是柔性板，并且柔性板的优选厚度为3μm至175μm
在一些实施例中，其中板是柔性板，并且柔性板的优选厚度为5μm至50μm。
杨氏模量(E)：在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且该柔性板的杨氏模量是0.01GPa至100GPa。
在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且该柔性板的杨氏模量是0.1GPa至50GPa。
在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的优选杨氏模量为1GPa～5GPa。
在一些实施例中，这些板中的至少一个是柔性板，并且柔性板的优选杨氏模量为0.01GPa～1GPa。
成像系统：在一些实施例中，检测来自样品的信号的成像系统包括但不限于光致发光、电致发光和电化学发光、光吸收、反射、透射、衍射、散射或扩散、表面拉曼散射的发光，选自电阻、电容和电感、磁驰豫的电阻抗以及它们的组合。
在一些实施例中，成像系统是显微镜、明场显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、复合光学显微镜、立体显微镜、数字显微镜、声学显微镜、电话显微镜。
分析系统：
在一些实施例中，分析系统包括但不限于机器学习、监督机器学习、无监督机器学习和强化学习。在一些实施例中，分析系统组合了软件分析和人类分析。
3.使用均匀微间隔件的适形柔性板(即膜)改善组织成像
如图1所示，在将样品沉积到底物上之后，将液体沉积到样品和板中的一者或两者上，板可包含间隔件。在将板与底物一起按压时(例如，样品夹在其间)，液体被压缩成具有均匀厚度的层，其中层的厚度由间隔件的高度调节。此外，由于板是柔性的(例如，适形的)，所以板适形于样品形状的任何不规则性，从而在样品上方保持均匀厚度的液体层。
我们发现使用均匀微间隔件的适形柔性板(即膜)改善了组织成像。
实施例4：成像改进
图5示出了(i)使用具有接触组织的间隔件的X-板的一步染色获得的荧光图像，和(ii)使用平板获得的荧光图像之间的比较。使用X-板的图像具有比平板更好的图像对比度和更清晰的图像。首先使用10μm柱高X-板将人源冷冻皮肤切片用抗CK14-AF488染色。然后通过使用X-板(10μm柱高，上图)或平PMMA膜(上图)用PBS回收组织切片。在荧光显微镜下观察组织切片。红色箭头表示CK14-AF488阳性皮肤上皮细胞。与PMMA膜相比，10μm柱X-板显示出更好的成像结果。
材料：新鲜的人源皮肤和肺冷冻切片来自Zyagen，组织切片在使用前储存在-80℃。本研究中使用的抗体均用Alexa Flour 488(AF488)进行商业预标记。Alexa fluor系列的荧光染料是由Molecular Probes(现在是Thermo Fisher Scientific的一部分)发明的一系列染料，并以Invitrogen的商标名称销售。在荧光显微镜和细胞生物学中，AlexaFluor染料经常用作细胞和组织标记。Alexa Fluor染料可以直接与抗体偶联以放大信号和灵敏度或其它生物分子。本研究中使用的商业预标记抗体是抗细胞角蛋白14-AF488(来自Novus Biologicals，货号NBP2-34675AF488)和palloidin-AF488(用于检测F-肌动蛋白，来自Thermo Fisher Scientific，货号A12379)。所有抗体在使用前在4℃避光保存。细胞膜可渗透染料吖啶橙(AO，来自Sigma Aldrich，货号A9231)也用于该研究中以在荧光显微镜下使细胞核可视化。X-板由Essenlix Coop.制造。X-板是175μm厚的PMMA，具有30μm×40μm柱尺寸，5μm柱高度和80μm间距的柱阵列。
本公开的一个方面是提供用于组织染色的容易且快速的装置和方法。在一些实施例中，染色液厚度的减少显著减少了染色剂扩散穿过染色液厚度的时间，因此减少了染色剂用于任何目的的饱和时间。例如，通过减少用于染色的抗体的扩散距离，这种构造减少了抗原-抗体结合的饱和时间，这是免疫染色的限速步骤，极大地促进了免疫染色的整体速度。
本公开的另一个方面是使用在此公开的用于组织染色的装置和方法为该样品提供对染色剂的均匀接近。在一些实施例中，由板和间隔件的特定构造产生的染色液的均匀厚度确保样品均匀地接近溶解并扩散在染色液中的染色剂。
样品
应当注意，除非另有说明，本文所用的术语“样品”是指液体生物/化学样品或非液体样品。
在一些实施例中，液体样品最初以液体形式获得，例如血液和唾液。在一些实施例中，最初获得的样品不是液态，例如固态或气态。在这些情况下，当使用本公开提供的装置和方法收集和保存非液体样品时，非液体样品被转化为液体形式。用于这种转化的方法包括但不限于与液体介质的混合物而不溶解(最终产物是悬浮液)，溶解在液体介质中，从固态融化成液态，从气态冷凝成液态(例如呼出气体冷凝物)。
在一些实施例中，样品可以在开放构造下在其上干燥，并且其中样品包括选自以下组成的组的体液：羊水、房水、玻璃体液、血液(例如，全血、分级血液、血浆或血清)、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、气息、胃酸、胃液、淋巴、粘液(包括鼻引流液和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出气冷凝物、皮脂、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿液以及它们的组合。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域被配置为使得样品可以在开放构造下在其上干燥，并且样品包括血液涂片并且在一个或两个板上干燥。
在一些实施例中，样品是固体样品，例如组织切片。在一些实施例中，样品是厚度在1-200μm范围内的实体组织切片。在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域与样品粘合。在一些实施例中，样品是石蜡包埋的。在一些实施例中，样品是固定的(例如福尔马林、多聚甲醛等)。
染色液
在一些实施例中，染色液具有在0.1至3.5mPa·S范围内的粘度。
在一些实施例中，染色液的一个主要功能是作为转移介质。储存(干燥/涂覆)在板上的试剂在接触染色液时溶解并扩散在染色液中。这样，染色液用作转移介质，以提供存储在板上的试剂到样品的通路。
在一些实施例中，染色液的一个主要功能是用作保持溶液。在一些实施例中，当板被按压以进入闭合构造时，由于由液体样品提供的像毛细管力的力，板被配置为在移除外部压缩力之后“自保持”在闭合构造。在样品不是液体形式的情况下，液体介质因此提供如板的“自持”所需的毛细管力的力。
在一些实施例中，染色液包括缓冲液对，以平衡最终溶液的pH值。在一些实施例中，染色液不包括能够改变样品性质的特定组分。
在一些实施例中，染色液包括处理，固定或染色样品所需的试剂，如以下部分中进一步详细讨论的。
在一些实施例中，染色液包括能够固定样品的固定剂。
在一些实施例中，染色液包括阻断剂，其中阻断剂被配置为使样品中的非特异性内源物质不能与用于特异性标记靶分析物的检测试剂反应。
在一些实施例中，染色液包括能够除去样品中石蜡的脱蜡试剂。
在一些实施例中，染色液包括能使组织样品中含有靶分析物的细胞透化的透化试剂。
在一些实施例中，染色液包括能够促进抗原修复的抗原修复剂。
在一些实施例中，染色液包括特异性标记样品中靶分析物的检测试剂。
板存储位置
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括储存位置，储存位置含有处理、固定或染色样品所需的试剂。这些试剂在接触液体样品或染色液时溶解并扩散在液体样品/染色液中。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括含有阻断剂的储存位置，其中阻断剂被配置为使样品中的非特异性内源物质不能与用于特异性标记靶分析物的检测试剂反应。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括含有能够除去样品中的石蜡的脱蜡剂的储存位置。在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括含有透化试剂的储存位置，透化试剂能够使含有靶分析物的组织样品中的细胞透化。
在一些实施例中。一个或两个板的样品接触区域包括含有能够促进抗原修复的抗原修复剂的存储位点。在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括含有特异性标记样品中靶分析物的检测试剂的储存位置。
在一些实施例中，一个或两个板的样品接触区域包括含有捕获剂的结合位点，其中捕获剂被配置为结合样品中细胞表面上的靶分析物并固定细胞。
检测试剂
在一些实施例中，检测试剂包括用于染色剂的染料，染色剂选自以下组成的组：酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、苯胺蓝WS、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、蔚蓝A、蔚蓝B、蔚蓝C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、C.I.甲酚紫、结晶紫、达罗红、曙红B、曙红Y、赤藓红、乙基曙红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、吉姆萨染色剂、苏木精、苏木精和曙红、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫、(亚甲基青莲)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红、橙G、橙II、地衣红、碱性副品红、四溴二氯荧光黄B、蛋白银S、派若宁B、派若宁、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert、瑞氏染色剂，以及它们的任意组合。
在一些实施例中，检测试剂包括被配置为特异性结合样品中的蛋白分析物的抗体。
在一些实施例中，检测试剂包括寡核苷酸探针，其被配置为特异性结合样品中的DNA和/或RNA。
在一些实施例中，检测试剂用报告分子标记，其中报告分子被配置为提供待读取和分析的可检测信号。
在一些实施例中，报告分子包括荧光分子(荧光团)，包括但不限于IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800、荧光素、异硫氰酸荧光素、羧基荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素的琥珀酰亚胺酯、荧光素二氯三嗪的5-异构体、笼状羧基荧光素-丙氨酸-甲酰胺、OregonGreen 488、Oregon Green 514；萤光黄、吖啶橙、若丹明、四甲基若丹明、德克萨斯红、碘化丙啶、JC-1(5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物)、四溴若丹明123、若丹明6G、TMRM(四甲基若丹明甲酯)、TMRE(四甲基若丹明乙酯)、四甲基红色碱性染料(tetramethylrosamine)、若丹明B和4-二甲氨基四甲基玫瑰胺、绿色荧光蛋白、蓝移绿色荧光蛋白、蓝绿移绿色荧光蛋白、红移绿色荧光蛋白、黄移绿色荧光蛋白、4-乙酰胺基-4'-异硫氰基芪-2,2'-二磺酸；吖啶及其衍生物，例如吖啶、异硫氰酸吖啶；5-(2’-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；4,4-二氟-5-(2-噻吩基)-4-硼杂-3a,4a二氮杂-5-引达省-3-丙酸氟硼二吡咯(BODIPY)；层叠蓝(cascade blue)；亮黄；香豆素和衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青染料；焰红染料；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"-二溴邻苯三酚磺酞(溴焦酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰基二氢化芪-2-,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸；5-(二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物：曙红、曙红异硫氰酸酯、赤藓红及其衍生物：赤藓红B、赤藓红、异硫氰酸酯；乙啶；荧光素和衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-[(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基]--荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、异硫氰酸荧光素、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物：芘、芘丁酸酯、琥珀酰亚胺基1-芘；丁酸盐量子点；活性红4(CibacronTM亮红3B-A)罗丹明及其衍生物：6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明X异硫氰酸酯、磺酰若丹明B、磺酰若丹明101、5磺酰若丹明的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明；四甲基霍丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、玫红酸；CAL Fluor Orange 560；铽螯合物衍生物；Cy 3；Cy 5；Cy 5.5；Cy7；IRD 700；IRD 800；拉霍亚蓝(La Jolla Blue)；酞菁绿；和萘酞菁、香豆素和相关染料、呫吨染料如对甲氨基酚、试卤灵、双烷(bimanes)、吖啶、异吲哚、丹酰染料、氨基邻苯二甲酸酰肼如鲁米诺和异鲁米诺衍生物、氨基邻苯二甲酰亚胺、氨基萘二甲酰亚胺、氨基苯并呋喃、氨基喹啉和二氰基对苯二酚、荧光铕和铽复合体；它们的组合等。合适的荧光蛋白和生色蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于来源于水晶果冻水母(Aequoriavictoria)的GFP或其衍生物，例如“人源化”衍生物如增强的GFP；来自另一物种如海肾(Renilla reniformis)，Renilla mulleri或Ptilosarcus guernyi的GFP；“人源化”重组GFP(hrGFP)；来自珊瑚虫物种的多种荧光和有色蛋白中的任一种；其任何组合；等等。
在一些实施例中，信号选自下以下组成的组：
i.选自光致发光、电致发光和电化学发光的发光；
ii.光吸收、反射、透射、衍射、散射或漫射；
iii.表面拉曼散射；
iv.选自电阻、电容和电感的电阻抗；
v.磁弛豫；以及
vi.i-v的任何组合。
免疫组织化学
在一些实施例中，本公开的装置和方法可用于对样品进行免疫组织化学。
在免疫组织化学(IHC)染色方法中，将组织样品固定(例如，在多聚甲醛中)，可选地包埋在蜡中，切成小于100μm厚(例如，2μm至6μm厚)的薄切片，并且然后安装在支持物如载玻片上。一旦固定，组织切片可以使用增加浓度的酒精冲洗脱水，并使用冲洗剂如二甲苯冲洗。在某些情况下，固定也是可选的步骤，例如用于血涂片染色。
在大多数IHC方法中，可以使用一抗和二抗。在这样的方法中，一抗结合感兴趣的抗原(例如，生物标记)并且是未标记的。二抗与一抗结合，并直接与报告分子或可募集溶液中报告分子的接头分子(例如生物素)偶联。或者，一抗本身可以直接偶联到报告分子或可募集溶液中的报告分子的接头分子(例如生物素)。报告分子包括荧光团(例如FITC、TRITC、AMCA、荧光素和若丹明)和酶如碱性磷酸酶(AP)和辣根过氧化物酶(HRP)，对于它们存在多种荧光、显色和化学发光底物如DAB或BCIP/NBT。
在直接方法中，将组织切片与标记的一抗(例如FITC-偶联的抗体)在结合缓冲液中孵育。一抗直接与组织切片中的抗原结合，在冲洗组织切片以除去任何未结合的一抗后，用显微镜分析切片。
在间接方法中，将组织切片与结合组织中靶抗原的未标记的一抗孵育。在冲洗组织切片以除去未结合的一抗后，将组织切片与结合一抗的标记的二抗孵育。
在抗原的免疫组织化学染色后，组织样品可以用另一种染料染色，例如苏木精、赫斯特染色(Hoechst stain)和DAPI，以提供对比和/或鉴定其他特征。
本装置可用于组织样品的免疫组织化学(IHC)染色。在这些实施例中，该装置可以包括第一板和第二板，其中：这些板可相对于彼此移动成不同的构造；一个或两个板是柔性的；每个板在其各自的表面上具有用于接触组织样品或IHC染色液的样品接触区域；第一板中的样品接触区域是平坦的和平面形的；第二板中的样品接触区域包括固定在表面上并且具有预定的基本上均匀的高度和在7μm至200μm范围内的预定的恒定的间隔件间距的间隔件；
其中这些构造之一是开放构造，其中：两个板完全或部分地分隔开，板之间的间距不受间隔件的调节；并且其中构造中的另一个是闭合构造，闭合构造是在样品和IHC染色液沉积之后处于开放构造的构造；并且在闭合构造中：至少部分样品在两个板之间，至少部分染色液的层在至少部分样品和第二板之间，其中至少部分染色液层的厚度由板、样品和间隔件调节，并且样品表面和第二板表面之间的平均距离等于或小于250μm，变化很小。
如上所述，在一些实施例中，装置可包括涂覆在一个或两个板的样品接触区域上的干IHC染色剂。在一些实施例中，装置可包括涂覆在第二板的样品接触区域上的干IHC染色剂，并且IHC染色液包括溶解干IHC染色剂的液体。在一些实施例中，样品的厚度为2μm至6μm。
H&E、特殊染色和细胞活力染色
在一些实施例中，本公开的装置和方法可用于进行H&E染色、特殊染色和细胞活力染色。
苏木精和伊红染色或苏木精和伊红染色(H&E染色或HE染色)是组织学上的主要染色之一。它是医学诊断中最广泛使用的染色剂，通常是金标准；例如，当病理学家观察疑似癌症的活组织检查时，组织学切片可能用H&E染色，并称为“H&E切片”、“H+E切片”或“HE切片”。苏木精和曙红的组合产生蓝色、紫色和红色。
在诊断病理学中，“特殊染色(special stain)”术语最常用于临床环境中，并且简单地表示除了H&E方法之外的用于将颜色赋予标本的任何技术。这也包括免疫组织化学和原位杂交染色。另一方面，H&E染色是组织学和医学诊断实验室中最流行的染色方法。
在任何实施例中，干结合位点可包括捕获剂如抗体或核酸。在一些实施例中，可释放的干试剂可以是标记的试剂，例如荧光标记的试剂，例如荧光标记的抗体或细胞染色剂，例如罗曼诺夫斯基氏染剂(Romanowsky’s stain)、利什曼染色剂(Leishman stain)、梅-格二氏染色剂(May-Grunwald stain)、吉姆萨染色剂(Giemsa stain)、詹纳尔染色剂(Jenner’sstain)、赖特氏染色剂(Wright's stain)或其任何组合(例如赖特-吉姆萨染色剂)。这种染色剂可以包括曙红Y或带有亚甲蓝的曙红B。在某些实施例中，染色剂可以是碱性染色剂，例如苏木精。
在一些实施例中，特殊染色剂包括但不限于酸性品红、阿尔新蓝8GX、茜素红S、苯胺蓝WS、金胺O、偶氮胭脂红B、偶氮胭脂红G、蔚蓝A、蔚蓝B、蔚蓝C、碱性品红、俾斯麦棕Y、亮甲酚蓝、亮绿、胭脂红、氯唑黑E、刚果红、C.I.甲酚紫、结晶紫、达罗红、曙红B、曙红Y、赤藓红、乙基曙红、乙基绿、固绿FCF、异硫氰酸荧光素、吉姆萨染色剂、苏木精、苏木精和曙红、靛蓝胭脂红、詹纳斯绿B、哲纳尔氏染色素1899、浅绿SF、孔雀石绿、马休黄、甲基橙、甲基紫2B、亚甲蓝、亚甲蓝、亚甲紫、(亚甲基青莲)、中性红、苯胺黑、尼罗蓝A、核固红、油红、橙G、橙II、地衣红、碱性副品红、四溴二氯荧光黄B、蛋白银S、派若宁B、派若宁、刃天青、玫瑰红、番红O、苏丹黑B、苏丹III、苏丹IV、四铬染色(MacNeal)、硫堇、甲苯胺蓝、Weigert、瑞氏染色剂，以及它们的任意组合。
术语“细胞活力染色”是指用于区别地染色组织样品内的活细胞和死细胞的染色技术。通常，活细胞和死细胞之间细胞膜和/或核膜通透性的差异被利用于差异染色。在其他情况下，细胞凋亡或坏死的标记物(指示垂死细胞或细胞尸体)用于这种染色。
在一些实施例中，装置在一个或两个板上包括染料以便为细胞活力染色样品。在一些实施例中，染料包括但不限于碘化丙啶(PI)、7-AAD(7-氨基放线菌素D)、台盼蓝、钙黄绿素紫AM、钙黄绿素AM、与不同荧光团偶联的可固定活力染料(FVD)、SYTO9和其他核酸染料、刃天青和甲臜(MTT/XTT)和其他线粒体染料，及其任何组合等。在一些实施例中，样品包括细菌，并且希望测定样品中的细菌活力，装置还在一个或两个板上包括细菌活力染料，例如PI、SYTO9等，以区别染色活细胞与死细胞。可选地，该装置在一个或两个板上还包括用于总细菌染色的染料，例如革兰氏染色试剂等。
原位杂交
在一些实施例中，本公开的装置和方法可用于在组织学样品上进行原位杂交(ISH)。
原位杂交(ISH)是一种杂交类型，它使用标记的互补DNA、RNA或修饰的核酸链(即，探针)将特定DNA或RNA序列定位在组织的一部分或部分(原位)，或如果组织足够小(例如，植物种子、果蝇胚胎)，定位在整个组织中(整体ISH)，定位在细胞中和定位在循环肿瘤细胞(CTC)中。
原位杂交用于揭示染色体上或组织中特定核酸序列的位置，这是理解基因的组织、调节和功能的关键步骤。目前使用的关键技术包括：用寡核苷酸和RNA探针(放射性标记的和半抗原标记的)与mRNA原位杂交；用光和电子显微镜进行分析；整装原位杂交；RNAs和RNA加蛋白的双重检测；荧光原位杂交检测染色体序列。DNAISH可用于测定染色体的结构。荧光DNAISH(FISH)可例如用于医学诊断以评估染色体完整性。RNA ISH(RNA原位杂交)用于测量和定位组织切片、细胞、完整标本和循环肿瘤细胞(CTC)内的RNA(mRNA、lncRNA和miRNA)。
在一些实施例中，检测试剂包括用于原位杂交染色的核酸探针。核酸探针包括，但不限于，被配置为特异性结合样品中的DNA和/或RNA的寡核苷酸探针。
用于组织染色和细胞成像的系统和方法
还提供了一种用于使用移动电话快速染色和分析组织样品的系统，包括：
(a)如上所述的样品、染色液和装置，
(b)移动通信装置，包括：
i.用于检测和/或成像样品的一个或多个相机；
ii.用于接收和/或处理所检测的信号和/或样品的图像并且用于远程通信的电子器件、信号处理器、硬件和软件；以及
(c)来自移动通信装置或外部源的光源。
还提供了一种用于使用移动电话快速染色和分析组织样品的方法，包括：
(a)将组织样品和染色液放置在上述系统的装置上，并将两块板放置成闭合构造；
(b)获得具有成像、数据处理和通信的硬件和软件的移动电话；
(c)通过移动电话对沉积在CROF装置上的组织样品进行测定以产生结果；以及
(d)将结果从移动电话传送到远离移动电话的位置。
4.快速均质细胞内测定
现今的大多数测定(除了病理学和细胞学)通过检测样品中的生物标记物来检测生物系统中与疾病或病症相关的生物标志物，而生物标志物在细胞外(例如，生物标志物从细胞泄漏到样品中或样品中的细胞被裂解)。通常细胞外生物标记物的浓度可能较低，这使得生物标记物的检测具有挑战性和/或复杂性。
本发明的一个方面是当生物标记物仍然在细胞内时检测生物标记。这种方法的一个原因是细胞中生物标记物的浓度通常比生物标记物从细胞出来进入样品时高得多。例如，对于最初在淋巴细胞中的生物标记物，淋巴细胞中的生物标记物的浓度可以比如果淋巴细胞裂解并且生物标记物混合在血液中的浓度高约5,000倍。这种高生物标记物浓度的细胞可极大地促进生物标记物的检测。
图6.细胞内测定的说明。具有夹在两个板之间的细胞的样品，其中细胞在细胞内部含有分析物(即生物标记)，并且一些分析物在细胞外部。在一些实施例中，细胞内的分析物浓度与细胞外的分析物浓度具有相关性。
本发明的一个方面是通过将标记的探针引入细胞来检测细胞中的生物标记物以检测生物系统中的疾病或病症，其中标记的探针特异性结合生物标记物。
本发明的一个方面，标记的探针包括蛋白、核酸、适体或其组合。
AA.在一些实施例中，一种用于样品中细胞膜内分析物的快速均质检测的方法，包括：
(a)提供第一板和第二板，每个在其表面上具有用于接触包含或疑似包含细胞内的分析物的细胞的样品的样品接触区域，
(b)提供检测探针，检测探针(i)特异性结合分析物并且(ii)能够发射一定波长的光；
(c)提供使细胞的膜对检测探针可渗透的透化试剂，其中在没有透化试剂的情况下，检测探针不能渗透到细胞中；
(d)将样品、检测探针和透化试剂夹在第一板和第二板之间以形成厚度为200微米(μm)或更小的薄层；以及
(e)在步骤(d)之后且不冲洗样品以去除未结合的检测探针的情况下，对薄层成像以检测具有结合至检测探针的分析物的细胞；
其中薄层的厚度和薄层中检测探针的浓度经选择以使得，在薄层中，在步骤(e)的成像过程中，具有与细胞内分析物结合的检测探针的位置的信号可与不具有细胞的位置的信号区分开。
实施例AA的方法，步骤(e)的成像在步骤(d)的夹入之后300秒或更少执行。
实施例AA的方法，其中选择薄层的厚度以使薄层中的一些细胞与其它细胞没有重叠或显著重叠。
实施例AA的方法，还包括定量(i)细胞内含有分析物的细胞和(ii)细胞内含有分析物的细胞的步骤。
实施例AA的方法，还包括定量(i)细胞内含有分析物的细胞和(ii)细胞内含有分析物的细胞的步骤，和定量细胞内含有分析物的细胞相对于细胞总数的百分比的步骤。
实施例AA的方法，其中由检测探针发射的光是荧光，并且其中该方法还包括(i)测量具有与检测探针结合的分析物的细胞的荧光强度，(ii)测量具有与检测探针结合的分析物的细胞的数目，以及(iii)通过将单位面积中具有结合至检测探针的分析物的细胞的总数与具有结合至检测探针的分析物的细胞的荧光强度的平均值相乘来计算总荧光强度。
示例25病毒检测
根据本发明，检测受试对象的病毒感染的方法包括：检测受试对象细胞内的病毒特异性糖蛋白(即细胞膜内的糖蛋白)，其中将病毒糖蛋白特异性探针引入细胞内(例如血浆和/或细胞核内)，其中探针具有标记，其中细胞中的探针浓度被配置为使得细胞的体积的至少一部分中与特异性病毒二醇-蛋白结合的探针的浓度高于(i)细胞的其他部分和/或(ii)细胞外的体积的其他部分的体积的一部分中未结合探针的浓度。在一些实施例中，染色试剂可包括能使组织样品中含有靶分析物的细胞透化的透化剂。
在一些实施例中，分析物是病毒的二醇蛋白。
在一些实施例中，间隔件与两个板分离，例如珠粒或纳米颗粒。在一些实施例中，珠粒在染色溶液中。在一些实施例中，间隔件预制在第二板的表面上。在一些实施例中，间隔件制造在第二板的表面上并且是柱形的而且具有平坦的顶部。
在一些实施例中，染色溶液包括：用于抗体染色的PH7至PH8缓冲液，例如PBS、盐水、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、碳酸氢钠。
在一些实施例中，染色溶液包括冲洗剂如：1-6％Zwittgent
在一些实施例中，细胞的透化是通过：
i.基于有机溶剂的溶液：在缓冲液中的50％-70％乙醇或异丙醇；
ii.将抗体递送到白细胞中的纳米颗粒载体(carrier)，例如基于脂质或聚合物的纳米颗粒；
iii.电穿孔以将抗体递送到白细胞中；
iv.将肽介导的抗体递送到白细胞中；或
v.以上的任何组合。
来自全血专利材料的白细胞中病毒的FAST染色和成像的示例。
样品收集：
1.通过轻轻地从手到指尖按压5-6次，按摩以温热手指并增加血流。用干净的纱布擦干或风干。
2.使用无菌刺血针，仅从指垫中心穿刺皮肤。
3.擦去第一滴血。直接在Q-卡上手指涂抹1-5μl第二滴全血。
染色和成像：
1.将血液与包括PBS、Zwittgent、乙醇和荧光团标记抗体的染色溶液混合。
2.闭合Q-卡，将血样与染色溶液室温孵育少于1分钟，不冲洗；
3.步骤2后，使用iPHONE或荧光显微镜在闭合的Q-卡中成像白细胞。
Q-卡的示例性实施例，柱尺寸为0.1-2μm、2-10μm、10-30μm。
成像装置的示例性实施例：iPHONE或荧光显微镜
染色和成像中的示例性实施例：
取样中的示例性实施例：任何含有病毒的生物样品：
a.血液标本
b.呼吸道标本
c.皮肤标本
d.宫颈标本
e.粪便标本
f.尿液标本
g.脑脊液标本
h.任何其他细针标本，如羊水
本发明可检测的病毒的示例包括但不限于：
a.血液标本中CMV、乙型肝炎病毒、丙型肝炎、EBV和HIV
b.皮肤标本中的HSV和VZV
c.粪便标本中轮状病毒
d.呼吸道标本中的RSV、流感和副流感病毒，以及腺病毒
e.宫颈和皮肤标本中的HPV
f.脑脊液标本中的HSV
g.羊水标本中寨卡病毒
生物标记和应用
本公开的另外的方面包括CROF装置，其包括各自与样品中的多种分析物结合的多种捕获剂，即，多路复用CROF装置。在这种情况下，包括多个捕获剂的CROF装置可以被配置为检测不同类型的分析物(蛋白、核酸、抗体等)。基于阵列内的位置，与不同分析物结合的可检测标记的发射波长或上述的组合，不同的分析物可在阵列上彼此区分。
可以使用本发明的装置、系统和方法在诊断样品中可检测的其他病原体包括但不限于：水痘带状疱疹；表皮葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSRA)、金黄色葡萄球菌、人葡萄球菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、头状葡萄球菌、华氏葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、流感嗜血杆菌、拟葡萄球菌、肺炎链球菌和白色念珠菌；淋病(淋病奈瑟菌)、梅毒(梅毒螺旋体)、衣原体(Clamyda tracomitis)、非淋菌性尿道炎(解脲尿支原体)、软下疳(杜克雷嗜血杆菌)、滴虫病(阴道滴虫)；铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSRA)、肺炎克雷伯氏菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽寡养单胞菌、副流感嗜血杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、副溶血嗜血杆菌(Haemophilisparahaemolyticus)、阴沟肠球菌(Enterococcus cloacae)、白色念珠菌、卡他莫拉菌(Moraxiella catarrhalis)、肺炎链球菌、弗氏柠檬酸杆菌、屎肠球菌、产酸克雷伯氏菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorscens)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neiseria meningitidis)、酿脓链球菌、卡氏肺孢子菌、肺炎克雷伯菌嗜肺军团菌、肺炎支原体和结核分枝杆菌等，以及表B2和表6中所列的细菌。
以下是疾病及其相关诊断标记的列表：
阿尔兹海默病：Aβ42、淀粉样β蛋白(CSF)、朊病毒蛋白(CSF)、促凋亡激酶R(PKR)及其磷酸化PKR(pPKR)(CSF)
多发性硬化：胎球蛋白-A(CSF)、尼曼-皮克C型：tau(CSF)、双相精神障碍：分泌粒蛋白II(CSF)、朊病毒病：朊病毒蛋白(CSF)
HIV相关的神经认知障碍：细胞因子(CSF)
帕金森氏病症(神经退行性疾病)：α-突触核蛋白(CSF)、tau蛋白(CSF)、载脂蛋白H(CSF)、血浆铜蓝蛋白(CSF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)(CSF)
轴索变性：神经丝轻链(CSF)
神经退行性疾病：帕金蛋白(CSF)、PTEN诱导的假定激酶1(CSF)、DJ-1(CSF)、富亮氨酸重复激酶2(CSF)
库弗-拉克病：突变的ATP13A2(CSF)
CSF鼻液溢(鼻手术样品)：转甲状腺蛋白(CSF)
多发性硬化进展：维生素D结合蛋白(CSF)、CXCL13(CSF)
鞘内炎症：IL-12p40、CXCL13和IL-8(CSF)
前列腺癌：Dkk-3(精液)
脓毒症(内皮细胞特异分子、由活化的肺血管内皮细胞特异性分泌、被认为在控制肺部炎症反应中起关键作用)：p14内皮细胞特异分子片段(血液)
视神经脊髓炎：血清(血液)
心血管疾病：ACE2(血液)、α-淀粉酶(唾液)
食管鳞状细胞癌的早期诊断：CD25自身抗体(血液)
肺癌：hTERT(血液)、CAI25(MUC 16)(血液)：VEGF(血液)、sIL-2(血液)、骨桥蛋白(血液)、BRAF、CCNI、EGRF、FGF19、FRS2、GREB1和LZTS1(唾液)
卵巢癌：人类附睾蛋白4(HE4)(血液)、CA 125(唾液)
妊娠：甲胎蛋白(血液)
糖尿病：白蛋白(尿)
蛋白尿：白蛋白(尿)尿
肾漏：微量白蛋白尿
镜像胎儿AFP水平：甲胎蛋白(尿)
急性肾损伤：中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(尿)、白细胞介素18(IL-18)(尿)、肾损伤分子-1(KIM-1)(尿)、肝脂肪酸结合蛋白(L-FABP)(尿)
EB病毒癌蛋白(鼻咽癌)：LMP1(唾液)、BARF1(唾液)
口腔癌：IL-8(唾液)
口腔或唾液恶性肿瘤：癌胚抗原(CEA)(唾液)
口腔恶性肿瘤：癌胚抗原(唾液)
脊髓细胞癌：IL8(唾液)、硫氧还蛋白(唾液)
HIV：β-2微球蛋白水平-监测病毒的活性(唾液)、肿瘤坏死因子-α受体-监测病毒的活性(唾液)
乳腺癌：CA15-3(唾液)
在一些情况下，本方法用于将其健康状况告知样品来源的受试对象。可通过本方法、装置和系统诊断或测量的健康状况包括但不限于：化学平衡；营养健康；锻炼；疲劳；睡眠；压力；糖尿病前期；过敏史；老龄化；暴露于环境毒素、杀虫剂、除草剂、合成激素类似物；怀孕；绝经；和男性更年期。下表B3提供了可使用本发明检测的生物标记及其相关健康状况的列表。
口腔鳞状细胞癌：p53
头颈部鳞状细胞癌：CASP-8、SART-1、TREX1、3'修复核酸外切酶；BRAP(BRCA1相关)：核定位蛋白；Trim 26锌指结构域；GTF21转录因子。鼠同系物TF11-1；NSEP1(YB-1)转录因子；与c-myc相关联的MAZ转录因子；SON(DBP-5；KIAA1019；NREBP DNA结合蛋白)；NACA新生多肽-相关复合物；NUBP2核苷酸结合蛋白；EEF2转录延伸因子2；GU2假定的RNA解旋酶；RPLI3A核糖体蛋白；SFRS21P(CASP11；SIP1；SRRP1290剪接因子)；RPS12核糖体蛋白；MGC2835 RNA解旋酶；TMF1、TATA调控因子；胞质分裂PRC1调节剂；KRT14角蛋白14；黏着斑蛋白；H2AFY组蛋白家族成员；SLK(KIAA02304)Ste相关激酶；NOL3(ARC)核蛋白3、细胞凋亡抑制因子；Hsp40家族的DNAJA2成员；HSP40家族的DNAJA1成员；LINE-1逆转录转座子；酵母蛋白的MOG(HSPC 165)同源物；LIMS1(PINCH)：LIM和衰老抗原样结构域；COPB2衣被蛋白复合物亚单位蛋白；FLJ22548假设蛋白；C21orf97；FLJ21324；MGC15873；SSNA1干燥综合征核自身抗原1；KIAA0530，锌指结构域；大鼠stannin；假设蛋白DKFZp4340032；人FLJ23089；PC326
1.阴离子冲洗剂
烷基硫酸盐：十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸锂、
Figure BDA0003439022770000301
2-乙基己基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、辛基硫酸钠、TeepolTM610S阴离子、土耳其红油钠盐
烷基磺酸盐：1-辛烷磺酸钠、4-十二烷基苯磺酸、乙烷磺酸钠一水合物、1-丁磺酸钠、1-癸磺酸钠、1-庚磺酸钠、1-壬磺酸钠、1-辛烷磺酸钠、1-戊磺酸钠、1-丙磺酸钠、己烷磺酸钠、戊烷磺酸钠
胆盐：鹅去氧胆酸二乙酸甲酯、鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、甘氨胆酸水合物、鹅去氧胆酸钠、胆酸钠水合物、胆酸钠水合物、胆酸钠水合物、胆甾醇硫酸钠、去氧胆酸钠、甘氨鹅脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺鹅胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、牛磺猪去氧胆酸钠、牛磺石胆酸钠、牛磺熊去氧胆酸钠、牛磺胆酸钠盐、牛磺石胆酸3硫酸二钠盐、熊去氧胆酸、
其他阴离子冲洗剂：二环己基磺基琥珀酸酯钠盐、双十六烷基磷酸酯、二己基磺基琥珀酸酯钠盐、多库酯钠、3,5-二碘水杨酸锂、N-月桂酰肌氨酸钠盐、N-月桂酰肌氨酸、N-月桂酰肌氨酸purum、辛酸钠、TritonTMQS-15
2.阳离子冲洗剂
烷基三甲基溴化铵、盐酸氨丙啉、苯扎氯铵、氢氧化苄索铵、苄基二甲基十二烷基铵、苄基二甲基十六烷基铵、苄基十二烷基二甲基铵、十六烷基氯化吡啶、二甲基双二十八烷基铵、十二烷基乙基二甲基铵、十二烷基三甲基铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、吉拉德试剂T、十六烷基(2-羟乙基)二甲基磷酸二氢铵、溴化十六烷基吡啶、氯化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基铵、LuviquatTMFC 370、LuviquatTMFC 550、LuviquatTMHOLD、LuviquatTMMonoLS、甲苄索氯铵、十四烷基三甲基铵、四庚基溴化铵、四(癸基)溴化铵、三-C8-10-烷基甲基氯化铵、十三烷基甲基氯化铵SelectophoreTM
3.非离子冲洗剂
1-油酰基-rac-甘油、2-环己基乙基β-D-麦芽糖苷、4-壬基苯基-聚乙二醇非离子、5-环己基戊基β-D-麦芽糖苷、6-环己基己基β-D-麦芽糖苷、正十二酰蔗糖、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正癸酰蔗糖、正癸基-β-D-麦芽糖苷、正辛酰蔗糖、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、APO-10、APO-12、
Figure BDA0003439022770000302
O20、
Figure BDA0003439022770000303
35、Big CHAP、Deoxy、
Figure BDA0003439022770000304
58、
Figure BDA0003439022770000305
L23、
Figure BDA0003439022770000306
L4、
Figure BDA0003439022770000307
O10、Cremophor
Figure BDA0003439022770000308
CE、CE、DGEA、癸二醇单十二烷基醚非离子表面活性剂、癸基β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、癸基-β-D-1-硫代麦芽糖苷、癸基-β-D--麦芽糖苷、二甘醇、洋地黄皂苷、洋地黄毒苷、ELUGENTTM冲洗剂、乙二醇、GC固定相SynperonicPE/F68、GC固定相Synperonic PE/L64、
Figure BDA0003439022770000309
X-100、
Figure BDA00034390227700003010
C-100、
Figure BDA00034390227700003011
X-080、
Figure BDA00034390227700003012
X-100、Glucopone 600 CS UP、
Figure BDA00034390227700003013
六聚乙二醇单十二烷基醚、六聚乙二醇单十六烷基醚、六聚乙二醇单十四烷基醚、己基β-D-吡喃葡萄糖苷、
Figure BDA0003439022770000311
CA-630、
Figure BDA0003439022770000312
CA-720、IPTG Imbentin AGS/35、异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷、
Figure BDA0003439022770000313
EL、
Figure BDA0003439022770000314
OP 2000非离子、甲氧基聚乙二醇350，甲基6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡萄糖苷，N,N-双[3-(D-葡糖酰胺)丙基]脱氧胆胺，N,N-二甲基癸胺N-氧化物，N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、N-癸酰-N-甲基葡糖胺、N-月桂酰-L-丙氨酸、N-壬酰-N-甲基葡糖胺、N-辛酰-N-甲基葡糖胺、NP-40替代品，单十二烷基九乙二醇醚非离子表面活性剂，NonidetTMP 40、壬基β-D-吡喃葡萄糖苷、壬基β-D-麦芽糖苷、壬基-β-D-1-硫代麦芽糖苷、壬基苯基-聚乙二醇乙酸酯、八甘醇单癸基醚、八甘醇单十二醚、八甘醇单十六烷基醚、辛基β-D-1-硫代吡喃葡萄糖苷、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、辛基-α/β-葡萄糖苷、辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、
Figure BDA0003439022770000315
F-127、五乙二醇单癸基醚、
Figure BDA0003439022770000316
F-127、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、聚(乙二醇)甲基醚、C11至C14异烷基醚的聚氧乙烯(10)十三烷基醚混合物、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、SODOSILTMRM003、SODOSILTMRM 01、二甘醇十八烷基醚、皂苷、
Figure BDA0003439022770000317
20、
Figure BDA0003439022770000318
60、
Figure BDA0003439022770000319
65、
Figure BDA00034390227700003110
80、
Figure BDA00034390227700003111
85、蔗糖单癸酸酯、蔗糖单月桂酸酯、
Figure BDA00034390227700003112
F 108、
Figure BDA00034390227700003113
PE P105、TERGITOLTMTMN 10、TERGITOLTMTMN 6、TERGITOLTM溶液NP-40型、TERGITOLTMMIN FOAM、TERGITOLTM15-S-5型、TERGITOLTM15-S-7型、TERGITOLTM15-S-9型、TERGITOLTMNP-10型、TERGITOLTMNP-9型、
Figure BDA00034390227700003114
X-100、
Figure BDA00034390227700003115
X-114、
Figure BDA00034390227700003116
20、
Figure BDA00034390227700003117
40、
Figure BDA00034390227700003118
60、
Figure BDA00034390227700003119
65、
Figure BDA00034390227700003120
80、
Figure BDA00034390227700003121
85、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单十二烷基醚、四甘醇、四甲基氢氧化铵五水合物、
Figure BDA00034390227700003122
十三烷基β-D-麦芽糖苷、三乙二醇单癸基醚、TritonTMN-57、TritonTMN-60、TritonTMX-100、TritonTMX-102、TritonTMX-114、TritonTMX-165、TritonTMX-305、TritonTMX-405、TritonTMX-45、
Figure BDA00034390227700003123
20、
Figure BDA00034390227700003124
40、
Figure BDA00034390227700003125
60、
Figure BDA00034390227700003126
80、
Figure BDA00034390227700003127
85、Tyloxapol、十一烷基β-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、正庚基β-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、正辛基β-D-麦芽糖苷
4.两性离子型(两性型)
3-(4-叔丁基-1-吡啶基)-1-丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十四烷基氨基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十八烷基氨基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基辛基氨基)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基棕榈基氨基)丙磺酸盐,3-(1-吡啶基)-1-丙磺酸盐、3-(苄基二甲基氨基)丙磺酸盐,3-(癸基二甲基氨基)丙磺酸内盐、3-[N,N-二甲基(3)-棕榈酰氨基丙基)氨]-丙磺酸盐、来自Glycine max(大豆)的L-α-溶血磷脂酰胆碱、ASB-14、两性离子酰胺磺基甜菜碱。ASB-16两性离子酰胺磺基甜菜碱冲洗剂、ASB-C80、
Figure BDA00034390227700003128
C7BzO、CHAPS、CHAPSO、DDMAB、二甲基乙基铵基丙烷、
Figure BDA00034390227700003129
BB冲洗剂、米替福新、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐，O-(癸基磷酰基)胆碱、聚(马来酸酐-alt-1-癸烯)、3-(二甲氨基)-1-丙胺衍生物，聚(马来酸酐-alt-1-十四烯)、3-(二甲氨基)-1-丙胺衍生物、2,3-二巯基丙烷磺酸钠、枯草芽孢杆菌的表面活性素、
Figure BDA00034390227700003130
3-08、
Figure BDA00034390227700003131
3-10、
Figure BDA00034390227700003132
3-12、
Figure BDA00034390227700003133
3-14、
Figure BDA00034390227700003134
3-16。
以下是可用于透化细胞膜的有机溶剂的列表：
烃：正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、正癸烷、2,2,4-三甲基戊烷、环己烷、苯、甲苯、乙苯、二甲苯(混合异构体)、C9芳族化合物、四氢化葵
醇：甲醇、l乙醇、l正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、正戊醇、异戊醇、环己醇、正辛醇、乙二醇、二甘醇、1,2-丙二醇
二醇醚：丙二醇甲基醚、乙二醇甲基醚、乙二醇乙基醚、乙二醇单丁基醚
含氯溶剂：二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、1,1,1-三氯乙烷、三氯乙烯、全氯乙烯、一氯苯
酮类：丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、环己酮、n-甲基-2-吡咯烷酮、苯乙酮
醚类：二乙醚、二异丙醚、二丁醚、甲基叔丁基醚、1,4-二氧六环、四氢呋喃
酯类：醋酸甲酯、醋酸乙酯、醋酸异丙酯、醋酸正丁酯、醋酸溶纤剂
混杂溶剂：二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、环丁砜、二硫化碳、乙酸、苯胺、硝基苯、吗啉、吡啶、2-硝基丙烷、乙腈、糠醛、苯酚、水
用于细胞内递送的纳米颗粒
1.无机纳米材料：金、银、磷酸钙、氧化石墨烯、量子点和磁性纳米材料如氧化铁。
氧化石墨烯
2.碳纳米管(CNTs)：多壁碳纳米管(MWNT)、单壁碳纳米管(SWNT)、聚乙烯亚胺(PEI)-MWNT、PEI-胆固醇-MWNT、琥珀酸化PEI(PEI-SA)-CNT、壳聚糖-叶酸纳米颗粒(CS-FANP)、官能化羧基化MWNT(fCNT)，
3.蛋白和肽纳米材料
4.聚合物基纳米材料
5.脂质纳米材料，参见脂质体
6.脂质体
用作脂质体原料的各种脂质和两亲性物质
Figure BDA0003439022770000321
脂质体类型：
脂质体、古细菌脂质体(Archaeosome)、泡囊(Niosome)、Novasome、Cryptosome、乳脂体(Emulsome)、囊泡体(Vesosome)
7.聚乙二醇(PEG)
8.聚乙烯亚胺(PEI)
9.天然聚合物基纳米材料
E.本发明在疾病和病症的诊断中的应用示例
E-1.与感染性疾病相关的疾病诊断，包括细菌、病毒、真菌和寄生虫感染
本发明的装置和方法可用于诊断疾病，包括鲍曼不动杆菌、不动杆菌感染、戈氏放线菌、以色列放线菌、放线菌病、艾滋病、甲病毒、阿米巴病、阿米巴痢疾、鱼腥藻、贫血、无形体属、无形体病，霉菌孢子包括黄曲霉(Aspergillius Flavis)、炭疽、炭疽病、丝囊藻属(Aphanizomenon)、溶血隐秘菌感染、沙粒病毒、阿根廷出血热、砷中毒、蛔虫症、蛔虫病、蛔虫、青霉(Aspergillius glaucus)、黑曲霉(Aspergillius niger)、曲霉病、曲霉属、星状病毒科、巴贝虫病、星状病毒感染、禽流感、炭疽杆菌、巨大芽孢杆菌属(Veg)、巨大芽孢杆菌属(孢子)、副伤寒芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、细菌性阴道病(BV)、噬菌体(大肠杆菌)、拟杆菌属感染、蓝绿藻、玻利维亚出血热、肉毒杆菌毒素、肉毒中毒、巴西出血热、布鲁氏菌属、布鲁氏菌病、流行性淋巴腺鼠疫、布尼亚病毒科、鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布路里溃疡分枝杆菌属、杯状病毒科、弯曲杆菌病、念珠菌病(念珠菌病；鹅口疮)、蓖麻、恰加斯病、衣原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、肺炎衣原体感染、霍乱、肉毒梭菌、艰难梭菌感染、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌(破伤风/牙关紧闭症)、大肠菌群、贝氏柯克斯体、克里米亚-刚果出血热、隐孢子虫、细小隐孢子虫、蓝藻毒素、拟柱孢藻、Cylindrospermopis、登革热、白喉、大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌、东方马脑炎、伤寒沙门氏菌、埃博拉病毒、溶组织阿米巴、ε毒素、大肠杆菌O157:H7、氟中毒、土拉弗朗西斯菌、肠兰伯氏鞭毛虫、鼻疽、淋病、瓜纳里托病毒、H1N1、H5N1、汉坦病毒、亨德拉病毒、肝炎、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、HIV、钩虫病中耳炎、人猴痘、流行性感冒(流感)、日本脑炎、胡宁病毒、拉沙热、拉沙病毒、军团病、利什曼病、Lenionella、麻风、钩端螺旋体Canicoal感染(黄疸)、钩端螺旋体病、淋巴丝虫病、马丘波病毒、疟疾、马尔堡出血热、马尔堡病毒、麻疹、类鼻疽、脑膜炎、脑膜炎球菌病、高铁血红蛋白血症、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)闪白色球菌、球状微球菌、微囊藻毒素、总状毛霉A、总状毛霉B、结核分枝杆菌(肺结核)、奈瑟菌属、尼帕病毒、节球藻属、念珠藻属、盘尾丝虫病、乳卵孢子菌、颤藻属、副伤寒肠热病、指状青霉、扩展青霉、娄地青霉、百日咳、Phtomomnas假单胞菌、鼠疫、脊髓灰质炎、脊髓灰质炎病毒-脊髓灰质炎、丙酸丙酸盐杆菌、荧光假单胞菌、鹦鹉热、Q热病、呼吸道感染、Rhisophus nigricans、蓖麻毒素、蓖麻、普氏立克次体、里夫特裂谷热、癣、轮状病毒、清风藤属、肠炎沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(肠炎热)、沙门氏菌种、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌(伤寒热)、沙门氏菌病、藤黄八叠球菌、疥疮、Schistomsomiasis、血吸虫病、粘质沙雷氏菌、志贺氏杆菌、痢疾志贺菌(痢疾)、弗氏志贺氏菌—(痢疾)、副痢疾志贺氏菌、志贺氏菌病、天花、红色螺菌、葡萄球菌肠毒素B、白色葡萄球菌(葡萄球菌)、金黄色葡萄球菌(葡萄球菌)、溶血性链球菌、乳酸链球菌、嗜血链球菌、草绿色链球菌、猪流感、梅毒、癣、烟草花叶病、沙眼、鞭虫病、锥虫病、肺结核、土拉菌病、伤寒、斑疹伤寒、溃疡杯状病毒感染(诺如病毒和札幌病毒)、Umezaka、大天花、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、霍乱弧菌、病毒性脑炎、病毒性出血热、黄热病、鼠疫耶尔森菌和鼠疫耶尔森菌。
E-2.癌症诊断
本发明的装置和方法可用于诊断癌症，包括但不限于：
急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、青少年，肾上腺皮质癌、儿童肾上腺皮质癌、AIDS-相关癌症、卡波西肉瘤(软组织肉瘤)、AIDS-相关淋巴瘤(淋巴瘤)、原发性CNS淋巴瘤(淋巴瘤)、肛门癌、胃肠类癌肿瘤、星形细胞瘤、儿童(脑癌)、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、儿童，中枢神经系统(脑癌)；
皮肤基底细胞癌-皮肤癌、胆管癌、膀胱癌、儿童膀胱癌、骨癌(包括尤文肉瘤和骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑肿瘤、乳腺癌、儿童乳腺癌、支气管肿瘤、儿童，伯基特淋巴瘤-非霍奇金淋巴瘤；
类癌肿瘤(胃肠)、儿童类癌肿瘤、原发性未知癌、儿童原发性未知癌、心脏(心脏)肿瘤、中枢神经系统肿瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、儿童(脑癌)、胚胎性肿瘤、儿童(脑癌)、生殖细胞肿瘤、儿童(脑癌)、原发性CNS淋巴瘤、宫颈癌、儿童宫颈癌、儿童癌症、儿童癌症、不常见、胆管癌-胆管癌、脊索瘤、儿童-儿童不常见癌症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、儿童结直肠癌、颅咽管瘤、儿童(脑癌)、皮肤T细胞淋巴瘤-淋巴瘤(真菌病和塞扎里综合征)；
原位导管癌(DCIS)-乳腺癌、
胚胎性肿瘤、中枢神经系统、儿童(脑癌)、子宫内膜癌(子宫癌)、室管膜瘤、儿童(脑癌)、食管癌、儿童食管癌；鼻腔神经胶质瘤(头颈癌)；尤文肉瘤(骨癌)；颅外生殖细胞肿瘤，儿童；性腺外生殖细胞肿瘤；眼癌；儿童期眼内黑色素瘤；眼内黑色素瘤；成视网膜细胞瘤；
输卵管癌；骨纤维组织细胞瘤，恶性和骨肉瘤；
胆囊癌；胃(胃)癌；儿童胃(胃)癌；胃肠类癌肿瘤；胃肠道间质瘤(GIST)(软组织肉瘤)；儿童胃肠道间质瘤；生殖细胞肿瘤；儿童中枢神经系统生殖细胞肿瘤(脑癌)；儿童颅外生殖细胞肿瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；睾丸癌；妊娠滋养细胞疾病；
毛细胞白血病；头颈癌；心脏肿瘤，儿童；肝细胞(肝)癌；组织细胞增多症，朗格汉斯细胞；霍奇金淋巴瘤；下咽癌(头颈癌)；
眼内黑色素瘤；儿童期眼内黑色素瘤；胰岛细胞肿瘤，胰腺神经内分泌肿瘤；卡波西肉瘤(软组织肉瘤)；肾(肾细胞)癌；朗格汉斯细胞组织细胞增多症；喉癌(头颈癌)；白血病；唇和口腔癌(头颈癌)；肝癌；肺癌(非小细胞和小细胞)；儿童肺癌；淋巴瘤；
男性乳腺癌；骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤；黑色素瘤；儿童黑色素瘤；黑色素瘤，眼内(眼)；儿童期眼内黑色素瘤；默克尔细胞癌(皮肤癌)；间皮瘤，恶性；儿童间皮瘤；转移性癌症；转移性鳞状头颈癌伴隐匿性原发性(头颈癌)；具有NUT基因改变的中线癌；口癌(头颈癌)；多发性内分泌瘤形成综合征；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿病(淋巴瘤)；骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤；慢性髓性白血病(CML)；急性髓性白血病(AML)；慢性骨髓增生性肿瘤；
鼻腔和鼻旁窦癌(头颈癌)；鼻咽癌(头颈癌)；成神经细胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非小细胞肺癌；
口腔癌、唇和口腔癌以及口咽癌(头颈癌)；骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；儿童卵巢癌；胰腺癌；儿童胰腺癌；胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)；乳头状瘤病(儿童喉部)；副神经节瘤；儿童副神经节瘤；鼻旁窦和鼻腔癌(头颈癌)；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽癌(头颈癌)；嗜铬细胞瘤；儿童嗜铬细胞瘤；垂体肿瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤；原发性腹膜癌；前列腺癌；
直肠癌；复发性癌症；肾细胞(肾)癌；成视网膜细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童期(软组织肉瘤)；唾液腺癌(头颈癌)；肉瘤；儿童横纹肌肉瘤(软组织肉瘤)；儿童血管肿瘤(软组织肉瘤)；尤文肉瘤(骨癌)；卡波西肉瘤(软组织肉瘤)；骨肉瘤(骨癌)；软组织肉瘤；子宫肉瘤；塞扎里综合征(淋巴瘤)；皮肤癌；儿童皮肤癌；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；皮肤鳞状细胞癌；原发性隐匿性转移性鳞状颈癌(头颈癌)；胃(胃)癌；儿童胃(胃)癌；
T细胞淋巴瘤、皮肤-淋巴瘤(蕈样肉芽肿病和塞扎里综合征)；睾丸癌；儿童睾丸癌；喉癌(头颈癌)；鼻咽癌；口咽癌；下咽癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管移行细胞癌(肾(肾细胞)癌)；原发性未知，癌症；原发性未知的儿童癌症；儿童不常见癌症；输尿管和肾盂，移行细胞癌(肾(肾细胞)癌；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；儿童期阴道癌；血管肿瘤(软组织肉瘤)；外阴癌；Wilms肿瘤和其他儿童肾脏肿瘤。
本公开的一个方面是提供用于通过利用可彼此移动的一对板来操作组织样品和/或小体积的染色液，减小样品/染色液厚度，在样品和染色试剂之间形成接触等而容易且快速地进行组织染色的装置和方法，所有这些都对组织染色具有有益的效果(简化和加速染色、免洗且节省试剂)。
本公开的另一个方面是通过在一个或两个板上涂覆染色试剂来提供容易且快速的组织染色，染色试剂在接触液体样品和/或染色液时溶解并扩散在样品和/或染色液中，从而无需专业培训即可容易地处理染色试剂。
本公开的另一个方面是通过利用具有均匀高度的板和多个间隔件以迫使样品和/或染色液形成均匀厚度的薄膜来确保样品与染色试剂的均匀接触，从而导致染色试剂在样品上的大的横向区域上具有相同的扩散距离。
本公开的另一方面是提供通过将用于染色的一对板与适于采集和分析由板染色的组织样品的图像的移动通信装置组合而容易且快速地进行组织染色和成像的系统。可选地，移动通信被配置为将成像数据和/或分析结果发送到远程位置用于存储和/或由专业人员或软件进一步分析和解释。
本公开的另一方面是提供用于免疫组织化学的装置，系统和方法。
本公开的另一方面是提供用于H&E染色，特殊染色和/或细胞活力染色的装置，系统和方法。
本公开的另一方面是提供用于原位杂交的装置，系统和方法。
本公开的另一方面是提供用于染色生物材料(例如用于细胞或组织的染色、核酸染色、H&E染色、特殊染色和/或细胞活力染色)的装置、系统和方法等，不进行冲洗，并且在一些实施例中，是在单个步骤中。
在细胞学/细胞病理学筛选和诊断中使用CROF卡
本发明的一些实施例涉及使用细胞学快速且简单地收集和分析一样品。
根据本发明，使用细胞学收集和分析样品的方法包括：
具有相对于彼此可移动的第一板和第二板；
从受试对象(例如人或动物)收集生物样品(即活组织检查)；
将样品的一部分沉积在第一板的内表面上；
将染色溶液沉积在(i)第一板的表面上和/或样品的顶部上，(ii)第二板的内表面上，或(iii)两者上，
将两个板合在一起形成闭合构造，其中第一和第二板的两个内表面彼此面对，并且板之间的间隔由板之间的间隔件调节，并且染色溶液的至少一部分位于样品和第二板的内表面之间；
具有成像器；以及
对样品成像用于分析。
在一些实施例中，通过成像的分析是细胞分析。
在一些实施例中，间隔件固定在一个或两个板上。在一些实施例中，间隔件在染色溶液的内部。
在一些实施例中，样品在滴到板上之前与染色溶液混合。
在一些实施例中，染色溶液包括溶液中的染色剂(染色细胞/组织的物质)。在一些实施例中，染色溶液不包括在溶液中的染色染料，但被配置为将涂覆在板之一上的染色剂运输到细胞/组织中。在一些实施例中，染色溶液包括在溶液中的染色剂(染色细胞/组织的物质)，并且被配置为将涂覆在板之一上的染色剂运输到细胞/组织中。
在一些实施例中，间隔件高度被配置为使得染色的细胞和/或组织可被成像装置看见而不洗掉第二板和样品之间的染色溶液。
在一些实施例中，该间隔件高度被配置为用于使这些染色的细胞和/或组织在这些板达到闭合构造之后在不打开这些板的情况下通过成像装置可见。
在一些实施例中，在不洗掉第二板和样品之间的染色溶液的情况下将样品染色，并且在将板闭合成闭合构造之后通过成像器成像，并且在不冲洗的情况下通过成像器成像。
在一些实施例中，在不洗掉第二板和样品之间的染色溶液的情况下将样品染色，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或更少，60秒或更少，120秒或更少，300秒或更少，600秒或更少，或这两者之间的范围内由成像器成像。
在一些优选的实施例中，在不洗掉第二板和样品之间的染色溶液的情况下将样品染色，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或更少，60秒或更少，120秒或更少，或在这两者之间的范围内由成像器成像。
在一些优选的实施例中，在不洗掉第二板和样品之间的染色溶液的情况下将样品染色，并且在将板闭合成闭合构造之后，在30秒或更短，60秒或更短，或在这两者之间的范围内通过成像器成像。
在一些实施例中，间隔件高度是0.2μm(微米)或更小、0.5μm或更小、1μm或更小、3μm或更小、5μm或更小、10μm或更小、20μm或更小、30μm或更小、40μm或更小、50μm或更小，或在这两者之间的范围。
在一些优选实施例中，间隔件高度为3μm或更小。在一些优选实施例中，10μm或更小。在一些优选实施例中，20μm或更小。在一些优选实施例中，30μm或更小。
在一些优选的实施例中，在板处于闭合构造后，染色溶液具有等于或小于亚噪音厚度的厚度。
术语“亚噪声厚度”(SNT)是指样品或染色溶液的厚度，其比样品或染色溶液中的噪声低于来自特异性结合的光学标记的信号的厚度更薄，使得光学标记对成像器可见。使染色溶液少于SNT，这将消除洗去未结合的光学标记的必要。
在一些实施例中，第一板和第二板通过铰链连接。
在一些实施例中，染色溶液的体积为2uL(微升)或更小、2uL或更小、5uL或更小、10uL或更小、15uL或更小、20uL或更小、30uL或更小、50uL或更小、100uL或更小，或这两者之间的范围。
在一些优选的实施例中，染色溶液的体积为2uL(微升)或或更小、2uL或更小、5uL或更小、10uL或更小、15uL或更小、20uL或更小、30uL或更小，或在这两者之间的范围。
在一些优选的实施例中，染色溶液的体积为2uL(微升)或更小、2uL或更小、5uL或更小、10uL或更小、15uL或更小，或在这两者之间的范围。
口腔癌诊断的示例。根据本发明，样品是通过拭子从受试对象口中脱落的上皮细胞。口腔癌诊断可以通过测量上皮细胞及其细胞核的大小和/或面积，和/或通过测量它们的大小和/或比例来进行。例如，癌上皮细胞通常具有大于正常上皮细胞的细胞核面积(和/或大小)与面积之比。
从非吸烟者中筛选吸烟者的示例。根据本发明，样品是通过拭子从受试对象口中脱落的上皮细胞。口腔癌诊断可以通过测量上皮细胞及其细胞核的大小和/或面积，和/或通过测量它们的大小和/或比例来进行。吸烟者具有的上皮细胞，与非吸烟者相比，该上皮细胞通常具有不同的细胞核面积(和/或大小)与大于正常上皮细胞面积的比率。
本发明的一个应用是在细胞病理学中。细胞病理学通常用于在细胞水平上使用从各个身体部位移除的游离细胞或组织碎片来研究疾病。它已经成为用于筛选和诊断癌症和一些感染性疾病或其他炎性病症的主要工具。例如，细胞病理学的常见应用是巴氏涂片，一种用于检测可能导致宫颈癌的癌前宫颈病变的筛选工具。
本发明在细胞学/细胞病理学中的一些示例是基于苏木精和曙红(H&E)染色的载玻片的诊断，以通过免疫细胞化学(ICC)和原位杂交(ISH)对肿瘤进行当前的常规评价，以确认肿瘤组织发生，亚型，并提供影响癌症预后和治疗的附加信息。
在一些实施例中，使用几种方式从受试对象的身体部位移除活检：针、内窥镜检查和切除或切口手术。
本发明的一个方面是用于以简单的方式执行活检处理和染色的装置和方法。与制备样品，在载玻片上取样，随后在载玻片上染色活检的标准细胞病理学不同，示例性实施例的优势是将三个步骤变成单个步骤，详细地，将活检材料的液滴，切片或阻断直接放置在卡保持器的下面，保持器可以是常规载玻片、微米高度室或任何类型保持器。将X-板柱侧向下放置，并将X-板与染色溶液一起轻轻按压到活检样品上。将X-板压到样品上能够将大量样品铺展成单层，其厚度以柱高(10μm)为前缀。具有两个主要特征：1)X-板上的预定微米(5μm、10μm或更高)高度柱，用于将活检样品均匀地处理/铺展成单细胞单层而不改变细胞或组织的形态；2)预定微体积室的染色时间显著快到小于1分钟。
使用微量体积实施例用于细胞病理学1)样品处理和2)染色。
例如，在某些实施例中，QMAX装置用于将活检材料加工(按压)成单层。活检材料可收集自：
取样方法。在一些实施例中，通过使用以下方法中的一种或组合来移除活检样品：针吸、内窥镜检查和切除或切口手术。
Figure BDA0003439022770000381
针吸活检来自皮肤病变、淋巴结、甲状腺、乳腺、肺和体腔
Figure BDA0003439022770000382
组织涂片来自口腔刷材料、宫颈(巴氏涂片)、体液：尿液、痰液(痰)、脊髓液、胸膜液、心包液、腹水。
Figure BDA0003439022770000383
内窥镜活组织检查来自
·胃肠道：食管、胃和十二指肠(食管胃十二指肠镜检查)、小肠(肠镜检查)、大肠/结肠(结肠镜检查、乙状结肠镜检查)、胆管、直肠(直肠镜检查)和肛门(肛门镜检查)；
·呼吸道：鼻(鼻镜)、下呼吸道(纤维支气管镜)
·耳：耳镜检查
·尿道：膀胱镜检查
·女性生殖道(阴道镜检查)：子宫颈(阴道镜检查)、子宫(子宫镜检查)、输卵管(输卵管镜检查)。
·通过一个小切口：腹腔或盆腔(腹腔镜)、关节内部(关节镜)、胸部器官(胸腔镜和纵隔镜)。
Figure BDA0003439022770000384
手术活检来自切除或切开组织或肿块
Figure BDA0003439022770000385
在某些实施例中，QMAX装置用于染色任何分子、细胞器、细胞、细胞外或细胞器结构。
Figure BDA0003439022770000386
生物分子包括，但不限于：蛋白、肽、氨基酸(硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、肉碱、鸟氨酸、GABA和牛磺酸)、脂质(糖脂、磷脂、甾醇、花生四烯酸、前列腺素、白三烯)、脂肪酸、碳水化合物(单糖、二糖、多糖)、核酸(核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸)、任何分解代谢物、任何代谢物、次级代谢物、维生素、活性氧/氮物质、矿物质、多酚大分子和其它小分子等。
Figure BDA0003439022770000387
生物分子的修饰/反应包括，但不限于：磷酸化、甲基化、乙酰化、脂化、硫醇反应、胺反应、羧酸盐反应、羟基反应、醛和酮反应等。
Figure BDA0003439022770000388
细胞器/亚细胞结构包括，但不限于：细胞核、核糖体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体、线粒体、溶酶体、细胞膜、核内体、外泌体、细胞骨架。
Figure BDA0003439022770000389
具有任何生理/病理状况的细胞类型包括但不限于：在肿瘤内(可以源自任何器官的任何上皮和血管内皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞)、神经元细胞、脂细胞、基质细胞、软骨细胞、视网膜细胞、胶质细胞、平滑肌细胞、任何类型的干细胞、任何类型的胚胎细胞、任何类型的内分泌细胞、任何类型的外分泌细胞、任何类型的免疫细胞、树突细胞、骨髓细胞、造血细胞、淋巴细胞、正常细胞、良性细胞、恶化前细胞、恶性细胞、转化细胞、静息细胞、增殖细胞、凋亡细胞、衰老细胞、有丝分裂细胞、炎性细胞、增生细胞、肥大细胞、萎缩细胞、增生细胞、异型增生细胞、化生细胞等。
Figure BDA0003439022770000391
结缔组织/细胞外结构包括但不限于：疏松的普通结缔组织、脂肪组织、血液和血液形成组织、致密的普通结缔组织、软骨、骨、任何类型的细胞外囊泡、细胞外基质、血小板等。
在一些实施例中，染色的材料和方法包括：
a.染料染色
ο巴氏染色：哈里斯苏木精；橙色G6；EA50(曙红Y，淡绿色SF)
οMay-Grünwald Giemsa染色(曙红G，亚甲蓝)
οZiehl-Neelsen染色
ο改性的Ziehl Neelson(对于耐酸杆菌)、革兰氏染色(细菌)、粘蛋白胭脂红(粘蛋白)、PAS(对于糖原、真菌壁、脂褐质等)、油红O(脂质)、Perl's普鲁士蓝(铁)、改性的福彻特试验(胆红素)，
ο用于生物分子、细胞器、细胞和生物结构的任何荧光/非荧光染料，例如核酸染料：花青染料(PicoGreen、OliGreen and RiboGreen、SYBR Gold、SYBR Green I andSYBRGreen II、CyQUANT GR染料)、花青二聚体染料(SYTOX、POPO-1、TOTO-1、YOYO-1、BOBO-1、JOJO-1、POPO-3、LOLO-1、TOTO-3、PO-PRO-1、JO-PRO-1、YO-PRO-1、PO-PRO-3、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5)、胺反应性花青染料(SYBR 101染料)、菲啶和吖啶(溴化乙锭(EB)和乙锭同源二聚体-1、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)、碘化己锭、二氢乙锭、乙锭同源二聚体-1、乙锭同源二聚体-2、单叠氮乙锭、吖啶同源二聚体双-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)精胺、ACMA)、吲哚和咪唑(Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、DAPI)、7-氨基放线菌素D和放线菌素D、羟芪巴脒、LDS 751、Nissl染色剂
b.IHC/IF染色
ο直接方法、间接方法、PAP方法(过氧化物酶抗过氧化物酶方法)、抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)方法、标记链霉亲和素-生物素(LSAB)方法、聚合方法(基于葡聚糖聚合物技术的预想系统、ImmPRESS聚合报告酶染色系统)、CAS系统(来自DAKO)、CSA II-无生物素酪胺信号放大系统
c.ISH/FISH
ο方法：直接和间接方法
ο探针：双链DNA(dsDNA)探针、单链DNA(ssDNA)探针、RNA探针(riboprobe)、
合成寡核苷酸标记探针：例如，DIG(洋地黄毒苷)、生物素、荧光团(FITC、alexa、酪胺等)
d.其他材料
在本研究中使用吖啶橙(50μg/ml)和苏木精染色溶液(来自VectorLaboratories)。
样品保持器。样品保持器包括具有间隔件/柱的X-板，间隔件/柱具有基本上均匀的高度和几乎均匀的横截面，彼此隔开一致的限定距离。
例如，X-板是175μm厚的PMMA，具有30×40μm柱尺寸，10μm柱高度和80μm间距的柱阵列，或包含X-板的iMOST Q-卡，该X-板是175μm厚的PMMA，具有40μm直径的柱尺寸，10μm柱高度和120μm间距的柱阵列。

Claims (21)

1.一种染色组织的方法，包括：
(a)在底板上放置待染色的组织切片；
(b)提供在其表面上具有100μm或更小的均匀高度的间隔件的柔性顶板；
(c)在所述组织表面上或在所述柔性顶板上沉积染色溶液；以及
(d)将所述样品和所述染色溶液夹在所述柔性顶板和所述底板之间并将它们压在一起；
其中所述顶部柔性板的所述柔性和所述间隔件之间的所述间隔被选择成使得所述顶部柔性板适形所述组织的所述表面。
2.一种在不冲洗的情况下快速分析样品的病理学或细胞学的方法，包括：
(e)提供第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域；
(f)提供染色所述靶组织或细胞的染色溶液；
(g)将所述样品和所述染色溶液夹在所述第一和所述第二板之间以形成厚度为200μm或更小的薄层；以及
(h)在步骤(c)之后且在不冲洗所述样品以从所述样品去除所述染色溶液的情况下，对所述薄层成像以观察所述染色的靶组织或细胞；
其中选择所述薄层的所述厚度和所述染色溶液在所述薄层中的所述浓度以在所述成像期间使得，所述薄层中的所述染色的靶组织或细胞可与薄层的所述其余部分区分开。
3.一种用于分析不冲洗的样品的病理学的试剂盒，包括：
(a)第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域；以及
(b)染色所述靶组织或细胞的染色溶液；
其中所述第一和所述第二板将所述样品和所述染色溶液夹在厚度由所述两个样品接触区域之间的所述距离调节的薄层中；
其中所述薄层在不冲洗所述样品以从所述样品去除染色溶液的情况下由成像器成像；以及
其中选择所述两个样品接触区域之间的所述距离和所述薄层中所述染色溶液的所述浓度以在所述成像期间使得，所述薄层中的所述染色的靶组织或细胞可与薄层的所述其余部分区分开。
4.一种用于分析不冲洗的样品的病理学的设备，包括：
(a)第一板和第二板；每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有靶组织或细胞的样品的样品接触区域；
(b)染色所述靶组织或细胞的染色溶液；以及
(c)成像器
其中所述第一和所述第二板将样品和染色溶液夹在厚度由所述两个样品接触区域之间的所述距离调节的薄层中；
其中所述成像器在不冲洗所述样品以从所述样品去除染色溶液的情况下对所述薄层成像；以及
其中选择所述两个样品接触区域之间的所述距离和所述薄层中所述染色溶液的所述浓度以在所述成像期间使得，所述薄层中的所述染色的靶组织或细胞可与薄层的所述其余部分区分开。
5.一种快速均质检测样品中细胞膜内分析物的方法包括：
(a)提供第一板和第二板，每个在其表面上具有用于接触含有或疑似含有细胞内分析物的细胞的样品的样品接触区域，
(b)提供检测探针，所述检测探针(i)特异性结合所述分析物并且(ii)能够发射一定波长的光；
(c)提供使所述细胞的膜对所述检测探针可渗透的透化试剂，其中在没有所述透化试剂的情况下，所述检测探针不能渗透到所述细胞中；
(d)将所述样品、所述检测探针和所述透化试剂夹在所述第一板和第二板之间以形成厚度为200微米(μm)或更小的薄层；以及
(e)在步骤(d)之后且不冲洗所述样品以去除未结合的检测探针的情况下，对所述薄层成像以检测具有结合至所述检测探针的所述分析物的所述细胞；
其中选择所述薄层的所述厚度和所述薄层中所述检测探针的所述浓度以使得，在所述薄层中，在步骤(e)的所述成像过程中，具有与所述细胞内所述分析物结合的所述检测探针的所述位置的所述信号，可与不具有所述细胞的所述位置的信号区分开。
6.根据权利要求4所述的方法，还包括定量(i)所述细胞内含有分析物的所述细胞和(ii)所述细胞内含有分析物的所述细胞的步骤。
7.根据权利要求4所述的方法，还包括定量(i)所述细胞内含有分析物的所述细胞和(ii)所述细胞内含有分析物的所述细胞的步骤，以及定量所述细胞内含有分析物的所述细胞相对于所述细胞的所述总数的百分比的步骤。
8.根据权利要求4所述的方法，其中由所述检测探针发射的所述光是荧光，并且其中所述方法还包括(i)测量含有与检测探针结合的所述分析物的所述细胞的所述荧光强度，(ii)测量含有与所述检测探针结合的所述分析物的所述细胞的数目，以及(iii)通过将单位面积中含有结合至所述检测探针的所述分析物的细胞的总数与含有结合至所述检测探针的所述分析物的所述细胞的所述荧光强度的所述平均值相乘来计算总荧光强度。
9.一种快速制备和染色具有比所述最终厚度更厚的初始厚度的组织的方法，包括：
(a)提供相对于彼此可移动的第一板和第二板；其中所述第二板在其表面上具有均匀高度的间隔件；
(b)将厚度比所述间隔件高度厚的组织样品放置在所述第一板上；
(c)将染色溶液沉积在所述第一板上或所述组织上，其中所述染色溶液将所述组织样品染色；
(d)将所述第一板放置在所述组织样品的顶部上并且将两个板压在一起以使所述组织样品形成薄层，其中所述组织样品层的所述最终厚度小于所述组织样品的所述初始厚度并且由所述间隔件和所述两个板调节。
10.一种改善组织表面成像的方法，包括：
(a)提供柔性板；
(b)提供均匀高度的间隔件，
(c)将所述间隔件和所述柔性板放置在待成像的组织的顶部上，其中所述间隔件的所述高度调节所述板和所述组织之间的距离，并且其中所述间隔件高度为50μm(微米)或更小。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述均匀高度在2μm到20μm之间选择。
12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述均匀高度为10μm。
13.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中，所述第一和第二板可相对于彼此移动成不同的构造，包括开放构造和闭合构造，其中所述一个或多个板在其表面上具有均匀高度的间隔件；
其中在开放构造中，所述两个板完全或部分地分隔开，所述板之间的所述间隔不由所述间隔件调节；以及
其中在闭合构造中，所述薄层的所述厚度由所述板和所述间隔件调节，并且所述样品表面与所述第二板表面之间的平均距离等于或小于200μm。
14.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，还包括调节所述第一板和所述第二板之间的所述距离的所述间隔件。
15.在一些实施例中，其中，步骤(e)的所述成像在步骤(d)的夹入之后300秒或更短进行。
16.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中选择所述薄层的所述厚度以使所述薄层中的一些所述细胞与其它细胞没有重叠或显著重叠。
17.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中所述透化试剂被涂覆在所述一个板或所述多个板的表面上。
18.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中在将所述样品和所述透化试剂夹入所述两个板之间之前将所述透化试剂引入所述样品。
19.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中所述板还具有涂覆在其表面上的干染色剂，并且其中所述染色溶液是将所述干染色剂转移到所述样品中的转移液体。
20.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中，在将所述样品和所述透化试剂夹入所述两个板之间之前将所述染色溶液引入所述样品。
21.根据前述权利要求中任一项所述的装置、试剂盒和方法，其中，所述样品包括选自由以下组成的组的体液：羊水、房水、玻璃体液、血液、母乳、脑脊液(CSF)、耳垢(耳屎)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、粪便、气息、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、风湿液、唾液、呼出气冷凝物、皮脂、精液、痰、汗液、滑液、眼泪、呕吐物、尿液及其任何组合。
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