CN114324885A - 一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用 - Google Patents
一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114324885A CN114324885A CN202111162835.3A CN202111162835A CN114324885A CN 114324885 A CN114324885 A CN 114324885A CN 202111162835 A CN202111162835 A CN 202111162835A CN 114324885 A CN114324885 A CN 114324885A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- serum
- aras
- patient
- antibody
- retinal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 84
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000003324 anti-retinal effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 206010071578 autoimmune retinopathy Diseases 0.000 claims abstract description 53
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 41
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 35
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 35
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 11
- 102100024441 Dihydropyrimidinase-related protein 5 Human genes 0.000 claims description 10
- 108050002654 Dihydropyrimidinase-related protein 5 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 101710167917 Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 101000839464 Leishmania braziliensis Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 claims description 9
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 claims description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 9
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000018210 Recoverin Human genes 0.000 claims description 8
- 108010076570 Recoverin Proteins 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 6
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 3
- 101710137010 Retinol-binding protein 3 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038247 Retinol-binding protein 3 Human genes 0.000 claims description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 241000287523 Ara Species 0.000 claims 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 8
- 208000004422 Ocular Paraneoplastic Syndromes Diseases 0.000 description 9
- 208000014361 cancer-associated retinopathy Diseases 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 5
- 229960002117 triamcinolone acetonide Drugs 0.000 description 4
- YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N triamcinolone acetonide Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H]3OC(C)(C)O[C@@]3(C(=O)CO)[C@@]1(C)C[C@@H]2O YNDXUCZADRHECN-JNQJZLCISA-N 0.000 description 4
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 3
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 3
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 3
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 3
- 229940083224 ozurdex Drugs 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 102100022135 S-arrestin Human genes 0.000 description 2
- 101710117586 S-arrestin Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000024031 melanoma associated retinopathy Diseases 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004378 blood-retinal barrier Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000004452 decreased vision Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 208000001749 optic atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法,包括下述步骤:(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血,离心,得到患者血清;(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物,采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数,即ARAs数量;(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物,采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的ARAs种类;(4)采用免疫荧光法检测患者血清中的ARAs,将其定位于正常人视网膜组织切片中,得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位;(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果,确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位,建立临床疑似AIR患者的血清学指标。本发明的检测方法灵敏度和特异性高,适用于临床早期检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用。
背景技术
自身免疫性视网膜病变(autoimmune retinopathy,AIR)是一类由免疫炎症介导的可致盲性眼病,包括副肿瘤病变(paraneoplastic,p-AIR)和非副肿瘤性病变(non-paraneoplastic,np-AIR)两大类型。AIR临床表现包括双眼无痛性亚急性视力丢失,ERG异常,血清中存在循环抗视网膜抗体(anti-retinal antibodies,ARAs)等。p-AIR包括癌症相关性视网膜病变(cancer-associated retinopathy,CAR)、黑色素瘤相关性视网膜病变melanoma-associated retinopathy,MAR)。某些良性肿瘤也会引起CAR样改变。np-AIR患者系统检查未发现肿瘤存在,但常伴有自身免疫性疾病。目前观点认为,AIR的发病机制与血清中存在ARAs密切相关。由于肿瘤或病毒、细菌等外界因素侵入,机体产生与视网膜某组织细胞结构相似的抗体释放入血清,破坏血视网膜屏障,与视网膜特定细胞(如感光细胞)抗原结合发生神经元凋亡反应而发病。
目前国际尚未就AIR确定统一的血清学检测标准,大量潜在患者存在,由于漏诊、误诊而导致延误治疗或盲目治疗情况普遍存在。基于以往研究样本含量小、检测ARAs数量少,检测方法单一等局限性,需要进行提出临床疑诊AIR患者血清中ARAs的新的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法,包括下述步骤:
(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血,离心,得到患者血清;
(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物,采用蛋白印迹法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中抗体阳性条带数,即ARAs数量;
(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物,采用蛋白印迹法检测并确认步骤(1)抽取得到的患者血清中存在的ARAs种类;
(4)采用免疫荧光法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中的ARAs,将其定位于正常人视网膜组织切片中,得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位;
(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果,确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位,建立临床疑似AIR患者的血清学指标。
本发明的优选技术方案中,所述ARAs种类包括recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1,tranducinɑ/β、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中,步骤(1)中离心条件为1500-2000rpm/min下,离心5-10min。
本发明的优选技术方案中,步骤(2)所述正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为:解剖显微镜下取视网膜,置于组织匀浆器内,0.5ml组织裂解液研磨5-10min,4℃下12000rpm/min离心20min,取上清液,即得视网膜蛋白;所述组织裂解液为:50mmol/L pH8.0的Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02%叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/mlAprotitin、1%Triton X-100或NP-40。
本发明的优选技术方案中,步骤(2)中采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数的方法,包括下述步骤:
①将浓度为6.25μg/μl的正常人视网膜蛋白上样至三个泳道孔,毎孔上样8μl,以100V*100min电泳,100V*60min转膜,将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min;
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块,分别作为实验组和阴性对照组,其中,所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清,阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而是直接加PBS,均淹没PVDF膜,4℃孵育过夜,所述PBS为磷酸盐缓冲盐溶液;
③取出各个PVDF膜,用PBS漂洗干净后,再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜,室温孵育60min,加入ECL荧光剂,发光显影,观察阳性抗体条带数,总阳性抗体条带数即为患者血清中的ARAs数量。
本发明的优选技术方案中,步骤(3)中所述采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的目标ARAs种类的方法,包括下述步骤:
①将浓度为6.25μg/μl的recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1,tranducinɑ、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70人重组抗原分别上样至不同的泳道孔,毎孔上样8μl,以100V*100min电泳,100V*60min转膜,将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min;
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分,分别作为实验组、阴性对照组、阳性对照组上样,其中,所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清;阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS;阳性对照为加入用PBS稀释1000倍的相应人重组抗体(抗人重组抗原),均淹没PVDF膜,且在4℃孵育过夜;所述人重组抗体为人重组抗原,包括recoverin,α-enolase,carbonic anhydrase II(CAII),TULP-1,TRPM-1,transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70,IRBP,CRMP-5的相应抗体的任一种或其组合;
③取出各个PVDF膜,用PBS漂洗干净后,再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜,室温孵育60min,加入ECL荧光剂,发光显影,确定患者血清中目标ARAs种类。
本发明的优选技术方案中,步骤(4)中所述采用免疫荧光法检测患者血清ARAs的方法,包括如下步骤:将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上,再加入抗人IgG荧光抗体,利用显微镜观察荧光阳性染色,观察阳性染色位于视网膜组织中的位置,确认ARAs在视网膜组织中的位置。
本发明的另一目的在于提供一种高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作制备检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的试剂盒中的应用。
本发明的优选技术方案中,所述试剂盒是利用患者血清ARAs中的阳性条带数量、种类及其在人视网膜中的位置来实现检测。
本发明的优选技术方案中,当检测抗体阳性条带数为4的时候,区分AIR和其它疾病的能力最大。
本发明的另一目的在于提供一种高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作筛选预防或治疗自身免疫性视网膜病变药物的应用。
本发明的优选技术方案中,所述筛选方法是利用患者血清ARAs中的阳性条带数量和种类及其在人视网膜中的位置来实现。
除非另有说明,本发明采用受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve,ROC)评价检测方法的灵敏度、特异性、以及抗体数量对区分疾病与正常及与其他疾病的能力。
ROC曲线下面积(Area Under Curve,AUC)是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈),以真阳性率(敏感度)为纵坐标,假阳性率特异度)为横坐标绘制的曲线。范围为0.5-1,数值越大,区分能力越高。
ROC曲线上最靠近左上角的那一点为最佳临界点,点上的值即为最佳临界值(cut-off),此点上敏感度与特异度都较高,假阳性与假阴性也最少。
约登指数为ROC曲线上取得最大值的界值,约登指数=敏感度+特异度-1。
除非另有说明,本发明涉及液体与液体之间的百分比时,所述的百分比为体积/体积百分比;本发明涉及液体与固体之间的百分比时,所述百分比为体积/重量百分比;本发明涉及固体与液体之间的百分比时,所述百分比为重量/体积百分比;其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比,本发明具有下述有益技术效果:
1、本发明采用正常人供体视网膜组织中提取的蛋白通过免疫印迹法全面检测临床疑诊AIR患者血清中ARAs的存在,包括数量、种类及其在视网膜组织切片中的位置等,并通过特定的统计学方法及手段确定血清ARAs数量。有利于患者及时介入治疗,将显著降低AIR患者的致盲率,显著提高AIR患者治疗的安全性及有效性,使患者从早期检测、预后评估、指导临床用药中直接获益。
2、本发明的方法具有检测灵敏度高,特异性高,准确性好、操作简便等优点,制备的试剂盒可用于临床早期检测,显著提高患者生存质量。
附图说明
图1抗体数量的ROC曲线
图2实施例2中某60岁女性癌症相关性视网膜病变(CAR)患者的血清ARAs检测结果。
具体实施方式
以下参照实施例说明本发明,但本发明不局限于实施例。
实施例1
临床疑似AIR患者纳入标准和排除标准参考2016年美国葡萄膜炎协会发表于AJO的关于非副肿瘤性AIR(np-AIR)的诊断与治疗共识(p-AIR患者除了患有恶性肿瘤,其他临床体征与此相似,见表1)。
表1
实验组:临床疑似AIR患者58例,包括p-AIR 15例30只眼,np-AIR患者33例65只眼。
疾病对照组:按照疾病诊断标准选取典型原发性视网膜色素变性(RP)患者12例和双眼葡萄膜炎患者15例。
正常对照组:选取无明显视网膜病变、视功能无明显异常的正常人10例。
高效检测临床疑似AIR患者血清中ARAs的方法,包括下述步骤:
(1)抽取患者静脉血5ml,将抽取的静脉血置于1500rpm下离心5min,取血清,将其置于-80℃保存,备用;
(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物,采用蛋白印迹法检测制得的血清中抗体阳性条带数,具体步骤为:
以正常人视网膜匀浆提取人视网膜蛋白,所述人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为:解剖显微镜下取视网膜,置于组织匀浆器内,加0.5ml组织裂解液研磨,4℃下12000rpm/min离心20min,取上清液,即为视网膜蛋白,所述组织裂解液为:50mmol/LpH8.0的Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02%叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotitin、1%Triton X-100或NP-40。
将浓度为6.25μg/μl人视网膜蛋白上样至三个泳道孔,毎孔上样8μl,以100V*100min电泳,100V*60min转膜;
将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min;把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块,分别作为实验组和阴性对照组上样,
其中所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清并淹没PVDF膜,
阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS并淹没PVDF膜,
4℃孵育过夜;取出各个PVDF膜,用PBS漂洗干净后,再加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体),淹没PVDF膜,室温孵育60min,加入ECL荧光剂,发光显影,观察阳性抗体条带数,即为患者血清中的ARAs数量。
(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物,采用蛋白印迹法检测并确认制得的血清中存在的目标抗体,具体步骤为:将浓度为6.25μg/μl的recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1,tranducinɑ、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70人重组抗原分别上样至不同的泳道孔,毎孔上样8μl,以100V*100min电泳,100V*60min转膜,将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min;
把封闭后的PVDF膜按泳道切分,分别作为实验组、阴性对照组、阳性对照组,
其中实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清并淹没PVDF膜;
阴性对照组不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS并淹没PVDF膜;
阳性对照组为用PBS稀释1000倍的人重组蛋白抗体(与人重组蛋白对应)并淹没PVDF膜,
均在4℃孵育过夜;所述人重组蛋白抗体为人重组蛋白抗原,包括recoverin,α-enolase,carbonic anhydrase II(CAII),TULP-1,TRPM-1,transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70,IRBP,CRMP-5的相应抗体的任一种或其组合;
取出各个PVDF膜,用PBS漂洗干净后,再加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体),淹没PVDF膜,室温孵育60min,加入ECL荧光剂,发光显影,确定阳性抗体种类,即为血清中ARAs中的种类。
(4)将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上,再加入抗人IgG荧光抗体,利用显微镜观察荧光阳性染色,观察阳性染色位于视网膜组织中的位置,确认ARAs在视网膜组织中的位置。
(5)统计前述步骤的临床疑似患者及疾病对照患者及正常人血清ARAs检测结果,确定临床疑似AIR患者血清ARAs的数量、目标抗体种类、ARAs在视网膜组织中的定位,并与疾病对照组及正常人对照组进行比对分析及区分能力检测,建立AIR患者的血清学检测系统及血清学检测指标。
统计学分析采用分析软件为SAS9.4,研究资料为计量或计数资料。
(6)实验结果:
p-AIR患者血清中,抗recoverin抗体20%(3/15)。ɑ-enolase抗体100%,CAII抗体60%(9/15)。其他ARAs包括CRMP-5(22%)、HSP-70(10%)、TRMP-1(22%)和S-arrestin(10%)。未检测到Transduction-ɑ和TULP-1。np-AIR患者血清中,ɑ-enolase 60%(20/33),CAII48%(15/33),其他包括TRMP-1(38%)、CRMP-5(6%)、S-arrestin(6%)和TULP-1(6%)。未发现recoveirn及HSP70和Transduction-ɑ的抗体。
p-AIR患者的ARAs数量为5.077±2.05(2-9)条,np-AIR为4.63±2.21(1-8)条;RP患者为2±0.91条,葡萄膜炎患者为2.9±1.63条,正常人为1.2±0.91条。经统计学分析(结合年龄及性别因素),各组间条带数有明显差异(P<0.05)。p-AIR及np-AIR患者条带数量明显大于疾病对照组及正常人对照组(P<0.01)。在此基础进行抗体阳性条带的灵敏度和特异性的分析。
图1为抗体数量的ROC曲线,AUC数值达0.835,cut-off值为3.5。检测方法的灵敏度和特异性高。经德龙检验分析,当抗体阳性条带数是4时,约登指数为0.459,表示抗体阳性条带数为4的时候,区分AIR和其它疾病的能力最大(表2)。
表2
实施例2
对经过实施例1检测的58例患者进行治疗方案如下:
15名p-AIR患者中,两名新诊断出肺癌的患者接受了化疗,13名p-AIR患者就诊时已经接受了针对肿瘤的治疗(包括切除肿瘤、化疗或放疗)。经检测后,12名患者局部或/和全身使用糖皮质激素,3名患者选择观察。
33名np-AIR患者中,8名np-AIR患者全身合并自身免疫性疾病,经检测后,26名患者开始或继续接受局部或/和全身糖皮质激素或环孢素治疗,7名np-AIR患者选择观察。
在接受治疗的患者中,30%(26/85)眼视力得到改善,23%(16/85)眼患者视力下降,53%(46/85)眼在观察期内保持稳定。
两种类型的视网膜病变对曲安奈德(TA)或地塞米松注射植入剂(Ozurdex)眼内玻璃体腔注射反应良好:一种伴有黄斑水肿,另一种显示明显的炎症浸润。治疗后所有12只患眼黄斑水肿减轻,视网膜炎症反应消退。TA注射后短时间内视力显著提高,但半数反复注射后由于视神经萎缩而失明。
无论疾病分期如何,近90%的患者都接受了一种以上的治疗方法,只有5名np-AIR患者选择接受观察。50%以上的患者视觉功能得以维持,1/3患者的视觉功能得到改善。单独玻璃体内注射TA或OZURDEX仍能改善由于黄斑水肿或视网膜炎性浸润患者的视功能。在5年的观察期内,5名未经特殊治疗的np-AIR患者中有2名视功能稳定。急性发作的CAR或np-AIR患者的视力预后通常在随访一年后较差,及时治疗有显著改善。
图2为某患有肺癌的60岁女性癌症相关性视网膜病变(CAR)患者,使用实施例1方法得到的血清ARAs检测结果。共检测出抗体阳性条带(ARAs)11条,其中,recoverin,ɑ-enolase及CAII被证实阳性。该患者由于进行该项检测发现了未被诊断的小细胞肺癌。经该检测确诊后,患者接受针对肿瘤的治疗并行双眼玻璃体腔内注射地塞米松缓释剂(OZURDEX)0.7mg。随访三月,患者的双眼视力从治疗前手动/眼前提高至0.1。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血,离心,得到患者血清;
(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物,采用蛋白印迹法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中抗体阳性条带数,即ARAs数量;
(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物,采用蛋白印迹法检测并确认步骤(1)抽取得到的患者血清中存在的ARAs种类;
(4)采用免疫荧光法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中的ARAs,将其定位于正常人视网膜组织切片中,得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位;
(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果,确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位,建立临床疑似AIR患者的血清学指标。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述ARAs种类包括recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1,tranducinɑ/β、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70的任一种或其组合。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法,其特征在于,步骤(1)中离心条件为1500-2000rpm/min下,离心5-10min。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为:解剖显微镜下取视网膜,置于组织匀浆器内,0.5ml组织裂解液研磨5-10min,4℃下12000rpm/min离心20min,取上清液,即得视网膜蛋白;所述组织裂解液为:50mmol/L pH8.0的Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02%叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotitin、1%Triton X-100或NP-40。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)中采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数的方法,包括下述步骤:
①将浓度为6.25μg/μl的正常人视网膜蛋白上样至三个泳道孔,毎孔上样8μl,以100V*100min电泳,100V*60min转膜,将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min;
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块,分别作为实验组和阴性对照组,其中,所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清,阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而是直接加PBS,均淹没PVDF膜,4℃孵育过夜,所述PBS为磷酸盐缓冲盐溶液;
③取出各个PVDF膜,用PBS漂洗干净后,再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜,室温孵育60min,加入ECL荧光剂,发光显影,观察阳性抗体条带数,总阳性抗体条带数即为患者血清中的ARAs数量。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法,其特征在于,,步骤(3)中所述采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的目标ARAs种类的方法,包括下述步骤:
①将浓度为6.25μg/μl的recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1,tranducinɑ、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70人重组抗原分别上样至不同的泳道孔,毎孔上样8μl,以100V*100min电泳,100V*60min转膜,将转印后的PVDF膜置于浓度为5%的脱脂奶粉中封闭60min;
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分,分别作为实验组、阴性对照组、阳性对照组上样,其中,所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清;阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS;阳性对照为加入用PBS稀释1000倍的相应人重组抗体(抗人重组抗原),均淹没PVDF膜,且在4℃孵育过夜;所述人重组抗体为人重组抗原,包括recoverin,α-enolase,carbonic anhydrase II(CAII),TULP-1,TRPM-1,transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70,IRBP,CRMP-5的相应抗体的任一种或其组合;
③取出各个PVDF膜,用PBS漂洗干净后,再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜,室温孵育60min,加入ECL荧光剂,发光显影,确定患者血清中目标ARAs种类。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法,其特征在于,,步骤(4)中所述采用免疫荧光法检测患者血清ARAs的方法,包括如下步骤:将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上,再加入抗人IgG荧光抗体,利用显微镜观察荧光阳性染色,观察阳性染色位于视网膜组织中的位置,确认ARAs在视网膜组织中的位置。
8.如权利要求1-7任一项所述的高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作制备检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述试剂盒是利用患者血清ARAs中的阳性条带数量、种类及其在人视网膜中的位置来实现检测目的,优选当检测抗体阳性条带数为4的时候,区分AIR和其它疾病的能力最大。
10.如权利要求1-7任一项所述的提供一种高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作筛选预防或治疗自身免疫性视网膜病变的药物的应用,优选所述应用是根据患者血清ARAs中的阳性条带数量和种类及其在人视网膜中的位置来实现。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202011057083X | 2020-09-30 | ||
CN202011057083 | 2020-09-30 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114324885A true CN114324885A (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=81045625
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111162835.3A Pending CN114324885A (zh) | 2020-09-30 | 2021-09-30 | 一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114324885A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105153295A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-16 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法 |
EP3379251A1 (en) * | 2017-03-22 | 2018-09-26 | Ciro Costagliola | Medical device, immunoassay method and test for detecting proliferative diabetic retinopathy |
CN109307761A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-02-05 | 华南农业大学 | 一种检测糠氨酸的间接竞争elisa方法 |
CN109841267A (zh) * | 2017-11-28 | 2019-06-04 | 北京市眼科研究所 | 一种眼科临床数据采集系统及方法 |
-
2021
- 2021-09-30 CN CN202111162835.3A patent/CN114324885A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105153295A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-16 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法 |
EP3379251A1 (en) * | 2017-03-22 | 2018-09-26 | Ciro Costagliola | Medical device, immunoassay method and test for detecting proliferative diabetic retinopathy |
CN109841267A (zh) * | 2017-11-28 | 2019-06-04 | 北京市眼科研究所 | 一种眼科临床数据采集系统及方法 |
CN109307761A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-02-05 | 华南农业大学 | 一种检测糠氨酸的间接竞争elisa方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
AUSTIN R. FOX等: "Consensus on the Diagnosis and Management of Nonparaneoplastic Autoimmune Retinopathy using a Modified Delphi Approach", 《AM J OPHTHALMOL.》, vol. 8, no. 168, 20 May 2016 (2016-05-20), pages 183 - 190, XP029663880, DOI: 10.1016/j.ajo.2016.05.013 * |
曾惠阳等: "自身免疫性视网膜病变血清抗视网膜抗体的检测", 《眼科》, vol. 27, no. 6, 15 November 2018 (2018-11-15), pages 451 - 455 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1937831B1 (en) | Use of n-myristoyltransferase on non-tumor tissue for cancer diagnosis | |
CN110632292A (zh) | 一种检测pd-l1和cd8抗原的免疫荧光试剂盒及应用方法 | |
KR102086788B1 (ko) | 간암의 비-침습성 진단을 위한 특이적 바이오마커 세트 | |
da Costa et al. | Early polymerase chain reaction detection of Chagas disease reactivation in heart transplant patients | |
Di Serio et al. | Evaluation of procalcitonin, Vitamin D and C-reactive protein levels in septic patients with positive emocoltures. Our preliminary experience | |
Walther et al. | Diagnosis of human filariases (except onchocerciasis) | |
ES2394962T3 (es) | Método de diagnóstico de enfermedades inflamatorias usando calgranulina C | |
Zeng et al. | Detection of serum anti-retinal antibodies in the Chinese patients with presumed autoimmune retinopathy | |
Gong et al. | Expression of CXCR4 and MMP-2 is associated with poor prognosis in patients with osteosarcoma | |
CN114324885A (zh) | 一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用 | |
Ito et al. | Risk factors for failure of vitrectomy cell block technique in cytological diagnosis of vitreoretinal lymphoma | |
Higuchi et al. | Archaea symbiont of T. cruzi infection may explain heart failure in Chagas disease | |
Baskaran et al. | Expression of matrix metalloproteinase-21 in oral squamous cell carcinoma | |
RU2670655C2 (ru) | Способ определения риска рецидива поверхностного рака мочевого пузыря после оперативного лечения | |
ES2774014T3 (es) | Dispositivo médico, procedimiento de inmunoensayo y ensayo para la detección de la retinopatía diabética proliferativa | |
RU2735660C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии iii степени и микроинвазивного рака шейки матки, ассоциированных с вирусом папилломы человека | |
Valenčáková-Agyagosová et al. | Canine perineal tumours and selected tumour markers | |
CN111690730B (zh) | Il-8阳性初始t细胞作为诊断胸腺占位性疾病的靶点的应用 | |
EP4290237A1 (en) | Method for determining respose to methrotrexate (mtx) in a human subject diagnosed with rheumatoid arthritis | |
CN116773815B (zh) | Slc2a6作为治疗靶点和筛查靶点的用途及乳腺癌筛查试剂盒 | |
Yap et al. | Anti-Phospholipase A2 Receptor Antibody Levels in Asian Patients with Primary Membranous Nephropathy: A Territory-Wide Study: PO1536 | |
Leclerc et al. | Qualitative and Quantitative Dosage of the Anti M-Type Phospholipase A2 Receptor Autoantibody: One-Year Experience in Quebec's Reference Center: PO1537 | |
Reinhard et al. | Clinical Relevance of NELL1 Antibodies in Patients with Membranous Nephropathy: PO1538 | |
Reinhard et al. | Non-Pathogenetic THSD7A Antibodies in a Patient with No Membranous Nephropathy: PO1539 | |
Abdullaevna et al. | Quantitative and Qualitative Changes in Extracellular DNA-a Marker For Early Diagnosis of Breast Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |