CN114306365A - 一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置，包括脱氧肌苷提取单元和脱氧肌苷试验单元，所述脱氧肌苷提取单元包括血浆收集模块、高分辨液质联用仪、Simca‑p软件、对比模块和化合物数据库。本发明通过血浆非靶向代谢组学筛选出具有显著差异的代谢产物脱氧肌苷(deoxyinosine，DI)，并验证了脱氧肌苷在类风湿性关节炎中治疗作用，本发明从RA血浆非靶向代谢组学，筛选出了一种内源性小分子物质—脱氧肌苷(DI)，通过细胞和动物实验证明了DI可以通过抑制机体炎症反应，从而缓解了类风湿性关节炎小鼠局部症状，为抗风湿药物研发提供新方向。DI有望成为一种更加安全的药物用于治疗类风湿性关节炎。

Description

一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置

技术领域

本发明涉及类风湿性关节炎技术领域，具体为一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置。

背景技术

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种常见的自身免疫疾病。患者临床表现为外周关节持续性滑膜炎，最终导致软骨侵蚀和骨质的破坏。类风湿性关节炎可发病于任何年龄段，全球发病率为0.5％-1％，我国的发病率为0.42％，男女患病比例约在1：4。RA患者如果不能接受及时且有效的治疗，病情会逐步加重，最终会引起关节畸形和功能障碍，甚至残疾，影响患者的日常生活能力，也给患者家庭和社会带来巨大的经济负担。

类风湿性关节炎治疗的主要目的在于减轻关节炎症反应，抑制病变发展，尽可能保护关节和肌肉的功能，最终达到病情完全缓解或降低疾病活动度的目标。尽管目前RA的治疗已取得了良好的发展，但是其确切发病机制仍未阐明，所以目前还没有一种药物能够彻底治愈RA。药物治疗主要包括非甾体类抗炎药、抗风湿药、免疫抑制剂、生物制剂及植物药等。但这些药物普遍副作用大，不良反应多，且某些生物制剂价格极为昂贵，大多数患者都难以承受。因而进一步探究RA的发病机制和寻找更加安全有效且价格低廉的化合物治疗RA是目前亟待解决的问题。

随着近年来针对RA的研究不断发展完善，RA在代谢组学研究方面亦取得了一定的进展。代谢组学是继基因组学和蛋白组学后新发展起来的一门学科，通过谱学分析技术，对生物体内小分子内源性代谢产物进行分析，以阐明机体生物学的变化本质和机制。通过代谢组学这一分析手段，可以更好的了解RA的发病机制以及发现新的治疗RA的潜在靶点，为诊断和治疗RA提供一个新的领域。

脱氧肌苷是一种嘌呤类核苷，分子式为C10H12N4O4，存在于DNA中，腺苷脱氨酶(ADA)催化腺苷和脱氧腺苷分别转化为肌苷和脱氧肌苷。ADA缺乏的个体患有严重的联合免疫缺陷，此外，脱氧肌苷被发现与嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏有关，这是一种天生的代谢错误。目前尚没有文献报道脱氧肌苷具有预防或治疗类风湿性关节炎的作用。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置，具备验证了脱氧肌苷具有预防或治疗类风湿性关节炎的作用，为抗风湿药物研发提供新方向的优点，解决了现有治疗类风湿性关节炎药物普遍副作用大，不良反应多，且某些生物制剂价格极为昂贵，大多数患者都难以承受的问题。

本发明提供如下技术方案：一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置，包括脱氧肌苷提取单元和脱氧肌苷试验单元，所述脱氧肌苷提取单元包括血浆收集模块、高分辨液质联用仪、Simca-p软件、对比模块和化合物数据库，所述高分辨液质联用仪与Simca-p软件电性连接，所述Simca-p软件和化合物数据库均与对比模块电性连接，所述脱氧肌苷试验单元包括巨噬细胞炎症试验模块、脓毒血症炎症试验模块和类风湿性关节炎试验模块。

作为本发明优选的，所述血浆收集模块包括健康血浆和RA患者血浆。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明通过血浆非靶向代谢组学筛选出具有显著差异的代谢产物脱氧肌苷(deoxyinosine，DI)，并验证了脱氧肌苷在类风湿性关节炎中治疗作用，本发明从RA血浆非靶向代谢组学，筛选出了一种内源性小分子物质—脱氧肌苷(DI)，通过细胞和动物实验证明了DI可以通过抑制机体炎症反应，从而缓解了类风湿性关节炎小鼠局部症状，为抗风湿药物研发提供新方向。脱氧肌苷是一种人体内源性成分，毒性较小。DI有望成为一种更加安全的药物用于治疗类风湿性关节炎。

附图说明

图1为本发明原理框图；

图2为本发明类风湿性关节炎试验模块流程图示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1至图2所示，一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置，包括脱氧肌苷提取单元和脱氧肌苷试验单元，脱氧肌苷提取单元包括血浆收集模块、高分辨液质联用仪、Simca-p软件、对比模块和化合物数据库，血浆收集模块包括健康血浆和RA患者血浆，高分辨液质联用仪与Simca-p软件电性连接，Simca-p软件和化合物数据库均与对比模块电性连接，脱氧肌苷试验单元包括巨噬细胞炎症试验模块、脓毒血症炎症试验模块和类风湿性关节炎试验模块。

本发明的技术方案如下，首先，收集RA患者的血浆和健康人的血浆，对血浆进行预处理，通过高分辨液质联用仪(Q Exactive LC-MS/MS)进行代谢组学研究，使用Simca-p软件对质谱数据多元统计分析，获得差异的代谢产物脱氧肌苷。

其次，探究脱氧肌苷能否抑制由LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应。研究显示，脱氧肌苷可以显著抑制iNOS和COX2的蛋白表达，并且还具有抗氧化应激的作用。qPCR结果显示DI可以显著抑制TNF-α，IL-1β的mRNA表达。

然后，构建脓毒血症小鼠模型，采用小鼠灌胃给药DI，观察DI对小鼠的抗炎作用影响。结果显示，连续给药后，与模型组相比，DI明显能提高小鼠的生存率，表明DI具有较强的抗炎作用。

最后，构建了胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型(CIA)，采用灌胃给药脱氧肌苷，观察DI对小鼠局部关节炎症的治疗作用。结果显示，连续给药DI后，小鼠的关节受损形态明显恢复，炎症因子表达明显下调。表明DI可以显著缓解类风湿性关节炎症状，保护关节功能。

本发明的工作原理及使用流程：脱氧肌苷提取单元工作时，收集RA患者血浆和健康血浆，对血浆进行预处理，通过高分辨液质联用仪(Q Exactive LC-MS/MS)对血浆样本进行快速扫描和定性分析，使用Simca-p软件对获得的质谱数据多元统计分析，后续根据质谱二级碎片的精确分子量与化合物数据库中的数据通过对比模块进行比对，获得差异显著的代谢产物脱氧肌苷。

将脱氧肌苷应用于脱氧肌苷试验单元中进行试验，首先，通过巨噬细胞炎症试验模块试验DI抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应，试验时，使用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激小鼠巨噬细胞(RAW264.7)构建细胞炎症模型。将RAW264.7细胞铺板于12孔培养板，分为四组，对照组，模型组(LPS10ng/mL)，给药组1(LPS 10ng/mL+DI 400μM)，给药组2(LPS 10ng/mL+DI 800μM)作用6小时后，将细胞裂解，制备蛋白样品，用SDS-PAGE电泳后，转至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗(iNOS，COX2)4℃孵育过夜，TBST洗涤后，加入兔二抗室温孵育1h，TBST洗涤后，加入发光底物进行曝光、显影和定影。

随后同上细胞分组，获取细胞总RNA，加入500μL TRIzol，室温静置5min，然后转移到1.5mL EP管，加入100μL氯仿上下摇晃10s，4度，12000rmp离心10min。取上层液体，加入异丙醇，混匀静置10min，4度，12000rmp离心10min。吸弃液体，加入RNA free水，反转录。上机荧光定量PCR。

其次，通过脓毒血症炎症试验模块试验DI抑制脓毒血症小鼠模型炎症反应，试验时，使用LPS(10mg/kg)腹腔注射BALB/c小鼠构建脓毒血症模型。实验分为五组，空白组(control)，模型组(LPS10 mg/kg)，给药组1(DI 50mg/kg+LPS 10mg/kg)，给药组2(DI200mg/kg+LPS 10mg/kg)，给药组3(DI 800mg/kg+LPS 10mg/kg)，DI为灌胃给药，一天2次。模型组在腹腔注射高剂量的LPS 24小时内全部死亡，而给与不同剂量DI干预后，均延长了小鼠的生存时间，具有统计学差异，说明DI具有较强的抗炎作用。

然后，通过类风湿性关节炎试验模块试验DI缓解CIA模型小鼠局部关节肿胀，为了进一步分析DI的抗类风湿性关节炎作用，试验时，采用DBA/1小鼠构建胶原诱导的类风湿性关节炎模型(CIA)，将小鼠用水合氯醛麻醉，用75％的酒精棉球消毒背部皮肤，每只实验小鼠背部取4-6点进行皮下注射，总共200μL胶原-完全弗氏佐剂混合乳剂。三周后，用同样的方法将不完全弗氏佐剂与牛II型胶原乙酸溶液等量混合并乳化，于每只小鼠尾根部取3-5点进行皮下注射，总共100μl，进行加强免疫。正常对照组小鼠按照上述方法注射无菌生理盐水。在第二次免疫前一天进行DI灌胃给药，一天2次，35天后处死，期间每三天测量体重和关节肿胀度。

最后，提取CIA小鼠的四肢，发病部位组织，血液以及脾脏。通过TRizol试剂提取组织总RNA，然后逆转录成cDNA，然后通过Realtime qPCR的方法检测小鼠发病部位组织中IL-6的表达水平。结果显示，与模型组相比，DI能显著CIA小鼠的四肢关节肿胀，降低小鼠炎症因子的表达，抑制小鼠免重要疫器官脾脏的肿大。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置，包括脱氧肌苷提取单元和脱氧肌苷试验单元，其特征在于：所述脱氧肌苷提取单元包括血浆收集模块、高分辨液质联用仪、Simca-p软件、对比模块和化合物数据库，所述高分辨液质联用仪与Simca-p软件电性连接，所述Simca-p软件和化合物数据库均与对比模块电性连接，所述脱氧肌苷试验单元包括巨噬细胞炎症试验模块、脓毒血症炎症试验模块和类风湿性关节炎试验模块；其具体提取试验步骤如下：收集RA患者的血浆和健康人的血浆，对血浆进行预处理，通过高分辨液质联用仪(Q Exactive LC-MS/MS)进行代谢组学研究，使用Simca-p软件对质谱数据多元统计分析，获得差异的代谢产物脱氧肌苷；

其次，探究脱氧肌苷能否抑制由LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7的炎症反应。研究显示，脱氧肌苷可以显著抑制iNOS和COX2的蛋白表达，并且还具有抗氧化应激的作用。qPCR结果显示DI可以显著抑制TNF-α，IL-1β的mRNA表达；

然后，构建脓毒血症小鼠模型，采用小鼠灌胃给药DI，观察DI对小鼠的抗炎作用影响。结果显示，连续给药后，与模型组相比，DI明显能提高小鼠的生存率，表明DI具有较强的抗炎作用；

最后，构建了胶原诱导的类风湿性关节炎小鼠模型(CIA)，采用灌胃给药脱氧肌苷，观察DI对小鼠局部关节炎症的治疗作用。结果显示，连续给药DI后，小鼠的关节受损形态明显恢复，炎症因子表达明显下调，表明DI可以显著缓解类风湿性关节炎症状，保护关节功能。

2.根据权利要求1所述的一种基于脱氧肌苷治疗类风湿性关节炎的提取试验装置，其特征在于：所述血浆收集模块包括健康血浆和RA患者血浆。

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