JP2022545501A - プラスミド - Google Patents

Abstract

本発明は細菌の間の接合を実行するための手段に関し、特に本発明は抗微生物剤を含むキャリア（即ちドナー）細菌および使用の方法に関する。キャリア細菌は、薬剤をコードするＤＮＡを標的細胞（即ちレシピエント細胞）に接合移入することができる。本発明は、これらの目的のため、機能性ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列を欠く新規なプラスミドを提供する。【選択図】図３（ａ）

Description

本発明は細菌の間の接合を実行するための手段に関し、特に本発明は抗微生物剤を含むキャリア（即ちドナー）細菌および使用の方法に関する。キャリア細菌は、薬剤をコードするＤＮＡを標的細胞（即ちレシピエント細胞）に接合移入することができる。本発明は、これらの目的のため、機能性ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列を欠く新規なプラスミドを提供する。

染色体外の複製（ｏｒｉ）および移入（ｔｒａ）を制御するＤＮＡ配列は相互に異なる。即ち、複製配列は一般にプラスミドの移入を制御せず、逆もそうである。複製および移入はいずれも、プラスミドおよび宿主にコードされた機能の両方を使用する複雑な分子プロセスである。細菌の接合は、１つの細菌から別の細菌への遺伝情報の一方向性かつ水平的な伝染である。移入される遺伝物質はプラスミドであってもよく、染色体の一部であってもよい。接合性プラスミドを保有する細菌細胞は、ドナー細胞とレシピエント細胞とのカップリングおよび遺伝情報の移入に関与する表面構造（性線毛）を含んでいる。接合には細胞間の接触が関与しており、遺伝形質の移入は多くのプラスミドによって媒介され得る。全ての天然の移入機構の中で、接合が最も効率的である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＦプラスミド、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓのｐＣＦｌＯプラスミド、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｐＸＯ１６プラスミドは、交配対の確立のために異なる機構を採用しており、交配凝集体のサイズが異なり、またこれらはグラム陰性（Ｆ）ならびにグラム陽性（ｐＣＦｌＯおよびｐＸＯ１６）の細菌の中で異なる宿主範囲を有している。これらのプラスミドのサイズも異なり、それぞれ５４、１００、および２００ｋｂである。しかし注目すべきことに、これらの接合系は極めて重要な特徴を共通して有している。これらは液体培地中で接合移入を持続することができ、極めて短時間で１００％に近い移入効率に到達することが多い。即ち、接合プロセスは、環境のヌクレアーゼに対するプラスミドＤＮＡの保護およびレシピエント細胞へのプラスミドＤＮＡの極めて効率的な送達を可能にする。接合機能は天然にはプラスミドにコードされている。数多くの接合性プラスミド（およびトランスポゾン）が知られており、これらは１つの種の中で（狭い宿主範囲）または多くの種の間で（広い宿主範囲）、関連する遺伝子を移入することができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、およびＮｏｃａｒｄｉａの病原性株を含むがこれらに限定されない数多くのグラム陽性の属において伝染可能なプラスミドが報告されている。接合の初期の段階は一般にグラム陰性細菌とグラム陽性の細菌とで異なる。グラム陰性細菌からの接合性プラスミドにおけるいくつかの移入遺伝子の役割は、線毛によって媒介される細胞間接触、接合ポアの形成、および関連する形態学的機能を提供することである。グラム陽性細菌においては、線毛は接合の開始には関与していないようである。

本発明は、以下を提供する。

第１の構成において、
ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを欠く接合性プラスミド。
第２の構成において、
接合性プラスミドを含む細菌細胞であって、前記細胞がｈｙｐＣ２タンパク質またはそのホモログを含まない、細菌細胞。
第３の構成において、
前記プラスミドを含む細胞の第１の集団を含む組成物の製造における、本発明によるプラスミドの使用であって、第１の細胞と第２の細胞が相互に接触した場合に、前記第１の細胞から第２の集団の細胞へのプラスミドの接合性移入の頻度を増進させるための使用。
第４の構成において、
ドナー細胞からレシピエント細胞に目的の核酸配列（ＮＳＩ）を移入する方法であって、前記ＮＳＩがプラスミドに含まれ、前記プラスミドが前記ドナー細胞に含まれ、前記方法が前記ドナー細胞から前記レシピエント細胞への前記プラスミドの接合性移入を可能にするように前記細胞を組み合わせることを含み、前記プラスミドが本発明による、方法。
第５の構成において、
ヒトまたは動物の対象における感染を処置する方法であって、前記感染が複数の細菌細胞（レシピエント細胞）の感染であり、前記方法が
（ｉ）複数のドナー細菌細胞を前記対象に投与することであって、それによりレシピエント細胞がドナー細胞と組み合わされ、それぞれのドナー細胞が本発明によるプラスミドを含む、投与すること、および
（ｉｉ）前記ドナー細胞から前記レシピエント細胞へのプラスミドの接合性移入を可能にすることであって、それぞれの移入されたプラスミドが、レシピエント細胞に対して毒性である抗菌剤またはその構成要素を含むかまたはコードするそれぞれの目的の核酸配列（ＮＳＩ）を含み、それによりレシピエント細胞が死滅するかまたはレシピエント細胞の成長もしくは増殖が阻害される、可能にすること
を含む、方法。
第６の構成において、
第５の構成の方法における使用のための、本発明のプラスミドまたは細胞。
第７の構成において、
機能性ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを欠く接合性プラスミドを産生する方法であって、
（ａ）ｈｙｐＣ２タンパク質を発現する機能を有するｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログである第１のヌクレオチド配列を含む第１の接合性プラスミドを準備すること、および
（ｂ）前記第１のプラスミドから前記第１の配列を欠失させるか、または前記第１の配列を変異させて、前記配列を前記タンパク質の発現について非機能性とし、それにより前記接合性プラスミドを産生すること
を含む、方法。
第８の構成において、
参照プラスミドの操作されたバージョンである接合性プラスミドであって、前記参照プラスミドが、ｈｙｐＣ２タンパク質を発現する機能を有するｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを含む第１のヌクレオチド配列を含み、前記操作によって前記ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログが欠失しているかまたは非機能性になっている、接合性プラスミド。

ｈｙｐｃ２ ＫＯ（ノックアウト）プラスミド変異体は、野生型（ＷＴ）と比較してほぼ１０００倍高い接合率を示す。ＷＴおよび最適化された（変異体）プラスミドによる同じドナー量およびインキュベーション時間で得られたトランスコンジュガント（感染した細胞）の数を示している。 様々な細菌宿主種において見られるプラスミドの個別の例で見出されたｈｙｐＣ２の関連性を示す系統図である。 （その配列部分が図中のそれぞれの線によって表される）多数のｉｎｃＸプラスミドの中のｈｙｐＣ２の存在を示す図である。ＨｙｐＣ２遺伝子は、ｈｙｐＣ１遺伝子（一般に存在するＯＲＦについて使用する名称）に関するその位置によって位置づけることができ（その遺伝子配置をｐＸ１プラスミドならびにその他の３つのｉｎｃＸプラスミドについて図式的に（ｂ）に示す）、ｓｔｂ型の毒素－抗毒素遺伝子に密に近接している。さらに、これは（ｔａｘＡまたはそのホモログから出発して）接合性オペロンの上流で一貫して見出される。（ａ）参照。 上記参照。

本発明は、接合性プラスミドにおける機能性ｈｙｐＣ２遺伝子の不活化が、プラスミドを有するドナー細胞とプラスミドが移入されるレシピエント細胞との間の接合の効率を大きく増強するという驚くべき知見に基づいている。不活化は、例えばそれによって遺伝子がその関連するｈｙｐＣ２タンパク質の発現について非機能性になるように、遺伝子またはその部分を欠失させるか、または１つもしくは複数の外因性配列を遺伝子に挿入することによって、達成され得る。任意で、プロモーターまたは遺伝子のその他の制御エレメントを不活化（例えば欠失）させて、遺伝子発現を防止してもよい。

さらに、本発明者は様々な多くのプラスミドを探索し、この遺伝子およびそのホモログが接合性プラスミドの中に広く分布していることを見出した。したがって本発明は、多くの治療用途および非治療用途を有するプラスミドの接合性移入を増進する一般に適用可能な方法を提供する。

本明細書では、「ドナー細胞」は「第１の細胞」または「キャリア細胞」と相互交換可能に使用され、「レシピエント細胞」は「第２の細胞」または「標的細胞」と相互交換可能に使用される。

この目的のため、本発明は、ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを欠く接合性プラスミドを提供する。

本発明はまた、
参照プラスミドの操作されたバージョンである接合性プラスミドであって、前記参照プラスミドが、ｈｙｐＣ２タンパク質を発現する機能を有するｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを含む第１のヌクレオチド配列を含み、前記操作によって前記ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログが欠失しているかまたは非機能性になっている、接合性プラスミドを提供する。

任意で、参照プラスミドはＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＨＧ９６３４７７．１、ＣＰ０２３１３７．２、ＣＰ００５３９１．２、ＣＰ０１３９７２．１、ＣＰ０１７５８８．１、またはＣＰ０２６６９９．１のプラスミドから選択され、または前記選択されたプラスミドのホモログから選択され、前記ホモログは、（ｉ）Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞、または（ｉｉ）Ｅ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、もしくはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞に接合移入することができる。

本発明はまた、
第７の構成の方法または以下に記載するプラスミドを産生する方法によって得られる接合性プラスミドを提供する。

本発明は、
機能性ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを欠く接合性プラスミドを産生する方法を提供し、本方法は、
（ａ）ｈｙｐＣ２タンパク質を発現する機能を有するｎｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログである第１のヌクレオチド配列を含む第１の接合性プラスミドを準備すること、および
（ｂ）前記第１のプラスミドから前記第１の配列を欠失させるか、または前記第１の配列を変異させて前記配列を前記タンパク質の発現について非機能性とし、それにより前記接合性プラスミドを産生すること
を含む。

日常的な分子生物学的手法、例えば当業者には既知の組換えＤＮＡ技術（例えば組換え操作）を使用して、第１の配列を欠失させまたは非機能性とすることができる。例えば、第１の配列またはその部分を、第１のプラスミドとの相同組換えにおいてＤＮＡベクターを使用すること等によって欠失させ、ここで相同組換え事象は第１の配列（または部分）を欠失させ、それにより、得られるプラスミドをｈｙｐＣ２タンパク質の発現について非機能性にしてもよい。さらにまたはその代わりに、１つまたは複数の核酸配列を第１の配列の中におよび／またはその付近に挿入し、それによりこの配列をｈｙｐＣ２タンパク質の発現について非機能性にしてもよい。

任意で、第１のプラスミドはＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＨＧ９６３４７７．１、ＣＰ０２３１３７．２、ＣＰ００５３９１．２、ＣＰ０１３９７２．１、ＣＰ０１７５８８．１、またはＣＰ０２６６９９．１のプラスミドから選択される。任意で、第１のプラスミドはＩｎｃＸプラスミド、例えばｐＸ１．０プラスミド、ｐＯＬＡ５２、ｐＩＳ１５＿４３、ｐＤＳＪ０７、またはＲ６Ｋプラスミドである。

任意で、接合性プラスミドまたは本発明のプラスミドは、Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＨＧ９６３４７７．１、ＣＰ０２３１３７．２、ＣＰ００５３９１．２、ＣＰ０１３９７２．１、ＣＰ０１７５８８．１、またはＣＰ０２６６９９．１から選択される改変されたプラスミドである。

任意で、接合性プラスミドまたは本発明のプラスミドは参照プラスミドの操作されたバージョンであり、参照プラスミドはＧｅｎｂａｎｋ（登録商標）受託番号ＨＧ９６３４７７．１、ＣＰ０２３１３７．２、ＣＰ００５３９１．２、ＣＰ０１３９７２．１、ＣＰ０１７５８８．１、またはＣＰ０２６６９９．１のプラスミドから選択され、参照プラスミドはｈｙｐＣ２タンパク質を発現する機能を有するｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを含む第１のヌクレオチド配列を含み、前記操作によってｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログは欠失しているかまたは非機能性になっている。

一例では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号１と少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。一例では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１および３～７から選択される配列または前記選択された配列と少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。

一例では、ｈｙｐＣ２タンパク質は、配列番号２または配列番号２と少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。

図３に見られるように、ｈｙｐＣ２はｓｔｂ型毒素－抗毒素遺伝子に密に近接して（ｓｔｂ遺伝子の１～５ｋｂ以内に）位置している。さらに、ｈｙｐＣ２は（ｔａｘＡまたはそのホモログから出発して）（ｔａｘＡ遺伝子の１～５ｋｂ以内に）接合性オペロンの上流で一貫して見出される。

一例では、ホモログは、配列番号１と少なくとも７５、７６、７７、７８、７９、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。説明として実施例２を参照されたい。さらにまたはその代わりに、ホモログはプラスミドｐＸ１．０の２０８４９位～２１０６４位に対応するプラスミド中の位置にある。

任意で、プラスミドは配列番号１または配列番号１と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を欠く。任意で、プラスミドは配列番号１または配列番号１と少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるヌクレオチド配列を欠く。

好ましくは、プラスミドはＩｎｃＸプラスミド、例えばｐＸ１．０プラスミドである。

一例では、プラスミドはＩｎｃＸプラスミド（例えばｐＸ１．０プラスミド、ｐＯＬＡ５２、ｐＩＳ１５＿４３、ｐＤＳＪ０７、またはＲ６Ｋプラスミド）から選択されるプラスミドのＯｒｉＴを含む。

一例では、プラスミドはｐＩＳ１５＿４３、ｐＣＦＳＡＮ００２０６９、ｐＯＬＡ５２、Ｒ６Ｋ、またはｐＤＳＪ０７プラスミドであり、即ちかかるプラスミドの骨格を含む。当業者には既知のように、プラスミド骨格はｏｒｉＶを含む。骨格はプラスミドの複製および／または接合に必要な１つまたは遺伝子をさらに含んでもよい。

任意で、プラスミドはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのプラスミドである。一例では、プラスミドはＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒのプラスミドである。

一例では、プラスミドはＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ宿主細胞の中で複製することができる。一例では、プラスミドは表２に開示した種または属の細胞の中で複製することができる。

任意で、プラスミドはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞を宿主とすることができる。

任意で、プラスミドはＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞を宿主とすることができる。

任意で、プラスミドはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞に接合移入することができ、例えば細胞は表２に開示したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの種または属の細胞である。

一例では、プラスミドは表２に開示した種または属の細胞に接合移入することができる。

任意で、プラスミドはＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばＫ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞に接合移入することができる。

本発明はまた、接合性プラスミドを含む細菌細胞を提供し、ここで細胞はｈｙｐＣ２タンパク質またはそのホモログを含まない。

例えば、細胞は配列番号２と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を含まない。例えば、細胞は配列番号２を含むタンパク質を含まず、例えばプラスミドはＩｎｃＸ（例えばｐＸ１．０）プラスミドである。例えば、プラスミドはＩｎｃＸ（例えばｐＸ１．０）プラスミドのＯｒｉＴを含む。例えば、プラスミドはＩｎｃＸプラスミドの接合系によって認識可能（即ちこれによって作動可能）である。

本発明はまた、かかる細菌細胞の集団を提供する。例えば、集団は少なくとも１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、または１０^１４個のかかる細胞を含む。

任意で、それぞれの細胞は少なくとも２、３、４，５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、または１００個の本発明のプラスミドを含む。任意で、細胞に含まれる本発明のプラスミドの全ては同一である。あるいは、細胞は２つ、３つ、またはそれより多い異なる型の本発明のプラスミドを含む。例えば、プラスミドは同一であるがＮＳＩにおいて異なってもよい。

任意で、細胞は配列番号２または配列番号２と少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を欠く。

任意で、細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞である。任意で、細胞はＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞である。

一実施形態では、プラスミドは抗菌剤またはかかる薬剤の構成要素を含むか、またはコードする。例えば、プラスミドは抗菌活性を有するＲＮＡ（例えばサイレンシングＲＮＡ）をコードする。例えば、プラスミドは抗菌活性を有するタンパク質をコードするか、またはタンパク質が抗菌剤の構成要素である。即ち、レシピエント細胞（または標的細胞もしくは第２の細胞。これらの両方は本明細書では「レシピエント細胞」と相互交換可能に使用される）の中に移入されれば、プラスミドは細胞内で薬剤または構成要素を発現することができ、薬剤は細胞を死滅させるか、または細胞の成長もしくは増殖を低減させる（または構成要素が細胞内で他の構成要素と組み合わされてかかる薬剤を形成する）。一例では、プラスミドはガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、任意でガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは標的細胞のプロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる。即ち、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは細胞中のＣａｓをガイドしてプロトスペーサーを改変（例えば切断）させ、それにより細胞が死滅するか、またはその成長もしくは増殖が阻害される。一例では、ＣａｓはＣａｓ９またはＣａｓ３である。ＣａｓはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型のＣａｓであってよい。Ｃａｓはニッカーゼであってよく、またはｄｓＤＮＡを切断してよい。ＣａｓはＲＮアーゼであってよい。

任意で、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばＫ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、ＰｒｏｔｅｕｓまたはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞から選択される。一例では、標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の細胞である。

本発明はさらに、
プラスミドを含む細胞の第１の集団を含む組成物の製造における、本発明によるプラスミドの使用であって、第１の細胞と第２の細胞が相互に接触し、かつ細菌細胞である場合に、第１の細胞（ドナー細胞）から第２の集団の細胞（レシピエント細胞）へのプラスミドの接合性移入の頻度を増進させるための使用
を提供する。

一例では、レシピエント細胞は、表面（例えば医用器材の上または装置の上）、気体（例えば空気）、または液体（例えば水もしくは水性液体、または液体油もしくはガソリン等の石油化学液体）に含まれてもよい。

一例では、頻度は、本発明のプラスミドと同一であるがｈｙｐＣ２にコードされるタンパク質を発現することができるｈｙｐＣ２遺伝子をさらに含む対照プラスミドの頻度の少なくとも１０、１００、または１０００倍に増進される。例えば、遺伝子は配列番号１（またはそのホモログ）を含み、タンパク質は配列番号２（またはそのホモログ）を含む。

任意で、第２の細胞はヒトまたは動物の対象に含まれる。あるいは、第２の細胞はｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏである。一例では、第２の細胞は環境の中にあり（即ち、ヒトまたは動物の中ではなく）、例えば第２の細胞は水、土壌、植物、野原、水路、油田、油、石油製品、食料またはその成分、飲料またはその成分、空気、気体、または空気もしくは液体の加熱もしくは冷却の装置に含まれる。

本発明はさらに、
ドナー細胞からレシピエント細胞に目的の核酸配列（ＮＳＩ）を移入する方法であって、前記ＮＳＩがプラスミドに含まれ、前記プラスミドが前記ドナー細胞に含まれ、前記方法が前記ドナー細胞から前記レシピエント細胞へのプラスミドの接合性移入を可能にするように前記細胞を組み合わせることを含み、前記プラスミドが本発明による、方法
を提供する。

一実施形態では、本方法は複数のドナー細胞およびレシピエント細胞によって実行され、複数のドナー細胞は複数のレシピエント細胞と組み合わされ、プラスミドがレシピエント細胞に移入される。

ＮＳＩの例としては、（例えば上で論じた）抗菌剤もしくはその構成要素、抗体ドメイン（例えばＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、またはＣドメイン）、治療用タンパク質、肥料、除草剤、殺虫剤、代謝酵素、ペプチドホルモン、またはシグナル伝達（例えばクオラムセンシング〔quorum sensing〕）ペプチドをコードする配列がある。任意で、本方法または使用においてＮＳＩは抗菌剤であるか、抗菌剤をコードし、任意で、薬剤はレシピエント細胞に対して毒性である。好ましくは、薬剤はドナー細胞に対しては毒性でないか、またはレシピエント細胞に対するよりドナー細胞に対して毒性が低い。

任意で、本方法または使用においてドナー細胞および／またはレシピエント細胞はＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞からなる群から選択される。例えば、ドナー細胞はＥ ｃｏｌｉ細胞、例えばＮｉｓｓｌｅ（例えばＮｉｓｓｌｅ １９１７）、Ｓ１７、ＤＳＭ １７２５２、Ａ０ ３４／８６、Ｍｕｔａｆｌｏｒ（商標）、Ｓｙｍｂｉｏｆｌｏｒ（商標）、およびＣｏｌｉｎｆａｎｔ（商標）から選択される株である。任意で、本方法または使用において、レシピエント細胞はＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞である。

本発明はさらに、
ヒトまたは動物（例えばブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、またはサケ）の対象における感染を処置する方法であって、前記感染が複数の細菌細胞（レシピエント細胞）の感染であり、前記方法が、
（ｉ）複数のドナー細菌細胞を前記対象に投与することであって、それによりレシピエント細胞がドナー細胞と組み合わされ、それぞれのドナー細胞が本発明によるプラスミドを含む、投与すること、および
（ｉｉ）前記ドナー細胞から前記レシピエント細胞へのプラスミドの接合性移入を可能にすることであって、それぞれの移入されたプラスミドが前記レシピエント細胞に対して毒性である抗菌剤またはその構成要素を含むかまたはコードするそれぞれの目的の核酸配列（ＮＳＩ）を含み、それによりレシピエント細胞が死滅するかまたはレシピエント細胞の成長もしくは増殖が阻害される、可能にすること
を含む、方法を提供する。

一実施形態では、プラスミドは同一である。別の実施形態では、例えばそのＮＳＩにおいて異なる、異なるプラスミドが使用される。

一例では、投与は経口投与である。一例では、投与は静脈内投与である。一例では、投与はカテーテルを経由する投与である。

一例では、レシピエント細胞は病原性のＥ ｃｏｌｉ細胞、例えばＥ ｃｏｌｉ ＥＴＥＣ、ＥＰＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＨＥＣ、ＥＡＥＣ、またはＡＩＥＣの細胞である。

本発明は、
本発明による方法における使用のための、本発明のプラスミドまたは細胞を提供する。

任意で、本方法または使用において、ドナー細胞はＥ ｃｏｌｉ細胞（例えばＮｉｓｓｌｅ株）であり、レシピエント細胞（例えばヒトまたは動物に対して病原性である細胞）はＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばＫ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞である。

一例では、標的細胞、第２の細胞、またはレシピエント細胞は、ヒトまたは動物に対して病原性である細菌の種または株の細胞である。

一部の実施形態では、本発明は所望のタンパク質またはＲＮＡをコードする（例えば抗微生物剤をコードする）キャリア細菌および使用の方法に関する。実施形態では、薬剤は（それに対して薬剤が毒性でない）キャリア細胞と標的細胞との間の接合によって標的細胞に移入することができ、それにより薬剤は標的細胞に対して毒性であり、標的細胞を死滅させる。他の実施形態では、標的細胞の成長または増殖は（例えば薬剤の非存在下の成長と比較して少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、または９０％）低減する。それぞれのキャリア細胞は、標的細菌細胞に対しては毒性であるがキャリア細胞に対しては毒性でない（または毒性が低い）抗菌剤をコードするエピソーマル（即ちプラスミド）ＤＮＡを含む。本発明は、例えばヒト、動物、または植物に対して病原性である標的細菌の制御または死滅に用途が見出される。本発明は、例えば動物（例えば家畜）に含まれる動物原性感染症の標的細菌の制御または死滅に用途が見出される。例えば、キャリア細胞は、ヒトまたは動物における疾患または状態を処置しまたは防止するための医薬、動物の成長を促進するために動物に投与する成長促進剤、動物における動物原性感染症細菌の死滅、殺虫剤としての家畜への投与のため、植物に適用する殺虫剤、または植物用肥料に含まれてよい。

本発明の利点は、キャリア細胞が、抗菌剤をコードするプラスミドＤＮＡがその中で複製され得るプロデューサー細胞として使用できることである。さらにまたはその代わりに、細胞が適合するｏｒｉＴを含む（任意の）プラスミドを動員する（ｈｙｐ２Ｃを欠く）接合系をその染色体上に有するように、プラスミドと接合系を分離してもよい。

ある特定の実施形態では、本発明は、選択性を達成するために標的細胞の配列特異的死滅を使用している。この目的のため、一例では、プラスミドは標的細胞の染色体の標的配列を認識して切断するように標的細胞中で作動可能なガイドされたヌクレアーゼをコードし、それにより細胞が死滅するか、または細胞の成長もしくは増殖が低減される。これは、その作用において差別性が低く、いくつかの種または株を死滅させることができる（例えばキャリア細胞に対してもある程度毒性である可能性がある）他の型の毒性薬剤の使用に比べて有利である。ガイドされたヌクレアーゼ（例えばＴＡＬＥＮまたはＣａｓヌクレアーゼ）を使用することによって、標的細胞のゲノムの中に存在する（例えば標的細胞の染色体またはエピソームに含まれる）が、キャリア細胞のゲノムの中には存在しない標的配列を認識するように、これらをプログラミングすることができる。

即ち、この場合には、コードされた薬剤および薬剤をコードする配列の複製によって細胞を死滅させ、またはその成長もしくは増殖を低減させるリスクなしに、キャリア細胞の中でプラスミドＤＮＡの複製が自由に生じることができる。即ち、プラスミドＤＮＡがガイドされたヌクレアーゼをコードする例では、ガイドされたヌクレアーゼは標的細胞のゲノム（例えば染色体）に含まれる標的核酸配列を認識して切断することができ、ここで標的細胞はキャリア細胞中に存在しない。

特に有用な例は、プラスミドＤＮＡが標的細胞中のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとともに作動可能なＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９またはＣａｓ３）をコードする場合であり、ここでＲＮＡはＣａｓを標的配列にガイドするように作動可能であり、Ｃａｓは標的配列を改変（例えば切断）し、標的細胞が死滅するか、または標的細胞の成長もしくは増殖が阻害される。一実施形態では、プラスミドＤＮＡはＣａｓおよびガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする。別の実施形態では、プラスミドＤＮＡはガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするが、関連するＣａｓをコードしない。この実施形態では、ＲＮＡは標的細胞のゲノムにコードされる内因性Ｃａｓとともに標的細胞中で作動可能であり、ここでＲＮＡはＣａｓを標的配列にガイドするように作動可能であり、Ｃａｓは標的配列を改変（例えば切断）し、標的細胞が死滅するか、または標的細胞の成長もしくは増殖が阻害される。この意味で、薬剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素（例えばＣａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｃａｓ、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。即ち、本発明は、標的細胞中では標的認識によって作用するがキャリア細胞中では作用しない抗菌剤を使用することの利点を有用であると認識するものであり、これはプラスミドＤＮＡがキャリア細胞に対する顕著な毒性なしにキャリア細胞中で自由に複製する能力を開くものである。

一例では、抗菌剤は、標的細胞のゲノムに含まれる標的核酸配列を認識して切断することができるガイドされたヌクレアーゼを含み、ここで標的配列はキャリア細胞に含まれない。したがってこの意味で、抗菌剤は標的細菌細胞に対して毒性であるがキャリア細胞に対しては毒性でない。例えば、薬剤は、標的細胞のゲノムに含まれる（例えば標的細胞の染色体に含まれる）標的核酸配列を改変するように標的細胞中で作動可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素である。

任意で、ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮである。任意で、ヌクレアーゼはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓヌクレアーゼである。一態様では、抗菌剤の構成要素は、標的細胞の標的配列にハイブリダイズすることができるガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡである。システムはＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型のＣＲＩＳＰＲシステムであってよい。

プロトスペーサー配列はキャリア細胞の染色体またはエピソーム（例えばプラスミド）に含まれ得る。

有利には、ドナー細胞またはプラスミドは、ヒトまたは動物の対象（例えばニワトリ、ウシ、ブタ、魚類、または甲殻類）における標的細胞の感染を処置または防止するためのものである。有利には、キャリア細胞は前記対象に対してプロビオティックな、またはヒトもしくは動物（例えばニワトリ）に対してプロビオティックな種の細胞である。例えば、キャリア細胞はプロビオティックなＥ ｃｏｌｉ細胞である。一例では、標的細胞は前記対象に対して病原性であるか、またはヒトもしくは動物（例えばニワトリ）に対して病原性である種の細胞である。有利には、プラスミドＤＮＡは標的細胞内でそれぞれの標的核酸配列にハイブリダイズすることができる１つもしくは複数のガイドＲＮＡまたは１つもしくは複数のｃｒＲＮＡをコードし、ここで標的配列は標的細胞の内因性染色体および／または内因性エピソームに含まれている。例えば、プラスミドＤＮＡはそれぞれの標的配列にハイブリダイズする２、３、４、５、６、７、７、９、もしくは１０個（または１０個を超える）異なるｇＲＮＡまたは異なるｃｒＲＮＡをコードし、ここで標的配列は相互に異なっている。例えば、３つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、２つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、３つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、４つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、３つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、５つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、６つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、７つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、８つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、９つの異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、１０個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、１１個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、１２個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。例えば、１３個の異なるｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡがプラスミドＤＮＡによってコードされる。一例では、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞である（例えば対象はニワトリである）。一例では、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、またはＣ ｄｉｆｉｃｉｌｅの細胞である。一例では、標的細胞はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの細胞である（例えば対象はニワトリである）。一例では、標的細胞はＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａの細胞である（例えば対象は魚類または甲殻類、例えばナマズまたはエビもしくはクルマエビである）。一例では、標的細胞はＥ ｃｏｌｉの細胞である。

本明細書における代替では、キャリア細胞および標的細胞は古細菌細胞である。

好ましい例では、ＮＳＩは、標的細菌細胞に対しては毒性であるがキャリア細胞に対しては毒性でない抗菌剤をコードする。一例では、ＮＳＩは抗生剤、抗体、抗体鎖、または抗体可変ドメインをコードする。一例では、ＮＳＩは関連するＣａｓ（例えば標的細胞の染色体またはエピソームに含まれるプロトスペーサー配列を標的として切断するＣａｓヌクレアーゼ）とともに標的細胞内で作動可能であるガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする。一例では、ＲＮＡは標的細胞の内因性標的核酸配列にハイブリダイズしてその転写および／または翻訳を沈黙させることができるｓｉＲＮＡである。

一例では、プラスミドは発現可能なｔｒａ１および／もしくはｔｒａ２モジュール、またはそれらのホモログを含む。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ（例えばＮｉｓｓｌｅ、またはＳ１７ Ｅ ｃｏｌｉ株）またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの細胞もしくはＢａｃｉｌｌｕｓの細胞もしくはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの細胞である。任意で、キャリア細胞はヒト、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウシ、魚類（例えばナマズまたはサケ）、または甲殻類（例えばエビまたはロブスター）、片利共生的細菌株（例えば片利共生的Ｅ ｃｏｌｉ株）の細胞である。

任意で、キャリア細胞またはプラスミドは医療用途のためのヒトまたは動物の対象の微生物群への投与のためのものである。例えば、医療用途は本明細書で開示した疾患の処置または防止のためである。例えば、医療用途は本明細書で開示した状態の処置または防止のためである。例えば、医療用途は前記標的細胞によって媒介される疾患または状態の処置または防止のためである。例えば、キャリア細胞またはプラスミドは、動物の成長または体重を増進するために動物に投与するためのものである。

一例では、本発明の方法における投与は、ヒトの成長または体重の増進のためのヒトへの投与である。任意で、増進は医学的治療ではない。任意で、増進は医学的治療である。任意で、本方法は対象の微生物群（例えば腸の微生物群）への複数のキャリア細胞の投与を含み、微生物群は標的細胞を含み、プラスミドＤＮＡはその中で発現させるために標的細胞の中に移入されて抗菌剤を産生し、それにより対象中の標的細胞を死滅させるか、または標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる。

任意で、例えば植物を成長させるためまたは除草処置として、植物に含まれる標的細胞（レシピエント細胞）に対して本使用または方法を実行してもよい。植物は本明細書で開示した任意の植物であってよい。例えば、本発明の任意の構成または実施形態における本明細書の植物は、トマト植物、ジャガイモ植物、コムギ植物、トウモロコシ植物、メイズ植物、リンゴ樹、マメ産生植物、エンドウマメ植物、ビート根植物、核果植物、オオムギ植物、ホップ植物、および草から選択される。例えば、植物は樹木、例えばヤシ、トチノキ、マツ、オーク、またはハードウッド樹である。例えば、植物はイチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、レッドカラント、キーウィ果実、バナナ、リンゴ、アプリコット、アボカド、チェリー、オレンジ、クレメンタイン、ミカン、グレープフルーツ、プラス、デーツ、イチジク、ライム、レモン、メロン、マンゴー、ナシ、オリーブ、またはブドウから選択される果実を産生する植物である。任意で、植物は双子葉植物である。任意で、植物は顕花植物である。任意で、植物は単子葉植物である。

本明細書の（例えば植物に適用される）いずれの構成、実施形態、または実施例においても、標的細菌は（例えば植物に含まれる）Ｐ ｓｙｒｉｎｇａｅ細菌である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅは単子葉植物と双子葉植物の両方で世界的に病気を惹起する一般的な植物関連細菌である。一例では、標的細菌はＰ．ｓ．ｐｖ．ａｃｅｒｉｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｐｔａｔａ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｄｙｓｏｘｙｌｉｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｌａｐｓａ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｎｉｃｉ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｐｕｌａｎｓ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐｉｓｉ、Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅ、およびＰ．ｓ．ｐｖ．ｍｏｒｓｐｒｕｎｏｒｕｍから選択される病原型のＰ ｓｙｒｉｎｇａｅ細菌である。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｃｅｒｉｓはカエデＡｃｅｒ種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｃｔｉｎｉｄｉａｅはキーウィ果実Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｄｅｌｉｃｉｏｓａを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｅｓｃｕｌｉはトチノキＡｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍを攻撃し、潰瘍病を惹起する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｐｔａｔａはビートＢｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ａｔｒｏｆａｃｉｅｎｓはコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｄｙｓｏｘｙｌｉｓコエコエ樹Ｄｙｓｏｘｙｌｕｍ ｓｐｅｃｔａｂｉｌｅを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｊａｐｏｎｉｃａはオオムギＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｌａｐｓａはコムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｎｉｃｉはキビ草種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐａｐｕｌａｎｓはクラブアップルＭａｌｕｓ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａはマメのカサ枯れ病を惹起する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｐｉｓｉはエンドウマメＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍを攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｓｙｒｉｎｇａｅはＳｙｒｉｎｇａ、Ｐｒｕｎｕｓ、およびＰｈａｓｅｏｌｕｓ種を攻撃する。
・Ｐ．ｓ．ｐｖ．ｇｌｙｃｉｎｅａはダイズを攻撃し、ダイズの斑点細菌病を惹起する。

一例では、標的細菌は、直前のパラグラフにおいて箇条書きで引用した血液型亜型から選択されるＰ ｓｙｒｉｎｇａｅであり、細菌はその箇条書きでも述べた植物に含まれる。

本方法または使用を植物に適用する場合には、キャリア細胞を、レシピエント細胞を含む微生物群と組み合わせてもよい。微生物群は植物の葉、幹、根、または茎に含まれる。一例では、標的細菌（または標的細胞）は植物の微生物群に含まれる。一例では、微生物群は葉に含まれる。一例では、微生物群は木質部に含まれる。一例では、微生物群は師部に含まれる。一例では、微生物群は根に含まれる。一例では、微生物群は塊茎に含まれる。一例では、微生物群は球根に含まれる。一例では、微生物群は種子に含まれる。一例では、微生物群は外果皮〔exocarp〕、外果皮〔epicarp〕、中果皮、または内果皮に含まれる。一例では、微生物群は果実、例えば単果、複合果、または多花果に含まれる。一例では、微生物群は種子または胚、例えば種皮、子葉、双葉、または幼根に含まれる。一例では、微生物群は花に含まれ、例えば花柄、萼片、花弁、雄しべ、花糸、葯、または雌しべに含まれる。一例では、微生物群は根、例えば主根系または髭根系に含まれる。一例では、微生物群は葉に含まれ、例えば葉身、葉柄、または托葉に含まれる。一例では、微生物群は茎に含まれ、例えば樹皮、表皮、師部、形成層、木質部、または髄に含まれる。

本発明は、
対象に含まれまたは表面上に含まれるバイオフィルムを低減させる方法であって、前記バイオフィルムが標的細胞（例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞）を含み、前記方法がバイオフィルムへの本発明による複数のキャリア細胞の投与を含み、プラスミドＤＮＡが標的細胞中における発現のためにキャリア細胞から標的細胞に移入されて抗菌剤を産生し、それによりバイオフィルム中の標的細胞を死滅させまたは標的細胞の成長もしくは増殖を低減させる、方法を提供する。

一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの被覆面積を低減させることを含む。一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの増殖を低減させることを含む。一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの永続性を低減させることを含む。一例では、「バイオフィルムを低減させること」は、バイオフィルムの拡散を低減させること（例えば対象の中または上における、対象を含む環境への拡散）を含む。

一例では、対象はヒトまたは動物である。例えば、バイオフィルムは対象の肺に含まれ、例えば標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ(例えばＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ)細胞である。これは、対象が肺炎または嚢胞性線維症等の肺の疾患または状態に罹患している場合に有用であり得る。例えば、バイオフィルムは、動物またはヒトの臓器に含まれる。例えば、バイオフィルムはヒトまたは動物の微生物群に含まれる。

一例では、標的細菌（または標的細胞）は植物のバイオフィルムに含まれる。一例では、バイオフィルムは葉に含まれる。一例では、バイオフィルムは木質部に含まれる。一例では、バイオフィルムは師部に含まれる。一例では、バイオフィルムは根に含まれる。一例では、バイオフィルムは塊茎に含まれる。一例では、バイオフィルムは球根に含まれる。一例では、バイオフィルムは種子に含まれる。一例では、バイオフィルムは外果皮〔exocarp〕、外果皮〔epicarp〕、中果皮、または内果皮に含まれる。一例では、バイオフィルムは果実、例えば単果、複合果、または多花果に含まれる。一例では、バイオフィルムは種子または胚、例えば種皮、子葉、双葉、または幼根に含まれる。一例では、バイオフィルムは花に含まれ、例えば花柄、萼片、花弁、雄しべ、花糸、葯、または雌しべに含まれる。一例では、バイオフィルムは根、例えば主根系または髭根系に含まれる。一例では、バイオフィルムは葉に含まれ、例えば葉身、葉柄、または托葉に含まれる。一例では、バイオフィルムは茎に含まれ、例えば樹皮、表皮、師部、形成層、木質部、または髄に含まれる。

任意で、表面はｅｘ ｖｉｖｏの表面、例えば家庭用または工業用の装置または容器に含まれる表面である。

任意で、標的細胞はバイオフィルム、例えば本明細書で開示したバイオフィルムに含まれる。

任意で、標的細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ細菌である。例えば、標的細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ細菌である。例えば、標的細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ． ｅｎｔｅｒｉｃａ、ｓｅｒｏｖａｒｓ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈａｄａｒ、およびＢｉｎｚａからなる群から選択される。例えば、標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ ｓｙｒｉｎｇａｅまたはＰ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）細菌である。

一実施形態では、標的細菌はＥ．ｃｏｌｉ細菌である。任意で、標的細菌は腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５７：Ｈ７、またはシガトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）である。一例では、標的細菌は
・シガトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ）（ＳＴＥＣはベロサイトトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＶＴＥＣ）とも称される）、
・腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）(この病原型は食中毒に関連するニュースで最も一般的に聞かれる病原型である)、
・エンテロトキシン産生Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、
・腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、
・腸管凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡＥＣ）、
・腸管侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、および
・散在付着性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）
から選択される。

腸管出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）血清型Ｏ１５７：Ｈ７は、世界的な出血性下痢および溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）の突発に関与するヒト病原体である。従来の抗微生物剤はＥＨＥＣにおいてＳＯＳ応答を誘発し、これがＥＨＥＣ感染に伴う罹患率および死亡率の多くに関与する強力なシガトキシンの放出を促進する。ウシはＥＨＥＣの天然の保有宿主であり、ＥＨＥＣの突発のほぼ７５％は汚染されたウシ由来製品の消費に関連している。ＥＨＥＣはヒトで疾患を惹起するが、成長した反芻動物では無症状である。Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）感染の特徴には、腹部の痙攣および出血性下痢、ならびに致命的な合併症である溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）が含まれる。現在、ＥＨＥＣ感染の処置に対するニーズがある（Ｇｏｌｄｗａｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｔｔｅｌｈｅｉｍ，２０１２）。従来の抗生剤の使用は、シガトキシン媒介細胞傷害性を悪化させる。Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎによって行われた疫学研究では、ＥＨＥＣ腸炎のための抗生剤で処置された患者は、ＨＵＳを発症するリスクが高い（Ｓｌｕｔｓｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。さらなる研究は、ＥＨＥＣ感染において抗生剤が禁忌であることを支持しており、ＥＨＥＣに伴う出血性腸炎のために抗生剤治療を受けた小児は、ＨＵＳを発症する危険が増加した（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｚｉｍｍｅｒｈａｃｋｌ，２０００、Ｓａｆｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｔａｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。従来の抗生剤は、染色体内で一体化されたラムダ形プロファージゲノムの中でコードされるｓｔｘ遺伝子の複製および発現を増進することによって、シガトキシンの産生を促進する。本発明のいくつかの構成のアプローチは、ヌクレアーゼ切断に依拠している。ｓｔｘの誘導は、ＥＨＥＣ細胞のエンベロープのファージ媒介溶解をも促進し、環境へのシガトキシンの放出および散布を可能にする（Ｋａｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｍａｔｓｕｓｈｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。即ち、有利には、本発明のこれらの構成は、ヒトおよび動物の対象においてＥＨＥＣを処置するための代替の手段を提供する。以下、ヌクレアーゼの作用によって産生される抗ＥＨＥＣ作用の（従来の抗生剤の作用とは反対の）速度および持続についての驚くべき結果とともにこれを例示する。

一例では、対象（例えばヒトまたは動物）は、溶血性尿毒症候群（ＨＵＳ）に罹患しているか、そのリスクにあり、例えば対象はＥ ｃｏｌｉ感染、例えばＥＨＥＣ Ｅ ｃｏｌｉ感染に罹患している。

本発明は、
本発明による複数のキャリア細胞を含む医薬組成物、家畜成長促進用組成物、土壌改良剤、除草剤、植物用肥料、食品または食品成分滅菌用組成物、歯科用組成物、個人衛生用組成物、または消毒用組成物（例えば家庭用または工業用）を提供する。

本明細書において、キャリア細胞は、例えばヒトまたは動物の対象に投与するためのプロビオティックな細胞である。例えば、キャリア細胞はヒトまたは動物の対象のマイクロバイオーム（例えば腸または血液のマイクロバイオーム）において片利共生的であり、キャリアは対象への投与のためである。一例では、キャリア細胞は細菌細胞である（また任意で標的細胞は細菌細胞である）。一例では、キャリア細胞は古細菌細胞である（また任意で標的細胞は古細菌細胞である）。

任意で、キャリア細胞はグラム陽性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はグラム陽性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はグラム陰性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はグラム陰性細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はグラム陽性細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はグラム陰性細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はＥ ｃｏｌｉ細菌細胞であり、標的細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細菌細胞である。

任意で、キャリア細胞はヒトまたは動物の対象への投与のためのプロビオティックなまたは片利共生的なＥ ｃｏｌｉ細菌細胞である。

本明細書において任意で、プラスミドは閉環状ＤＮＡを含む。一実施形態では、一例においてプラスミドＤＮＡはｄｓＤＮＡである。一実施形態では、一例においてプラスミドＤＮＡはｓｓＤＮＡである。

任意で、標的細胞はＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞（例えばここでキャリア細胞はＥ ｃｏｌｉの細胞である）、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｖｉｒｃｈｏｗ、Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ、Ｈａｄａｒ、またはＢｉｎｚａである。

例えば、標的細菌はＳ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｋ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ ｊｕｊｅｎｉ、Ｈ ｐｙｌｏｒｉ、Ａ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、またはＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される。

一例では、標的細胞はヒトに院内感染を惹起する種の細胞である。

任意で、標的細胞は動物（例えば家禽動物（例えばニワトリ）、ブタ、ウシ、魚類（例えばナマズまたはサケ）、または甲殻類（例えばエビまたはロブスター））のマイクロバイオームに含まれる。任意で、マイクロバイオームは腸マイクロバイオームである。例えば、標的細胞はニワトリの腸のバイオフィルムに含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞である。例えば、標的細胞はｅｘ ｖｉｖｏでニワトリの腸のバイオフィルム試料に含まれるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの細胞である。

任意で、複数のキャリア細胞はキャリア細胞の第１の副集団（第１の細胞）およびキャリア細胞の第２の副集団（第２の細胞）を含み、第１の細胞は同一のプラスミドＤＮＡを含み、第２の細胞は（第１の細胞のプラスミドＤＮＡとは異なる）同一のプラスミドＤＮＡを含む。例えば、前者のＤＮＡは他のＤＮＡに含まれるＮＳＩとは異なるＮＳＩを含む。例えば、プラスミドＤＮＡは第１のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、第２のＤＮＡは第２のガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、第１のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡは第１の標的細胞中の第１のプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができ、第２のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡは第２の標的細胞中の第２のプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができ、プロトスペーサーは異なる。任意で、第１の標的細胞は第２の標的細胞とは異なる。任意で、第１の標的細胞は第２の標的細胞と同じ種または株である。あるいは、第１の標的細胞は第２の標的細胞の種または株とは異なる種または株である（このようにして、例えば異なる種または株の複数の標的細胞を標的化して死滅させるために、ヒトまたは動物または植物に投与するためのキャリア細胞のカクテルが提供される）。

一例では、その、またはそれぞれのプラスミドＤＮＡは複数の（例えば第１および第２の）ＮＳＩを含み、第１のＮＳＩは第２のＮＳＩとは異なる（例えば、これらは異なるタンパク質またはＲＮＡ、例えば異なるガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードする）。一例では、その、またはそれぞれのプラスミドＤＮＡは、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なる種類のＮＳＩを含む。一例では、その、またはそれぞれのプラスミドＤＮＡは２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるガイドＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。一例では、その、またはそれぞれのプラスミドＤＮＡは２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるｃｒＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。一例では、その、またはそれぞれのプラスミドＤＮＡは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるガイドＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。一例では、その、またはそれぞれのプラスミドＤＮＡは少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０の異なるｃｒＲＮＡをコードするＮＳＩを含む。

任意で、組成物は液体（例えば水性液体または水）に含まれ、組成物は１×１０^３～１×１０^１０（例えば、１×１０^４～１×１０^１０、１×１０^４～１×１０^９ 、１×１０^４～１×１０^８、１×１０^４～１×１０^７、１×１０^３～１×１０^１０、１×１０^３～１×１０^９、１×１０^３～１×１０^８、１×１０^３～１×１０^７、１×１０^５～１×１０^１０ 、１×１０^５～１×１０^９、１×１０^５～１×１０^８、１×１０^５～１×１０^７、１×１０^６～１×１０^１０ 、１×１０^６～１×１０^９、１×１０^６～１×１０^８、または１×１０^６～１×１０^７）ｃｆｕ／ｍｌの量でキャリア細胞を含む。例えば、液体は例えばヒトまたは動物の消費のための飲料である。例えば、飲料は家畜用飲料、例えば家禽用飲料（即ちニワトリ等の家禽による消費のための飲料）である。

一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための食品（例えば補助食品）組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための痩身用組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための成長促進組成物である。一例では、組成物はヒトによる消費のためのボディビル組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のためのプロビオティック組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための殺生物性組成物である。一例では、組成物はヒトまたは動物による消費のための殺虫性組成物である。一例では、組成物は動物による消費のための動物原性感染症制御用組成物である。

一例では、組成物はキャリア細胞に加えてビタミン類を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えてビタミンＡ、Ｂ（例えばＢ１２）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および／またはＫを含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えて脂質を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えて炭水化物を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えてタンパク質および／またはアミノ酸を含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えてミネラルを含む。一例では、組成物はキャリア細胞に加えて金属イオン（例えばＭｇ^２＋、Ｃｕ^２＋、および／またはＺｎ^２＋）を含む。一例では、組成物はナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、銅イオン、亜鉛イオン、および／またはモリブデンイオンを含む。

一例では、組成物は植物用肥料組成物である。一例では、組成物は除草剤である。一例では、組成物は植物に適用するための殺虫剤組成物である。

いずれの実施形態または実施例でも、適用可能な場合には、植物は例えば作物である。植物は、例えばコムギである。植物は、例えばトウモロコシである。植物は、例えばメイズである。植物は、例えば果樹である。植物は、例えば野菜である。植物は、例えばトマト植物である。植物は、例えばジャガイモ植物である。植物は、例えば草植物である。植物は、例えば顕花植物である。植物は、例えば樹木である。植物は、例えば灌木である。

一例では、組成物は環境用途向けであり、環境は屋外環境（例えば野外または水路または貯水池への用途）である。

一例では、組成物は食品または食品成分（例えばヒトまたは動物の消費のための）に含まれる。一例では、組成物は飲料または飲料成分（例えばヒトまたは動物の消費のための）に含まれる。

一例では、標的細胞はヒトバイオフィルム細胞であり、例えばバイオフィルムは腸、皮膚、肺、眼、鼻、耳、胃腸管（ＧＩ管）、胃、毛髪、腎、尿道、気管支、口腔、口、肝、心臓、肛門、直腸、膀胱、大腸、小腸、陰茎、膣、または陰嚢のバイオフィルムである。一例では、標的細胞は動物のバイオフィルム細胞であり、例えばバイオフィルムは腸、皮膚、肺、眼、鼻、耳、胃腸管（ＧＩ管）、盲腸、胃、毛髪、羽毛、鱗、腎、尿道、気管支、口腔、口、肝、心臓、肛門、直腸、膀胱、大腸、小腸、陰茎、膣、または陰嚢のバイオフィルムである。例えば、バイオフィルムは鳥（例えばニワトリ）盲腸のバイオフィルムである。

一例では、本明細書におけるいずれの方法もｅｘ ｖｉｖｏである。一例では、本明細書における方法はｉｎ ｖｉｖｏである。一例では、本明細書における方法はｉｎ ｖｉｔｒｏである。一例では、本明細書における方法は環境中、例えば家庭内（例えば屋内）、工業的（例えば工場内）、または農業的環境（例えば野外）で実行される。一例では、本明細書における方法は容器の中もしくはその上、または表面上で実行される。

一例では、ＮＳＩ（またはそのＲＮＡ産生物）は、標的細胞に含まれる標的細胞の染色体またはエピソームと組み換えて、染色体またはエピソームを改変することができる。任意で、これは、染色体またはエピソームが（例えばＣａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼ等のガイドされたヌクレアーゼを使用して所定の部位で）切断され、同時にもしくは逐次的にプラスミドＤＮＡがキャリア細胞との接合によって標的細胞中に導入され、ＮＳＩまたはその配列が切断された部位またはその近傍で染色体またはエピソームに挿入される方法によって、実行される。

一例では、プラスミドＤＮＡはプロトスペーサーを切断するように標的細胞中で作動可能なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成要素を含む（例えばプロトスペーサーは、ＮＳＩによってコードされるｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡと標的細胞中でハイブリダイズすることができる１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～１００、１２～１５、または１２～２０の連続したヌクレオチドを含む）。

例えば、システムはＩ、ＩＩ，ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである。

一例では、ＮＳＩはＣａｓ９（および任意で第２の異なるＣａｓ、例えばＣａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１０）をコードする。一例では、ＮＳＩはＣａｓ３（および任意で第２の異なるＣａｓ、例えばＣａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、またはＣａｓ１０）をコードする。一例では、ＮＳＩはＣａｓ３、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、およびＣａｓ１０から選択されるＣａｓをコードする。さらにまたはその代わりに、プラスミドＤＮＡ（例えばＮＳＩ）は、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡをコードする。例えば、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡは第１のＣａｓに関連している（即ち、標的細胞中でこれとともに作動可能である）。

一例では、本明細書におけるＣａｓはＣａｓ９である。一例では、本明細書におけるＣａｓはＣａｓ３である。Ｃａｓは、標的細菌によってコードされるＣａｓと同一であってよい。

一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそのコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞の死滅または標的細胞の成長もしくは増殖の下方制御を媒介する。一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞のゲノムによってコードされる１つまたは複数のＲＮＡもしくはタンパク質の発現のスイッチオフまたはその下方制御を媒介する。

一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞の成長もしくは増殖の上方制御を媒介する。一実施形態では、標的細菌中におけるＮＳＩまたはそれによってコードされるタンパク質もしくはＲＮＡの存在は、標的細胞のゲノムによってコードされる１つまたは複数のＲＮＡもしくはタンパク質の発現のスイッチオンまたはその上方制御を媒介する。

一実施形態では、ＮＳＩは標的細菌に対して毒性であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素をコードする。

一実施形態では、プラスミドはシャトルベクターである。

任意で、標的細胞は、プラスミドＤＮＡ、例えば標的細胞中で機能性であって標的細胞に対して毒性である外因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素を含むプラスミドＤＮＡがその中に移入される前には、機能性内因性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを欠いている。一実施形態は、複数の本発明のキャリア細胞を含む抗菌性組成物を提供し、それぞれの標的細胞は任意でこのパラグラフにより、医療用途のためにヒトまたは動物の対象に投与するためのものである。

一例では、本発明の組成物は除草剤、殺虫剤、殺昆虫剤、植物用肥料、または洗浄剤である。

任意で、本明細書における標的細菌は対象のマイクロバイオーム、例えば腸のマイクロバイオームに含まれる。あるいは、マイクロバイオームは皮膚、頭皮、毛髪、眼、耳、口腔、咽喉、肺、血液、直腸、肛門、膣、陰嚢、陰茎、鼻、または舌のマイクロバイオームである。

一例では、対象（例えばヒトまたは動物）は、キャリア細胞の投与と同時にまたは逐次的に、医薬がさらに投与される。一例では、医薬は抗生剤、抗体、免疫チェックポイント阻害剤（例えば抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、または抗ＣＴＬＡ４抗体）、養子細胞療法（例えばＣＡＲ－Ｔ療法）、またはワクチンである。

一実施形態では、ＮＳＩはガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼをコードする。即ち、毒性薬剤はガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼを含んでよい。任意で、ＮＳＩは標的細胞の染色体を切断することができる制限ヌクレアーゼをコードする。

任意で、組成物はヒトまたは動物の対象に実施される医療における使用のための医薬組成物である。

一例では、動物は家畜または伴侶ペット動物（例えばウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、またはウサギ）である。一例では、動物は昆虫（そのライフサイクルの任意のステージ、例えば卵、幼虫、またはさなぎにある昆虫）である。一例では、動物は原生動物である。一例では、動物は頭足動物である。

任意で、組成物は除草剤、殺虫剤、食品もしくは飲料の加工剤、食品もしくは飲料の添加剤、石油化学もしくは燃料の処理剤、水精製剤、化粧品添加剤、洗剤添加剤、または環境（例えば土壌）添加剤または洗浄剤である。

本発明はまた、
標的細菌細胞またはそれぞれが前記プラスミドＤＮＡを含む複数の標的細菌細胞を提供する。例えば、キャリア細菌はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｌ ｒｅｕｔｅｒｉまたはＬ ｌａｃｔｉｓ）、Ｅ ｃｏｌｉ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）細菌である。有用には、キャリアはプラスミドＤＮＡを周囲の環境から保護することができる。キャリアの使用は、キャリアが対象における酸性の胃またはその他の厳しい環境からプラスミドＤＮＡを保護することができる場合に、経口投与またはその他の経路に有用であり得る。さらに、キャリアは飲料、例えばプロビオティック飲料、例えば適合化させたＹａｋｕｌｔ（商標）、Ａｃｔｉｍｅｌ（商標）、Ｋｅｖｉｔａ（商標）、Ａｃｔｉｖｉａ（商標）、Ｊａｒｒｏｗ（商標）、またはヒトの消費用の同様の飲料に配合することができる。

任意で、キャリア細胞または組成物は、薬剤またはＮＳＩの発現産生物を使用して標的細菌を死滅させることを含む医療用途のためのヒトまたは動物への投与のためのものであり、標的細菌は対象における疾患または状態を媒介する。一例では、対象がヒトである場合には、対象は胚ではない。一例では、キャリア細胞は対象においてプロビオティックである。

本発明はまた、
環境中の標的細菌細胞を死滅させる方法を提供し、任意で、本方法はヒトまたは動物の身体では実施されず、本方法は本発明のキャリア細胞または組成物に環境を曝露してＮＳＩの産生物を標的細胞中で発現させることを含み、標的細菌は前記産生物の存在下で死滅する。例えば、産生物はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたはその構成要素、例えば本明細書で開示したシステムまたは構成要素をコードする。即ち、本システムは標的細胞の染色体プロトスペーサー配列を認識して切断することができ、それにより標的細胞が死滅する。任意で、死滅した標的細胞はさらなるステップで単離される。

本発明はまた、
標的細菌を含むヒトまたは動物の対象における疾患または状態の処置のための、標的細菌を死滅させる抗菌剤の製造における本発明の組成物または細胞の使用を提供する。

任意で、環境は土壌のマイクロバイオーム、即ち植物、植物の部分（例えば葉、果実、野菜、または花）もしくは植物製品（例えばパルプ）、水、水路、流体、食材もしくはその成分、飲料もしくはその成分、医療用デバイス、化粧品、洗剤、血液、体液、医療用装置、産業用装置、オイルリグ、石油化学加工、保存もしくは輸送の装置、ビヒクルまたは容器である。

任意で、環境はｅｘ ｖｉｖｏ体液（例えば尿、血液、血液製剤、汗、涙、痰、または唾）、体固形物（例えば糞便）、または組成物を投与されたヒトもしくは動物の対象の組織である。

任意で、環境はｉｎ ｖｉｖｏ体液（例えば尿、血液、血液製剤、汗、涙、痰、または唾）、体固形物（例えば糞便）、または組成物を投与されたヒトもしくは動物の対象の組織である。

任意で、毒性薬剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１つまたは複数の構成要素、例えばＩ型Ｃａｓｃａｄｅの１つまたは複数の構成要素（例えばＣａｓＡ）をコードするＤＮＡ配列を含む。

任意で、毒性薬剤はガイドされたヌクレアーゼ、例えばＣａｓヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列を含む。

一例では、キャリア細胞または組成物は、医療用容器、例えばシリンジ、バイアル、ＩＶバッグ、吸入器、点眼器、またはネブライザーに含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、無菌の容器に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、医療用に適合した容器に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、発酵容器、例えば金属、ガラス、またはプラスチックの容器に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、農業用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、食品の製造用または加工用の装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、園芸用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、飼育用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、石油化学の回収用または加工用の装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、蒸留用装置に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、（例えば少なくとも５０、１００、１０００、１００００、または１０００００リットルの容量を有する）細胞培養用容器に含まれる。さらにまたはその代わりに、標的細胞はこれらの装置等のいずれかに含まれる。

一例では、キャリア細胞または組成物は、例えばヒトまたは動物の対象への経口、ＩＶ、皮下、鼻内、眼内、経膣、局所、経直腸、または吸入による投与によって薬剤を投与するための指示書を含む説明書またはパッケージラベルと組み合わせて、医薬に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、経口医薬製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、鼻内または眼内医薬製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、個人用衛生組成物（例えばシャンプー、石鹸、または脱臭剤）または化粧用製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、洗浄製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、例えば医療用または産業用のデバイスまたは装置を洗浄するための清浄製剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、食材、食材成分、または食材加工剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、飲料、飲料成分、または飲料加工剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、医療用バンデージ、繊維製品、プラスター、またはスワブに含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、除草剤または殺虫剤に含まれる。一例では、キャリア細胞または組成物は、殺昆虫剤に含まれる。

一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＩＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの構成要素である。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列を含む（例えばＳ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、またはＳ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９）。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓ３をコードするヌクレオチド配列を含む（例えばＥ ｃｏｌｉ Ｃａｓ３、Ｃ ｄｉｆｉｃｉｌｅ Ｃａｓ３、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃａｓ３）。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣｐｆをコードするヌクレオチド配列を含む。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓＸをコードするヌクレオチド配列を含む。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素はＣａｓＹをコードするヌクレオチド配列を含む。

一例では、それぞれのキャリア細胞は、標的細菌中で作動可能なプロモーターを含むヌクレオチド配列（ＮＳＩ）からの目的のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素またはタンパク質をコードする。

任意で、標的の細菌はグラム陰性細菌（例えばらせん菌またはビブリオ菌）である。任意で、標的細菌はグラム陽性細菌である。任意で、標的細菌はマイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータ、またはマイコバクテリウム細菌である。任意で、標的細菌はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えばｐｙｏｇｅｎｅｓまたはｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である。任意で、標的細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えばａｕｒｅｕｓ、例えばＭＲＳＡ）である。任意で、標的細菌はＥ．ｃｏｌｉ（例えばＯ１５７：Ｈ７）であり、例えばＣａｓはベクターによってコードされるか、または内因性標的細胞Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ３）活性は脱抑制されている。任意で、標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばｓｙｒｉｎｇａｅまたはａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。任意で、標的細菌はＶｉｂｒｏ（例えばｃｈｏｌｅｒａｅ（例えば０１３９）またはｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）である。任意で、標的細菌はＮｅｉｓｓｅｒｉａ（例えばｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。任意で、標的細菌はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ（例えばｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）である。任意で、標的細菌はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えばｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）である。任意で、標的細菌はＳｈｉｇｅｌｌａ（例えばｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）である。任意で、標的細菌はＢｒｕｃｅｌｌａ（例えばａｂｏｒｔｕｓ）である。任意で、標的細菌はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ宿主である。任意で、標的細菌はＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓである。任意で、標的細菌はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。任意で、標的細菌はＥｒｗｉｎｉａである。任意で、標的細菌はＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ（例えばｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）である。任意で、標的細菌はＬｉｓｔｅｒｉａ（例えばｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）である。任意で、標的細菌はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えばｊｅｊｕｎｉ）である。任意で、標的細菌はＹｅｒｓｉｎｉａ（例えばｐｅｓｔｉｓ）である。任意で、標的細菌はＢｏｒｅｌｉａ（例えばｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）である。任意で、標的細菌はＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（例えばｐｙｌｏｒｉ）である。任意で、標的細菌はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えばｄｉｆｉｃｉｌｅまたはｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）である。任意で、標的細菌はＥｒｌｉｃｈｉａ（例えばｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）である。任意で、標的細菌はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばｔｙｐｈｉまたはｅｎｔｅｒｉｃａ、例えば血清型ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、例えばＤＴ１０４）である。任意で、標的細菌はＣｈｌａｍｙｄｉａ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。任意で、標的細菌はＰａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａ宿主である。任意で、標的細菌はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）である。任意で、標的細菌はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である。任意で、標的細菌はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えばｆａｅｃａｌｉｓまたはｆａｅｃｉｍ、例えばリネゾリド耐性）である。任意で、標的細菌はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（例えばｂａｕｍａｎｎｉｉ、例えば多剤耐性）である。

標的細胞のさらなる例としては、以下の選択肢の一つが挙げられる。

任意で、標的細菌は、例えばメチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルフォプリスチン、およびテイコプラニンから選択される抗生剤に耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばセファロスポリン類（例えばセフタジジム）、カルバペネム類（例えばイミペネムまたはメロペネム）、フルオロキノロン、アミノグリコシド類（例えばゲンタマイシンまたはトブラマイシン）およびコリスチンから選択される抗生剤に耐性のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばカルバペネムに耐性のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばエリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ－ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン、およびペニシリンから選択される抗生剤に耐性のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えばｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはｐｙｏｇｅｎｅｓ）細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばセフトリアキソン、アジスロマイシン、およびシプロフロキサシンから選択される抗生剤に耐性のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば血清型Ｔｙｐｈｉ）細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばシプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生剤に耐性のＳｈｉｇｅｌｌａ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばイソニアジド（ＩＮＨ）、リファンピシン（ＲＭＰ）、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン、およびカプレオマイシン、およびアジスロマイシンへの耐性から選択される抗生剤に耐性のｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばバンコマイシンに耐性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばセファロスポリンおよびカルバペネムから選択される抗生剤に耐性のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばトリメトプリム、イトロフラントイン、セファレキシン、およびアモキシシリンから選択される抗生剤に耐性のＥ．ｃｏｌｉ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばフルオロキノロン抗生剤およびカルバペネムから選択される抗生剤に耐性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えばｄｉｆｉｃｉｌｅ）細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばセフィキシム（例えば経口セファロスポリン）、セフトリアキソン（注射用セファロスポリン）、アジスロマイシン、およびテトラサイクリンから選択される抗生剤に耐性のＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばベータ－ラクタム、メロペネム、およびカルバペネムから選択される抗生剤に耐性のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ〔Acinetoebacter〕 ｂａｕｍａｎｎｉｉ細胞である。

任意で、標的細菌は、例えばシプロフロキサシンおよびアジスロマイシンから選択される抗生剤に耐性のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えばｊｅｊｕｎｉ）細胞である。

任意で、標的細胞はベータ（β）－ラクタマーゼを産生する（例えばＥＳＢＬ産生Ｅ．ｃｏｌｉまたはＥＳＢＬ産生Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）。

例えば、標的細胞は上記のこれらの選択肢のうちいずれか一つで引用した抗生剤に対して耐性がある細菌細胞である。

一例では、標的細胞はＳｈｉｇｅｌｌａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒから選択される種の細胞である。

任意で、組成物は、それぞれまたは組み合わせて、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒのうち２つ以上から選択される種の標的細胞中にプラスミドＤＮＡを接合移入することができるキャリア細胞を含む。

一例では、キャリア細胞の成長または増殖の低減は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、または９５％である。任意で、組成物またはキャリア細胞は、標的細胞に対して毒性である抗生剤と同時にまたは逐次的に投与される。例えば、抗生剤は本明細書で開示した任意の抗生剤であってよい。

任意で、ＮＳＩの発現は、標的細胞中で作動可能な誘起性プロモーターの制御下にある。任意で、ＮＳＩの発現は、標的細胞中で作動可能な構造性プロモーターの制御下にある。

実施形態では、プラスミドＤＮＡは、スクリーニング可能なまたは選択可能なマーカー遺伝子を含む。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、抗生剤耐性遺伝子である。

キャリア細菌は、表２に現れる種または属から選択される種または属の細菌であってよい。例えば、種は温血動物（例えば家畜脊椎動物）で見出される。例えば、種はヒトで見出される。例えば、種は植物で見出される。好ましくは、ヒトまたは動物の体内の非無菌部分（例えば皮膚、消化管、尿生殖器領域、口、鼻道、咽喉および上気道、耳、ならびに眼）に定着する非病原性細菌がキャリア細胞として利用され、一例ではヒトまたは動物の体内のかかる部分の標的細胞細菌感染と闘うために本発明の方法が使用される。別の実施形態では、感染は全身性感染である。特に好ましいキャリア細菌種の例には、それだけに限らないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの非病原性株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ１８、Ｓ１７、およびＥ． ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの種々の種（例えばＬ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｚｅａｅ、およびＬ．ｇａｓｓｅｒｉ）、またはその他の皮膚またはＧＩに定着する非病原性もしくはプロビオティックな細菌、例えばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ、および死滅するように運命付けられているが、それでもプラスミドを移入することができる無核様体細胞である細菌性ミニ細胞が含まれる（例えばＡｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５７；３２１－３２６，１９７０、Ｆｒａｚｅｒ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６９：１－８４，１９７５、Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩへの米国特許第４，９６８，６１９号を参照）。一部の実施形態では、標的レシピエント細胞は、ヒト、動物、または植物に、例えば皮膚の上または消化管、尿生殖器領域、口、鼻道、咽喉および上気道、眼、および耳の中に含まれる病原性細菌である。ターゲティングおよび撲滅のために特に興味あるものは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびその他の種、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの病原性株である。一例では、標的細胞の属または種は、表２に列挙した任意の属または種である。

本発明は、米国特許第６，２７１，３５９号、第６，２６１，８４２号、第６，２２１，５８２号、第６，１５３，３８１号、第６，１０６，８５４号、および第５，６２７，２７５号に記載されたものを含むが、それだけに限らない幅広い設定または環境、例えば治療用、農業用、またはその他の設定において用途がある。その他の用途も本明細書で論じており、さらに他の用途も当業者には容易に明らかになる。

プラスミドＤＮＡを含む数多い種類のプラスミドが、本発明における使用のために好適である。この観点において、当業者であれば単一のキャリア細菌株が（例えばそれらがコードする抗菌剤が異なる）２種以上のかかるプラスミドを含み得ることを認識することになる。さらに、別の例では、それぞれが１つまたは複数のかかるプラスミドを含む２つ以上の異なるキャリア細菌株を、マルチターゲット効果のために、即ち２つ以上の異なる標的種または株を死滅させるために、または標的細胞の同じ種または株の細胞を死滅させるために、組み合わせてよい。

本発明は、ヒトの処置および種々の獣医学、農業、園芸、および食品加工への応用のための有用性を見出す。ヒトおよび獣医学への応用については、保護のために目標とする細胞集団または組織に応じて、本発明のキャリア細菌の以下の投与様式、即ち局所、経口、経鼻、経眼、経耳、経肺（例えば吸入器を介する）、眼科、直腸、尿生殖器、皮下、腹腔内、および静脈内が意図される。細菌は、処置される患者のために選択される投与の様式に適した送達ビヒクル中で、医薬組成物として供給され得る。本明細書で使用する用語「患者」または「対象」は、ヒトまたは動物を指す（動物は例えば特定のドナー株の臨床的有効性のモデルとして特に有用であり、または飼育された動物もしくは家畜である）。商業的に関連のある動物はニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ナマズ、サケ、タラ、ニシン、ロブスター、エビ、クルマエビ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ヤギ、ガチョウ、またはウサギである。

例えば、キャリア細菌を胃腸管または鼻道に送達するために、好ましい投与様式は経口摂取もしくは経鼻エアロゾル、または（単独の、または対象の飼料もしくは食料、および／または飲料、例えば飲水に組み込んだ）給餌であってよい。これに関して、キャリア細胞は家畜（または飼育された動物もしくはコンパニオン動物）の食料に含まれてよく、例えばキャリア細菌は家畜用の食料添加物に含まれてよい。あるいは、添加物は家畜用の飲料（例えば飲水）添加物である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ等のプロビオティック細菌は、細菌細胞とマンニトール等の固相支持体との凍結乾燥された混合物を含むゲルカプセルとして販売されていることに注目されたい。ゲルカプセルが液体とともに摂取された場合には、凍結乾燥された細胞が再水和され、生存可能なコロニー形成性の細菌になる。即ち、同様にして、本発明のキャリア細菌細胞は、例えば食品または飲料に散布するためのゲルカプセルまたはバルクで、粉末化され凍結乾燥された製剤として供給することができる。再水和された生存可能な細菌細胞は、次いで上部および／または下部の胃腸管系にわたる部位に生息し、および／またはコロニーを形成し、その後、標的細菌と接触することになる。

局所的適用のため、キャリア細菌は、罹患した皮膚表面上に塗布する軟膏またはクリームとして処方してよい。軟膏またはクリームの製剤は、坐剤等の他の標準的な製剤とともに、直腸または膣での送達にも適している。局所、膣、および直腸への投与のための適切な処方は、医化学者には周知である。

本発明は、種々の細菌感染または細菌に関連する望ましくない状態を処置するための局所または経粘膜投与に特に有用である。これらの使用のいくつかの代表的な例には、（１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．によって惹起される結膜炎、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって惹起される角膜潰瘍、（２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって惹起される外耳炎、（３）多くのグラム陽性球菌およびグラム陰性桿菌によって惹起される慢性副鼻腔炎、または気管支の一般的な汚染除去、（４）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに伴う嚢胞性線維症、（５）Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（例えば胃潰瘍を処置または防止するため）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、またはＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｐ．によって惹起される腸炎,（６）例えば予防手段としての手術または非手術としての開放創傷、（７）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａまたはその他のグラム陰性病原体を除去するための熱傷、（８）例えばＰｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｃｎｅｓによって惹起される座瘡、（９）例えばメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＲＡ）によって惹起される鼻または皮膚の感染、（１０）例えばグラム陽性嫌気性菌によって惹起される体臭（即ち、脱臭剤におけるキャリア細胞の使用）、（１１）例えばＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓまたはその他の嫌気性細菌に伴う細菌性膣炎、ならびに（１２）種々の生命体によって惹起される歯肉炎および／または齲蝕の処置が含まれる。

一例では、標的細胞はＥ ｃｏｌｉ細胞であり、ヒトにおいて処置すべき疾患または状態は子宮管の感染または呼吸器関連の感染、例えば肺炎である。

他の実施形態では、本発明のキャリア細胞は、望ましくない標的細菌の除去または減衰のための表面の処置における応用、例えば標的細菌を含むかかる表面または環境を処置する方法における使用に用途があり、本方法は表面または環境を本発明のキャリア細菌と接触させてキャリアから標的細菌に本発明のプラスミドＤＮＡを接合移入させ、抗菌剤に標的細胞を死滅させることを含む。例えば、表面における細菌汚染による対象の感染を防止するために、手術、カテーテル挿入、その他の侵襲的処置において使用される表面を処置してよい。その上における細菌汚染を制御するために、本発明の方法および組成物を使用して数多くの表面、対象物、材料、その他（例えば医療用または救急用の装置、看護施設、ならびに厨房用の装置および表面）を処置することができることが意図されている。

キャリア細菌を含む医薬製剤またはその他の組成物は、投与を容易にし、用量を均一にするために、用量単位形態に処方してよい。用量単位形態は、本明細書で使用する場合、処置を受ける患者または植物または環境または表面に適した医薬製剤の物理的に離散した単位を意味する。それぞれの用量は、選択したキャリアと共同して所望の抗菌効果を生じるように計算された量のキャリア細菌を含む必要がある。適切な用量単位を決定するための手順は、当業者には周知である。用量単位は、患者、植物、表面、または環境の重量に基づいて比例的に増加または減少してよい。（例えば患者の組織に含まれる）病原性標的細胞の撲滅を達成するための適切な濃度は、当技術で既知の用量濃度曲線の計算によって決定してよい。

本発明のキャリア細菌のその他の使用も意図されている。これらには、種々の農業用、園芸用、環境用、および食品加工用の用途が含まれる。例えば、農業および園芸においては、植物の疾患を最小化するために種々の植物病原性細菌が標的化され得る。標的化に適した植物病原体の一例は、Ｅｒｗｉｎｉａ（例えば、Ｅ ａｍｙｌｏｖｏｒａ、火傷病の病原体）である。切り花の立ち枯れを低減または防止するために同様の戦略が利用され得る。獣医または動物飼育のために、本発明のキャリア細胞を動物の飼料（ニワトリ、ブタ、家禽、ヤギ、ヒツジ、魚類、甲殻類、またはウシの飼料）に組み込んで生体負荷を低減し、またはある種の病原性生命体（例えばニワトリ、シチメンチョウ、またはその他の家禽におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）を除去してよい。他の実施形態では、望ましくないまたは病原性の細菌（例えば食肉におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７、または海産物の「魚臭」の原因であるＰｒｏｔｅｕｓ ｓｐｐ．）を除去するために本発明を食肉またはその他の食品に適用してよい。

環境への効用には、（例えばマラリアまたは西ナイルウイルスを蔓延させる蚊を制御するために）例えば抗菌剤に加えてまたはその代わりに殺昆虫剤を送達して条件に応じて発現させるためにキャリア細菌を操作することが含まれる。そのような応用においては、上記の農業用および園芸用またはその他の応用と同様に、溶液、エアロゾル、またはゲルカプセルとしてのキャリア細菌の処方が意図される。

本明細書で使用する場合、用語「キャリア細胞」、「第１の細胞」、または「ドナー細胞」は、分裂するおよび／または分裂しない細菌細胞（ミニ細胞およびマキシ細胞）、または条件によって機能性のない細胞を含む。

一例では、プラスミドは操作されたＲＫ２またはＲＰ４プラスミドである。一例では、プラスミドＤＮＡは操作されたＲＫ２／ＲＰ４プラスミド（即ち組換えＤＮＡ技術によって改変されたＲＫ２プラスミドまたはかかる改変されたプラスミドの子孫）に含まれる。プラスミドＲＫ２は、２９種類の（およびおそらくそれより多い）グラム陰性種の中で複製することができる無差別なプラスミドである（Ｇｕｉｎｅｙ ａｎｄ Ｌａｎｋａ，１９８９，ｐ２７－５４．Ｉｎ Ｃ．Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ（ｅｄ）Ｐｒｏｍｉｓｃｏｕｓ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｌｏｎｄｏｎ，Ｌｔｄ Ｌｏｎｄｏｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。プラスミドＲＫ２は、完全なヌクレオチド配列が知られている６０ｋｂの自己伝染性プラスミドである（Ｐａｎｓｅｇｒａｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３９，６２３－６６３）。この大きなプラスミドから誘導され、ＴｒｆＡと呼ばれるプラスミドのＲｅｐタンパク質をコードするｔｒｆＡ遺伝子および栄養複製の起点であるｏｒｉＶを除いて全ての遺伝子を欠く最小のレプリコンが得られている。ＲＫ２複製およびＴｒｆＡタンパク質によるその制御の総説については、Ｈｅｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６（Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（ｅｄ．Ｆ．Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，ｅｔ ａｌ．，２２９５－２３２４，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）を参照されたい。

一例では、プラスミドＤＮＡは操作されたＲＫ６プラスミド（即ち、組換えＤＮＡ技術によって改変されたＲＫ６プラスミド、またはかかる改変されたプラスミドの子孫）に含まれる。

本発明は任意で産業用または家庭用の使用のためであるか、またはかかる使用のための方法において使用される。例えば、これは農業、油もしくは石油の産業、食品もしくは飲料の産業、被服産業、包装産業、電子産業、コンピュータ産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医療産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費者製品産業、医薬産業、鉱業、クリーニング産業、森林産業、水産業、レジャー産業、リサイクル業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプもしくは製紙産業、テキスタイル産業、被服産業、皮革もしくはスエードもしくは動物革産業、タバコ産業、または製鋼業のためであるかまたはこれらにおいて使用される。

本発明は任意で、産業における使用のためであり、または環境は産業的環境であり、産業は医療およびヘルスケア、医薬、ヒト用食料、飼料、植物用肥料、飲料、乳業、食肉加工、農業、牧畜業、養鶏業、魚介水産業、獣医学、油、ガス、石油化学、水処理、下水処理、包装、電子およびコンピュータ、パーソナルヘルスケアおよびトイレタリー、化粧品、歯科、非医療歯科、眼科、非医療眼科、鉱業および鉱産物加工、金属鉱業および金属加工、採石業、航空、自動車、鉄道、輸送、宇宙、環境、土壌処理、パルプおよび紙、被服製造、染料、印刷、接着剤、空調、溶剤、生体防御、ビタミン補給、低温保存、繊維の浸漬および生産、バイオテクノロジー、化学、産業用洗浄製品、家庭用洗浄製品、石鹸および洗剤、消費者製品、森林業、水産業、レジャー、リサイクル、プラスチック、皮革、レザーおよびスエード、廃棄物処理、葬儀および請負、燃料、建設、エネルギー、鉄鋼、ならびにタバコ産業の分野からなる群から選択される分野の産業である。

一例では、プラスミドＤＮＡは標的細菌を標的とするＣＲＩＳＰＲアレイを含み、アレイは、標的細菌のゲノムを標的とする１つまたは２つもしくはそれ以上の異なるスペーサー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０またはそれ以上のスペーサー）を含む。

一例では、標的細菌は以下のように環境に含まれる。一例では、環境はヒトのマイクロバイオーム、例えば口腔マイクロバイオームもしくは腸マイクロバイオーム、または血流である。一例では、環境はヒトの中またはその上の環境ではない。一例では、環境は非ヒト動物の中またはその上の環境ではない。一実施形態では、環境は空気環境である。一実施形態では、環境は農業環境である。一実施形態では、環境は油または石油の回収環境、例えば油または石油の油田または油井である。一例では、環境はヒトまたは非ヒト動物による消費のための食料または飲料の中またはその上における環境である。一例では、環境は海洋環境、例えば海水中または船上（例えば船またはボートのバラスト水）である。

一例では、環境はヒトまたは動物のマイクロバイオーム（例えば腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚、または口腔のマイクロバイオーム）である。一例では、標的細菌はヒトまたは動物のマイクロバイオーム（例えば腸、膣、頭皮、腋窩、皮膚、または口腔のマイクロバイオーム）に含まれる。

一例では、本発明のキャリア細菌または組成物は、ヒトまたは非ヒト動物に鼻内、局所、もしくは経口で投与され、またはかかる投与のためのものである。ヒトまたは動物のマイクロバイオームを処置しようとする当業者は、目的のマイクロバイオームに応じて最良の投与経路を決定することができる。例えば、マイクロバイオームが腸のマイクロバイオームである場合には、投与は経鼻または経口であってよい。マイクロバイオームが頭皮または腋窩のマイクロバイオームである場合には、投与は局所であってよい。マイクロバイオームが口または咽頭である場合には、投与は経口であってよい。

一例では、環境は飲料もしくは水（例えばヒトの消費のための水路または飲料水）または土壌に含まれる。水は任意で加熱、冷却、もしくは産業用のシステムの中にあるか、または飲料水保存容器の中にある。

一例では、キャリアおよび／または標的細菌はＡｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ、Ａｃｅｔａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ａｎａｅｒｏｆｉｌｕｍ、Ａｎａｅｒｏｓｉｎｕｓ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、Ａｎａｅｒｏｖｏｒａｘ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃａｐｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｄｏｒｅａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｔｈａｎｏｌｉｇｅｎｅｎｓ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍｅｌｌａ、Ｈｅｓｐｅｌｌｉａ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、Ｍｅｇａｍｏｎａｓ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｐａｐｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ、Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｓｐｉｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｐｓｅｕｄｏｒａｍｉｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｒｃｉｎａ、Ｓｅｉｎｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｕｒｉｂａｃｔｅｒ、およびＷｅｉｓｅｌｌａから選択されるＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓである。

一例では、キャリア細菌、組成物、使用、または方法は、病原性感染を低減するため、または腸もしくは口腔のバイオフィルムのバランスを調整するため、例えばヒトまたは動物における肥満または疾患を処置または防止するため、またはＧＩの状態（例えばクローン病、ＩＢＤ、または腸炎）を処置または防止するためのものである。例えば、ＤＮＡ、キャリア細菌、組成物、使用、または方法は、ヒトまたは動物または植物、好ましくはヒトまたは動物の腸のバイオフィルムにおいてＳａｌｍｏｍｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎｏｕｓ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、またはＥ ｃｏｌｉ細菌をノックダウンするためのものである。

一例では、動物は例えばニワトリであり、標的細菌はＳａｌｍｏｍｎｅｌｌａまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである。一例では、動物は例えば魚類（例えばナマズまたはサケ）または甲殻類（例えばエビまたはロブスター）であり、標的細菌はＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａである。一例では、植物は例えばジャガイモ植物であり、標的細菌はＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍである。一例では、植物は例えばキャベツ植物であり、標的細菌はＸａｎｔｈｏｍｏｎｏｕｓ（例えばＸ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。一例では、植物はマリファナ植物であり、例えば標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ｃａｎｎａｂｉｎａまたはＰ ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＡ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（例えばＸ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。一例では、植物は麻植物であり、例えば標的細菌はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ ｃａｎｎａｂｉｎａまたはＰ ａｍｙｇｄａｌｉ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＡ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（例えばＸ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。

一例では、疾患または状態はがん、炎症性もしくは自己免疫の疾患または状態、例えば肥満、糖尿病、ＩＢＤ、ＧＩ管の状態または口腔の状態である。

任意で、環境は、または標的細菌は、腸バイオフィルム、皮膚バイオフィルム、口腔バイオフィルム、咽喉バイオフィルム、毛髪バイオフィルム、腋窩バイオフィルム、膣バイオフィルム、直腸バイオフィルム、肛門バイオフィルム、眼バイオフィルム、鼻バイオフィルム、舌バイオフィルム、肺バイオフィルム、肝バイオフィルム、腎バイオフィルム、生殖器バイオフィルム、陰茎バイオフィルム、陰嚢バイオフィルム、乳腺バイオフィルム、耳バイオフィルム、尿道バイオフィルム、陰唇バイオフィルム、臓器バイオフィルム、または歯バイオフィルムに含まれる。任意で、環境は、または標的細菌は、植物（例えばタバコ、作物、果樹、野菜、またはタバコ、例えば植物の表面上もしくは植物に含まれる）または環境（例えば土壌または水もしくは水路または水性液体）に含まれる。

一例では、キャリア細胞または組成物は、動物またはヒトにおける疾患または状態を処置するためのものである。一例では、疾患または状態は、対象または患者に含まれる標的細胞の感染によって惹起されまたは媒介される。一例では、疾患または状態は、対象または患者に含まれる標的細胞の感染に伴う。一例では、疾患または状態の症状は、対象または患者に含まれる標的細胞の感染である。

任意で、ヒトまたは動物の対象の疾患または状態は、
（ａ）神経変性の疾患または状態、
（ｂ）脳の疾患または状態、
（ｃ）ＣＮＳの疾患または状態、
（ｄ）記憶の喪失または損傷、
（ｅ）心臓または心臓血管の疾患または状態、例えば心臓麻痺、発作、または心房細動、
（ｆ）肝臓の疾患または状態、
（ｇ）腎臓の疾患または状態、例えば慢性腎疾患（ＣＫＤ）、
（ｈ）膵臓の疾患または状態、
（ｉ）肺の疾患または状態、例えば嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ、
（ｊ）胃腸の疾患または状態、
（ｋ）咽喉または口腔の疾患または状態、
（ｌ）眼の疾患または状態、
（ｍ）生殖器の疾患または状態、例えば膣、陰唇、陰茎、または陰嚢の疾患または状態、
（ｎ）性感染性の疾患または状態、例えば淋病、ＨＩＶ感染、梅毒、またはクラミジア感染、
（ｏ）耳の疾患または状態、
（ｐ）皮膚の疾患または状態、
（ｑ）心臓の疾患または状態、
（ｒ）鼻の疾患または状態、
（ｓ）血液の疾患または状態、例えば貧血、例えば慢性疾患またはがんの貧血、
（ｔ）ウイルス感染、
（ｕ）病原性細菌感染、
（ｖ）がん、
（ｗ）自己免疫性の疾患または状態、例えばＳＬＥ、
（ｘ）炎症性の疾患または状態、例えばリウマチ性関節炎、乾癬、皮膚炎、喘息、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病、またはＩＢＤ、
（ｙ）自閉症、
（ｚ）ＡＤＨＤ、
（ａａ）双極性障害、
（ｂｂ）ＡＬＳ（筋委縮性側索硬化症）、
（ｃｃ）骨関節炎、
（ｄｄ）先天性または発育の欠陥または状態、
（ｅｅ）流産、
（ｆｆ）血液凝固状態、
（ｇｇ）気管支炎、
（ｈｈ）乾燥または湿潤ＡＭＤ、
（ｉｉ）新生血管形成（例えば腫瘍または眼の）、
（ｊｊ）一般的な風邪、
（ｋｋ）てんかん、
（ｌｌ）線維症、例えば肝臓または肺の線維症、
（ｍｍ）真菌性の疾患または状態、例えば鵞口瘡、
（ｎｎ）代謝性の疾患または状態、例えば肥満、拒食症、糖尿病、Ｉ型もしくはＩＩ型の糖尿病、
（ｏｏ）潰瘍、例えば胃潰瘍または皮膚潰瘍、
（ｐｐ）乾燥皮膚、
（ｑｑ）シェーグレン症候群、
（ｒｒ）サイトカインストーム、
（ｓｓ）難聴、聴覚の喪失または損傷、
（ｔｔ）代謝の遅延または亢進（即ち、対象の体重、性別、および年齢の平均より遅延または亢進）
（ｕｕ）受胎障害、例えば不妊または受精能低下、
（ｖｖ）黄疸、
（ｗｗ）皮膚発疹、
（ｘｘ）川崎病、
（ｙｙ）ライム病、
（ｚｚ）アレルギー、例えばナッツ、草、花粉、イエダニ、ネコ、またはイヌの毛皮または鱗屑に対するアレルギー、
（ａａａ）マラリア、腸チフス熱、結核、またはコレラ、
（ｂｂｂ）うつ病、
（ｃｃｃ）精神発達遅滞、
（ｄｄｄ）小頭症、
（ｅｅｅ）栄養不良、
（ｆｆｆ）結膜炎、
（ｇｇｇ）肺炎、
（ｈｈｈ）肺塞栓症、
（ｉｉｉ）肺高血圧症、
（ｊｊｊ）骨障害、
（ｋｋｋ）敗血症または敗血性ショック、
（ｌｌｌ）静脈洞炎、
（ｍｍｍ）ストレス（例えば職業性ストレス）、
（ｎｎｎ）サラセミア、貧血、フォンウィレブラント病、または血友病、
（ｏｏｏ）帯状疱疹またはヘルペス、
（ｐｐｐ）月経、
（ｑｑｑ）精子数減少
から選択される。

本発明による処置または防止のための神経変性またはＣＮＳの疾患または状態
一例では、神経変性またはＣＮＳの疾患または状態は、アルツハイマー病、老年期精神病、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性神経障害、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋委縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、およびクロイツフェルト・クロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択される。例えば、疾患はアルツハイマー病である。例えば、疾患はパーキンソン症候群である。

本発明の方法がＣＮＳまたは神経変性の疾患または状態を処置するためにヒトまたは動物の対象に対して実施される例では、本方法は対象におけるＴｒｅｇ細胞の下方制御を惹起し、それにより全身的な単球誘導マクロファージおよび／またはＴｒｅｇ細胞が脈絡叢を横切って対象の脳の中に進入することを促進し、それにより疾患または状態（例えばアルツハイマー病）を処置し、防止し、またはその進行を低減する。一実施形態では、本方法は対象のＣＮＳシステムにおける（例えば脳および／またはＣＳＦにおける）ＩＦＮ－ガンマの増加を惹起する。一例では、本方法は神経線維を回復し、および／または神経線維の損傷の進行を低減する。一例では、本方法は神経ミエリンを回復し、および／または神経ミエリンの損傷の進行を低減する。一例では、本発明の方法はＷＯ２０１５１３６５４１に開示された疾患または状態を処置または防止し、および／または本方法はＷＯ２０１５１３６５４１に開示された任意の方法とともに使用することができる（本書類の開示は、例えばＣＮＳおよび神経変性の疾患および状態の処置および／または防止をもたらすために対象に投与することができるかかる方法、疾患、状態、および可能性のある治療剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＴＩＭ３、または本明細書で開示したその他の抗体などの薬剤の開示を提供するために、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。

本方法による処置または防止のためのがん
処置し得るがんは、血管新生していない、または実質的に血管新生していない腫瘍、ならびに血管新生した腫瘍を含む。がんは非固形腫瘍（血液腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫など）を含み得る、または固形腫瘍を含み得る。本発明によって処置すべきがんの型には、癌腫、芽腫、および肉腫、ならびにある種の白血病またはリンパ悪性疾患、良性および悪性の腫瘍、および悪性疾患、例えば肉腫、癌腫、および黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／がんおよび小児の腫瘍／がんも含まれる。

血液がんは血液または骨髄のがんである。血液の（または造血性の）がんの例には、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄原性白血病、および骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球、単球、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄原性白血病、および慢性リンパ性白血病など）を含む白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（不活性および高グレードの形態）、多発性骨髄腫、ワルデンストロームのマクログロブリン血症、重鎖疾患、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病、および骨髄異形成が挙げられる。

固形腫瘍は、通常嚢胞または液体の区域を含まない組織の異常な塊である。固形腫瘍は良性または悪性であり得る。様々な型の固形腫瘍の名称は、それらを形成する細胞の型に由来する（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、およびその他の肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞脂肪腺癌腫、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛腫、ウィルムズ腫瘍、子宮頸がん、睾丸腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、およびＣＮＳ腫瘍（例えば神経膠腫（脳幹神経膠腫および混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形神経膠芽腫としても知られている）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫〔craniopharyogioma〕、上衣腫、松果体腫〔pineaioma〕、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫〔menangioma〕、神経芽細胞腫、網膜芽腫、および脳転移）が挙げられる。

本方法による処置または防止のための自己免疫疾患
１．急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）
２．急性壊死性出血性白質脳炎
３．アジソン病
４．無ガンマグロブリン血症
５．円形脱毛症
６．アミロイドーシス
７．強直性脊髄炎
８．抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎
９．抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）
１０．自己免疫性血管性浮腫
１１．自己免疫性再生不良性貧血
１２．自己免疫性自律神経障害
１３．自己免疫性肝炎
１４．自己免疫性高脂血症
１５．自己免疫性免疫不全
１６．自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）
１７．自己免疫性心筋炎
１８．自己免疫性卵巣炎
１９．自己免疫性膵炎
２０．自己免疫性網膜炎
２１．自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）
２２．自己免疫性甲状腺疾患
２３．自己免疫性蕁麻疹
２４．軸索およびニューロンの神経障害
２５．バロー病
２６．ベーチェット病
２７．水疱性類天疱瘡
２８．心筋ミオパチー
２９．キャスルマン病
３０．セリアック病
３１．チャガス病
３２．慢性疲労症候群
３３．慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）
３４．慢性再発性多発性骨髄炎〔ostomyelitis〕（ＣＲＭＯ）
３５．チャーグ・ストラウス症候群
３６．瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡
３７．クローン病
３８．コーガンス症候群
３９．寒冷凝集素症
４０．先天性心ブロック
４１．コクサッキー心筋炎
４２．ＣＲＥＳＴ病
４３．本態性混合クリオグロブリン血症
４４．脱髄性神経障害
４５．疱疹状皮膚炎
４６．皮膚筋炎
４７．デビッチ病（視神経脊髄炎）
４８．ディスコイドループス
４９．ドレスラー症候群
５０．子宮内膜症
５１．好酸球性食道炎
５２．好酸球性筋膜炎
５３．結節性紅斑
５４．実験性アレルギー性脳脊髄炎
５５．エバンス症候群
５６．線維筋痛症
５７．線維化性肺胞炎
５８．巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）
５９．巨細胞性心筋炎
６０．糸球体腎炎
６１．グッドパスチャー症候群
６２．多発性血管炎を伴う内芽腫症（ＧＰＡ）（以前はウェゲナー内芽腫症と呼ばれていた）
６３．グレーブス病
６４．ギランバレー症候群
６５．橋本脳炎
６６．橋本甲状腺炎
６７．溶血性貧血
６８．ヘノッホ・シェーンライン紫斑病
６９．妊娠性ヘルペス
７０．低ガンマグロブリン血症
７１．特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）
７２．ＩｇＡ腎症
７３．ＩｇＧ４関連硬化性疾患
７４．免疫調節性リポタンパク質
７５．封入体筋炎
７６．間質性膀胱炎
７７．若年性関節炎
７８．若年性糖尿病（１型糖尿病）
７９．若年性筋炎
８０．川崎症候群
８１．ランバート・イートン症候群
８２．白血球破砕性血管炎
８３．扁平苔癬
８４．硬化性苔癬
８５．木質性結膜炎
８６．線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）
８７．ループス（ＳＬＥ）
８８．ライム病、慢性
８９．メニエール病
９０．顕微鏡的多発性血管炎
９１．混合結合組織病（ＭＣＴＤ）
９２．モーレン潰瘍
９３．ムッカ・ハーベルマン病
９４．多発性硬化症
９５．重症筋無力症
９６．筋炎
９７．ナルコレプシー
９８．視神経脊髄炎（デビッチの）
９９．好中球減少症
１００．眼瘢痕性類天疱瘡
１０１．視神経炎
１０２．回帰性リウマチ
１０３．ＰＡＮＤＡＳ（ストレプトコッカス関連小児自己免疫性神経精神障害）
１０４．傍腫瘍性小脳変性症
１０５．発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）
１０６．パリー・ロンバーグ症候群
１０７．パーソナージ・ターナー症候群
１０８．扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）
１０９．天疱瘡
１１０．末梢神経障害
１１１．静脈周囲脳脊髄炎
１１２．悪性貧血
１１３．ＰＯＥＭＳ症候群
１１４．結節性多発性動脈炎
１１５．Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型の自己免疫性多腺性症候群
１１６．リウマチ性多発性筋痛
１１７．多発性筋炎
１１８．心筋梗塞後症候群
１１９．心膜切開術後症候群
１２０．プロゲステロン皮膚炎
１２１．原発性胆汁性肝硬変
１２２．原発性硬化性胆管炎
１２３．乾癬
１２４．乾癬性関節炎
１２５．特発性肺線維症
１２６．壊疽性膿皮症
１２７．赤芽球癆
１２８．レイノー現象
１２９．反応性関節炎
１３０．反射性交感神経性ジストロフィー
１３１．ライター症候群
１３２．再発性多発性軟骨炎
１３３．下肢静止不能症候群
１３４．後腹膜線維化症
１３５．リウマチ熱
１３６．リウマチ性関節炎
１３７．サルコイドーシス
１３８．シュミット症候群
１３９．強膜炎
１４０．強皮症
１４１．シェーグレン症候群
１４２．精子および睾丸の自己免疫
１４３．スティッフパーソン症候群
１４４．亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）
１４５．スーザック症候群
１４６．交感性眼炎
１４７．高安動脈炎
１４８．側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎
１４９．血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）
１５０．トロサ・ハント症候群
１５１．横断性脊髄炎
１５２．１型糖尿病
１５３．潰瘍性大腸炎
１５４．未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）
１５５．ブドウ膜炎
１５６．血管炎
１５７．小水疱水疱性皮膚病
１５８．白斑
１５９．ウェゲナー肉芽腫症（現在では多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）と称する）

本方法による処置または防止のための炎症性疾患
１．アルツハイマー病
２．強直性脊椎炎
３．関節炎（骨関節炎、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎）
４．喘息
５．アテローム性動脈硬化
６．クローン病
７．結腸炎
８．皮膚炎
９．憩室炎
１０．線維筋痛
１１．肝炎
１２．過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
１３．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）
１４．腎炎
１５．パーキンソン病
１６．潰瘍性大腸炎

本明細書に記載した特定の実施形態は説明のために示されており、本発明の限定としてではないことが理解されよう。本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態において本発明の主要な特徴を採用することができる。当業者であれば、日常的なものを超えない検討を使用して、本明細書に記載した特定の手順に数多くの等価物を認識し、または確定することができる。かかる等価物は本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲によって包含されている。明細書中で述べた全ての出版物および特許出願は、本発明が関係する当業者のスキルのレベルを示す。全ての出版物および特許出願、ならびに全ての等価の米国特許出願および特許は、それぞれ個別の出版物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。単語「１つ（〔a〕または〔an〕）」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と併せて使用される場合には、「１つ」を意味し得るが、これは「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味とも合致する。本開示は選択肢および「および／または」のみを意味する定義を支持するが、特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみを意味するように明示的に指示され、または選択肢が相互に排他的である場合以外には、「および／または」を意味するように使用される。本出願を通じて、用語「約」は、ある値がデバイスについての固有の誤差変動を含むことを示すために使用され、本方法はその値または検討対象の間に存在する変動を決定するために採用される。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単語「含む〔comprising〕」（および〔comprising〕の任意の形態、例えば〔comprise〕および〔comprises〕）、「有する〔having〕」（および〔having〕の任意の形態、例えば〔have〕および〔has〕）、「含む〔including〕」（および〔including〕の任意の形態、例えば〔includes〕および〔include〕）、または「含む〔containing〕」（および〔containing〕の任意の形態、例えば〔contains〕および〔contain〕）は包括的またはオープンエンドであり、引用していないさらなる要素または方法ステップを排除しない。

用語「またはそれらの組合せ」または同様の用語は、本明細書で使用する場合、その用語に先立って列挙された項目の全ての順列または組合せを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣのうち少なくとも１つを、また特定の文脈において順序が重要な場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢのうち少なくとも１つも含むことを意図している。この例を続けて、１つまたは複数の項目または用語、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ等々の繰り返しを含む組合せが明示的に含まれる。文脈から他が明白でない限り、典型的には任意の組合せにおいて項目または用語の数に制限がないことが当業者には理解されよう。

文脈から他が明白でない限り、本開示のいずれの部分も本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。

本明細書で開示し特許請求する組成物および／または方法の全ては、本開示に照らして、不必要な実験をすることなく作製し実行することができる。本発明の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載しているが、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱することなく、組成物および／または方法に、また本明細書に記載した方法のステップまたはステップの配列に、変更を適用できることは、当業者には明らかであろう。当業者には明らかな全てのかかる同様の置換および改変は、添付した特許請求の範囲で定義される本発明の精神、範囲、および概念に含まれるとみなされる。

［実施例１］ｈｙｐＣ２機能のノックアウトは接合効率を大きく増強する。
トランスポゾンライブラリーの構築および高接合性変異体の富化
ＥＺ－Ｔｎ５（商標）キット（Ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用し、メーカーのプロトコルに従って、プラスミドｐＸ１．０（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＨＭ１１４２２６．１）のトランスポゾン変異体ライブラリーを構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を、エレクトロポレーションによって１μｌのライブラリーで形質転換し、振盪しながら３７℃、２時間で回収した。次いで形質転換混合物を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン中で５倍に希釈し、Ｔｎ５転位が成功したプラスミドを富化した。

接合効率の決定
ドナー（野生型または変異体のプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５）およびストレプトマイシン耐性レシピエントＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５のオーバーナイト培養物を１：１で混合し、ＬＢ寒天プレートの表面にスポットした。接合混合物を１４時間インキュベートした後、２つの株からなるコロニーをプレートから掬い取り、ＰＢＳ中で希釈した。様々な希釈物を選択プレート上に播種して、トランスコンジュガント、ドナー、およびレシピエントを分離し定量した。

ｈｙｐＣ２およびそのタンパク質の配列を表３に示す。

接合実験の結果：
図１を参照されたい。ｈｙｐｃ２ ＫＯ（ノックアウト）プラスミド変異体は、野生型（ＷＴ）と比較してほぼ１０００倍高い接合率を示す。ＷＴと最適化された（変異体）プラスミドを用い、同じドナー量および同じインキュベーション時間で得られたトランスコンジュガント（感染した細胞）の数を示している。

［実施例２］ｈｙｐＣ２はプラスミドの間で広く分布している。
ｐＸ１．０プラスミドは、天然産生のＩｎｃＸプラスミドから構築され、ＩｎｃＸプラスミド群の中心的な機能を含む典型的なＩｎｃＸプラスミドである。ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１１；６（５）：ｅ１９９１２． ｄｏｉ： １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１９９１２． Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｍａｙ １８； “Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｑｕｉｎｔｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｓｅｌｆ－ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ＩｎｃＸ１ ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＸ１．０”、Ｈａｎｓｅｎ ＬＨ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。ＩｎｃＸプラスミドは、その複製モジュールによって歴史的に定義されており、この複製モジュールは他の箇所に記載したようにそのタイプ分けに使用されている。例えば、Ｐｌａｓｍｉｄ． ２０１２ Ｊｕｌ；６８（１）：４３－５０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｐｌａｓｍｉｄ．２０１２．０３．００１． Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｍａｒ ２６； “Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩｎｃＸ ｐｌａｓｍｉｄ ｆａｍｉｌｙ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ”、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＴＪ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。

ｈｙｐＣ２遺伝子のｂｌａｓｔは、Ｇｅｎｂａｎｋの３３種の異なるプラスミドの中に同一（１００％のＩＤおよびカバレッジ）の遺伝子が存在していることを明らかにしている。これらとは別に、これは８０％を超えるカバレッジおよび８０％のＩＤを有する６８種のシーケンシングされたプラスミドの中で見出され、その後でＩＤおよびカバレッジの（関連のない配列への）急峻な低下が観察される。遺伝子はＥ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種で見出されるが、ＳｈｉｇｅｌｌａおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａでも高い同一性で見出される。

ペアワイズ整列アウトプットにおいて：
％ＩＤは整列中の（完全な）一致のパーセンテージであり、（クエリー）カバレッジは標的配列に整列したクエリー（ｈｙｐ２Ｃ）の配列の（長さの）パーセンテージである。

また、図解のための系統樹を図２に示す。

Claims (23)

1. ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを欠く接合性プラスミド。
2. 配列番号１または配列番号１と少なくとも７０％同一であるヌクレオチド配列を欠く、請求項１に記載のプラスミド。
3. ＩｎｃＸプラスミドのＯｒｉＴを含み、任意でＩｎｃＸプラスミドである、請求項１または２に記載のプラスミド。
4. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅのプラスミドであり、任意でＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒのプラスミドである、前記いずれかの請求項に記載のプラスミド。
5. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞を宿主とすることができ、任意でＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞を宿主とすることができる、前記いずれかの請求項に記載のプラスミド。
6. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞に接合移入することができ、任意でＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞に接合移入することができる、前記いずれかの請求項に記載のプラスミド。
7. 接合性プラスミドを含む細菌細胞であって、前記細胞がｈｙｐＣ２タンパク質またはそのホモログを含まない、細菌細胞。
8. 前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の細胞。
9. Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞であり、任意でＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞である、請求項７または８に記載の細胞。
10. 前記プラスミドが抗菌剤を含むか、またはコードする、前記いずれかの請求項に記載のプラスミドまたは細胞。
11. 前記プラスミドがガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードし、任意で前記ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡが標的細胞のプロトスペーサー配列にハイブリダイズすることができる、前記いずれかの請求項に記載のプラスミドまたは細胞。
12. 前記標的細胞がＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞から選択される、請求項１１に記載のプラスミドまたは細胞。
13. 前記プラスミドを含む細胞の第１の集団を含む組成物の製造における、請求項１から６および１０から１２のいずれか一項に記載のプラスミドの使用であって、第１の細胞と第２の細胞が相互に接触し、かつ細菌細胞である場合に、前記第１の細胞から第２の集団の細胞へのプラスミドの接合性移入の頻度を増進させるための使用。
14. ドナー細胞からレシピエント細胞に目的の核酸配列（ＮＳＩ）を移入する方法であって、前記ＮＳＩがプラスミドに含まれ、前記プラスミドが前記ドナー細胞に含まれ、前記方法が前記ドナー細胞から前記レシピエント細胞への前記プラスミドの接合性移入を可能にするように前記細胞を組み合わせることを含み、前記プラスミドが請求項１から６および１０から１２のいずれか一項に記載のものである、方法。
15. 前記ドナー細胞が、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞からなる群から選択され、かつ／または前記レシピエント細胞が、Ｅ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記レシピエント細胞がＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅの細胞であり、かつ／または前記ドナー細胞がＥ ｃｏｌｉの細胞である、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 前記ＮＳＩが抗菌剤であるか、抗菌剤をコードし、任意で、前記薬剤が前記レシピエント細胞に対して毒性である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ヒトまたは動物の対象における感染を処置する方法であって、前記感染が複数の細菌細胞（レシピエント細胞）の感染であり、前記方法が、
    （ｉ）複数のドナー細菌細胞を前記対象に投与することであって、それによりレシピエント細胞がドナー細胞と組み合わされ、それぞれのドナー細胞が請求項１から６および１０から１２のいずれか一項に記載のプラスミドを含む、投与すること、および
    （ｉｉ）前記ドナー細胞から前記レシピエント細胞へのプラスミドの接合性移入を可能にすることであって、それぞれの移入されたプラスミドが、レシピエント細胞に対して毒性である抗菌剤またはその構成要素を含むかまたはコードするそれぞれの目的の核酸配列（ＮＳＩ）を含み、それによりレシピエント細胞が死滅するかまたはレシピエント細胞の成長もしくは増殖が阻害される、可能にすること
    を含む、方法。
19. 請求項１８に記載の方法における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載のプラスミドまたは細胞。
20. 前記方法がさらに、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のものである、請求項１８または１９に記載の方法、プラスミド、または細胞。
21. 前記ドナー細胞がＥ ｃｏｌｉの細胞であり、前記レシピエント細胞がＥ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒの細胞である、請求項１８、１９、または２０に記載の方法、プラスミド、または細胞。
22. 機能性ｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログを欠く接合性プラスミドを産生する方法であって、
    （ａ）ｈｙｐＣ２タンパク質を発現する機能を有するｈｙｐＣ２ヌクレオチド配列またはそのホモログである第１のヌクレオチド配列を含む第１の接合性プラスミドを準備すること、および
    （ｂ）前記第１のプラスミドから前記第１の配列を欠失させるか、または前記第１の配列を変異させて、前記配列を前記タンパク質の発現について非機能性とし、それにより前記接合性プラスミドを産生すること
    を含む、方法。
23. 前記プラスミドが請求項２２に記載の方法によって得られるか、または得られた、請求項１から１２および２１のいずれか一項に記載のプラスミドまたは細胞。

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