CN114324885A - 一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法，包括下述步骤：(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血，离心，得到患者血清；(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物，采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数，即ARAs数量；(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物，采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的ARAs种类；(4)采用免疫荧光法检测患者血清中的ARAs，将其定位于正常人视网膜组织切片中，得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位；(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果，确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位，建立临床疑似AIR患者的血清学指标。本发明的检测方法灵敏度和特异性高，适用于临床早期检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高效检测血清中抗视网膜抗体的方法及其应用。
背景技术
自身免疫性视网膜病变(autoimmune retinopathy，AIR)是一类由免疫炎症介导的可致盲性眼病，包括副肿瘤病变(paraneoplastic,p-AIR)和非副肿瘤性病变(non-paraneoplastic,np-AIR)两大类型。AIR临床表现包括双眼无痛性亚急性视力丢失，ERG异常，血清中存在循环抗视网膜抗体(anti-retinal antibodies,ARAs)等。p-AIR包括癌症相关性视网膜病变(cancer-associated retinopathy，CAR)、黑色素瘤相关性视网膜病变melanoma-associated retinopathy，MAR)。某些良性肿瘤也会引起CAR样改变。np-AIR患者系统检查未发现肿瘤存在，但常伴有自身免疫性疾病。目前观点认为，AIR的发病机制与血清中存在ARAs密切相关。由于肿瘤或病毒、细菌等外界因素侵入，机体产生与视网膜某组织细胞结构相似的抗体释放入血清，破坏血视网膜屏障，与视网膜特定细胞(如感光细胞)抗原结合发生神经元凋亡反应而发病。
目前国际尚未就AIR确定统一的血清学检测标准，大量潜在患者存在，由于漏诊、误诊而导致延误治疗或盲目治疗情况普遍存在。基于以往研究样本含量小、检测ARAs数量少，检测方法单一等局限性，需要进行提出临床疑诊AIR患者血清中ARAs的新的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法，包括下述步骤：
(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血，离心，得到患者血清；
(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物，采用蛋白印迹法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中抗体阳性条带数，即ARAs数量；
(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物，采用蛋白印迹法检测并确认步骤(1)抽取得到的患者血清中存在的ARAs种类；
(4)采用免疫荧光法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中的ARAs，将其定位于正常人视网膜组织切片中，得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位；
(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果，确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位，建立临床疑似AIR患者的血清学指标。
本发明的优选技术方案中，所述ARAs种类包括recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1，tranducinɑ/β、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中离心条件为1500-2000rpm/min下，离心5-10min。
本发明的优选技术方案中，步骤(2)所述正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为：解剖显微镜下取视网膜，置于组织匀浆器内，0.5ml组织裂解液研磨5-10min，4℃下12000rpm/min离心20min,取上清液，即得视网膜蛋白；所述组织裂解液为:50mmol/L pH8.0的Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02％叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/mlAprotitin、1％Triton X-100或NP-40。
本发明的优选技术方案中，步骤(2)中采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数的方法，包括下述步骤：
①将浓度为6.25μg/μl的正常人视网膜蛋白上样至三个泳道孔，毎孔上样8μl，以100V*100min电泳，100V*60min转膜，将转印后的PVDF膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中封闭60min；
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块，分别作为实验组和阴性对照组，其中，所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清，阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而是直接加PBS，均淹没PVDF膜，4℃孵育过夜，所述PBS为磷酸盐缓冲盐溶液；
③取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，观察阳性抗体条带数，总阳性抗体条带数即为患者血清中的ARAs数量。
本发明的优选技术方案中，步骤(3)中所述采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的目标ARAs种类的方法，包括下述步骤：
①将浓度为6.25μg/μl的recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1，tranducinɑ、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70人重组抗原分别上样至不同的泳道孔，毎孔上样8μl，以100V*100min电泳，100V*60min转膜，将转印后的PVDF膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中封闭60min；
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分，分别作为实验组、阴性对照组、阳性对照组上样，其中，所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清；阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS；阳性对照为加入用PBS稀释1000倍的相应人重组抗体(抗人重组抗原)，均淹没PVDF膜，且在4℃孵育过夜；所述人重组抗体为人重组抗原，包括recoverin，α-enolase，carbonic anhydrase II(CAII)，TULP-1，TRPM-1，transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70，IRBP，CRMP-5的相应抗体的任一种或其组合；
③取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，确定患者血清中目标ARAs种类。
本发明的优选技术方案中，步骤(4)中所述采用免疫荧光法检测患者血清ARAs的方法，包括如下步骤：将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上，再加入抗人IgG荧光抗体，利用显微镜观察荧光阳性染色，观察阳性染色位于视网膜组织中的位置，确认ARAs在视网膜组织中的位置。
本发明的另一目的在于提供一种高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作制备检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的试剂盒中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述试剂盒是利用患者血清ARAs中的阳性条带数量、种类及其在人视网膜中的位置来实现检测。
本发明的优选技术方案中，当检测抗体阳性条带数为4的时候，区分AIR和其它疾病的能力最大。
本发明的另一目的在于提供一种高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作筛选预防或治疗自身免疫性视网膜病变药物的应用。
本发明的优选技术方案中，所述筛选方法是利用患者血清ARAs中的阳性条带数量和种类及其在人视网膜中的位置来实现。
除非另有说明，本发明采用受试者工作特征曲线(receiver operatingcharacteristic curve,ROC)评价检测方法的灵敏度、特异性、以及抗体数量对区分疾病与正常及与其他疾病的能力。
ROC曲线下面积(Area Under Curve，AUC)是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(敏感度)为纵坐标，假阳性率特异度)为横坐标绘制的曲线。范围为0.5-1，数值越大，区分能力越高。
ROC曲线上最靠近左上角的那一点为最佳临界点，点上的值即为最佳临界值(cut-off),此点上敏感度与特异度都较高,假阳性与假阴性也最少。
约登指数为ROC曲线上取得最大值的界值，约登指数＝敏感度+特异度-1。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明采用正常人供体视网膜组织中提取的蛋白通过免疫印迹法全面检测临床疑诊AIR患者血清中ARAs的存在，包括数量、种类及其在视网膜组织切片中的位置等，并通过特定的统计学方法及手段确定血清ARAs数量。有利于患者及时介入治疗，将显著降低AIR患者的致盲率，显著提高AIR患者治疗的安全性及有效性，使患者从早期检测、预后评估、指导临床用药中直接获益。
2、本发明的方法具有检测灵敏度高，特异性高，准确性好、操作简便等优点，制备的试剂盒可用于临床早期检测，显著提高患者生存质量。
附图说明
图1抗体数量的ROC曲线
图2实施例2中某60岁女性癌症相关性视网膜病变(CAR)患者的血清ARAs检测结果。
具体实施方式
以下参照实施例说明本发明，但本发明不局限于实施例。
实施例1
临床疑似AIR患者纳入标准和排除标准参考2016年美国葡萄膜炎协会发表于AJO的关于非副肿瘤性AIR(np-AIR)的诊断与治疗共识(p-AIR患者除了患有恶性肿瘤，其他临床体征与此相似，见表1)。
表1
实验组：临床疑似AIR患者58例，包括p-AIR 15例30只眼，np-AIR患者33例65只眼。
疾病对照组：按照疾病诊断标准选取典型原发性视网膜色素变性(RP)患者12例和双眼葡萄膜炎患者15例。
正常对照组：选取无明显视网膜病变、视功能无明显异常的正常人10例。
高效检测临床疑似AIR患者血清中ARAs的方法，包括下述步骤：
(1)抽取患者静脉血5ml，将抽取的静脉血置于1500rpm下离心5min，取血清，将其置于-80℃保存，备用；
(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物，采用蛋白印迹法检测制得的血清中抗体阳性条带数，具体步骤为：
以正常人视网膜匀浆提取人视网膜蛋白，所述人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为：解剖显微镜下取视网膜，置于组织匀浆器内，加0.5ml组织裂解液研磨，4℃下12000rpm/min离心20min,取上清液，即为视网膜蛋白，所述组织裂解液为:50mmol/LpH8.0的Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02％叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotitin、1％Triton X-100或NP-40。
将浓度为6.25μg/μl人视网膜蛋白上样至三个泳道孔，毎孔上样8μl，以100V*100min电泳，100V*60min转膜；
将转印后的PVDF膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中封闭60min；把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块，分别作为实验组和阴性对照组上样，
其中所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清并淹没PVDF膜，
阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS并淹没PVDF膜，
4℃孵育过夜；取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)，淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，观察阳性抗体条带数，即为患者血清中的ARAs数量。
(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物，采用蛋白印迹法检测并确认制得的血清中存在的目标抗体，具体步骤为：将浓度为6.25μg/μl的recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1，tranducinɑ、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70人重组抗原分别上样至不同的泳道孔，毎孔上样8μl，以100V*100min电泳，100V*60min转膜，将转印后的PVDF膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中封闭60min；
把封闭后的PVDF膜按泳道切分，分别作为实验组、阴性对照组、阳性对照组，
其中实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清并淹没PVDF膜；
阴性对照组不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS并淹没PVDF膜；
阳性对照组为用PBS稀释1000倍的人重组蛋白抗体(与人重组蛋白对应)并淹没PVDF膜，
均在4℃孵育过夜；所述人重组蛋白抗体为人重组蛋白抗原，包括recoverin，α-enolase，carbonic anhydrase II(CAII)，TULP-1，TRPM-1，transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70，IRBP，CRMP-5的相应抗体的任一种或其组合；
取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)，淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，确定阳性抗体种类，即为血清中ARAs中的种类。
(4)将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上，再加入抗人IgG荧光抗体，利用显微镜观察荧光阳性染色，观察阳性染色位于视网膜组织中的位置，确认ARAs在视网膜组织中的位置。
(5)统计前述步骤的临床疑似患者及疾病对照患者及正常人血清ARAs检测结果，确定临床疑似AIR患者血清ARAs的数量、目标抗体种类、ARAs在视网膜组织中的定位，并与疾病对照组及正常人对照组进行比对分析及区分能力检测，建立AIR患者的血清学检测系统及血清学检测指标。
统计学分析采用分析软件为SAS9.4，研究资料为计量或计数资料。
(6)实验结果：
p-AIR患者血清中，抗recoverin抗体20％(3/15)。ɑ-enolase抗体100％，CAII抗体60％(9/15)。其他ARAs包括CRMP-5(22％)、HSP-70(10％)、TRMP-1(22％)和S-arrestin(10％)。未检测到Transduction-ɑ和TULP-1。np-AIR患者血清中，ɑ-enolase 60％(20/33)，CAII48％(15/33)，其他包括TRMP-1(38％)、CRMP-5(6％)、S-arrestin(6％)和TULP-1(6％)。未发现recoveirn及HSP70和Transduction-ɑ的抗体。
p-AIR患者的ARAs数量为5.077±2.05(2-9)条，np-AIR为4.63±2.21(1-8)条；RP患者为2±0.91条,葡萄膜炎患者为2.9±1.63条，正常人为1.2±0.91条。经统计学分析(结合年龄及性别因素)，各组间条带数有明显差异(P<0.05)。p-AIR及np-AIR患者条带数量明显大于疾病对照组及正常人对照组(P<0.01)。在此基础进行抗体阳性条带的灵敏度和特异性的分析。
图1为抗体数量的ROC曲线，AUC数值达0.835，cut-off值为3.5。检测方法的灵敏度和特异性高。经德龙检验分析，当抗体阳性条带数是4时，约登指数为0.459，表示抗体阳性条带数为4的时候，区分AIR和其它疾病的能力最大(表2)。
表2
实施例2
对经过实施例1检测的58例患者进行治疗方案如下：
15名p-AIR患者中，两名新诊断出肺癌的患者接受了化疗，13名p-AIR患者就诊时已经接受了针对肿瘤的治疗(包括切除肿瘤、化疗或放疗)。经检测后，12名患者局部或/和全身使用糖皮质激素，3名患者选择观察。
33名np-AIR患者中，8名np-AIR患者全身合并自身免疫性疾病，经检测后，26名患者开始或继续接受局部或/和全身糖皮质激素或环孢素治疗，7名np-AIR患者选择观察。
在接受治疗的患者中，30％(26/85)眼视力得到改善，23％(16/85)眼患者视力下降，53％(46/85)眼在观察期内保持稳定。
两种类型的视网膜病变对曲安奈德(TA)或地塞米松注射植入剂(Ozurdex)眼内玻璃体腔注射反应良好：一种伴有黄斑水肿，另一种显示明显的炎症浸润。治疗后所有12只患眼黄斑水肿减轻，视网膜炎症反应消退。TA注射后短时间内视力显著提高，但半数反复注射后由于视神经萎缩而失明。
无论疾病分期如何，近90％的患者都接受了一种以上的治疗方法，只有5名np-AIR患者选择接受观察。50％以上的患者视觉功能得以维持，1/3患者的视觉功能得到改善。单独玻璃体内注射TA或OZURDEX仍能改善由于黄斑水肿或视网膜炎性浸润患者的视功能。在5年的观察期内，5名未经特殊治疗的np-AIR患者中有2名视功能稳定。急性发作的CAR或np-AIR患者的视力预后通常在随访一年后较差，及时治疗有显著改善。
图2为某患有肺癌的60岁女性癌症相关性视网膜病变(CAR)患者，使用实施例1方法得到的血清ARAs检测结果。共检测出抗体阳性条带(ARAs)11条，其中，recoverin,ɑ-enolase及CAII被证实阳性。该患者由于进行该项检测发现了未被诊断的小细胞肺癌。经该检测确诊后，患者接受针对肿瘤的治疗并行双眼玻璃体腔内注射地塞米松缓释剂(OZURDEX)0.7mg。随访三月，患者的双眼视力从治疗前手动/眼前提高至0.1。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高效检测血清中抗视网膜抗体(ARAs)的方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)抽取临床疑似AIR患者静脉血，离心，得到患者血清；
(2)以正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白为反应底物，采用蛋白印迹法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中抗体阳性条带数，即ARAs数量；
(3)以已知人重组蛋白抗原为反应底物，采用蛋白印迹法检测并确认步骤(1)抽取得到的患者血清中存在的ARAs种类；
(4)采用免疫荧光法检测步骤(1)抽取得到的患者血清中的ARAs，将其定位于正常人视网膜组织切片中，得到患者血清中的ARAs在视网膜组织中的定位；
(5)根据步骤(2)、(3)、(4)得到的患者血清ARAs检测结果，确定血清ARAs的数量、血清ARAs的种类、ARAs在视网膜组织中的定位，建立临床疑似AIR患者的血清学指标。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ARAs种类包括recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1，tranducinɑ/β、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70的任一种或其组合。
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中离心条件为1500-2000rpm/min下，离心5-10min。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述正常人视网膜组织匀浆中提取的视网膜蛋白的方法为：解剖显微镜下取视网膜，置于组织匀浆器内，0.5ml组织裂解液研磨5-10min，4℃下12000rpm/min离心20min,取上清液，即得视网膜蛋白；所述组织裂解液为:50mmol/L pH8.0的Tris·Cl、150mmol/L NaCl、0.02％叠氮钠、100μg/ml PMSF、1μg/ml Aprotitin、1％Triton X-100或NP-40。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中采用蛋白印迹法检测患者血清中抗体阳性条带数的方法，包括下述步骤：
①将浓度为6.25μg/μl的正常人视网膜蛋白上样至三个泳道孔，毎孔上样8μl，以100V*100min电泳，100V*60min转膜，将转印后的PVDF膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中封闭60min；
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分成两块，分别作为实验组和阴性对照组，其中，所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清，阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而是直接加PBS，均淹没PVDF膜，4℃孵育过夜，所述PBS为磷酸盐缓冲盐溶液；
③取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，观察阳性抗体条带数，总阳性抗体条带数即为患者血清中的ARAs数量。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，，步骤(3)中所述采用蛋白印迹法检测并确认患者血清中存在的目标ARAs种类的方法，包括下述步骤：
①将浓度为6.25μg/μl的recoverin、α-enolase、CA-II、TULP-1，tranducinɑ、TRMP-1、CRMP-5、arrestin、HSP-70人重组抗原分别上样至不同的泳道孔，毎孔上样8μl，以100V*100min电泳，100V*60min转膜，将转印后的PVDF膜置于浓度为5％的脱脂奶粉中封闭60min；
②把封闭后的PVDF膜按泳道切分，分别作为实验组、阴性对照组、阳性对照组上样，其中，所述实验组加入用PBS稀释200倍的临床疑似AIR患者血清；阴性对照不加临床疑似AIR患者血清而直接加PBS；阳性对照为加入用PBS稀释1000倍的相应人重组抗体(抗人重组抗原)，均淹没PVDF膜，且在4℃孵育过夜；所述人重组抗体为人重组抗原，包括recoverin，α-enolase，carbonic anhydrase II(CAII)，TULP-1，TRPM-1，transducin-ɑ/β,arrestin,HSP-70，IRBP，CRMP-5的相应抗体的任一种或其组合；
③取出各个PVDF膜，用PBS漂洗干净后，再分别加入用PBS稀释2000倍的二抗(带有荧光的抗人IgG抗体)并淹没PVDF膜，室温孵育60min，加入ECL荧光剂，发光显影，确定患者血清中目标ARAs种类。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，，步骤(4)中所述采用免疫荧光法检测患者血清ARAs的方法，包括如下步骤：将患者血清滴加到正常人视网膜的切片上，再加入抗人IgG荧光抗体，利用显微镜观察荧光阳性染色，观察阳性染色位于视网膜组织中的位置，确认ARAs在视网膜组织中的位置。
8.如权利要求1-7任一项所述的高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作制备检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒是利用患者血清ARAs中的阳性条带数量、种类及其在人视网膜中的位置来实现检测目的，优选当检测抗体阳性条带数为4的时候，区分AIR和其它疾病的能力最大。
10.如权利要求1-7任一项所述的提供一种高效检测自身免疫性视网膜病变患者血清中ARAs的方法用作筛选预防或治疗自身免疫性视网膜病变的药物的应用，优选所述应用是根据患者血清ARAs中的阳性条带数量和种类及其在人视网膜中的位置来实现。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105153295A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-16 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法 |
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-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105153295A (zh) * | 2015-09-16 | 2015-12-16 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 标志物及其应用、试剂盒、该标志物的检测方法 |
| EP3379251A1 (en) * | 2017-03-22 | 2018-09-26 | Ciro Costagliola | Medical device, immunoassay method and test for detecting proliferative diabetic retinopathy |
| CN109841267A (zh) * | 2017-11-28 | 2019-06-04 | 北京市眼科研究所 | 一种眼科临床数据采集系统及方法 |
| CN109307761A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-02-05 | 华南农业大学 | 一种检测糠氨酸的间接竞争elisa方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| AUSTIN R. FOX等: "Consensus on the Diagnosis and Management of Nonparaneoplastic Autoimmune Retinopathy using a Modified Delphi Approach", 《AM J OPHTHALMOL.》, vol. 8, no. 168, 20 May 2016 (2016-05-20), pages 183 - 190, XP029663880, DOI: 10.1016/j.ajo.2016.05.013 * |
| 曾惠阳等: "自身免疫性视网膜病变血清抗视网膜抗体的检测", 《眼科》, vol. 27, no. 6, 15 November 2018 (2018-11-15), pages 451 - 455 * |
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