CN114302964A

CN114302964A - 质粒

Info

Publication number: CN114302964A
Application number: CN202080059527.5A
Authority: CN
Inventors: A·波尔斯
Original assignee: Snip Bio Formation Co ltd
Current assignee: Snip Bio Formation Co ltd
Priority date: 2019-08-23
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2022-04-08
Also published as: WO2021037732A1; EP4017982A1; CA3148395A1; AU2020336866A1; US20220275380A1; JP2022545501A; GB201912176D0; BR112022001414A2

Abstract

本发明涉及用于在细菌之间进行接合的手段，并且具体地讲本发明涉及包含抗微生物剂的载体(即供体)细菌和使用方法。载体细菌能够将编码所述抗微生物剂的DNA接合转移至靶细胞(即受体细胞)。出于这些目的，本发明提供缺乏功能性hypC2核苷酸序列的新质粒。

Description

质粒

技术领域

本发明涉及用于在细菌之间进行接合的手段，并且具体地讲本发明涉及包含抗微生物剂的载体(即供体)细菌和使用方法。载体细菌能够将编码所述抗微生物剂的DNA接合转移至靶细胞(即受体细胞)中。出于这些目的，本发明提供缺乏功能性hypC2核苷酸序列的新质粒。

背景

控制染色体外复制(ori)和转移(tra)的DNA序列彼此不同；即复制序列通常不控制质粒转移，或者反之亦然。复制和转移两者均为利用质粒和宿主编码功能两者的复杂分子过程。细菌接合为遗传信息从一种细菌到另一种细菌的单向和水平传递。转移的遗传物质可为质粒，或者其可为染色体的一部分。具有接合质粒的细菌细胞含有表面结构(性菌毛)，其参与供体和受体细胞的偶联以及遗传信息的转移。接合涉及细胞之间的接触，并且遗传性状的转移可由许多质粒介导。在所有自然转移机制中，接合为最有效的。例如，大肠杆菌的F质粒、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的pCF10质粒和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的pXO16质粒采用不同的接合对建立机制，接合聚集体的大小不同，并且其在革兰氏阴性(F)以及革兰氏阳性(pCF10和pXO16)细菌内具有不同的宿主范围。它们的质粒大小也不同；分别为54、100和200 kb。然而，值得注意的是，这些接合系统具有非常重要的共同特征：其能够在液体介质中维持接合转移，并且通常在非常短的时间内达到接近100%的转移效率。因此，接合过程允许保护质粒DNA免受环境核酸酶的影响，并将质粒DNA非常有效地递送到受体细胞中。接合功能为天然质粒编码的。许多接合质粒(和转座子)为已知的，其可在一个物种内(狭窄的宿主范围)或在许多物种之间(广泛的宿主范围)转移相关基因。已报道了许多革兰氏阳性菌属中的可传播质粒，所述革兰氏阳性菌属包括(但不限于)链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)和诺卡氏菌属(Nocardia)的致病菌株。接合的早期阶段在革兰氏阴性和革兰氏阳性菌中通常不同。革兰氏阴性菌接合质粒中一些转移基因的作用为提供菌毛介导的细胞间接触、接合孔的形成和相关的形态功能。菌毛似乎不参与启动革兰氏阳性菌的接合。

发明概述

本发明提供：

在第一配置中

一种缺乏hypC2核苷酸序列或其同源物的接合质粒。

在第二配置中

一种包含接合质粒的细菌细胞，其中细胞不包含hypC2蛋白或其同源物。

在第三配置中

本发明的质粒在制造组合物中的用途，所述组合物包含含有质粒的第一细胞群，用于在第一和第二细胞彼此接触时，提高质粒从第一细胞到第二群体的细胞的接合转移的频率。

在第四配置中

一种将感兴趣的核酸序列(NSI)从供体细胞转移至受体细胞中的方法，其中NSI包含在质粒中并且质粒包含在供体细胞中，方法包括组合细胞以允许将质粒从供体细胞接合转移至受体细胞，其中质粒为本发明的质粒。

在第五配置中

一种在人类或动物受试者中治疗感染的方法，其中感染为多种细菌细胞(受体细胞)的感染，方法包括：

(i) 将多种供体细菌细胞给予受试者，藉此受体细胞与供体细胞组合，其中每种供体细胞包含本发明的质粒；

(ii) 并允许将质粒从供体细胞接合转移至受体细胞，其中每种转移的质粒包含相应的感兴趣的核酸序列(NSI)，所述核酸序列包含或编码对受体细胞具有毒性的抗菌剂或其组分，藉此杀伤受体细胞或者抑制受体细胞的生长或增殖。

在第六配置中

一种用于第五配置的方法的本发明质粒或细胞。

在第七配置中

一种产生缺乏功能性hypC2核苷酸序列或其同源物的接合质粒的方法，方法包括

(a) 提供包含第一核苷酸序列的第一接合质粒，第一核苷酸序列为对于表达hypC2蛋白为功能性的hypC2核苷酸序列或其同源物；和

(b) 从第一质粒中缺失第一序列或使第一序列突变以使序列对于所述蛋白的表达为非功能性的，从而产生所述接合质粒。

在第八配置中

一种接合质粒，其为参考质粒的改造形式，其中参考质粒包含第一核苷酸序列，后者包含对于表达hypC2蛋白为功能性的hypC2核苷酸序列或其同源物，其中改造已缺失hypC2核苷酸序列或其同源物或使hypC2核苷酸序列或其同源物为非功能性。

附图简述

图1：hypC2 KO (敲除)质粒突变体显示出接合率为野生型(WT)的大约1000x高。显示的为利用WT和优化的(突变型)质粒从相同量的供体和温育时间获得的转移接合子(感染细胞)的数量。

图2：显示存在于不同细菌宿主物种中的个体质粒实例中发现的hypC2相关性的系统发生图。

图3：(a) 显示hyp2C在多种incX质粒中的存在(其序列部分由图中的相应线表示)。Hyp2C基因可经其相对于hypC1基因(我们用于常见的ORF的名称)的位置来定位(对于pX1质粒以及其他三种incX质粒，其基因排列在(b)中示意性地显示)并且紧靠stb型毒素-抗毒素基因。此外，其始终存在于接合操纵子的上游(从taxA或其同源物开始)参见(a)。

详述

本发明基于以下令人惊讶的发现：接合质粒中功能性hypC2基因的失活极大地提高包含质粒的供体细胞和质粒将被转移到的受体细胞之间的接合效率。失活可例如通过缺失基因或其部分或者通过将一个或多个外源序列插入到基因中使得基因对于表达其同源hypC2蛋白为非功能性的来实现。任选地，基因的启动子或其他调控元件可以失活(例如缺失)以防止基因表达。

另外，发明人调查了许多不同的质粒并发现该基因及其同源物广泛存在于接合质粒中。因此，本发明提供一种增强质粒的接合转移的普遍适用的方式，其具有许多治疗和非治疗用途。

在本文中，“供体细胞”可与“第一细胞”或“载体细胞”互换使用；和“受体细胞”可与“第二细胞”或“靶细胞”互换使用。

为此，本发明提供一种缺乏hypC2核苷酸序列或其同源物的接合质粒。

本发明还提供：-

一种接合质粒，其为参考质粒的改造形式，其中参考质粒包含第一核苷酸序列，后者包含对于表达hypC2蛋白为功能性的hypC2核苷酸序列或其同源物，其中改造已缺失hypC2核苷酸序列或其同源物或使hypC2核苷酸序列或其同源物为非功能性的。

任选地，参考质粒选自Genbank®登录号HG963477.1、CP023137.2、CP005391.2、CP013972.1、CP017588.1或CP026699.1的质粒；或所述选定质粒的同源物，其中同源物能够接合转移至(i)肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细胞；或(ii) 大肠杆菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)、志贺氏菌属(Shigella)、泛菌属(Pantoea)、变形菌属(Proteus)或柠檬酸杆菌属(Citrobacter)细胞中。

本发明还提供：-

一种可通过第七配置的方法或如下所述的产生质粒的方法获得的接合质粒。

本发明提供：-

常规分子生物学技术，比如如技术人员已知的重组DNA技术(例如重组工程)，可用于缺失第一序列或使其为非功能性的。例如，可缺失第一序列或其部分，比如通过使用与第一质粒同源重组的DNA载体，其中同源重组事件缺失第一序列(或一部分)，从而使所得质粒对于hypC2蛋白的表达为非功能性的。另外或者备选地，一个或多个核酸序列可插入到第一序列中和/或邻近第一序列，从而使其对于hypC2蛋白的表达为非功能性的。

任选地，第一质粒选自Genbank®登录号HG963477.1、CP023137.2、CP005391.2、CP013972.1、CP017588.1或CP026699.1的质粒。任选地，第一质粒为IncX质粒，例如pX1.0质粒、pOLA52、pIS15_43、pDSJ07或R6K质粒。

任选地，本发明的接合质粒或质粒为选自Genbank®登录号HG963477.1、CP023137.2、CP005391.2、CP013972.1、CP017588.1或CP026699.1的质粒的修饰质粒。

任选地，本发明的接合质粒或质粒为参考质粒的改造形式，其中参考质粒选自Genbank®登录号HG963477.1、CP023137.2、CP005391.2、CP013972.1、CP017588.1或CP026699.1的质粒，其中参考质粒包含第一核苷酸序列，后者包含对于表达hypC2蛋白为功能性的hypC2核苷酸序列或其同源物，其中改造已缺失hypC2核苷酸序列或其同源物或使hypC2核苷酸序列或其同源物为非功能性。

在一个实例中，第一核苷酸序列包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。在一个实例中，第一核苷酸序列包含选自SEQ ID NO: 1和3-7的序列或与所述选定的序列具有至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。

在一个实例中，hypC2蛋白包含SEQ ID NO: 2或与SEQ ID NO: 2具有至少70、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。

如图3所示，hyp2C位于紧靠stb型毒素-抗毒素基因(在stb基因的1-5 kb内)。此外，其始终存在于接合操纵子的上游(从taxA或其同源物开始) (在taxA基因的1-5kb内)。

在一个实例中，同源物包含与SEQ ID NO:1具有至少75、76、77、78、79、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。参见实例2作为说明。另外或者备选地，同源物在质粒中的位置对应于质粒pX1.0中的位置20849-21064。

任选地，质粒缺乏SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性的核苷酸序列。任选地，质粒缺乏SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 1具有至少60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的核苷酸序列。

优选地，质粒为IncX质粒，例如pX1.0质粒。

在一个实例中，质粒包含选自IncX质粒(例如pX1.0质粒、pOLA52、pIS15_43、pDSJ07或R6K质粒)的质粒的OriT。

在一个实例中，质粒为pIS15_43、pCFSAN002069、pOLA52、R6K或pDSJ07质粒，即包含这种质粒的骨架。如技术人员已知的，质粒骨架包含oriV。骨架可进一步包含质粒复制和/或接合所需的一种或多种基因。

任选地，质粒为肠杆菌科质粒。在一个实例中，质粒为大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属质粒。

在一个实例中，质粒能够在大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属宿主细胞中复制。在一个实例中，质粒能够在表2中公开的种或属的细胞中复制。

任选地，质粒能够寄宿于肠杆菌科细胞中。

任选地，质粒能够寄宿于大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞中。

任选地，质粒能够接合转移至肠杆菌科细胞中，例如其中细胞属于表2中公开的肠杆菌科种或属。

在一个实例中，质粒能够接合转移至表2中公开的种或属的细胞中。

任选地，质粒能够接合转移至大肠杆菌、克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌(K pneumoniae))、沙门氏菌属(例如鼠伤寒沙门氏菌(S typhimurium))、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞中。

本发明还提供包含接合质粒的细菌细胞，其中细胞不包含hypC2蛋白或其同源物。

例如，细胞不包含含有与SEQ ID NO: 2具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99同一性的氨基酸序列的蛋白。例如，细胞不包含含有SEQ ID NO: 2的蛋白，例如其中质粒为IncX (例如pX1.0)质粒。例如，质粒包含IncX (例如pX1.0)质粒的OriT。例如，质粒能够被IncX质粒的接合系统识别(即与之可操作)。

本发明还提供这种细菌细胞的群体。例如，该群体包含至少10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³或10¹⁴个这种细胞。

任选地，每个细胞包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90或100个本发明的质粒。任选地，包含在细胞中的所有本发明质粒均为相同的。或者，细胞包含两种、三种或更多种不同类型的本发明质粒。例如，质粒可以相同但NSI不同。

任选地，细胞缺乏SEQ ID NO: 2或与SEQ ID NO: 2具有至少60、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。

任选地，细胞为肠杆菌科细胞。任选地，细胞为大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

在一个实施方案中，质粒包含或编码抗菌剂或这种抗菌剂的组分。例如，质粒编码具有抗菌活性的RNA (例如沉默RNA)。例如，质粒编码具有抗菌活性的蛋白或者其中蛋白为抗菌剂的组分。因此，一旦转移到受体细胞(或靶细胞或第二细胞-其两者在本文中可与“受体细胞”互换使用)中，质粒可在细胞内表达抗菌剂或组分，其中抗菌剂杀伤细胞或者减少细胞的生长或增殖(或该组分在细胞中与其他组分结合以形成这种抗菌剂)。在一个实例中，质粒编码引导RNA或crRNA，任选地其中引导RNA或crRNA能够与靶细胞的前间隔序列杂交。因此，引导RNA或crRNA引导细胞中的Cas来修饰(例如切割)前间隔区，藉此杀伤细胞或者抑制其生长或增殖。在一个实例中，Cas为Cas9或Cas3。Cas可为I、II、III、IV或V型Cas。Cas可为切口酶或者可切割dsDNA。Cas可为RNA酶。

任选地，靶细胞选自大肠杆菌、克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)、沙门氏菌属(例如鼠伤寒沙门氏菌)、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。在一个实例中，靶细胞为假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)细胞。

本发明进一步提供：-

本发明的质粒在制造组合物中的用途，所述组合物包含含有质粒的第一细胞群，用于在第一和第二细胞彼此接触且为细菌细胞时，提高质粒从第一细胞(供体细胞)到第二群体的细胞(受体细胞)的接合转移的频率。

在一个实例中，受体细胞可包含在表面(例如在医疗设备上或在装置上)、气体(例如空气)或液体(例如水或水性液体，或者石油化学液体比如液态油或汽油)中。

在一个实例中，频率提高至与本发明质粒相同但进一步包含能够表达hypC2编码的蛋白的hypC2基因的对照质粒的频率的至少10、100或1000倍。例如，基因包含SEQ ID NO:1 (或其同源物)并且蛋白包含SEQ ID NO: 2 (或其同源物)。

任选地，第二细胞包含在人类或动物受试者中。或者，第二细胞为离体或体外的。在一个实例中，第二细胞处于环境中(即不在人类或动物体内)，例如，第二细胞包含在水、土壤、植物、田地、水道、油田、油、石油产品、食品或其成分、饮料或其成分、空气、气体或者空气或液体加热或冷却设备。

本发明进一步提供：-

一种将感兴趣的核酸序列(NSI)从供体细胞转移至受体细胞中的方法，其中NSI包含在质粒中并且质粒包含在供体细胞中，方法包括组合细胞以允许将质粒从供体细胞接合转移至受体细胞中，其中质粒为本发明的质粒。

在一个实施方案中，方法用多个供体和受体细胞进行，其中使多个供体细胞与多个受体细胞组合，并将质粒转移到受体细胞中。

NSI的实例为编码抗菌剂或其组分(例如如上所述)、抗体结构域(例如VH、VL、VHH或C结构域)、治疗性蛋白、肥料、除草剂、杀虫剂、代谢酶、肽激素或信号(例如群体感应)肽的序列。任选地，在方法或用途中，NSI为或编码抗菌剂，任选地其中抗菌剂对受体细胞具有毒性。优选地，抗菌剂对供体细胞没有毒性，或者对供体细胞的毒性低于受体细胞。

任选地，在方法或用途中，供体细胞和/或受体细胞选自大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。例如，供体细胞为大肠杆菌细胞，例如选自Nissle (例如Nissle 1917)、S17、DSM 17252、A0 34/86、Mutaflor^TM、Symbioflor^TM和Colinfant^TM的菌株。任选地，在方法或用途中，受体细胞为肠杆菌科细胞。

本发明进一步提供：-

一种在人类或动物(例如猪、牛、马、狗、猫、绵羊或鲑鱼)受试者中治疗感染的方法，其中感染为多种细菌细胞(受体细胞)的感染，方法包括：

(ii) 并允许将质粒从供体细胞接合转移至受体细胞中，其中每种转移的质粒包含相应的感兴趣的核酸序列(NSI)，所述核酸序列包含或编码对受体细胞具有毒性的抗菌剂或其组分，藉此杀伤受体细胞或者抑制受体细胞的生长或增殖。

在一个实施方案中，质粒为相同的。在另一个实施方案中，使用不同的质粒，例如其NSI不同。

在一个实例中，给予为口服给予。在一个实例中，给予为静脉内给予。在一个实例中，给予为通过导管给予。

在一个实例中，受体细胞为致病性大肠杆菌细胞，例如大肠杆菌ETEC、EPEC、EIEC、EHEC、EAEC或AIEC细胞。

本发明提供：-

用于本发明的方法的本发明的质粒或细胞。

任选地，在方法或用途中，供体细胞为大肠杆菌细胞(例如Nissle菌株)和受体细胞(例如对人类或动物为致病性的细胞)为大肠杆菌、克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)、沙门氏菌属(例如鼠伤寒沙门氏菌)、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

在一个实例中，靶细胞、第二细胞或受体细胞为对人类或动物为致病性的细菌物种或菌株的细胞。

在一些实施方案中，本发明涉及编码期望的蛋白或RNA (例如编码抗微生物剂)的载体细菌和使用方法。在实施方案中，抗微生物剂可通过载体细胞(抗微生物剂对其没有毒性)和靶细胞之间的接合转移到靶细胞中，藉此抗微生物剂对靶细胞具有毒性并杀伤靶细胞。在其他实施方案中，靶细胞的生长或增殖减少(例如与不存在抗微生物剂情况下的生长相比较减少至少40、50、60、70、80或90%)。每个载体细胞包含编码对靶细菌细胞具有毒性但对载体细胞没有毒性(或毒性较小)的抗菌剂的附加体(即质粒) DNA。本发明可应用于例如控制或杀伤对人类、动物或植物为致病性的靶细菌。本发明可应用于例如控制或杀伤包含在动物(例如牲畜动物)中的动物传染病性靶细菌。例如，载体细胞可包含在用于在人类或动物中治疗或预防疾病或病症的药物中；用于给予动物以促进其生长的生长促进剂；在动物杀伤动物传染病性细菌；用于作为杀虫剂给予牲畜；施用于植物的杀虫剂；或植物肥料中。

本发明的一个优点为载体细胞可用作生产细胞，其中可复制编码抗菌剂的质粒DNA。另外或者备选地，质粒和接合系统也可分开，使得细胞在其染色体上携带接合系统(缺乏hyp2C)以动员含有相容性oriT的(任何)质粒。

在某些实施方案中，本发明使用靶细胞的序列特异性杀伤来实现选择性。为此，在一个实例中，质粒编码引导性核酸酶，后者可在靶细胞中操作以识别和切割靶细胞染色体的靶序列，从而杀伤细胞或者其中细胞的生长或增殖减少。这优于使用其他类型的毒剂，这些毒剂在其作用上区别较小，能够杀伤几种物种或菌株(例如在某种程度上也可能对载体细胞具有毒性)。通过使用引导性核酸酶(例如TALEN或Cas核酸酶)，这些可被编程以识别存在于靶细胞基因组中(例如包含在靶细胞的染色体或附加体中)但在载体细胞的基因组中不存在的靶序列。

因此，在这种情况下，质粒DNA的复制可在载体细胞中自由发生而没有由于编码的试剂和编码该试剂的序列的复制所致的杀伤细胞或者减少其生长或增殖的风险。因此，在一个实例中，当质粒DNA编码引导性核酸酶时，引导性核酸酶能够识别和切割包含在靶细胞的基因组(例如染色体)中的靶核酸序列，其中靶细胞在载体细胞中不存在。

一个特别有用的实例为其中质粒DNA编码可与靶细胞中的引导RNA或crRNA一起操作的Cas核酸酶(例如Cas9或Cas3)，其中RNA可操作以将Cas引导至靶序列，其中Cas修饰(例如切割)靶序列并且杀伤靶细胞或者抑制靶细胞的生长或增殖。在一个实施方案中，质粒DNA编码Cas和引导RNA或crRNA。在另一个实施方案中，质粒DNA编码引导RNA或crRNA，但不编码同源Cas。在该实施方案中，RNA可在靶细胞中与由靶细胞基因组编码的内源性Cas一起操作，其中RNA可操作以将Cas引导至靶序列，其中Cas修饰(例如切割)靶序列并且杀伤靶细胞或者抑制靶细胞的生长或增殖。在这个意义上，试剂可包含CRISPR/Cas系统的组分(例如Cas核酸酶、Cascade Cas、crRNA、引导RNA或tracrRNA)。因此，本发明有效地认识到使用通过在靶细胞中而不是在载体细胞中的靶标识别起作用的抗菌剂的益处，这开启了质粒DNA在载体细胞中自由复制而对载体细胞没有显著毒性的能力。

在一个实例中，抗菌剂包含引导性核酸酶，其能够识别和切割包含在靶细胞基因组中的靶核酸序列，其中靶序列不包含在载体细胞中。因此，在这个意义上，抗菌剂对靶细菌细胞具有毒性，但对载体细胞没有毒性。例如，抗菌剂为CRISPR/Cas系统的组分，其可在靶细胞中操作以修饰包含在靶细胞基因组中(例如包含在靶细胞染色体中)的靶核酸序列。

任选地，核酸酶为Cas核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶或TALEN。任选地，核酸酶为I、II、III、IV或V型CRISPR系统的Cas核酸酶。

在一个方面，抗菌剂的组分为能够与靶细胞的靶序列杂交的引导RNA或crRNA。其系统可为I、II、III、IV或V型CRISPR系统。

前间隔序列包含在载体细胞的染色体或附加体(例如质粒)中。

有利地，供体细胞或质粒用于在人类或动物受试者(例如鸡、牛、猪、鱼或贝类)中治疗或预防靶细胞感染。有利地，载体细胞为对所述受试者为益生菌或者对人类或动物(例如鸡)为益生菌的物种的细胞。例如，载体细胞为益生菌大肠杆菌细胞。在一个实例中，靶细胞为对所述受试者具有致病性或者对人类或动物(例如鸡)具有致病性的物种的细胞。有利地，质粒DNA编码一种或多种引导RNA或者一种或多种crRNA，后者能够在靶细胞中与相应的靶核酸序列杂交，其中靶序列包含在靶细胞的内源性染色体和/或内源性附加体中。例如，质粒DNA编码2、3、4、5、6、7、7、9或10种(或者多于10种)与相应的靶序列杂交的不同gRNA或不同crRNA，其中靶序列彼此不同。例如，3种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，2种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，3种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，4种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，3种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，5种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，6种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，7种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，8种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，9种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，10种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，11种不同的gRNA或 crRNA由质粒DNA编码。例如，12种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。例如，13种不同的gRNA或crRNA由质粒DNA编码。在一个实例中，靶细胞为沙门氏菌属细胞(例如其中受试者为鸡)。在一个实例中，靶细胞为大肠杆菌、假单胞菌属、克雷伯氏菌属或艰难梭菌(C difficile)细胞。在一个实例中，靶细胞为弯曲杆菌属(Campylobacter)细胞(例如其中受试者为鸡)。在一个实例中，靶细胞为爱德华氏菌属(Edwardsiella)细胞(例如其中受试者为鱼或贝类，例如鲶鱼或虾或对虾)。在一个实例中，靶细胞为大肠杆菌细胞。

在本文的备选方案中，载体和靶细胞为古细菌细胞。

在一个优选的实例中，NSI编码对靶细菌细胞具有毒性但对载体细胞没有毒性的抗菌剂。在一个实例中，NSI编码抗生素剂、抗体、抗体链或抗体可变结构域。在一个实例中，NSI编码引导RNA或crRNA，该引导RNA或crRNA可在靶细胞中与同源Cas (例如靶向并切割包含在靶细胞的染色体或附加体中的前间隔序列的Cas核酸酶)一起操作。在一个实例中，RNA为能够与靶细胞的内源性靶核酸序列杂交以沉默其转录和/或翻译的siRNA。

在一个实例中，质粒包含可表达的tra1和/或tra2模块或其同源物。

任选地，载体细胞为大肠杆菌(例如Nissle或S17大肠杆菌菌株)或乳杆菌属(Lactobacillus)细胞或芽孢杆菌属细胞或肠球菌属(Enterococcus)细胞。任选地，载体细胞为人类、鸡、猪、绵羊、牛、鱼(例如鲶鱼或鲑鱼)或贝类(例如虾或龙虾)共生细菌菌株(例如共生大肠杆菌菌株)的细胞。

任选地，载体细胞或质粒用于给予人类或动物受试者的微生物群以供医学用途。例如，医学用途为用于治疗或预防本文公开的疾病。例如，医学用途为用于治疗或预防本文公开的病症。例如，医学用途为用于治疗或预防由所述靶细胞介导的疾病或病症。例如，载体细胞或质粒用于给予动物以增强动物的生长或体重。

在一个实例中，本发明方法中的给予为给予人类，以增强人类的生长或体重。任选地，增强不是医学疗法。任选地，增强为医学疗法。任选地，方法包括给予受试者的微生物群(例如肠道微生物群)多个载体细胞，其中微生物群包含靶细胞并且将质粒DNA转移到靶细胞中用于在其中表达以产生抗菌剂，从而杀伤受试者中的靶细胞或减少靶细胞的生长或增殖。

任选地，可对包含在植物中的靶细胞(受体细胞)实施用途或方法，例如使植物施肥或作为除草剂处理。植物可为本文公开的任何植物。例如，在本发明的任何配置或实施方案中，本文中的植物选自番茄植物、马铃薯植物、小麦植物、谷物植物、玉米植物、苹果树、产豆植物、豌豆植物、甜菜根植物、核果植物、大麦植物、忽布植物和草。例如，植物为树，例如棕榈、七叶树、松树、橡树或阔叶树。例如，植物为产生选自草莓、覆盆子、黑莓、红醋栗(reducrrants)、猕猴桃、香蕉、苹果、杏、鳄梨、樱桃、橙子、细皮小柑橘、萨摩蜜橘、葡萄柚、plus、海枣、无花果、酸橙、柠檬、瓜、芒果、梨、橄榄或葡萄的果实的植物。任选地，植物为双子叶植物。任选地，植物为开花植物。任选地，植物为单子叶植物。

在本文的任何配置(例如其中应用于植物)、实施方案或实例中，靶细菌为丁香假单胞菌(P syringae)细菌(例如包含在植物中)。丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)为一种常见的植物相关细菌，可导致全世界单子叶和双子叶植物两者的疾病。在一个实例中，靶细菌为选自以下的致病变型的丁香假单胞菌细菌：丁香假单胞菌大叶槭致病变种(P. s. pv. aceris)、丁香假单胞菌适合致病变种(P. s. pv.aptata)、丁香假单胞菌致黑致病变种(P. s. pv. atrofaciens)、P. s. pv. dysoxylis、丁香假单胞菌粳稻致病变种(P. s. pv. japonica)、丁香假单胞菌猝倒致病变种(P. s.pv. lapsa)、丁香假单胞菌黍致病变种(P. s. pv. panici)、丁香假单胞菌疱疹致病变种(P. s. pv. papulans)、丁香假单胞菌豌豆致病变种(P. s. pv. pisi)、丁香假单胞菌丁香致病变种(P. s. pv. syringae)和丁香假单胞菌李死致病变种(P. s. pv.morsprunorum)。

• 丁香假单胞菌大叶槭致病变种(P. s. pv. aceris)攻击槭树槭属(Acer)物种。

• 丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(P. s. pv. actinidiae)攻击猕猴桃美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)。

• 丁香假单胞菌七叶树致病变种(P. s. pv. aesculi)攻击欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)，导致出血性溃疡。

• 丁香假单胞菌适合致病变种(P. s. pv. aptata)攻击甜菜(Beta vulgaris)。

• 丁香假单胞菌致黑致病变种(P. s. pv. atrofaciens)攻击小麦(Triticumaestivum)。

• 丁香假单胞菌dysoxylis致病变种(P. s. pv. dysoxylis)攻击快快木树华丽樫木(Dysoxylum spectabile)。

• 丁香假单胞菌粳稻致病变种(P. s. pv. japonica)攻击大麦(Hordeumvulgare)。

• 丁香假单胞菌猝倒致病变种(P. s. pv. lapsa)攻击小麦。

• 丁香假单胞菌黍致病变种(P. s. pv. panici)攻击黍属草(Panicum grass)物种。

• 丁香假单胞菌疱疹致病变种(P. s. pv. papulans)攻击海棠欧洲苹果(Malussylvestris)物种。

• 丁香假单胞菌菜豆致病变种(P. s. pv. phaseolicola)导致豆类的光轮疫病。

• 丁香假单胞菌豌豆致病变种(P. s. pv. pisi)攻击豌豆。

• 丁香假单胞菌丁香致病变种(P. s. pv. syringae)攻击丁香属(Syringa)、李属(Prunus)和菜豆属(Phaseolus)物种。

• 丁香假单胞菌大豆致病变种(P. s. pv. glycinea)攻击大豆(soybean)，导致大豆细菌性斑点病。

在一个实例中，靶细菌为选自在前一段的要点中列举的血清变型的丁香假单胞菌，并且细菌包含在该要点中也提及的植物中。

当方法或用途应用于植物时，载体细胞可与包含受体细胞的微生物群组合。微生物群包含在植物的叶、干、根或茎中。

在一个实例中，靶细菌(或靶细胞)包含在植物的微生物群中。在一个实例中，微生物群包含在叶子中。在一个实例中，微生物群包含在木质部中。在一个实例中，微生物群包含在韧皮部中。在一个实例中，微生物群包含在根中。在一个实例中，微生物群包含在块茎中。在一个实例中，微生物群包含在球茎中。在一个实例中，微生物群包含在种子中。在一个实例中，微生物群包含在外果皮(anexocarp)、外果皮(epicarp)、中果皮或内果皮中。在一个实例中，微生物群包含在果实，例如单果、聚合果或复果中。在一个实例中，微生物群包含在种子或胚，例如在种皮、子叶(seed leaf)、子叶(cotyledons)或胚根中。在一个实例中，微生物群包含在花中，例如包含在花梗、萼片：花瓣；雄蕊、花丝、花药或雌蕊中。在一个实例中，微生物群包含在根，例如主根系统或须根系统中。在一个实例中，微生物群包含在一片或多片叶子中，例如包含在叶片、叶柄或托叶中。在一个实例中，微生物群包含在茎中，例如包含在树皮、表皮、韧皮部、形成层、木质部或髓中。

本发明提供：-

一种用于减少包含在受试者中或包含在表面上的生物膜的方法，其中生物膜包含靶细胞(例如假单胞菌属细胞)，其中方法包括将多个本发明的载体细胞给予生物膜，其中将质粒DNA从载体细胞转移到靶细胞中用于在其中表达以产生抗菌剂，从而杀伤生物膜中的靶细胞或者减少靶细胞的生长或增殖。

在一个实例中，“减少生物膜”包括减少生物膜的覆盖面积。在一个实例中，“减少生物膜”包括减少生物膜的增殖。在一个实例中，“减少生物膜”包括减少生物膜的持久性。在一个实例中，“减少生物膜”包括减少生物膜的扩散(例如在受试者中或其上，例如，扩散至含有受试者的环境中)。

在一个实例中，受试者为人类或动物。例如，生物膜包含在受试者的肺部中，例如，其中靶细胞为假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)细胞。这可为有用的，其中受试者为患有肺部疾病或病症的人类，比如肺炎或囊性纤维化。例如，生物膜包含在动物或人体器官中。例如，生物膜包含在人类或动物的微生物群中。

在一个实例中，靶细菌(或靶细胞)包含在植物的生物膜中。在一个实例中，生物膜包含在叶子中。在一个实例中，生物膜包含在木质部中。在一个实例中，生物膜包含在韧皮部中。在一个实例中，生物膜包含在根中。在一个实例中，生物膜包含在块茎中。在一个实例中，生物膜包含在球茎中。在一个实例中，生物膜包含在种子中。在一个实例中，生物膜包含在外果皮(anexocarp)、外果皮(epicarp)、中果皮或内果皮中。在一个实例中，生物膜包含在果实，例如单果、聚合果或复果中。在一个实例中，生物膜包含在种子或胚，例如在种皮、子叶(seed leaf)、子叶(cotyledons)或胚根中。在一个实例中，生物膜包含在花中，例如包含在花梗、萼片：花瓣；雄蕊、花丝、花药或雌蕊中。在一个实例中，生物膜包含在根，例如主根系统或须根系统中。在一个实例中，生物膜包含在一片或多片叶子中，例如包含在叶片、叶柄或托叶中。在一个实例中，生物膜包含在茎中，例如包含在树皮、表皮、韧皮部、形成层、木质部或髓中。

任选地，表面为离体表面，比如包含在家用或工业设备或容器中的表面。

任选地，靶细胞包含在生物膜，例如如本文公开的生物膜中。

任选地，靶细菌为沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌属(Clostridium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)或链球菌属(Streptococcus)细菌。例如，靶细菌为肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)细菌。例如，靶细菌选自肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp. enterica)鼠伤寒(Typhimurium)、肠炎(Enteritidis)、魏尔啸氏(Virchow)、蒙得维的(Montevideo)、哈达尔(Hadar)和宾查(Binza)血清变型。例如，靶细菌为假单胞菌属(例如丁香假单胞菌或铜绿假单胞菌)细菌。

在一个实施方案中，靶细菌为大肠杆菌细菌。任选地，靶细菌为肠出血性大肠杆菌(EHEC)、大肠杆菌血清型O157:H7或产志贺毒素大肠杆菌(STEC)。在一个实例中，靶细菌选自

• 产志贺毒素大肠杆菌(EHEC) (EHEC也可称为产维罗细胞毒素大肠杆菌(VTEC))；

• 肠出血性大肠杆菌(EHEC) (这种致病型为新闻中最常听到的与食源性暴发相关的一种)；

• 产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic E. coli) (ETEC)；

• 肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E. coli) (EPEC)；

• 肠聚集性大肠杆菌(Enteroaggregative E. coli) (EAEC)；

• 肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E. coli) (EIEC)；和

• 弥散黏附性大肠杆菌(Diffusely adherent E. coli) (DAEC)。

肠出血性大肠杆菌(EHEC)血清型O157:H7为一种人类病原体，可造成全世界血性腹泻和溶血性尿毒症综合征(HUS)的爆发。常规的抗微生物药物会在EHEC中引发SOS反应，从而促进有效志贺毒素的释放，这种毒素是造成与EHEC感染相关的许多发病率和死亡率的原因。牛为EHEC的天然宿主，并且大约75%的EHEC暴发与食用污染的牛衍生产品有关。EHEC在人类中引起疾病，但在成年反刍动物中无症状。大肠杆菌血清型O157:H7 (EHEC)感染的特征包括腹部绞痛和血性腹泻，以及危及生命的并发症溶血性尿毒症综合征(HUS)。目前需要治疗EHEC感染(Goldwater和Bettelheim, 2012)。使用常规抗生素会加剧志贺毒素介导的细胞毒性。在疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)进行的一项流行病学研究中，接受用抗生素治疗EHEC肠炎的患者发生HUS的风险更高(Slutsker等人, 1998)。另外的研究支持在EHEC感染中抗生素的禁忌症；进行用于与EHEC相关的出血性结肠炎的抗生素疗法的儿童发生HUS的机会增加(Wong等人, 2000;Zimmerhackl, 2000; Safdar等人, 2002; Tarr等人, 2005)。常规抗生素通过增强在染色体整合的λ样前噬菌体基因组内编码的stx基因的复制和表达来促进志贺毒素的产生。本发明一些配置的方法依赖于核酸酶切割。Stx诱导还促进噬菌体介导的EHEC细胞被膜的裂解，使得志贺毒素能够释放和传播到环境中(Karch等人, 1999; Matsushiro等人, 1999;Wagner等人, 2002)。因此，有利地，本发明的这些配置提供用于在人类和动物受试者中治疗EHEC的备选方法。这以下以关于由核酸酶作用(与常规抗生素作用相反)产生的抗EHEC作用的速度和持续时间的令人惊讶的结果来举例说明。

在一个实例中，受试者(例如人类或动物)患有溶血性尿毒症综合征(HUS)或处于其风险下，例如受试者患有大肠杆菌感染，比如EHEC大肠杆菌感染。

本发明提供：-

一种包含多个本发明载体细胞的药用组合物、牲畜生长促进组合物、土壤改良剂、除草剂、植物肥料、食品或食品成分灭菌组合物、牙科组合物、个人卫生组合物或消毒剂组合物(例如用于家用或工业用途)。

在本文中，载体细胞为例如用于给予人类或动物受试者的益生菌细胞。例如，载体细胞在人类或动物受试者的微生物组(例如肠道或血液微生物组)中为共生的，其中载体用于给予受试者。在一个实例中，载体细胞为细菌细胞(并且任选地靶细胞为细菌细胞)。在一个实例中，载体细胞为古细菌细胞(并且任选地靶细胞为古细菌细胞)。

任选地，载体细胞为革兰氏阳性菌细胞和靶细胞为革兰氏阳性菌细胞。

任选地，载体细胞为革兰氏阳性菌细胞和靶细胞为革兰氏阴性菌细胞。

任选地，载体细胞为革兰氏阴性菌细胞和靶细胞为革兰氏阳性菌细胞。

任选地，载体细胞为革兰氏阴性菌细胞和靶细胞为革兰氏阴性菌细胞。

任选地，载体细胞为大肠杆菌细菌细胞和靶细胞为假单胞菌属细菌细胞。

任选地，载体细胞为大肠杆菌细菌细胞和靶细胞为革兰氏阳性菌细胞。

任选地，载体细胞为大肠杆菌细菌细胞和靶细胞为革兰氏阴性菌细胞。

任选地，载体细胞为大肠杆菌细菌细胞和靶细胞为沙门氏菌属细菌细胞。

任选地，载体细胞为大肠杆菌细菌细胞和靶细胞为大肠杆菌细菌细胞。

任选地，载体细胞为用于给予人类或动物受试者的益生菌或共生的大肠杆菌细菌细胞。

在本文中，任选地质粒包含闭合环状DNA。在一个实施方案中，在一个实例中，质粒DNA为dsDNA。在一个实施方案中，在一个实例中，质粒DNA为ssDNA。

任选地，靶细胞为沙门氏菌属细胞(例如其中载体细胞为大肠杆菌细胞)，例如肠道沙门氏菌肠道亚种，例如肠道沙门氏菌肠道亚种鼠伤寒、肠炎、魏尔啸氏、蒙得维的、哈达尔或宾查血清变型。

例如，靶细菌选自肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(K pneumoniae)、空肠弯曲杆菌(C jujeni)、幽门螺杆菌(H pylori)、鲍曼不动杆菌(A baumanii)、艰难梭菌(C difficile)、金黄色葡萄球菌(S aureus)、化脓性链球菌(S pyogenes)或嗜热链球菌(S thermophilus)。

在一个实例中，靶细胞为在人类引起医院感染的物种的细胞。

任选地，靶细胞包含在动物(例如家禽动物(比如鸡)、猪、牛、鱼(例如鲶鱼或鲑鱼)或贝类(例如对虾或龙虾))微生物组中。任选地，微生物组为肠道微生物组。例如，靶细胞为包含在鸡肠道生物膜中的沙门氏菌属细胞。例如，靶细胞为包含在离体鸡肠道生物膜样品中的沙门氏菌属细胞。

任选地，多个载体细胞包含载体细胞的第一亚群(第一细胞)和载体细胞的第二亚群(第二细胞)，其中第一细胞包含相同的质粒DNA和第二细胞包含相同的质粒DNA (其不同于第一细胞的质粒DNA)。例如，前者DNA包含不同于包含在其他DNA中的NSI的NSI。例如，质粒DNA编码第一引导RNA或crRNA和第二DNA编码第二引导RNA或crRNA，其中第一引导RNA/crRNA能够与第一靶细胞中的第一前间隔序列杂交；和第二引导RNA/crRNA能够与第二靶细胞中的第二前间隔序列杂交，其中前间隔区不同。任选地，第一靶细胞不同于第二靶细胞。任选地，第一靶细胞属于与第二靶细胞相同的物种或菌株。或者，第一靶细胞属于不同于第二靶细胞的物种或菌株的物种或菌株(以这种方式提供载体细胞的混合物，例如用于给予人类或动物或植物，以靶向并杀伤多种不同物种或菌株的靶细胞)。

在一个实例中，该或每个质粒DNA包含多种(例如第一和第二) NSI，其中第一NSI不同于第二NSI (例如它们编码不同的蛋白或RNA，比如不同的引导RNA或crRNA)。在一个实例中，该或每个质粒DNA包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同类型的NSI。在一个实例中，该或每个质粒DNA包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的引导RNA的NSI。在一个实例中，该或每个质粒DNA包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的crRNA的NSI。在一个实例中，该或每个质粒DNA包含编码至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的引导RNA的NSI。在一个实例中，该或每个质粒DNA包含编码至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同的crRNA的NSI。

任选地，组合物包含在液体(例如水性液体或在水中)中，组合物包含载体细胞的量为1 x 10³-1 x 10¹⁰ (例如1 x 10⁴-1 x 10¹⁰、1 x 10⁴-1 x 10⁹、1 x 10⁴-1 x 10⁸、1 x10⁴-1 x 10⁷、1 x 10³-1 x 10¹⁰、1 x 10³-1 x 10⁹、1 x 10³-1 x 10⁸、1 x 10³-1 x 10⁷、1 x10⁵-1 x 10¹⁰、1 x 10⁵-1 x 10⁹、1 x 10⁵-1 x 10⁸、1 x 10⁵-1 x 10⁷、1 x 10⁶-1 x 10¹⁰、1 x10⁶-1 x 10⁹、1 x 10⁶-1 x 10⁸、或1 x 10⁶-1 x 10⁷) cfu/ml。例如，液体为饮料，比如供人类或动物食用。例如，饮料为牲畜饮料，例如家禽饮料(即供家禽比如鸡食用的饮料)。

在一个实例中，组合物为供人类或动物食用的膳食(例如膳食补充剂)组合物。在一个实例中，组合物为供人类或动物食用的减肥组合物。在一个实例中，组合物为供人类或动物食用的生长促进组合物。在一个实例中，组合物为供人类食用的健身组合物。在一个实例中，组合物为供人类或动物食用的益生菌组合物。在一个实例中，组合物为供人类或动物食用的杀生物组合物。在一个实例中，组合物为供人类或动物食用的杀虫组合物。在一个实例中，组合物为供动物食用的动物传染病控制组合物。

在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含维生素类。在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含维生素A、B (例如B12)、C、D、E和/或K。在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含脂质。在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含碳水化合物。在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含蛋白和/或氨基酸。在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含矿物质。在一个实例中，组合物除载体细胞之外还包含金属离子(例如Mg²⁺、Cu²⁺和/或Zn²⁺)。在一个实例中，组合物包含钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、锰离子、铁离子、钴离子、铜离子、锌离子和/或钼离子。

在一个实例中，组合物为植物肥料组合物。在一个实例中，组合物为一种除草剂。在一个实例中，组合物为用于施用于植物的杀虫剂组合物。

在任何实施方案或实例中，在适当情况下：植物为例如作物。植物为例如小麦。植物为例如谷物。植物为例如玉米。植物为例如结果植物。植物为例如蔬菜植物。植物为例如番茄植物。植物为例如马铃薯植物。植物为例如草植物。植物为例如开花植物。植物为例如树木。植物为例如灌木。

在一个实例中，组合物用于环境应用，其中环境为户外环境(例如施用于田地或水道或水库)。

在一个实例中，组合物包含在食品或食品成分中(例如供人类或动物食用)。在一个实例中，组合物包含在饮料或饮料成分中(例如供人类或动物食用)。

在一个实例中，靶细胞为人类生物膜细胞，例如其中生物膜为肠道、皮肤、肺部、眼睛、鼻子、耳部、胃肠道(GI道)、胃、毛发、肾脏、尿道、细支气管、口腔、口、肝脏、心脏、肛门、直肠、膀胱、肠(bowel)、肠(intestine)、阴茎、阴道或阴囊生物膜。在一个实例中，靶细胞为动物生物膜细胞，例如其中生物膜为肠道、皮肤、肺部、眼睛、鼻子、耳部、胃肠道(GI道)、盲肠、胃、毛发、羽毛、鳞片、肾脏、尿道、细支气管、口腔、口、肝脏、心脏、肛门、直肠、膀胱、肠(bowel)、肠(intestine)、阴茎、阴道或阴囊生物膜。例如，生物膜为鸟(例如鸡)盲肠生物膜。

在一个实例中，本文中的任何方法均为离体的。在一个实例中，本文中的方法为体内的。在一个实例中，本文中的方法为体外的。在一个实例中，本文中的方法在环境中进行，例如在家用(比如在房屋中)、工业(比如在工厂中)或农业环境(比如在田地中)。在一个实例中，本文中的方法在容器中或其上、或在表面上进行。

在一个实例中，NSI (或其RNA产物)能够与包含在靶细胞中的靶细胞染色体或附加体重组以修饰染色体或附加体。任选地，这以这样的方法进行，其中染色体或附加体被切割(例如在预定位点处使用引导性核酸酶，比如Cas、TALEN、锌指核酸酶或大范围核酸酶)并通过与载体细胞接合同时或依序地将质粒DNA引入到靶细胞中和在切割位点处或邻近切割位点将NSI或其序列插入到染色体或附加体中。

在一个实例中，质粒DNA包含CRISPR/Cas系统的一种或多种组分，其可操作以在靶细胞中进行前间隔区切割(例如其中前间隔区包含10-20、10-30、10-40、10-100、12-15或12-20个能够在靶细胞中与NSI编码的crRNA或gRNA杂交的连续核苷酸)。

例如，系统为I、II、III、IV或V型CRISPR/Cas系统。

在一个实例中，NSI编码Cas9 (以及任选地第二种不同的Cas，比如Cas3、Cas9、Cpf1、Cas13a、Cas13b或Cas10)。在一个实例中，NSI编码Cas3 (以及任选地第二种不同的Cas，比如Cas3、Cas9、Cpf1、Cas13a、Cas13b或Cas10)。在一个实例中，NSI编码选自Cas3、Cas9、Cpf1、Cas13a、Cas13b和Cas10的Cas。另外或者备选地，质粒DNA (例如NSI)编码引导RNA或crRNA或tracrRNA。例如，引导RNA或crRNA或tracrRNA与第一种Cas关联(即可在靶细胞中操作)。

在一个实例中，本文中的Cas为Cas9。在一个实例中，本文中的Cas为Cas3。Cas可与靶细菌编码的Cas相同。

在一个实施方案中，NSI或其编码的蛋白或RNA在靶细菌中的存在介导靶细胞杀伤或靶细胞生长或增殖的下调。在一个实施方案中，NSI或其编码的蛋白或RNA在靶细菌中的存在介导靶细胞基因组编码的一种或多种RNA或蛋白的表达关闭或其下调。

在一个实施方案中，NSI或其编码的蛋白或RNA在靶细菌中的存在介导靶细胞生长或增殖的上调。在一个实施方案中，NSI或其编码的蛋白或RNA在靶细菌中的存在介导靶细胞基因组编码的一种或多种RNA或蛋白的表达的开启或其上调。

在一个实施方案中，NSI编码对靶细菌具有毒性的CRISPR/Cas系统的组分。

在一个实施方案中，质粒为穿梭载体。

任选地，靶细胞在将质粒DNA转移至其中之前缺乏功能性内源性CRISPR/Cas系统，所述质粒DNA例如包含在靶细胞中为功能性的并且对靶细胞具有毒性的外源性CRISPR/Cas系统的组分的质粒DNA。一个实施方案提供一种包含多个本发明载体细胞的抗菌组合物，用于给予人类或动物受试者以供医学用途，其中每个靶细胞为任选地根据本段落的靶细胞。

在一个实例中，本发明的组合物为除草剂、杀虫剂(pesticide)、杀虫剂(insecticide)、植物肥料或清洁剂。

任选地，本文中的靶细菌包含在受试者的微生物组，例如肠道微生物组中。或者，微生物组为皮肤、头皮、毛发、眼睛、耳部、口腔、咽喉、肺部、血液、直肠、肛门、阴道、阴囊、阴茎、鼻子或舌头微生物组。

在一个实例中，与载体细胞给予同时或依序地进一步给予受试者(例如人类或动物)药物。在一个实例中，药物为抗生素、抗体、免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA4抗体)、过继性细胞疗法(例如CAR-T疗法)或疫苗。

在一个实施方案中，NSI编码引导性核酸酶，比如Cas核酸酶、TALEN、锌指核酸酶或大范围核酸酶。因此，毒剂可包括引导性核酸酶，比如Cas核酸酶、TALEN、锌指核酸酶或大范围核酸酶。任选地，NSI编码能够切割靶细胞染色体的限制性核酸酶。

任选地，组合物为对于人类或动物受试者实践的用于医学的药用组合物。

在一个实例中，动物为牲畜或伴侣宠物动物(例如牛、猪、山羊、绵羊、马、狗、猫或兔子)。在一个实例中，动物为昆虫(处于其生命周期的任何阶段的昆虫，例如卵、幼虫或蛹)。在一个实例中，动物为原生动物。在一个实例中，动物为头足动物。

任选地，组合物为除草剂、杀虫剂、食品或饮料加工剂、食品或饮料添加剂、石油化学品或燃料加工剂、净水剂、化妆品添加剂、洗涤剂添加剂或环境(例如土壤)添加剂或清洁剂。

本发明还提供：-

一种靶细菌细胞或多种靶细菌细胞，每种包含所述质粒DNA。

例如，载体细菌为乳杆菌属(例如罗伊氏乳杆菌(L reuteri)或乳酸乳球菌(L lactis))、大肠杆菌或链球菌属(例如嗜热链球菌(S thermophilus))细菌。有用地，载体可为质粒DNA提供保护免受周围环境的影响。载体的使用可用于口服给予或其他途径，其中载体可为质粒DNA提供保护免受受试者的酸性胃或其他恶劣环境的影响。此外，载体可配制成饮料，例如益生菌饮料，例如供人类食用的适用的Yakult (商标)、Actimel (商标)、Kevita(商标)、Activia (商标)、Jarrow (商标)或类似的饮料。

任选地，载体细胞或组合物用于给予人类或动物受试者以供医学用途，包括使用试剂或NSI的表达产物杀伤靶细菌，其中靶细菌在受试者中介导疾病或病症。在一个实例中，当受试者为人类时，受试者不为胚胎。在一个实例中，载体细胞为受试者中的益生菌。

本发明还提供：-

一种杀伤环境中的靶细菌细胞的方法，任选地其中方法不对于人类或动物体进行实践，其中方法包括使环境暴露于本发明的载体细胞或组合物并使得NSI的产物能够在靶细胞中表达，其中靶细菌在存在所述产物的情况下被杀伤。例如，产物编码CRISPR/Cas系统或其组分，比如本文公开的系统或组分。因此，系统可能能够识别和切割靶细胞的染色体前间隔序列，藉此杀伤靶细胞。任选地，在另一个步骤中，分离杀伤的靶细胞。

本发明还提供：-

本发明的组合物或细胞在制造用于在包含靶细菌的人类或动物受试者中治疗疾病或病症的杀伤靶细菌的抗菌剂中的用途。

任选地，环境为以下的微生物组：土壤；植物、一部分的部分(例如叶子、果实、蔬菜或花)或植物产品(例如果肉)；水；水道；流体；食品或其成分；饮料或其成分；医疗装置；化妆品；洗涤剂；血液；体液；医疗设备；工业设备；石油钻井平台；石油化学加工、储存或运输设备；车辆或容器。

任选地，环境为已经给予组合物的人类或动物受试者的离体体液(例如尿液、血液、血液制品、汗液、眼泪、痰液或唾液)、身体固体(例如粪便)或组织。

任选地，环境为已经给予组合物的人类或动物受试者的体内体液(例如尿液、血液、血液制品、汗液、眼泪、痰液或唾液)、身体固体(例如粪便)或组织。

任选地，毒剂包含CRISPR/Cas系统的一种或多种组分，例如编码I型Cascade (例如CasA)的一种或多种组分的DNA序列。

任选地，毒剂包含编码引导性核酸酶，比如Cas核酸酶、TALEN、锌指核酸酶或大范围核酸酶的DNA序列。

在一个实例中，载体细胞或组合物包含在医疗容器，例如注射器、小瓶、IV袋、吸入器、滴眼器或喷雾器中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在无菌容器中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在医学上相容性的容器中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在发酵容器，例如金属、玻璃或塑料容器中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在农业设备中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在食品生产或加工设备中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在园艺设备中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在农业设备中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在石油化学品回收或加工设备中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在蒸馏设备中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在细胞培养容器(例如具有至少50、100、1000、10000或100000升的容量)中。另外或者备选地，靶细胞包含在任何这些设备等中。

在一个实例中，载体细胞或组合物包含在药物中，例如与说明书或包装标签组合，其中说明通过口服、IV、皮下、鼻内、眼内、阴道、局部、直肠或吸入给予人类或动物受试者来给予药物。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在口服药物制剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在鼻内或眼部药物制剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在个人卫生组合物(例如洗发剂、肥皂或除臭剂)或化妆品制剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在洗涤剂制剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在清洁制剂中，例如用于清洁医疗或工业装置或设备。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在食品、食品成分或食品加工剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在饮料、饮料成分或饮料加工剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在医用绷带、织物、膏药或拭子中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在除草剂或杀虫剂中。在一个实例中，载体细胞或组合物包含在杀虫剂中。

在一个实例中，CRISPR/Cas组分为I型CRISPR/Cas系统的组分。在一个实例中，CRISPR/Cas组分为II型CRISPR/Cas系统的组分。在一个实例中，CRISPR/Cas组分为III型CRISPR/Cas系统的组分。在一个实例中，CRISPR/Cas组分为IV型CRISPR/Cas系统的组分。在一个实例中，CRISPR/Cas组分为V型CRISPR/Cas系统的组分。在一个实例中，CRISPR/Cas组分包含编码Cas9的核苷酸序列(例如化脓性链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9或嗜热链球菌Cas9)。在一个实例中，CRISPR/Cas组分包含编码Cas3的核苷酸序列(例如大肠杆菌Cas3、艰难梭菌Cas3或沙门氏菌属Cas3)。在一个实例中，CRISPR/Cas组分包含编码Cpf的核苷酸序列。在一个实例中，CRISPR/Cas组分包含编码CasX的核苷酸序列。在一个实例中，CRISPR/Cas组分包含编码CasY的核苷酸序列。

在一个实例中，每种载体细胞编码来自包含可在靶细菌中操作的启动子的核苷酸序列(NSI)的感兴趣的CRISPR/Cas组分或蛋白。

任选地，靶细菌为革兰氏阴性菌(例如螺旋状菌属或弧菌属)。任选地，靶细菌为革兰氏阳性菌。任选地，靶细菌为支原体属、衣原体属、螺旋体或分枝杆菌属细菌。任选地，靶细菌为链球菌属(例如化脓性链球菌或嗜热链球菌)。任选地，靶细菌为葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌，例如MRSA)。任选地，靶细菌为大肠杆菌(例如O157:H7)，例如其中Cas由载体编码或内源性靶细胞Cas核酸酶(例如Cas3)活性被去抑制。任选地，靶细菌为假单胞菌属(例如丁香假单胞菌或铜绿假单胞菌)。任选地，靶细菌为弧菌属(例如霍乱弧菌(例如O139)或创伤弧菌)。任选地，靶细菌为奈瑟氏菌属(例如淋病奈瑟氏菌或脑膜炎奈瑟氏菌)。任选地，靶细菌为博德特菌属(例如百日咳博德特菌)。任选地，靶细菌为嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌)。任选地，靶细菌为志贺氏菌属(例如痢疾志贺氏菌)。任选地，或靶细菌为布鲁菌属(例如流产布鲁菌)。任选地，靶细菌为弗朗西斯菌属宿主。任选地，靶细菌为黄单胞菌属。任选地，靶细菌为农杆菌属。任选地，靶细菌为欧文氏菌属。任选地，靶细菌为军团菌属(例如嗜肺军团菌)。任选地，靶细菌为李斯特菌属(例如单核细胞增多性李斯特菌)。任选地，靶细菌为弯曲杆菌属(例如空肠弯曲杆菌)。任选地，靶细菌为耶尔森氏菌属(例如鼠疫耶尔森氏菌)。任选地，靶细菌为疏螺旋体属(例如伯氏疏螺旋体)。任选地，靶细菌为螺杆菌属(例如幽门螺杆菌)。任选地，靶细菌为梭菌属(例如艰难梭菌或肉毒梭菌)。任选地，靶细菌为埃立克体属(例如查菲埃立克体)。任选地，靶细菌为沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌或肠炎沙门氏菌，例如鼠伤寒血清型，例如DT 104)。任选地，靶细菌为衣原体属(例如肺炎衣原体)。任选地，靶细菌为副衣原体属宿主。任选地，靶细菌为棒杆菌属(例如无枝菌酸棒杆菌)。任选地，靶细菌为克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)。任选地，靶细菌为肠球菌属(例如粪肠球菌或屎肠球菌，例如利奈唑胺耐药的)。任选地，靶细菌为不动杆菌属(例如鲍曼不动杆菌，例如多重耐药的)。

靶细胞的其他实例为以下选项之一：-

任选地，靶细菌为金黄色葡萄球菌细胞，例如对选自甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素、奎奴普丁、达福普汀和替考拉宁的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为铜绿假单胞菌细胞，例如对选自头孢菌素类(例如头孢他啶)、碳青霉烯类(例如亚胺培南或美罗培南)、氟喹诺酮类、氨基糖苷类(例如庆大霉素或妥布霉素)和粘菌素的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯氏菌)细胞，例如对碳青霉烯具有抗性。

任选地，靶细菌为链球菌属(例如嗜热链球菌、肺炎链球菌或化脓性链球菌)细胞，例如对选自红霉素、克林霉素、β-内酰胺、大环内酯、阿莫西林、阿奇霉素和青霉素的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为沙门氏菌属(例如伤寒血清型)细胞，例如对选自头孢曲松、阿奇霉素和环丙沙星的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为志贺氏菌属细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为结核分枝杆菌细胞，例如对选自对异烟肼(INH)、利福平(RMP)、氟喹诺酮、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素和阿奇霉素抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为肠球菌属细胞，例如对万古霉素具有抗性。

任选地，靶细菌为肠杆菌科细胞，例如对选自头孢菌素和碳青霉烯的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为大肠杆菌细胞，例如对选自甲氧苄啶、呋喃妥因、头孢氨苄和阿莫西林的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为梭菌属(例如艰难梭菌)细胞，例如对选自氟喹诺酮抗生素和碳青霉烯的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为淋病奈瑟氏菌细胞，例如对选自头孢克肟(例如口服头孢菌素)、头孢曲松(注射用头孢菌素)、阿奇霉素和四环素的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为鲍曼不动杆菌细胞，例如对选自β-内酰胺、美罗培南和碳青霉烯的抗生素具有抗性。

任选地，靶细菌为弯曲杆菌属(例如空肠弯曲杆菌)细胞，例如对选自环丙沙星和阿奇霉素的抗生素具有抗性。

任选地，靶细胞产生贝塔(β)-内酰胺酶(例如产生ESBL的大肠杆菌或产生ESBL的克雷伯氏菌属)。

例如，靶细胞为对以上这些选项中的任何一个中所述的抗生素具有抗性的细菌细胞。

在一个实例中，靶细胞为选自志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、沙雷菌属、克雷伯氏菌属、耶尔森氏菌属、假单胞菌属和肠杆菌属的物种的细胞。

任选地，组合物包含载体细胞，载体细胞各自或组合能够将质粒DNA接合转移到选自志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、沙雷菌属、克雷伯氏菌属、耶尔森氏菌属、假单胞菌属和肠杆菌属中的两种或更多种的物种的靶细胞中。

在一个实例中，载体细胞的生长或增殖减少至少50、60、70、80、90或95%。任选地，组合物或载体细胞与对靶细胞具有毒性的抗生素同时或依序给予。例如，抗生素可为本文公开的任何抗生素。

任选地，NSI的表达在可在靶细胞中操作的诱导型启动子的控制下。任选地，NSI的表达在可在靶细胞中操作的组成型启动子的控制下。

在实施方案中，质粒DNA含有可筛选或可选择的标记基因。例如，可选择的标记基因为抗生素抗性基因。

载体细菌可为选自表2中出现的那些的种或属的细菌。例如，所述种存在于温血动物(例如牲畜脊椎动物)中。例如，所述种存在于于人类中。例如，所述种存在于植物中。优选地，定殖于人类或动物体的非无菌部分(例如皮肤、消化道、泌尿生殖区、口、鼻道、咽喉和上气道、耳部和眼睛)的非致病性细菌用作载体细胞，并且在一个实例中，本发明的方法用于对抗人类或动物体的这种部分的靶细胞细菌感染。在另一个实施方案中，感染为全身感染。特别优选的载体细菌物种的实例包括(但不限于)：大肠杆菌的非致病性菌株(大肠杆菌F18和大肠杆菌菌株Nissle)、各种乳杆菌属物种(比如干酪乳杆菌(L. casei)、植物乳杆菌(L. plantarum)、类干酪乳杆菌(L. paracasei)、嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、玉米乳杆菌(L. zeae)和加氏乳杆菌(L. gasseri))或其他非致病性或益生菌皮肤或GI定殖细菌，比如乳球菌属、双歧杆菌属、真细菌和细菌微细胞，它们是注定会死亡但仍然能够转移质粒的类核细胞(参见例如Adler等人, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 57; 321-326, 1970; Frazer和Curtiss III, Current Topics in Microbiologyand Immunology 69: 1-84, 1975; Curtiss III的美国专利号4,968,619)。在一些实施方案中，靶受体细胞为包含在人类、动物或植物中的致病性细菌，例如在皮肤上或者在消化道、泌尿生殖区、口、鼻道、咽喉和上气道、耳部和眼睛中。对于靶向和根除特别感兴趣的为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌、肺炎葡萄球菌(Staphylococcus pneumoniae)和其他物种、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)、肠球菌属物种(Enterococcus spp.)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的致病菌株。在一个实例中，靶细胞属或种为表2中列出的任何属或种。

本发明可用于广泛的背景或环境，例如治疗、农业或其他背景，包括(但不限于)美国专利 6,271,359、6,261,842、6,221,582、6,153,381、6,106,854和5,627,275中描述的那些。本文中还讨论了其他内容，并且其他内容对于本领域的技术人员仍然为易于显而易见的。

包含质粒DNA的许多类型的质粒适用于本发明。鉴于此，本领域的技术人员将意识到单一载体细菌菌株可能包含多于一种类型的这种质粒(例如它们编码的抗菌剂不同)。进一步地，在另一个实例中，可组合两种或更多种不同的载体细菌菌株(每种均含有一种或多种这种质粒)，以实现多靶点效应，即杀伤两种或更多种不同的靶物种或菌株，或杀伤相同物种的细胞或靶细胞的菌株。

本发明可用于治疗人类和多种兽医、农艺、园艺和食品加工应用。对于人类和兽医用途，并且取决于用于保护的靶向细胞群或组织，考虑本发明载体细菌的以下给予方式：局部、口服、鼻部、眼部、耳部、肺部(例如经吸入器)、眼科、直肠、泌尿生殖、皮下、腹膜内和静脉内。细菌可作为药用组合物在适合于为被治疗的患者选择的给予方式的递送媒介物中提供。如此处使用的术语“患者”或“受试者”是指人类或动物(例如特别地可用作特定供体菌株的临床功效的模型的动物，例如或者为家畜或牲畜动物的动物)。商业上相关的动物为鸡、火鸡、鸭、鲶鱼、鲑鱼、鳕鱼、鲱鱼、龙虾、虾、对虾、牛、绵羊、山羊、猪、山羊、鹅或兔子。

例如，为了将载体细菌递送至胃肠道或鼻道中，优选的给予方式可为通过口服摄入或鼻气雾剂，或者通过饲喂(单独或掺入到受试者的饲料或食物和/或饮料中，比如饮用水)。在这点上，载体细胞可包含在牲畜(或者家畜或伴侣动物)的食物中，例如载体细菌包含在牲畜的饲料添加剂中。或者，添加剂为用于牲畜的饮料(例如水)添加剂。应当注意的是，益生菌，比如嗜酸乳杆菌，作为含有细菌细胞和固体支持物比如甘露醇的冻干混合物的凝胶胶囊剂出售。当凝胶胶囊剂与液体一起摄入时，冻干的细胞会重新水合并成为活的结肠原细菌。因此，以类似的方式，本发明的载体细菌细胞可作为凝胶胶囊剂中的粉状、冻干制剂或以散装提供，例如用于洒到食物或饮料上。然后重新水合的活细菌细胞将寄居和/或定殖于在整个上和/或下胃肠系统中的位点，并且之后与靶细菌接触。

对于局部应用，可将载体细菌配制成软膏剂或乳膏剂以涂抹于受影响的皮肤表面上。软膏剂或乳膏制剂也适合于与其他标准制剂比如栓剂一起进行直肠或阴道递送。药物化学家熟知用于局部、阴道或直肠给予的适当制剂。

本发明将特别适用于局部或粘膜给予以治疗多种细菌感染或细菌相关不期望的病症。这些用途的一些代表性实例包括以下的治疗：(1) 由嗜血杆菌属引起的结膜炎和由铜绿假单胞菌引起的角膜溃疡；(2) 由铜绿假单胞菌引起的外耳道炎；(3) 由许多革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌引起的慢性鼻窦炎，或用于支气管的一般去污；(4) 与铜绿假单胞菌相关的囊性纤维化；(5) 由幽门螺杆菌(例如治疗或预防胃溃疡)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弯曲杆菌属或志贺氏菌属引起的肠炎；(6) 开放性伤口，比如手术或非手术性的，例如作为预防措施；(7) 烧伤以消除铜绿假单胞菌或其他革兰氏阴性病原体；(8) 例如由痤疮丙酸杆菌引起的痤疮；(9) 例如由耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MSRA)引起的鼻子或皮肤感染；(10) 例如由革兰氏阳性厌氧细菌引起的体臭(即在除臭剂中使用载体细胞)；(11) 例如与阴道加德纳菌或其他厌氧菌相关的细菌性阴道病；和(12) 由各种生物体引起的牙龈炎和/或蛀牙。

在一个实例中，靶细胞为大肠杆菌细胞并且要在人类中治疗的疾病或病症为子宫道感染或呼吸机相关的感染，例如肺炎。

在其他实施方案中，本发明的载体细胞可用于处理表面以去除或减弱不需要的靶细菌，例如用于处理包含靶细菌的这种表面或环境的方法中，其中方法包括使表面或环境与本发明的载体细菌接触，使得本发明的质粒DNA能够从载体接合转移至靶细菌，并使得抗菌剂能够杀伤靶细胞。例如，可处理可用于侵入性治疗比如外科手术、导管插入术等的表面以防止受试者被表面上的细菌污染物感染。考虑本发明的方法和组合物可用于处理许多表面、物体、材料等(例如医疗或急救设备、婴儿室和厨房设备和表面)以控制其上的细菌污染。

包含载体细菌的药用制剂或其他组合物可以剂量单位形式配制以易于给予和剂量均匀。如本文使用的剂量单位形式是指适合于经受处理的患者或植物或环境或表面的药用制剂的物理离散单位。每个剂量应含有经计算可产生与所选载体相关的期望的抗菌作用的一定量的载体细菌。用于确定适当剂量单位的程序为本领域技术人员熟知的。剂量单位可基于患者、植物、表面或环境的重量成比例地增加或减少。如本领域已知的，可通过剂量浓度曲线计算确定用于实现致病性靶细胞(例如包含在患者的组织中)的根除的适当浓度。

还考虑本发明载体细菌的其他用途。这些包括各种农业、园艺、环境和食品加工应用。例如，在农业和园艺中，可靶向各种植物致病性细菌以尽量减少植物病害。适合于靶向的植物病原体的一个实例为欧文氏菌属(例如火疫病的病原体解淀粉欧文氏菌(E amylovora))。类似的策略可用于减少或防止切花萎蔫。对于兽医或动物养殖，本发明的载体细胞可掺入到动物饲料(鸡、猪、家禽、山羊、绵羊、鱼、贝类或牛饲料)中以减少生物负荷或消除某些致病性生物体(例如沙门氏菌属，比如鸡、火鸡或其他家禽中的)。在其他实施方案中，本发明可应用于肉类或其他食物以消除不需要的或致病性细菌(例如肉类上的大肠杆菌O157:H7，或变形杆菌属，海鲜上“鱼腥味”的一种原因)。

环境效用包括例如改造载体细菌以递送和条件性地表达除抗菌剂之外或代替抗菌剂的杀虫剂(例如用于控制传播疟疾或西尼罗河病毒的蚊子)。在这种应用中，以及在农业和园艺或上述其他应用中，考虑将载体细菌配制成溶液剂、气雾剂或凝胶胶囊剂。

如本文使用的术语“载体细胞”、“第一细胞”或“供体细胞”包括分裂和/或非分裂细菌细胞(微细胞和大细胞)，或条件性非功能性细胞。

在一个实例中，质粒为改造的RK2或RP4质粒。在一个实例中，质粒DNA包含在改造的RK2/RP4质粒(即已通过重组DNA技术修饰的RK2质粒或这种修饰的质粒的后代)中。质粒RK2为一种混杂质粒，可在29种(并且可能更多)革兰氏阴性物种中复制(Guiney和Lanka,1989, p 27-54. 载于C. M. Thomas (ed) Promiscous plasmids in gram-negativebacteria. London, Ltd London United Kingdom.)。质粒RK2为一种60-kb可自我传播的质粒，具有已知的完整核苷酸序列(Pansegrau等人, 1994, J. Mol. Biol. 239, 623-663)。已经获得衍生于这种大质粒的最小复制子，除了trfA基因外，其缺乏编码称为TrfA的质粒Rep蛋白和营养复制起点oriV的所有其基因，关于RK2复制及其通过TrfA蛋白的控制的综述，参见Helinski等人, 1996 (载于Escherichia coli and Salmonella Cellular andMolecular Biology, Vol. 2 (ed. F. Neidhardt,等人, 2295-2324, ASM Press,Washington D.C.)。

在一个实例中，质粒DNA包含在改造的R6K质粒(即已通过重组DNA技术修饰的R6K质粒或这种修饰的质粒的后代)中。

本发明任选地用于工业或家庭用途，或者用于这种用途的方法中。例如，其用于或使用于农业、燃油或石油工业、食品或饮料工业、服装工业、包装工业、电子工业、计算机工业、环境工业、化学工业、航空航天工业、汽车工业、生物技术工业、医疗工业、医疗保健工业、牙科工业、能源工业、消费品工业、制药工业、采矿工业、清洁工业、林业、渔业、休闲工业、回收工业、化妆品工业、塑料工业、纸浆或造纸工业、纺织工业、服装工业、皮革或绒面革或动物皮工业、烟草工业或钢铁工业。

本发明任选地用于工业或者环境为工业环境，其中工业为选自以下领域的工业：医疗和保健；制药；人类食品；动物食品；植物肥料；饮料；乳制品；肉类加工；农业；畜牧业；家禽养殖；鱼类和贝类养殖；兽医；燃油；气体；石油化学品；水处理；污水处理；包装；电子和计算机；个人保健和洗漱用品；化妆品；牙科；非医疗牙科；眼科；非医疗眼科；矿产开采和加工；金属开采和加工；采石；航空；汽车；轨道；航运；空间；环境；土壤处理；纸浆和造纸；服装制造；染料；印刷；粘合剂；空气处理；溶剂；生物防御；维生素补充剂；冷藏；纤维浸渍和生产；生物技术；化学；工业清洁产品；家用清洁产品；肥皂和洗涤剂；消费产品；林业；捕鱼；休闲；回收；塑料；兽皮、皮革和绒面革；废物管理；殡葬事业；燃料；建筑；能源；钢铁；和烟草工业领域。

在一个实例中，质粒DNA包含靶向靶细菌的CRISPR阵列，其中阵列包含一个或两个或更多个不同的间隔区(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个间隔区)用于靶向靶细菌的基因组。

在一个实例中，靶细菌包含在如下的环境中。在一个实例中，环境为人类的微生物组，例如口腔微生物组或肠道微生物组或血流。在一个实例中，环境不是人类体内或之上的环境。在一个实例中，环境不是非人动物体内或之上的环境。在一个实施方案中，环境为空气环境。在一个实施方案中，环境为农业环境。在一个实施方案中，环境为燃油或石油采收环境，例如燃油或石油田或井。在一个实例中，环境为供人类或非人动物食用的食品或饮料中或之上的环境。在一个实例中，环境为海洋环境，例如，在海水中或在船上(例如在船或船压载水中)。

在一个实例中，环境为人类或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤或口腔微生物组)。在一个实例中，靶细菌包含在人类或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤或口腔微生物组)中。

在一个实例中，将本发明的载体细菌或组合物鼻内、局部或口服给予人类或非人动物，或者用于这种给予。旨在治疗人类或动物微生物组的技术人员将能够根据感兴趣的微生物组确定最佳给予途径。例如，当微生物组为肠道微生物组时，可鼻内或口服给予。当微生物组为头皮或腋窝微生物组时，可局部给予。当微生物组在口腔或喉咙中时，可口服给予。

在一个实例中，环境包含在饮料或水(例如供人类食用的水道或饮用水)或土壤中。水任选地在加热、冷却或工业系统中，或者在饮用水储存容器中。

在一个实例中，载体和/或靶细菌为选自以下的厚壁菌门(Firmicutes)：厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、厌氧发酵产氢细菌(Acetanaerobacterium)、聚乙酸菌属(Acetitomaculum)、醋弧菌属(Acetivibrio)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、厌氧细杆菌属(Anaerofilum)、厌氧弯曲菌属(Anaerosinus)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、Anaerovorax、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、梭菌属(Clostridium)、粪球菌属(Capracoccus)、脱卤素杆菌属(Dehalobacter)、小杆菌属(Dialister)、多尔氏菌属(Dorea)、肠球菌属(Enterococcus)、产乙醇杆菌属(Ethanoligenens)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Gracilibacter、Guggenheimella、Hespellia、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、巨单胞菌属(Megamonas)、Moryella、光冈菌属(Mitsuokella)、颤杆菌克属(Oribacterium)、产醋杆菌属(Oxobacter)、乳头杆属(Papillibacter)、丙酸螺菌属(Proprionispira)、假丁酸弧菌属(Pseudobutyrivibrio)、假支杆菌属(Pseudoramibacter)、罗氏菌属(Roseburia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、八叠球菌属(Sarcina)、清野氏菌属(Seinonella)、Shuttleworthia、孢杆菌属(Sporobacter)、Sporobacterium、链球菌属(Streptococcus)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、互营球菌属(Syntrophococcus)、栖热杆菌属(Thermobacillus)、Turibacter和魏斯氏菌属(Weissella)。

在一个实例中，载体细菌、组合物、用途或方法用于减少致病性感染或者用于重新平衡肠道或口腔生物膜，例如用于在人类或动物治疗或预防肥胖症或疾病，或者用于治疗或预防GI病症(比如克罗恩病、IBD或结肠炎)。例如，DNA、载体细菌、组合物、用途或方法用于在人类或动物的肠道生物膜或植物中(优选地在人类或动物中)敲减沙门氏菌属(Salmomnella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonous)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、艰难梭菌(Clostridium difficile)或大肠杆菌细菌。

在一个实例中，动物为鸡，例如靶细菌为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。在一个实例中，动物为鱼(例如鲶鱼或鲑鱼)或贝类(例如对虾或龙虾)，并且例如靶细菌为爱德华氏菌属。在一个实例中，植物为马铃薯植物并且例如靶细菌为果胶杆菌属(Pectobacterium)。在一个实例中，植物为甘蓝植物，并且例如靶细菌为黄单胞菌属(Xanthomonous) (例如野油菜黄单胞菌(X campestris))。在一个实例中，植物为大麻植物，并且例如靶细菌为假单胞菌属(例如大麻假单胞菌(P cannabina)或扁桃假单胞菌(P amygdali))、农杆菌属(Agrobacterium) (例如根癌农杆菌(A tumefaciens))或黄单胞菌属(例如野油菜黄单胞菌(X campestris))。在一个实例中，植物为大麻类植物，并且例如靶细菌为假单胞菌属(例如大麻假单胞菌或扁桃假单胞菌)、农杆菌属(例如根癌农杆菌)或黄单胞菌属(例如野油菜黄单胞菌)。

在一个实例中，疾病或病症为癌症、炎症性或自身免疫性疾病或病症，例如肥胖症、糖尿病、IBD、GI道病症或口腔病症。

任选地，环境包含在或靶细菌包含在肠道生物膜、皮肤生物膜、口腔生物膜、喉咙生物膜、毛发生物膜、腋窝生物膜、阴道生物膜、直肠生物膜、肛门生物膜、眼部生物膜、鼻部生物膜、舌头生物膜、肺部生物膜、肝脏生物膜、肾脏生物膜、生殖器生物膜、阴茎生物膜、阴囊生物膜、乳腺生物膜、耳部生物膜、尿道生物膜、唇生物膜、器官生物膜或牙齿生物膜中。任选地，环境包含在或靶细菌包含在植物(例如烟草、作物、果树、蔬菜植物或烟草，例如在植物表面上或包含在植物中)或环境(例如土壤或水或水道或水性液体)中。

在一个实例中，载体细胞或组合物用于在动物或人类中治疗疾病或病症。在一个实例中，疾病或病症由包含在受试者或患者中的靶细胞的感染引起或介导。在一个实例中，疾病或病症与包含在受试者或患者中的靶细胞的感染相关。在一个实例中，疾病或病症的症状为包含在受试者或患者中的靶细胞的感染。

任选地，人类或动物受试者的疾病或病症选自：

(a) 神经退行性疾病或病症；

(b) 脑部疾病或病症；

(c) CNS疾病或病症；

(d) 记忆丧失或损伤；

(e) 心脏或心血管疾病或病症，例如心脏病发作、中风或心房颤动；

(f) 肝脏疾病或病症；

(g) 肾脏疾病或病症，例如慢性肾脏疾病(CKD)；

(h) 胰腺疾病或病症；

(i) 肺部疾病或病症，例如囊性纤维化或COPD；

(j) 胃肠疾病或病症；

(k) 喉咙或口腔疾病或病症；

(l) 眼部疾病或病症；

(m) 生殖器疾病或病症，例如阴道、阴唇、阴茎或阴囊疾病或病症；

(n) 性传播疾病或病症，例如淋病、HIV感染、梅毒或衣原体属感染；

(o) 耳部疾病或病症；

(p) 皮肤病或病症；

(q) 心脏病或病症；

(r) 鼻部疾病或病症

(s) 血液疾病或病症，例如贫血，例如慢性病或癌症性贫血；

(t) 病毒感染；

(u) 致病性细菌感染；

(v) 癌症；

(w) 自身免疫性疾病或病症，例如SLE；

(x) 炎症性疾病或病症，例如类风湿性关节炎、银屑病、湿疹、哮喘、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩病或IBD；

(y) 自闭症；

(z) ADHD；

(aa) 双相型障碍；

(bb) ALS [肌萎缩侧索硬化]；

(cc) 骨关节炎；

(dd) 先天性或发育缺陷或病症；

(ee) 流产；

(ff) 血液凝固病症；

(gg) 支气管炎；

(hh) 干性或湿性AMD；

(ii) 新血管形成(例如肿瘤或眼睛中的)；

(jj) 普通感冒；

(kk) 癫痫；

(ll) 纤维化，例如肝脏或肺部纤维化；

(mm) 真菌性疾病或病症，例如鹅口疮；

(nn) 代谢性疾病或病症，例如肥胖症、厌食症、糖尿病、I型或II型糖尿病。

(oo) 溃疡，例如胃溃疡或皮肤溃疡；

(pp) 干性皮肤；

(qq) 干燥综合征；

(rr) 细胞因子风暴；

(ss) 耳聋、听力丧失或损伤；

(tt) 缓慢或快速的新陈代谢(即比受试者的体重、性别和年龄的平均值更缓慢或更快速)；

(uu) 受孕障碍，例如不育或生育力低；

(vv) 黄疸；

(ww) 皮疹；

(xx) 川崎病；

(yy) 莱姆病；

(zz) 过敏，例如坚果、草、花粉、尘螨、猫或狗的皮毛或皮屑过敏；

(aaa) 疟疾、伤寒、结核病或霍乱；

(bbb) 抑郁症；

(ccc) 智力低下；

(ddd) 小头畸形；

(eee) 营养不良；

(fff) 结膜炎；

(ggg) 肺炎；

(hhh) 肺栓塞；

(iii) 肺动脉高压；

(jjj) 骨病；

(kkk) 败血症或败血症性休克；

(lll) 鼻窦炎；

(mmm) 应激(例如职业性应激)；

(nnn) 地中海贫血、贫血、血管性血友病或血友病；

(ooo) 带状疱疹或感冒疮；

(ppp) 月经；

(qqq) 精子计数低。

用于通过本发明治疗或预防的神经退行性或CNS疾病或病症

在一个实例中，神经退行性或CNS疾病或病症选自阿尔茨海默病(Alzheimerdisease)、老年精神病(geriopsychosis)、唐氏综合征(Down syndrome)、帕金森病(Parkinson's disease)、克雅氏病(Creutzfeldt-jakob disease)、糖尿病性神经病(diabetic neuropathy)、帕金森综合征(Parkinson syndrome)、亨廷顿病(Huntington'sdisease)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis)、糖尿病性神经病(diabetic neuropathy)和克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt Creutzfeldt- Jakob disease)。例如，疾病为阿尔茨海默病。例如，疾病为帕金森综合征。

在一个实例中，其中本发明的方法对于人类或动物受试者实施以治疗CNS或者神经退行性疾病或病症，方法导致受试者的Treg细胞下调，从而促进系统性单核细胞衍生的巨噬细胞和/或Treg细胞穿过脉络丛进入受试者的大脑，藉此治疗、预防疾病或病症(例如阿尔茨海默病)或者减缓其进展。在一个实施方案中，方法导致受试者的CNS系统(例如大脑和/或CSF)中的IFN-γ增加。在一个实例中，方法恢复神经纤维和/或减少神经纤维损伤的进展。在一个实例中，方法恢复神经髓鞘和/或减缓神经髓鞘损伤的进展。在一个实例中，本发明的方法治疗或预防WO2015136541中公开的疾病或病症和/或方法可与WO2015136541中公开的任何方法一起使用(该文献的公开内容通过参考以其全部结合至本文中，例如用于提供这种方法、疾病、病症和潜在治疗剂的公开，这些治疗剂可给予受试者以实现CNS和神经退行性疾病和病症的治疗和/或预防，例如治疗剂比如免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM3或其中公开的其他抗体)。

用于通过该方法治疗或预防的癌症

可治疗的癌症包括没有血管化的或基本上没有血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(比如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或者可包括实体肿瘤。待用本发明治疗的癌症类型包括(但不限于)癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴系统恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤(malignant tumour)以及恶性肿瘤(malignancies)，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。

血液癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或造血性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(比如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和髓母细胞、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(比如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma) (惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体肿瘤为通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们(比如肉瘤、癌和淋巴瘤)的细胞类型命名。实体肿瘤(比如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing's tumour)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴系统恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤(Wilms'tumour)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(比如胶质瘤(比如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

用于通过该方法治疗或预防的自身免疫性疾病

1. 急性播散性脑脊髓炎(ADEM)

2. 急性坏死性出血性白质脑炎

3. 艾迪生病

4. 无丙种球蛋白血症

5. 斑秃

6. 淀粉样变性

7. 强直性脊柱炎

8. 抗GBM/抗TBM肾炎

9. 抗磷脂综合征(APS)

10. 自身免疫性血管性水肿

11. 自身免疫性再生障碍性贫血

12. 自身免疫性自主神经功能障碍

13. 自身免疫性肝炎

14. 自身免疫性高脂血症

15. 自身免疫性免疫缺陷

16. 自身免疫性内耳疾病(AIED)

17. 自身免疫性心肌炎

18. 自身免疫性卵巢炎

19. 自身免疫性胰腺炎

20. 自身免疫性视网膜病

21. 自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)

22. 自身免疫性甲状腺疾病

23. 自身免疫性荨麻疹

24. 轴突和神经元神经病

25. 巴洛病

26. 白塞氏病

27. 大疱性类天疱疮

28. 心肌病

29. 卡斯尔曼病

30. 乳糜泻

31. 恰加斯病

32. 慢性疲劳综合征

33. 慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)

34. 慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)

35. Churg-Strauss综合征

36. 瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮

37. 克罗恩病

38. 科干综合征

39. 冷凝集素病

40. 先天性心脏阻滞

41. 柯萨奇心肌炎

42. CREST病)

43. 特发性混合型冷球蛋白血症

44. 脱髓鞘性神经病

45. 疱疹样皮炎

46. 皮肌炎

47. 德维克病(视神经脊髓炎)

48. 盘状狼疮

49. 德雷斯勒综合征

50. 子宫内膜异位

51. 嗜酸性食管炎

52. 嗜酸性筋膜炎

53. 结节性红斑

54. 实验性变应性脑脊髓炎

55. 埃文斯综合征

56. 纤维肌痛

57. 纤维化性肺泡炎

58. 巨细胞动脉炎(颞动脉炎)

59. 巨细胞性心肌炎

60. 肾小球肾炎

61. 肺出血-肾炎综合征

62. 肉芽肿性多血管炎(GPA) (以前称为韦格纳肉芽肿)

63. 格雷夫斯病

64. 吉兰-巴利综合征

65. 桥本脑炎

66. 桥本甲状腺炎

67. 溶血性贫血

68. 亨诺-许兰紫癜

69. 妊娠疱疹

70. 低丙种球蛋白血症

71. 特发性血小板减少性紫癜(ITP)

72. IgA肾病

73. IgG4相关的硬化性疾病

74. 免疫调节性脂蛋白

75. 包涵体肌炎

76. 间质性膀胱炎

77. 幼年关节炎

78. 幼年型糖尿病(1型糖尿病)

79. 幼年肌炎

80. 川崎综合征

81. 兰伯特-伊顿综合征

82. 白细胞碎裂性血管炎

83. 扁平苔藓

84. 硬化性苔藓

85. 木样结膜炎

86. 线状IgA病(LAD)

87. 狼疮(SLE)

88. 莱姆病，慢性

89. 梅尼埃病

90. 显微镜下多血管炎

91. 混合性结缔组织病(MCTD)

92. 莫伦氏溃疡

93. 穆夏-哈伯曼病

94. 多发性硬化

95. 重症肌无力

96. 肌炎

97. 发作性睡病

98. 视神经脊髓炎(德维克)

99. 中性粒细胞减少症

100. 眼部瘢痕性类天疱疮

101. 视神经炎

102. 复发性风湿病

103. PANDAS (儿童链球菌属相关性自身免疫性神经精神障碍)

104. 副肿瘤性小脑变性

105. 阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)

106. 帕罗综合征

107. 牧师-特纳综合征

108. 扁平部睫状体炎(周边葡萄膜炎)

109. 天疱疮

110. 周围神经病

111. 静脉周围脑脊髓炎

112. 恶性贫血

113. POEMS综合征

114. 结节性多动脉炎

115. I、II、III型自身免疫性多腺体综合征

116. 风湿性多肌痛

117. 多发性肌炎

118. 心肌梗塞后综合征

119. 心包切开术后综合征

120. 孕酮皮炎

121. 原发性胆汁性肝硬化

122. 原发性硬化性胆管炎

123. 银屑病

124. 银屑病关节炎

125. 特发性肺纤维化

126. 坏疽性脓皮病

127. 单纯红细胞再生障碍性贫血

128. 雷诺现象

129. 反应性关节炎

130. 反射性交感神经营养不良

131. 赖特综合征

132. 复发性多软骨炎

133. 不宁腿综合征

134. 腹膜后纤维化

135. 风湿热

136. 类风湿性关节炎

137. 结节病

138. 施密特综合征

139. 巩膜炎

140. 硬皮病

141. 干燥综合征

142. 精子和睾丸自身免疫

143. 僵人综合症

144. 亚急性细菌性心内膜炎(SBE)

145. 苏萨克综合征

146. 交感性眼炎

147. 大动脉炎

148. 颞动脉炎/巨细胞动脉炎)

149. 血小板减少性紫癜(TTP)

150. Tolosa-Hunt综合征

151. 横贯性脊髓炎

152. 1型糖尿病

153. 溃疡性结肠炎

154. 未分化结缔组织病(UCTD)

155. 葡萄膜炎

156. 血管炎

157. 水疱性大疱性皮肤病

158. 白癜风

159. 韦格纳肉芽肿(现称为肉芽肿性多血管炎(GPA))

用于通过该方法治疗或预防的炎症性疾病

1. 阿尔茨海默病

2. 强直性脊柱炎

3. 关节炎(骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎)

4. 哮喘

5. 动脉粥样硬化

6. 克罗恩病

7. 结肠炎

8. 皮炎

9. 憩室炎

10. 纤维肌痛

11. 肝炎

12. 肠易激综合征(IBS)

13. 系统性红斑狼疮(SLE)

14. 肾炎

15. 帕金森病

16. 溃疡性结肠炎。

应当理解，本文描述的特定实施方案为通过说明而不是作为对本发明的限制来显示。本发明的主要特征可用于各种实施方案而不背离本发明的范围。本领域的技术人员将认识到或能够使用不多于常规研究来确定本文描述的特定程序的许多等效物。这种等效物认为处于本发明的范围内并且由权利要求覆盖。说明书中提及的所有出版物和专利申请均表明本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请以及所有美国等效专利申请和专利均通过参考结合至本文中至如同每个单独出版物或专利申请具体地和单独地表明通过参考结合的相同程度。当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，词语“一(a)”或“一个(an)”的使用可意指“一个(one)”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指明仅指备选方案或者备选方案为相互排斥的，尽管本公开支持仅指备选方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括装置的固有误差变化、用于确定该值的方法或研究对象之间存在的变化。

如在本说明书和权利要求中使用的词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含(comprising)，比如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有(having)，比如“具有(have)”和 “具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，比如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有(containing)，比如“含有(contains)”和“含有(containing)”)为包括性或开放式的并且不排除另外未列举的要素或方法步骤。

如本文使用的术语“或其组合”或类似术语是指在该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合旨在包括以下至少一项：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果顺序在特定上下文中很重要，则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合，比如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCACC、CBBAAA、CABABB等。技术人员应当理解，一般地对任何组合中的项目或术语的数量没有限制，除非从上下文中另外显而易见。

本公开的任何部分可与本公开的任何其他部分组合阅读，除非从上下文中另外显而易见。

根据本公开，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可在没有过度实验的情况下制造和执行。尽管本发明的组合物和方法已根据优选的实施方案进行描述，但对本领域技术人员显而易见的是可对本文描述的组合物和/或方法以及在方法的步骤或步骤顺序方面施加变化而不背离本发明的概念、精神和范围。对本领域技术人员显而易见的所有这种类似的替代和修改均认为处于如所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念之内。

实施例

实施例1：敲除hypC2功能大大提高接合效率

高度接合突变体的转座子文库构建和富集

使用EZ-Tn5™试剂盒(Lucigen, Middleton, USA)按照制造商的方案构建质粒pX1.0 (Genbank登录号：HM114226.1)的转座子突变体文库。用1 μl文库经电穿孔转化大肠杆菌Top10感受态细胞(ThermoFisher, Massachusetts, USA)，并在37℃下伴随振荡回收2小时。然后将转化混合物在50 ug/ml卡那霉素中稀释五倍以富集具有成功的Tn5转座的质粒。

确定接合效率

供体(含有野生型或突变型质粒的大肠杆菌MG1655)和链霉素抗性受体大肠杆菌MG1655的过夜培养物以1:1的比例混合并点样于LB琼脂平板表面上。将接合混合物温育14小时，之后将由两种菌株组成的菌落从平板上刮下并在PBS中稀释。将不同稀释液铺板于选择性平板上以分离和量化转移接合子、供体和受体。

hypC2及其蛋白的序列如表3所示。

接合实验结果：

参见图1。hypC2 KO (敲除)质粒突变体显示出的接合率为野生型(WT)的大约1000x高。显示的是利用WT和优化的(突变型)质粒从相同量的供体和温育时间获得的转移接合子(感染的细胞)的数量。

实施例2：hypC2广泛存在于质粒中

pX1.0质粒为一种典型的IncX质粒，由天然存在的IncX质粒构建，以含有IncX质粒组内的核心功能。参见PLoS One. 2011; 6(5):e19912. doi: 10.1371/journal.pone.0019912. Epub 2011年5月18日; “Design and synthesis of aquintessential self-transmissible IncX1 plasmid, pX1.0”, Hansen LH等人。IncX质粒在历史上由其复制模块定义，该模块用于其分型，如其他地方所述。参见例如Plasmid.2012年7月; 68(1):43-50. doi: 10.1016/j.plasmid.2012.03.001. Epub 2012年3月26日; “Expansion of the IncX plasmid family for improved identification andtyping of novel plasmids in drug-resistant Enterobacteriaceae”, Johnson TJ等人。

hypC2基因的blast显示相同(100% ID和覆盖率)基因存在于Genbank中的33种不同质粒中。除此之外，在68种测序的质粒中发现了多于80%的覆盖率和80%的ID，之后观察到ID和覆盖率(对不相关的序列)两者急剧下降。该基因存在于大肠杆菌和沙门氏菌属物种中，而且在志贺氏菌属和克雷伯氏菌属中也有高同一性。

作为成对比对输出：

% ID为比对中(完美)匹配的百分比，并且(查询)覆盖率为与靶序列对齐的查询(hyp2C)序列的(长度的)百分比。

表 1：在存在于不同细菌宿主物种中的个体质粒实例中发现的hypC2的相关性：

登录号	ID %	覆盖率%	质粒	物种	SEQ ID NO:
						HG963477.1	100	100	pIS15_43	大肠杆菌	1
CP023137.2	96.7	98	未命名	肺炎克雷伯氏菌	3
						CP005391.2	96.6	100	pCFSAN002069	肠道沙门氏菌	4
CP013972.1	79.6	99	未命名	嗜气管欧文氏菌	5
						CP017588.1	98.1	99	pDSJ07	斯氏泛菌	6
CP026699.1	78.5	88	未命名)	克氏柠檬酸杆菌	7

并且用于说明的系统发生图如图2所示。

。

表3：序列

hypC2处于pX1.0骨架的20849-21064位

#转座子插入下划线的A和G之间，从而使基因的功能失活以产生hypC2 KO

*序列位于基因的源序列的反向链上(即方向为从右到左)。

Claims

1.一种缺乏hypC2核苷酸序列或其同源物的接合质粒。

2.权利要求1的质粒，其中所述质粒缺乏SEQ ID NO: 1或与SEQ ID NO: 1具有至少70%同一性的核苷酸序列。

3.权利要求1或2的质粒，其中所述质粒包含IncX质粒的OriT，任选地其中所述质粒为IncX质粒。

4.任何前述权利要求的质粒，其中所述质粒为肠杆菌科质粒，任选地其中所述质粒为大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属质粒。

5.任何前述权利要求的质粒，其中所述质粒能够寄宿于肠杆菌科细胞中，任选地其中所述质粒能够寄宿于大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

6.任何前述权利要求的质粒，其中所述质粒能够接合转移至肠杆菌科细胞中，任选地其中所述质粒能够接合转移至大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞中。

7.一种包含接合质粒的细菌细胞，其中所述细胞不包含hypC2蛋白或其同源物。

8.权利要求7的细胞，其中所述蛋白包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70%同一性的氨基酸序列。

9.权利要求7或8的细胞，其中所述细胞为肠杆菌科细胞，任选地其中所述细胞为大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

10.任何前述权利要求的质粒或细胞，其中所述质粒包含或编码抗菌剂。

11.任何前述权利要求的质粒或细胞，其中所述质粒编码引导RNA或crRNA，任选地其中所述引导RNA或crRNA能够与靶细胞的前间隔序列杂交。

12.权利要求11的质粒或细胞，其中所述靶细胞选自大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

13.权利要求1-6和10-12中任何一项的质粒在制造组合物中的用途，所述组合物包含含有所述质粒的第一细胞群，用于在第一和第二细胞彼此接触且为细菌细胞时，提高质粒从第一细胞到第二群体的细胞的接合转移的频率。

14.一种将感兴趣的核酸序列(NSI)从供体细胞转移至受体细胞中的方法，其中NSI包含在质粒中并且所述质粒包含在所述供体细胞中，所述方法包括组合所述细胞以允许将所述质粒从所述供体细胞接合转移至所述受体细胞中，其中所述质粒为权利要求1-6和10-12中任何一项的质粒。

15.权利要求14的方法，其中所述供体细胞选自大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞和/或所述受体细胞选自大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

16.权利要求14或15的方法，其中所述受体细胞为肠杆菌科细胞和/或所述供体细胞为大肠杆菌细胞。

17.权利要求14-16中任何一项的方法，其中所述NSI为或编码抗菌剂，任选地其中所述抗菌剂对所述受体细胞具有毒性。

18.一种在人类或动物受试者中治疗感染的方法，其中所述感染为多种细菌细胞(受体细胞)的感染，所述方法包括：

(i) 将多种供体细菌细胞给予所述受试者，藉此受体细胞与供体细胞组合，其中每种供体细胞包含权利要求1-6和10-12中任何一项的质粒；

(ii) 并允许将质粒从所述供体细胞接合转移至所述受体细胞中，其中每种转移的质粒包含相应的感兴趣的核酸序列(NSI)，所述核酸序列包含或编码对受体细胞具有毒性的抗菌剂或其组分，藉此杀伤受体细胞或者抑制受体细胞的生长或增殖。

19.用于权利要求18的方法的权利要求1-12中任何一项的质粒或细胞。

20.权利要求18或19的方法、质粒或细胞，其中所述方法进一步根据权利要求14-17中的任何一项。

21.权利要求18、19或20的方法、质粒或细胞，其中所述供体细胞为大肠杆菌细胞和所述受体细胞为大肠杆菌、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、欧文氏菌属、志贺氏菌属、泛菌属、变形菌属或柠檬酸杆菌属细胞。

22.一种产生缺乏功能性hypC2核苷酸序列或其同源物的接合质粒的方法，所述方法包括

(a) 提供包含第一核苷酸序列的第一接合质粒，第一核苷酸序列为对于表达hypC2蛋白为功能性的hypC2核苷酸序列或其同源物；和

(b) 从第一质粒中缺失第一序列或使第一序列突变以使所述序列对于所述蛋白的表达为非功能性的，从而产生所述接合质粒。

23.权利要求1-12和21中任何一项的质粒或细胞，其中所述质粒通过权利要求22的方法可获得或获得。