CN114317520A - 一种基于dna共价交联的质粒组装方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于DNA共价交联的质粒组装方法，本方法巧妙运用交联剂实现来源于质粒的DNA进行链间交联，提高了双链交联引物在变性剂及高温下的抗变性能力。相较于利用未组装的引物通过PCR过程进行组装，经过交联的双链交联引物在PCR过程中展示出更高效高产的组装性能。而将该交联引物运用于质粒的DNA组装中，只需要经过一次普通的PCR反应即能实现，因此该方法简便易行，发展前景好。

Description

一种基于DNA共价交联的质粒组装方法

技术领域

本发明属于生物技术、核酸组装技术领域，更具体的涉及一种基于DNA共价交联的质粒组装方法。

背景技术

DNA分子是生命信息的载体，大量的信息储存在基因组中，编码生物功能。随着众多基因组测序项目的完成，具有编码功能的大量基因序列已经得到确定，人类已经进入后基因时代，遗传生物工程已扩展到诸多应用领域，包括复杂通路的综合分析、新生物元件的构建和现有自然生物系统的重新设计。为设计和构建新生命系统并能实现精确预测和控制，一个新兴领域—合成生物学在生命科学、化学、工程学等多个学科的优势中发展而来，广泛应用于生物技术和生物医学领域。在过去的十年中，合成生物学家建立了丰富的元件集，并将它们进行组合按照人的意愿构建出新的质粒，从而实现具有更高级功能(例如转录调控)的电路搭建，这些电路可进一步相互结合，实现更复杂的性能，例如逻辑门，RNA核糖开关，振荡器等；同时也可构建微生物细胞工厂，进行化学物质、生物燃料和生物材料的生产，例如蓝细菌中异丁醛，异丁醇和异戊二烯的生产。

在基因电路搭建的过程中，DNA组装是具有重要地位的使能技术。尽管完整的目标基因可以通过合成而非组装获得，但由于化学合成目的片段所需的成本或技术的限制，该方式未能得到广泛的应用。此外，生物医学研究中所搭建的电路所用片段大多都可从已有的基因组中通过PCR等方式获得，因此目的DNA组装仍是基因电路搭建的主要手段。通过将一定数目的基因元件，按照不同的排列方式和组合方案进行拼接，DNA组装可以完成多种预定DNA结构的搭建。

但是，由于目标组装产物的复杂性，待组装片段序列的多样性以及实验操作的不确定性等因素，不同基因电路搭建效果有差距；目前各种组装方式具有各自局限性，复杂基因电路往往需要多种方式构建，受序列限制，组装效率不高。当前发展时间较久的DNA组装方法主要有BioBrick,Goden Gate,以及与其相类似的方法，如BASIC、BglBrick等。这些方法可实现模块组装，为防止限制酶切割酶切位点以外的序列，组装前需对目标基因序列严格检查，防止大量无效连接产生。Goden Gate以及MoClo方法使用Ⅱ类限制性内切酶可以对粘性末端进行设计，但依然受粘性末端的碱基数限制。除此之外，应用较为广泛的还有Gibson assembly，该方法不依赖限制性内切酶，通过在体系中同时使用T5外切酶、高保真DNA聚合酶(或Taq DNA聚合酶)以及Taq连接酶，控制温度实现多片段连接。该方法省时简便，可有效避免外源序列引入，但存在外切酶消化末端长度不可控的问题，且单链DNA易产生二级结构，不适用于短片段以及带有重复序列片段的连接，如TALEN DNA结合组件、CRISPR基因簇、启动子、核糖体结合位点(RBS)。还有一些基于PCR方法的DNA组装方法，如TPA(Twin-Primer Assembly)方法，能够不依赖限制酶与外切酶进行组装，但是该方法需要多步骤进行，略微繁琐，且在组装过程中有不可避免的产物损失，因此需要进一步得到发展。

基于上述理由，DNA组装技术对合成生物学领域发展具有重要意义，新型DNA组装方法需要得到探索。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于DNA共价交联的质粒组装方法，该方法可解决依赖限制性内切酶切割的质粒组装技术受粘性末端的碱基数限制以及基于外切酶方法所得到的单链末端长度不可控制的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种基于DNA共价交联的质粒组装方法，包括以下步骤：

1)按照交联引物的功能设计用于组装的交联引物序列，包括构成杂交双链的两条单链核酸；其中：

交联引物的功能区从5’至3’的排列依次为：5’-左侧片段X的反向引物-交联区-右侧交联片段Y的正向引物-3’；两条单链核酸能够特异性互补，长度依据实际组装片段而定，交联引物带有两个方向为5’至3’的单链核酸链；

2)利用步骤1)设计的两条单链核酸制备交联引物；

3)将步骤2)制备的交联引物加入PCR体系，待组装的DNA片段作为PCR反应的模板，经常规PCR反应制得组装产物。

优选地，步骤2)中，制备交联引物的方法为：首先按照等物质的量混合正反两种互补单链，之后从95℃至20℃进行复性杂交形成杂交双链，配制交联溶液体系，利用交联剂产生DNA双链链间交联。

进一步优选地，两条互补的单链的摩尔浓度均为5μM；交联溶液体系中用到的交联剂的总物质的量应当过量以实现充分交联。

进一步优选地，加入的交联剂采用8-methoxypsoralen，其能够在DNA链间形成稳定共价双键，浓度为15mM。

优选地，在步骤2)和步骤3)之间还包括验证交联是否成功的操作步骤，包括：对步骤2)获得的交联产物测定Tm值、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证交联成功；通过对交联产物末端杂交单链互补核酸验证交联引物作为引物功能区的单链核酸末端存在且能与交联产物的单链末端互补链杂交。

进一步优选地，步骤3)中制得的产物，包括交联引物的一侧片段组装产物以及交联引物的两侧片段组装产物。

进一步优选地，PCR反应体系所使用的聚合酶为不具有链置换活性且不具有3’至5’外切酶活性的热稳定DNA聚合酶。

进一步优选地，DNA聚合酶为Taq酶。

优选地，步骤3)中所述的PCR反应体系总体积为50μL，包含以下成分：

5U/μL Taq酶，0.25μL；

10×PCR Buffer，Mg²⁺plus，5μL；

质粒，5ng至30ng；

2.5mM dNTP Mixture，4μL；

对于双侧片段的组装，引物用量为反向引物1：交联引物：反向引物2＝1:4:1，体系中终浓度0.04μM：0.16μM：0.04μM；

用水补充至50μL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本方法巧妙运用交联剂实现来源于质粒的DNA进行链间交联，提高了双链交联引物在变性剂及高温下的抗变性能力。相较于利用未组装的引物通过PCR过程进行组装，经过交联的双链交联引物在PCR过程中展示出更高效高产的组装性能。而将该交联引物运用于质粒的DNA组装中，只需要经过一次普通的PCR反应即能实现，因此该方法简便易行，发展前景好。

附图说明

图1为发明的方法流程示意图；

图2为单侧组装DNA的琼脂糖凝胶电泳验证图；

图3为双侧组装DNA的琼脂糖凝胶电泳验证图；

图4为待组装DNA在质粒pEDA5_GFPmut3_Y66H中的位置(a)及双侧交联引物对来源于质粒的DNA的组装电泳验证图(b)。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1为本发明的方法流程示意图，图1中(a)为交联引物的制备过程；(b)为质粒组装过程，包括单侧片段组装与双侧片段组装；(c)为交联引物的序列设计，序列包括交联区、反向引物区与正向引物区三部分。

利用本发明所述方法组装DNA片段，为证明原理图1中(b)图所示的PCR能够单侧组装DNA片段，如图2所示(图2中，Lane 1为Marker；Lane 2为单侧组装片段；Lane 3为单侧组装片段的末端杂交产物)，由第二泳道可知PCR得到长度约为252bp的片段，与预计片段长度符合；由第三泳道可知，与一互补单链杂交后条带明显靠近胶孔，单侧PCR产物的单链末端与另一核酸链杂交成功，证明了交联引物单链末端在PCR之后仍然存在，该产物可继续充当后续片段组装的反应物。

图3所进行的是图1中(b)图所示的双侧片段组装产物的电泳结果，图3中，Lane 1为Marker；Lane 2为交联引物的双侧片段组装；Lane 3为非交联引物的双侧片段组装。在体系交联引物浓度与普通的反向引物的终浓度比为0.16μM：0.04μM的条件下最终得到与预期相符的电泳条带，图中第2条泳道得到一条明亮电泳条带，大小略小于600bp，与预期条带大小相符合，该条带为正确的扩增产物；作为对比，非交联引物经过相同PCR过程后产物如泳道3所示，经过电泳结果为两条300bp左右的条带，推测PCR产生为两种单侧PCR产物，只有极少数双侧片段的组装产物，说明非交联条件下几乎无法得到双侧片段的组装产物，这进一步证明了使用交联引物组装质粒片段的必要性。

利用双侧交联引物对来源于细菌提取得到的质粒DNA进行组装，本发明选择以pEDA5_GFPmut3_Y66H质粒作为示例，所组装的DNA在质粒上的位置如图4(a)所示。

实验过程如下：

1、交联引物的制备：

1)向浓度为50μM溶于超纯水的的两种单链核酸，用80mM的NaCl溶液在两管中分别稀释至10μM，用超微量分光光度计测定其浓度。将上一步所得的混合溶液吸入PCR管，放入PCR仪中，进行复性杂交。杂交温度设定为：95℃高温变性5分钟，之后复性杂交，65℃10分钟，60℃10分钟，55℃10分钟，37℃5分钟，储存于20℃。

2)得到的溶液加入96孔板中，加入8-methoxypsoralen混匀，之后打开96孔板盖，将96孔板放入紫外发生装置中在室温下进行交联。参数设置为紫外波长365nm，4000μJ/cm²，照射时长为20分钟。交联过程中应当适当摇晃孔板使溶液接受充分照射。待紫外照射结束后取出96孔板，将溶液吸至离心管中保存于4℃冰箱。

2、目的片段的获取：

1)按照质粒小提试剂盒说明书提取质粒，产物从吸附柱上用50μL超纯水洗脱，用超微分光光度计定量，测定四次质粒提取核酸的吸光度与浓度。通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒验证。

2)通过常规PCR，从质粒pEDA5_GFPmut3_Y66H中得到目标片段。PCR反应体系如下表1所示：

表1 50μLPCR反应体系

反应条件如下填表2所示：

表2 PCR反应条件

3、双侧交联引物对目的片段的组装

反应体系如下表3所示：

表3 双侧交联引物对目的片段的组装PCR反应体系

反应条件同上述表2所示。对获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4中(b)所示，得到一条长度约为800bp的条带，即为目标组装产物。

综上所述，本发明的方法相较于其他的基于PCR的组装方法，利用交联引物替代了普通引物，组装更为高效；且本方法可实现一锅组装，不需分步，简便易行

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按照交联引物的功能设计用于组装的交联引物序列，包括构成杂交双链的两条单链核酸；其中：

交联引物的功能区从5’至3’的排列依次为：5’-左侧片段X的反向引物-交联区-右侧交联片段Y的正向引物-3’；两条单链核酸能够特异性互补，长度依据实际组装片段而定，交联引物带有两个方向为5’至3’的单链核酸链；

2)利用步骤1)设计的两条单链核酸制备交联引物；

3)将步骤2)制备的交联引物加入PCR体系，待组装的DNA片段作为PCR反应的模板，经常规PCR反应制得组装产物。

2.根据权利要求1基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，步骤2)中，制备交联引物的方法为：首先按照等物质的量混合正反两种互补单链，之后从95℃至20℃进行复性杂交形成杂交双链，配制交联溶液体系，利用交联剂产生DNA双链链间交联。

3.根据权利要求2基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，两条互补的单链的摩尔浓度均为5μM；交联溶液体系中用到的交联剂的总物质的量应当过量以实现充分交联。

4.根据权利要求2基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，加入的交联剂采用8-methoxypsoralen，其能够在DNA链间形成稳定共价双键，浓度为15mM。

5.根据权利要求1基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)之间还包括验证交联是否成功的操作步骤，包括：对步骤2)获得的交联产物测定Tm值、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证交联成功；通过对交联产物末端杂交单链互补核酸验证交联引物作为引物功能区的单链核酸末端存在且能与交联产物的单链末端互补链杂交。

6.根据权利要求1基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，步骤3)中制得的产物，包括交联引物的一侧片段组装产物以及交联引物的两侧片段组装产物。

7.根据权利要求1基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，PCR反应体系所使用的聚合酶为不具有链置换活性且不具有3’至5’外切酶活性的热稳定DNA聚合酶。

8.根据权利要求7基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，DNA聚合酶为Taq酶。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的基于DNA共价交联的质粒组装方法，其特征在于，步骤3)中所述的PCR反应体系总体积为50μL，包含以下成分：

5U/μL Taq酶，0.25μL；

10×PCR Buffer，Mg²⁺plus，5μL；

质粒，5ng至30ng；

2.5mM dNTP Mixture，4μL；

对于双侧片段的组装，引物用量为反向引物1：交联引物：反向引物2＝1:4:1，体系中终浓度0.04μM：0.16μM：0.04μM；

用水补充至50μL。

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