CN114306372B - 一种中药组合物的多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN114306372B CN202111482088.1A CN202111482088A CN114306372B CN 114306372 B CN114306372 B CN 114306372B CN 202111482088 A CN202111482088 A CN 202111482088A CN 114306372 B CN114306372 B CN 114306372B
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Abstract

本发明提供了一种中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：红参0‑5份、熟地0‑8份、党参5‑8份、山楂0‑5份；并提供了其制备方法和应用。本发明的的特点及优点是：本发明提供的一种中药组合物的多糖提取物及其制备方法和其在制备用于改善胃癌癌前病变各个阶段的药物或保健食品中的应用，通过体内体外实验相结合，建立胃癌前病变模型，证明所述中药组合物多糖提取物对构建PLGC的动物模型，具有显著的改善作用，并进一步揭示了所述中药组合物多糖提取物对改善胃癌前病变的机制。

Description

一种中药组合物的多糖提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物提取物技术领域，具体涉及一种中药组合物的多糖提取物及其制备方法和其在制备用于改善胃癌癌前病变各个阶段的药物中的应用。
背景技术
胃癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一。根据Correa假说，胃癌的演变规律为：正常胃黏正常胃黏膜→慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃癌，胃癌前病变（precancerous lesions of gastric cancer,PLGC）是慢性萎缩性胃炎和侵袭性胃癌之间的“桥梁”，是胃黏膜恶性转变的关键阶段，同时也是关键的治疗＂窗口期＂。通过对胃癌前病变的深入研巧，不但可揭示胃黏膜恶性转变机理，更能实施针对性的一级预防措施，从而降低胃癌的发生率、病死率。
现代医学主要围绕以下几方面，包括根除幽门螺杆菌、抗氧化维生素（ β-胡萝卜素, 维生素C,维生素E等）、COX-2抑制剂等开展对胃癌前病变的逆转研究。目前，在胃癌前病变尚缺乏疗效肯定的治疗药物及理想的治疗方法的情况下，中医药提供了重要的治疗选择。研究表明中医药辨证治疗慢性萎缩性胃炎、肠化生及胃黏膜异型增生安全性好、疗效显著。
从中药中寻找安全、有效的PLGC各个阶段的药物成为近年来研究的热点，从常用的补益类中药中发现对PLGC各个阶段具有改善作用的药物也是本发明的创新。多糖是一类天然大分子物质，主要存在于植物、动物和微生物中。已经发现，大多数多糖是相对无害的，不会产生明显的副作用。另外，多糖的生物活性在口服后得到很好的保持也是公认的。因此，具有广泛生物活性的多糖一直是国内外各个科学领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药组合物的多糖提取物及其制备方法和其在制备用于改善胃癌癌前病变各个阶段的药物中的应用。
本发明的上述目的可采用下列技术方案来实现：
一种中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：红参0-5份、熟地0-8份、党参5-8份、山楂0-5份。
进一步的，上述的一种中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：红参1份、熟地7份、党参7份、山楂3份；或红参1份、熟地7份、党参7份。
进一步的，上述的一种中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的制备方法包括以下步骤：
1）按重量份数称取各中药原料；
2）用乙醇回流脱脂2次，弃去乙醇液，晾至无醇味，再以水煎煮提取三次，合并提取液；
3）将步骤2）得到的合并提取物有浓缩，得浓缩液；
4）步骤3）得到的浓缩液中加入乙醇后，静置，离心得沉淀，将沉淀干燥至恒重，得到多糖提取物粗品I；
5）将步骤4）得到的多糖提取物粗品I，脱色素除蛋白，干燥至恒重，得到多糖提取物粗品II；
6）步骤5）得到的多糖提取物粗品II，经过透析后，再次干燥至恒重，即可得到多糖提取物，其中糖含量占比大于等于90%。
本发明的第二个目的是提供了上述中药组合物多糖提取物的制备方法，包括以下步骤：
1）按重量份数称取各中药原料；
2）用乙醇回流脱脂2次，弃去乙醇液，晾至无醇味，再以水煎煮提取三次，合并提取液；
3）将步骤2）得到的合并提取物有浓缩，得浓缩液；
4）步骤3）得到的浓缩液中加入乙醇后，静置，离心得沉淀，将沉淀干燥至恒重，得到多糖提取物粗品I；
5）将步骤4）得到的多糖提取物粗品I，脱色素除蛋白，干燥至恒重，得到多糖提取物粗品II；
6）步骤5）得到的多糖提取物粗品II，经过透析后，再次干燥至恒重，即可得到多糖提取物，其中糖含量占比大于等于90%。
进一步的，上述中药组合物多糖提取物的制备方法，所述步骤2）中，乙醇的浓度为95%，每次回流提取的乙醇用量为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min，水煎煮提取三次中，水的用量每次为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min。
进一步的，上述中药组合物多糖提取物的制备方法，所述步骤3）中，浓缩液中生药量为1-3g/ml。
进一步的，上述中药组合物多糖提取物的制备方法，所述步骤4）中，乙醇的加入量为加入乙醇至醇浓度为70-85%，静置时间为24h，10000rpm离心15min，沉淀干燥是在60℃以下。
进一步的，上述中药组合物多糖提取物的制备方法，所述步骤5）中，采用Savage法除蛋白，以体积比计多糖提取物粗品I溶液：氯仿：正丁醇=16：4：1混合，振摇，离心，重复多次，采用考马斯亮蓝法测定蛋白，直到数值无变化为止；再采用过氧化氢法脱色素，以体积比计多糖提取物粗品I溶液：过氧化氢=10：1混合，脱色2 h，在60℃以下干燥至恒重。
进一步的，上述中药组合物多糖提取物的制备方法，所述步骤6）中，以截留分子量为8000D以上的透析袋透析，流水透析2d后再用蒸馏水透析2d，干燥至恒重是在60℃以下；多糖提取物中糖含量的测定是采用苯酚硫酸法。
本发明的第三个目的是提供了上述的中药组合物的多糖提取物在制备用于改善胃癌癌前病变各个阶段的药物中的应用。
研究发现，党参多糖具有改善造血功能、改善心力衰竭、抗氧化及抗衰老、调节免疫、保护胃黏膜和抗肿瘤等作用；红参多糖具有增强免疫、抗肿瘤、抗氧化和降血糖等作用；熟地黄多糖具有增强机体造血、增强机体免疫力、抗氧化、抗肿瘤和中枢抑制作用。
本技术从胃粘膜组织形态、胃肠生化指标、炎性因子、抗氧化因子、凋亡相关蛋白表达、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达等多层次，从细胞和整体动物水平研究了有党参、红参、熟地、山楂组成的中药组合物多糖提取物对PLGC的改善作用和机制。
研究结果显示各配伍的多糖提取物包括：
1、党参、红参、熟地、山楂多糖提取物；
2、党参、红参、熟地多糖提取物；
3、红参、熟地多糖提取物；
4、党参多糖提取物。
上述各个中药组合物多糖提取物均显示对PLGC的改善作用，且4味药的多糖提取物活性最强，其余3个多糖提取物作用弱于4味药的多糖提取物。
本发明的的特点及优点是：本发明提供的一种中药组合物的多糖提取物及其制备方法和其在制备用于改善胃癌癌前病变各个阶段的药物中的应用，通过体内体外实验相结合，建立胃癌前病变模型，证明所述中药组合物多糖提取物对构建PLGC的动物模型，具有显著的改善作用，并进一步解释了揭示了所述中药组合物多糖提取物对改善胃癌前病变的机制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示为实验大鼠13周体重改变情况；与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
图 2 显示为大鼠胃黏膜大体形态；(A)正常对照组，(B)模型组，(C)阳性对照组，(D)党参红参熟地山楂多糖低剂量组，(E)党参红参熟地多糖低剂量组，(F)红参熟地多糖低剂量组，(G)党参多糖低剂量组，(H)党参红参熟地山楂多糖高剂量组，(I)党参红参熟地多糖高剂量组，(J)红参熟地多糖高剂量组，(K)党参多糖高剂量组。
图 3显示为大鼠胃黏膜病理学表现；(A)正常对照组，(B)模型组，(C)阳性对照组，(D)党参红参熟地山楂多糖低剂量组，(E)党参红参熟地多糖低剂量组，(F)红参熟地多糖低剂量组，(G)党参多糖低剂量组，(H)党参红参熟地山楂多糖高剂量组，(I)党参红参熟地多糖高剂量组，(J)红参熟地多糖高剂量组，(K)党参多糖高剂量组。
图 4显示为大鼠血清胃肠激素水平变化；(A)胃蛋白酶原I(PGI)/胃蛋白酶原II(PGII)，(B)胃泌素-17(G-17)；正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 5显示为大鼠血清氧化应激标志物水平变化；(A)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，(B) 超氧化物歧化酶(SOD)，(C) 丙二醛(MDA)；与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 6显示为大鼠血清炎症因子水平变化；(A)白介素-1β(IL-1β)，(B) 白介素-6(IL-6)，(C)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 7显示为大鼠凋亡相关蛋白表达结果；(A)蛋白质印迹条带，(B - D)bcl-2/bax和caspase-3的相对水平；与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 8显示为大鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达结果；(A)蛋白质印迹条带，(B - D)bcl-2/bax和caspase-3的相对水平；与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 9显示为AGS与GES细胞存活率变化；(A)AGS细胞，(B)GES细胞；与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与缺氧组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 10显示为AGS细胞凋亡相关蛋白表达结果；(A)蛋白质印迹条带，(B - D)bcl-2/bax和caspase-3的相对水平；与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与缺氧组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 11显示为GES细胞凋亡相关蛋白表达结果；(A)蛋白质印迹条带，(B - D)bcl-2/bax和caspase-3的相对水平；与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与缺氧组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 12显示为AGS细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达结果；(A)蛋白质印迹条带，(B - D)bcl-2/bax和caspase-3的相对水平；与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与缺氧组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
图 13显示为GES细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达结果；(A)蛋白质印迹条带，(B - D)bcl-2/bax和caspase-3的相对水平；与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与缺氧组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本发明的动物实验
（一）实验材料与仪器
1.材料
SOD、GSH-Px和MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；PGⅠ、PGⅡ、G-17、IL-1β、IL-6、TNF-α检测试剂盒（上海凡科维有限公司）；PVDF 膜、Tris、甘氨酸、SDS、PMSF裂解液、ECL发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白酶和磷酸酶抑制剂（北京索莱宝科技有限公司）；氯化钠（天津市大茂化学试剂厂）； Bax、Bcl-2、caspase-3、Wnt-1、β-catenin、TCF-4和β-actin（英国Abcam公司）；人胃腺癌AGS细胞、人正常胃黏膜上皮GES细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）；高糖DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司）；MTT（Sigma，美国）；其他所有化学品都是分析级的。
2.仪器
Thremo-3131三气培养箱（美国Patent公司）；旋转蒸发仪（Eyela，日本）；离心机（Hitachi，日本）；全自动酶标仪（Infinite F50，帝肯（上海）贸易有限公司）；分析天平（FA2004，上海良华仪器仪表有限公司）；HH-2恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；蛋白电泳与转膜装置（JY600MCS-3，北京君意东方电泳设备有限公司）；脱色摇床（TS-2000A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；化学发光成像系统（Tanon 5200，上海天能科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（DHG9070A；上海一恒科学仪器有限公司）；光学显微镜（NikonEclipse E100；北京世纪科信科学仪器有限公司）。
（二）实验方法
1.中药组合物多糖提取物的制备：
1.1一种中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：党参7份、红参1份、熟地7份、山楂3份。
多糖提取物的制备方法包括以下步骤：
1）按重量份数称取各中药原料；
2）用95%乙醇回流提取脱脂2次，弃去乙醇液，晾至无醇味，再以水煎煮提取三次，合并提取液；
3）将步骤2）得到的合并提取物有浓缩，得浓缩液；
4）步骤3）得到的浓缩液中加入乙醇后，静置，离心得沉淀，将沉淀干燥至恒重，得到多糖提取物粗品I；
5）将步骤4）得到的多糖提取物粗品I，脱色素除蛋白，干燥至恒重，得到多糖提取物粗品II；
6）步骤5）得到的多糖提取物粗品II，经过透析后，再次干燥至恒重，即可得到多糖提取物，其中糖含量占比大于等于90%。
步骤2）中，乙醇的浓度为95%，每次回流提取的乙醇用量为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min，水煎煮提取三次中，水的用量每次为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min。
步骤3）中，浓缩液中生药量为1-3g/ml。
步骤4）中，乙醇的加入量为加入乙醇至醇浓度为70-85%，静置时间为24h，10000rpm离心15min，沉淀干燥是在60℃以下。
步骤5）中，采用Savage法除蛋白，以体积比计多糖提取物粗品I溶液：氯仿：正丁醇=16：4：1混合，振摇，离心，重复多次，采用考马斯亮蓝法测定蛋白，直到数值无变化为止；再采用过氧化氢法脱色素，以体积比计多糖提取物粗品I溶液：过氧化氢=10：1混合，脱色2 h，在60℃以下干燥至恒重。
步骤6）中，以截留分子量为8000D以上的透析袋透析，流水透析2d后再用蒸馏水透析2d，干燥至恒重是在60℃以下；多糖提取物中糖含量的测定是采用苯酚硫酸法。
1.2中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：党参7份、红参1份、熟地7份。
所述多糖提取物的制备方法如1.1。
1.3中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：红参1份、熟地7份。
所述多糖提取物的制备方法如1.1。
1.4中药组合物的多糖提取物，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：党参7份。
所述多糖提取物的制备方法如1.1。
2.动物实验方法
2.1 动物分组与给药
120只雄性健康Wistar大鼠，购自兰州大学动物中心，体重180-220 g，分笼喂养于室温25±2℃、湿度55-60％的室内，自由进食进水，12 h昼夜循环。所有程序均按照世界医学会的道德规范执行，并经兰州大学药学院伦理委员会批准。
适应性生长1周后，将SD大鼠随机分为11组，模型组20只，其余每组10只，分组如下：正常对照组、模型组、阳性对照组（维酶素，270mg/kg）、党参红参熟地山楂多糖低剂量组（350mg/kg）、党参红参熟地山楂多糖高剂量组（1400 mg/kg）、党参红参熟地多糖低剂量组（250 mg/kg）、党参红参熟地多糖低高剂量组（1000 mg/kg）、红参熟地多糖低剂量组（80mg/kg）、红参熟地多糖高剂量组（320 mg/kg）、党参多糖低剂量组（110 mg/kg）、党参多糖高剂量组（440 mg/kg）。除正常对照组党参外，其余大鼠每三天灌胃给予5mg/mL的MNNG溶液（40%乙醇溶液）10mL/kg结合不规则饮食（饱足2天，禁食1天，两者交替进行），诱导胃癌前病变模型。阳性对照组与多糖治疗组每天分别灌胃给与按剂量配置好的维霉素、多糖药物水分散液10mL/kg，模型组和正常对照组每日灌胃相同量蒸馏水，连续13周。每天记录各组大鼠的大体动物特征，每2周记录1次大鼠体重。
2.2 实验末，将大鼠禁食过夜，次日对所有大鼠称重，以7%水合氯醛（5ml/kg）腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血，2ml注入EDTA-K2采血管中，测定血常规，剩余血液注入无促凝剂采血管中，静置半小时，后以3000rpm转速共离心10min，取上层血清分装标记后保存在-80°C用于生化和ELISA分析；取大鼠胃组织，观察胃组织外部的形态结构，沿胃大弯剪开，用生理盐水将胃黏膜表面清洗干净，展平后肉眼观察胃黏膜的结构形态和色泽，沿中线（即胃小弯侧中间线）剪开，拍照，一半固定于10%多聚甲醛进行组织学检查，另一半保存在-80°C进行WB分析。
2.3胃组织病理学检查
将胃组织固定在10%多聚甲醛中24 h以上，然后用75%的醇脱水并包埋在石蜡中，切成4 μm厚的切片，用苏木精和曙红（H＆E）染色，并在光学显微镜下观察胃组织情况。
2.4血清中胃肠激素与炎症因子的测定
使用ELISA试剂盒测定血清中PGⅠ、PGⅡ、G-17、IL-1β、IL-6和TNF-α含量；具体步骤遵循试剂盒方法。
2.5血清中活性氧指数的测定
使用生化试剂盒测定血清中SOD、GSH-PX活力和MDA含量；具体步骤遵循试剂盒方法。
2.6Western Blot分析
取-80°C冷冻的胃组织样品加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液于冰上放置30 min，在此期间匀浆两次（50 Hz），每次1 min。然后，将匀浆液在4°C下离心（12000rpm, 5 min），并收集上清液。根据制造商的说明，使用BCA蛋白测定法确定上清液蛋白浓度。95℃变性5min后，将每孔等量的蛋白样品加载于10%SDS-PAGE凝胶上进行分离，然后转移至PVDF膜。在室温下，将膜在封闭溶液（含5%脱脂奶粉的TBS-T）中孵育2小时，然后使用特异性一抗：Bcl-2（1:1000）、Bax（1:1000）、caspase-3（1:1000）、Wnt-1（1:1000）、β-catenin（1:1000）、TCF-4（1:1000）和β-actin（1:2000）分别4°C孵育过夜，之后再用TBS-T洗涤4次，每次10 min。然后加入相应的二抗（1:5000）在室温孵育1.5 h后，TBS-T清洗2次，每次10min；最后用ECL发光液显色后采用化学发光成像系统检测。
2.7数据分析
数据SPSS19.0进行统计学分析，计算各组检测数值的平均值和标准差，用K-S检验数据是否符合正态分布，若渐进显著性>0.05，说明满足正态分布；进行T检验，显著性差异水平P<0.05，P<0.01。
3 细胞实验方法
3.1.细胞培养
人胃腺癌AGS细胞与人正常胃黏膜上皮GES细胞，在37℃、5%CO2饱和湿度条件下置于含10%的胎牛血清、0.5mL的青链霉素混合液的高糖DMEM培养基中，常规培养，每1-2天换液更换培养基，每2-4天用0.25%胰酶消化传代培养。
细胞传至第3代时，将细胞置于37℃，5%CO2、1%O2、94%N2的三气孵箱内培养，作为缺氧组；将37℃、21%O2、5%CO2条件下与实验组培养相同时间细胞作为常氧组。
3.2.MTT比色测定评价细胞毒性
取生长到90%的细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，取96孔板，接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液。置于37℃，5%CO2培养箱培养，至细胞单层基本铺满96孔板底层，不同组别分别加入DMEM培养液、多糖提取物溶液（1mg·mL-1）进行干预，设DMEM培养液为对照组，平行8个复孔，继续常氧或缺氧条件下培养48 h后，吸取各孔中的液体，每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液10μL，孵育4h，然后吸取各孔中的液体，每孔加入DMSO100μL，振荡混匀，室温放置10min，使结晶充分溶解并混匀，在全自动酶标仪570nm处测定各组吸光度值（即OD值）。
3.3.Western Blot分析
将处于指数生长期的细胞种于6孔板中，按实验设计加入1mg·mL-1的多糖提取物溶液，接种后培养7d终止培养。采用RIPA缓冲液提取细胞中的蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒，根据说明书测定蛋白浓度。然后，将每个样品中的40μg/10μL蛋白上传到12%SDS-PAGE上，电泳转移到PVDF膜。随后，用5%脱脂奶粉封闭。之后，用一抗孵育，在4℃下过夜。次日回收一抗，二抗孵育，ECL显色液显色，使用ImageJ软件对结果进行分析。
（三）实验结果
1.动物实验的结果
1.1大鼠直观观察描述及体重变化
一般观察来看，造模结束时，正常对照组大鼠活跃度较高，饮食饮水功能良好，精神状态良好，体型健硕，皮毛浓密有光泽；模型组胃癌前病变大鼠则普遍喜蜷卧扎堆，精神状态萎靡，嗜卧，拱背，眯眼，憔悴，自主活动减少，饮食饮水减少，对刺激反应程度亦不如正常组大鼠灵敏，抓取吋挣扎疲软无力，体形普遍均较正常对照组大鼠瘦小，皮毛较乱呈爆炸状，失去光泽。治疗组一般情况均较模型组有所好转，精神萎靡、活动减少等症状表现均有不同程度减轻，活动反应灵敏度有所改善，食欲改善，体重略有增长，其中高剂量组好转明显。
观察大鼠给药治疗后的体重，经过干预后，阳性对照组与多糖治疗组大鼠体重较模型组增加，但差异无统计学意义（p＞0.05），表明中药组合物的多糖提取物对胃癌前病变大鼠体重有增长作用。结果见图 1。
1.2.大鼠胃黏膜病理改变
观察大鼠胃组织大体形态观察发现，正常对照组大鼠胃部呈粉红色，胃壁有弹性，皱襞较深，走向整齐有序，黏膜颜色橘红，被覆较多粘液，表面光滑有光泽，未见出血点或水肿等明显异常。模型组大鼠胃壁弹性减低，皱襞低平、稀少甚至消失，走向紊乱，胃黏膜明显变薄，表面色泽晦暗，无光泽，黏膜表面出现出现大小不等、数量不一的瘤样增生结节，个别出现糜烂、血窦等，粘液变少。阳性对照组与多糖治疗组大鼠肌层有弹性，胃部有较多粘液，有光泽，无出血点，表面无异常增生物等，未见明显异常。结果见图 2。
光镜下 HE 切片观察胃组织切面显示，正常对照组大鼠胃组织均呈正常形态，腺体形态结构完整，腺体数量无减少，排列整齐，未见或极少见炎症细胞浸润、腺体萎缩或结构异常等病变。与正常对照组相比，模型组胃黏膜组织腺体萎缩明显，腺体数目则显著减少，腺体结构紊乱，排列失去规则，大小不一，粘膜层变薄。与模型组相比，阳性对照组大鼠胃黏膜改善明显，少有糜烂及缺损，腺体排列稍显紊乱；多糖治疗组胃组织损伤较模型组明显减轻，腺体数量无明显减少，排列基本整齐，未见肠上皮化生等病变。结果见图 3。
1.3.大鼠血常规参数结果
研究结果显示，各组大鼠在红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、血小板/淋巴细胞比值（PLR）方面，差异有统计学意义（p＜0.05），见表1-1。与正常对照组比较，模型组大鼠RBC、HGB均显著降低（p<0.01），PLT、PLR均显著升高（p<0.01）。经过药物干预后，与模型组比较，阳性对照组与多糖治疗组大鼠RBC、HGB的水平均升高（p<0.05，p<0.01），PLT、PLR的水平均下降（p<0.05，p<0.01）。大鼠血常规参数结果比较如下表1所示：
表1
白细胞（WBC）*109/L 红细胞（RBC）*1012/L 血红蛋白（HGB）g/L 血小板（PLT）*109/L 淋巴细胞（W-SCC）*109/L 血小板/淋巴细胞比值（PLR）
正常对照组 9.50±2.21 11.37±0.66 186.67±5.03 1269.00±86.43 8.43±1.81 153.53±21.62
模型组 8.90±1.41 8.18±0.95** 143.33±12.34** 1694.33±35.30** 7.73±0.72 220.74±34.18**
阳性对照组 9.57±1.44 11.61±0.58## 189.67±12.22## 1349.67±316.18## 8.70±1.39 158.8±51.79#
党参红参熟地山楂多糖低剂量组 9.45±0.64 10.07±0.95## 166.00±7.07## 1541.00±62.23## 8.40±0.57 184.12±19.81#
党参红参熟地山楂多糖高剂量组 9.80±0.99 10.57±0.63## 171.00±1.41## 1437.00±114.55## 8.40±0.85 171.26±3.66##
党参红参熟地多糖低剂量组 9.90±0.57 10.32±1.00## 161.00±12.73## 1519.50±45.96## 7.55±0.78 202.65±26.96
党参红参熟地多糖高剂量组 9.85±0.64 10.29±0.20## 166.00±1.41## 1453.00±287.09 8.30±0.42 174.4±25.67#
红参熟地多糖低剂量组 9.35±0.21 9.93±0.53## 160.50±4.95# 1685.50±153.44 8.35±0.07 201.94±20.09
红参熟地多糖高剂量组 10.05±1.06 10.17±0.80## 161.50±3.54## 1440.00±65.05## 8.30±0.57 174.17±19.71#
党参多糖低剂量组 9.60±4.10 10.23±0.30## 164.00±1.41## 1647.00±265.87 8.60±1.70 198.43±70.07
党参多糖高剂量组 9.95±0.07 10.17±0.17## 166.50±4.95## 1456.50±71.42## 8.35±0.49 174.99±18.93#
注：与正常对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05，##p＜0.01。
1.4.大鼠血清胃肠激素水平变化
釆用ELISA法检测大鼠血清血清胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）和胃泌素-17（G-17）的水平，模型组大鼠血清PGI/II与G-17水平明显降低，与正常对照组相比，具有显著性差异（p＜0.01）；给予多糖提取物干预之后，大鼠血清PGI/II、G-17水平均有增加（p＜0.05，p＜0.01），高剂量组大鼠血清PGI/II、G-17水平增加与低剂量组相比较为明显，呈现剂量相关性。实验结果见图 4。
1.5.大鼠血清炎症因子水平变化
与正常对照组比较，模型组大鼠血清白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平明显升高（p＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组与多糖治疗组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均出现降低（p＜0.05，p＜0.01），高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低与低剂量组相比较为明显，呈现剂量相关性。结果见图 5。
1.6.大鼠血清活性氧指数水平变化
与正常对照组比较，模型组大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平降低，丙二醛（MDA）水平升高（p＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组与多糖治疗组大鼠血清SOD、GSH-Px水平均明显升高，丙二醛（MDA）水平降低（p＜0.05，p＜0.01）；高剂量组大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平变化与低剂量组相比较为明显，呈现剂量相关性。结果见图6。
1.7.大鼠凋亡相关蛋白表达结果
与正常对照组比较，模型组大鼠胃黏膜bcl-2/bax表达水平显著上升，caspase-3表达水平显著下降（p＜0.01）。与模型组比较，多糖提取物减弱了bcl-2/bax的表达，增加了caspase-3的表达（p＜0.05，p＜0.01），特别是在高剂量组下。结果见图7。
1.8.大鼠Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达结果
与正常对照组比较，模型组大鼠胃黏膜wnt-1、β-catenin、tcf-4表达水平均显著上升（p＜0.01）。与模型组比较，多糖提取物减弱了wnt-1、β-catenin、tcf-4的表达（p＜0.05，p＜0.01），特别是在高剂量组下。结果见图 8。
结果表明：中药组合物的多糖提取物可以改善胃癌前病变大鼠一般情况，提高体重，改善胃黏膜病变，胃肠激素、改善炎症因子的分泌，调节氧化应激，调控细胞凋亡，下调Wnt/β-catenin信号通路，达到治疗胃癌前病变的作用。
2细胞实验结果
2.1 AGS与GES细胞存活率
缺氧条件下培养AGS与GES细胞48小时后，MTT法检测细胞的生长、增殖，随着缺氧时间的延长，AGS细胞存活率逐渐增高，GES细胞存活率逐渐降低（p＜0.01）。说明一定程度的缺氧会促进胃癌AGS细胞的增殖，生物学行为发生变化以适应缺氧，同时缺氧会抑制正常胃黏膜细胞的增殖。
在常氧和低氧条件下，多糖提取物作用于AGS细胞48h后，其对AGS细胞生长均有抑制效应，差异具有统计学意义（p＜0.01）。
在低氧条件下，多糖提取物作用于GES细胞48h后，其对GES细胞生长均有促进效应，差异具有统计学意义（p＜0.01）。结果见图 9。
2.2 AGS与GES细胞凋亡相关蛋白表达结果
与对照组比较，缺氧组AGS细胞胃黏膜bcl-2/bax表达水平显著上升，caspase-3表达水平显著下降（p＜0.01）。与缺氧组比较，多糖提取物减弱了AGS细胞bcl-2/bax的表达，增加了caspase-3的表达（p＜0.05，p＜0.01），结果见图 10。
与对照组比较，缺氧组GES细胞胃黏膜bcl-2/bax表达水平显著下降，caspase-3表达水平均显著上升（p＜0.01）。与缺氧组比较，多糖提取物减弱了GES细胞caspase-3的表达，增加了bcl-2/bax的表达（p＜0.05，p＜0.01），结果见图 11。
2.3 AGS与GES细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达结果
与对照组比较，缺氧组AGS细胞wnt-1、β-catenin、tcf-4表达水平均显著上升（p＜0.01）。与缺氧组比较，多糖提取物减弱了AGS细胞wnt-1、β-catenin、tcf-4的表达（p＜0.05，p＜0.01），结果见图 12。
与对照组比较，缺氧组GES细胞wnt-1、β-catenin、tcf-4表达水平均显著下降（p＜0.01）。与缺氧组比较，多糖提取物增加了GES细胞wnt-1、β-catenin、tcf-4的表达（p＜0.05，p＜0.01），结果见图 13。
多糖提取物通过抑制AGS细胞增殖，抑制AGS细胞中Wnt/β-catenin信号通路的异常激活；促进GES细胞增殖，激活GES细胞中Wnt/β-catenin信号通路，发挥对Wnt/β-catenin信号通路的双重调节作用，从而发挥治疗作用。
综上所述，中药组合物的多糖提取物可能通过Wnt/β-catenin等信号转导通路来调控胃黏膜上皮细胞凋亡，下调bcl-2蛋白表达及上调bax蛋白表达，从而实现对胃癌前病变的干预影响。
（四）结论
研究结果表明，中药组合物的多糖提取物主要从整体动物，器官，组织和蛋白表达多个水平上均表现出明显的治疗胃癌前病变作用。具体而言，中药组合物的多糖提取物可以改善胃癌前病变大鼠一般情况，提高体重，改善胃黏膜病变，胃肠激素、改善炎症因子的分泌，调节氧化应激，下调Wnt/β-catenin信号通路，继而促进凋亡蛋白caspase-3的表达水平，抑制Bcl-2/Bax的比率，促进细胞凋亡，达到治疗胃癌前病变的作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种用于改善胃癌癌前病变各个阶段的中药组合物的多糖提取物，其特征在于，所述多糖提取物的原料为按照重量份计的以下中药原料：红参1份、熟地7份、党参7份、山楂3份；所述多糖提取物的制备方法包括以下步骤：
1）按重量份数称取各中药原料；
2）用乙醇回流脱脂2次，弃去乙醇液，晾至无醇味，再以水煎煮提取三次，合并提取液；乙醇的浓度为95%，每次回流提取的乙醇用量为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min，水煎煮提取三次中，水的用量每次为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min；
3）将步骤2）得到的合并提取物有浓缩，得浓缩液；
4）步骤3）得到的浓缩液中加入乙醇后，静置，离心得沉淀，将沉淀干燥至恒重，得到多糖提取物粗品I；乙醇的加入量为加入乙醇至醇浓度为70-85%，静置时间为24h，10000rpm离心15min，沉淀干燥是在60℃以下；
5）将步骤4）得到的多糖提取物粗品I，脱色素除蛋白，干燥至恒重，得到多糖提取物粗品II；
6）步骤5）得到的多糖提取物粗品II，经过透析后，再次干燥至恒重，即可得到多糖提取物，其中糖含量占比大于等于90%。
2.一种如权利要求1所述的用于改善胃癌癌前病变各个阶段的中药组合物多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）按重量份数称取各中药原料；
2）用乙醇回流脱脂2次，弃去乙醇液，晾至无醇味，再以水煎煮提取三次，合并提取液；乙醇的浓度为95%，每次回流提取的乙醇用量为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min，水煎煮提取三次中，水的用量每次为中药原料总量的8-12倍，提取时间为40-90min；
3）将步骤2）得到的合并提取物有浓缩，得浓缩液；
4）步骤3）得到的浓缩液中加入乙醇后，静置，离心得沉淀，将沉淀干燥至恒重，得到多糖提取物粗品I；乙醇的加入量为加入乙醇至醇浓度为70-85%，静置时间为24h，10000rpm离心15min，沉淀干燥是在60℃以下；
5）将步骤4）得到的多糖提取物粗品I，脱色素除蛋白，干燥至恒重，得到多糖提取物粗品II；
6）步骤5）得到的多糖提取物粗品II，经过透析后，再次干燥至恒重，即可得到多糖提取物，其中糖含量占比大于等于90%。
3.根据权利要求2所述的用于改善胃癌癌前病变各个阶段的中药组合物多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中，浓缩液中生药量为1-3g/ml。
4.根据权利要求2所述的用于改善胃癌癌前病变各个阶段的中药组合物多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中，采用Savage法除蛋白，以体积比计多糖提取物粗品I溶液：氯仿：正丁醇=16：4：1混合，振摇，离心，重复多次，采用考马斯亮蓝法测定蛋白，直到数值无变化为止；再采用过氧化氢法脱色素，以体积比计多糖提取物粗品I溶液：过氧化氢=10：1混合，脱色2 h，在60℃以下干燥至恒重。
5.根据权利要求2所述的用于改善胃癌癌前病变各个阶段的中药组合物多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤6）中，以截留分子量为8000D以上的透析袋透析，流水透析2d后再用蒸馏水透析2d，干燥至恒重是在60℃以下；多糖提取物中糖含量的测定是采用苯酚硫酸法。
6.根据权利要求1-5任一所述的用于改善胃癌癌前病变各个阶段的中药组合物的多糖提取物在制备用于改善胃癌癌前病变各个阶段的药物中的应用。
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