CN114302948A - 用于产生高细胞密度种子培养物的系统和方法 - Google Patents

Abstract

用于低温保存的高细胞密度种子培养物HCDC制备物的自动化生产的系统，所述系统包括细胞扩增装置，其用于使HCDC在所述细胞扩增装置的装置容积内的培养基中生长；至少一个传感器，其用于通过至少在时间上监测指示所述HCDC的生理状态的至少一个参数来收集数据；以及控制单元，其用于处理所述收集的数据以确定所述监测的参数是否满足至少一个预定标准，以基于所述监测的参数是否满足至少一个预定标准来控制低温保护剂CPA至少部分交换所述培养基。

Description

用于产生高细胞密度种子培养物的系统和方法

本发明涉及用于低温保存的高细胞密度种子培养物(HCDC)制备物(HCDC制备物)的自动化生产的方法和系统。

通常，生产生物过程需要所谓的冷冻种子培养物，其用于接种生物过程的种子培养物。HCDC满足了缩短种子系(seed train)的需要，即使其更有成本效益。因此，低温保存的HCDC制备物，特别是HCDC-等分试样帮助改进生产生物过程。HCDC制备物的品质可以变化。品质的一个重要量度是HCDC经历低温处理的生理状态。

根据本公开内容的一个方面，该目的涉及在低温保存之前改进HCDC制备物的品质。

通过根据独立权利要求的系统和方法来实现该目的。优选的实施方案由从属权利要求覆盖。

在完成生产步骤之前，即在完成制备HCDC制备物的步骤之前，其被称为包含HCDC-细胞的HCDC而不是HCDC制备物。

根据一个方面，系统是用于低温保存的高细胞密度种子培养物HCDC制备物的自动化生产，所述系统包括：

-细胞扩增装置，其用于使HCDC在所述细胞扩增装置的装置容积内的培养基中生长；

-至少一个传感器，其用于通过至少在时间上监测指示所述HCDC的生理状态的至少一个参数来收集数据；以及

-控制单元，其用于处理收集的数据以确定监测的参数是否满足至少一个预定标准，以基于监测的参数是否满足至少一个预定标准来控制低温保护剂CPA至少部分交换所述培养基。

所述系统允许CPA自动替代至少部分培养基。所述系统可以提供用于高品质低温保存的HCDC制备物。优选地，所述系统的所有或至少大部分元件可以由控制单元控制和/或调节，使得它们的功能可以被自动地请求和/或启动。

在线监测过程可以帮助找到开始处理分散在含有HCDC的肉汤中的细胞(特别是用于低温保存的HCDC的制备物)的理想处理时间。此外，所述系统可以重复地开始HCDC的制备，即在预定条件下处理HCDC细胞，从而在不同细胞库和/或细胞干或品系的世代之间保持低变化。

连续在线，特别是原位监测允许实时过程控制。对于离线数据，只能在样品分析时作出决定，从而导致完全不精确的时间或丢失事件。这种在线数据可以通过电容探针(也称为电容传感器)和/或光谱学、pH传感器、气体检测器等或者几个指定的传感器和探针的组合来收集。

被认为特别有用的方法包括不区分活细胞和死细胞的光学探针，电容探针和射频阻抗(RFI)探针，其中电容探针和RFI探针可以在电容测量中检测活细胞。

而且，由于指示HCDC的活细胞密度状态的稳健实时数据，介电常数测量可能是有用的。介电常数测量与指数阶段的离线细胞计数很好地相关，没有计数误差的风险。相应的介电常数传感器可用于提高许多细胞系、工艺类型和规模的工艺品质。

由于用于低温保存的HCDC制备物的改进的生产，即在活细胞的密度特别高的时间点停止生长，系统可以帮助减少细胞扩增阶段，即细胞扩增所需的时间段。因此，需要较少的培养基，因此可以降低操作工作量和成本。

此外，所述系统通过监测生理细胞状态，例如新陈代谢和细胞生长，帮助将细胞保持在有益状态，因此所述系统可以改进后续培养物的性能和再现性。因此，HCDC的生产可以更可靠，提供更高的再现性，更好的效率。换句话说，所述系统具有降低或甚至避免故障率，以及在种子培养处理中具有更高的成本效率的优点。因此可以降低或消除(高)可变性和性能波动的风险。

所述系统的另一个优点是可以减少或甚至消除需要手动执行的步骤的数量。所述系统可以自主地运行用于低温保存的HCDC制备物的生产，例如过夜和/或长时间和/或永久地没有人与之交互，同时提供具有高密度活细胞的改进品质的HCDC制备物。可以避免手动监测该过程，特别是手动取样HCDC和测定HCDC的活细胞密度。因此，可以避免或至少减少通过手动处理步骤污染的风险。

这些效果和优点允许系统的高(成本)效率以及容易和方便的处理。处理可以例如仅包括提供开始生产包括HCDC生长在内的HCDC制备物所需的材料以及指示系统开始生产。可以由操作者执行的进一步步骤可以包括预设至少一个预定标准，以及潜在地对用于指定功能的系统编程。

优选地，所述至少一个传感器包括电容探针(也称为电容传感器)，其用于通过至少在时间上(优选在线的，即在测量期间基本上实时地)监测包括电容在内的至少一个参数来收集数据，其中所述参数，特别是所述电容指示HCDC的生理状态。

所述至少一个参数优选包括以下中的至少一个：活细胞密度或基本上指示活细胞密度的任何参数，包括活细胞和非活细胞的总细胞密度，气体浓度，气体压力(例如氧气和/或二氧化碳)，电容，介电常数，电阻，光的分子振动吸收，散射光的量，pH，生物质的量和/或重量，特别是HCDC的量和/或重量。

确定监测参数是否满足至少一个预定标准的步骤优选包括以下中的至少一个：确定HCDC的活细胞密度是否超过或等于或低于阈值，确定HCDC的活细胞密度是否达到平稳值，确定HCDC的活细胞密度随时间的变化是否超过、等于或低于预定值，确定装置容积内的气压是否达到或低于预定值，确定HCDC的重量是否超过或等于或低于阈值。

根据一个方面，所述细胞扩增装置布置在摇杆上，所述摇杆被配置为产生所述细胞扩增装置的运动，使得液体能够在所述细胞扩增装置的装置容积内移动。根据一个方面，所述细胞扩增装置布置在磁力搅拌器上，所述磁力搅拌器被配置为在装置容积内移动磁性元件，使得液体能够在装置容积内移动。根据一个方面，所述细胞扩增装置布置在回火装置(如加热板)上，所述回火装置被配置为控制，即加热和/或冷却装置容积内的物质，例如气体和/或液体。这些方面可以组合在一个装置中。根据一个方面，所述细胞扩增装置布置在平衡元件上，所述平衡元件被配置为确定所述细胞扩增装置的重量。

当搅拌或摇动细胞在其中生长的液体，基本上是培养基以提供例如足够的氧并避免它们附近的氧和/或营养损耗时，对于装置容积内的细胞生长可能是有利的。此外，提供温度控制以将具有细胞的培养基调温到生长的最佳温度可能是有利的。

根据一个方面，摇杆、磁力搅拌器和/或回火装置由控制单元控制，使得控制单元可以设置诸如摇摆强度、温度和/或搅拌频率的参数。优选地，控制单元被配置为基于监测参数满足的至少一个标准来控制摇杆、磁力搅拌器和/或回火装置。例如，该参数可以在某个时间窗口中显示出基本上指数增长，而在另一个时间窗口中显示出平坦化(flattening)。控制单元优选地被配置为确定何时通过参数达到一定程度的平坦化。作为对所确定的平坦化的响应，控制单元可以降低或增加摇摆频率或摇摆强度，或者控制单元可以降低温度以基本上停止进一步的细胞生长。

根据另一个方面，所述至少一个传感器中的一个基本上布置在细胞扩增装置的外壁或外壳上或者外壁或外壳处。可选地或另外，传感器基本上布置在细胞扩增装置的内壁或内壳上或者内壁或内壳处。例如，气体传感器可以布置在细胞扩增装置的内壁上。可选地或另外，传感器通过细胞扩增装置的壁或外壳从外部到达内部装置容积。

根据一个方面，特别表示为“选项A)”，所述细胞扩增装置包括：

-至少一个排放口，其用于从所述装置容积的内部朝向所述装置容积的外部排放所述培养基或任何其它溶剂的至少一部分；以及

-膜元件，其用于通过CPA至少部分交换所述培养基，其中所述膜元件布置在所述排放口(即用作出口的排放孔或端口)处，即在所述排放口之上和/或之中和/或之后和/或之前，使得当至少一部分培养基从所述装置容积通过所述膜元件并且通过所述排放口朝向所述装置容积的外部排放时，所述HCDC被所述膜元件保留在所述装置容积内；以及

其中控制单元被配置为基于是否满足标准，例如当活细胞密度达到阈值时，启动以下步骤：

-将至少一部分培养基从所述装置容积内部通过所述膜元件排放到所述装置容积外部；以及

-将CPA添加到装置容积内的HCDC，和任选地，

其中所述系统包括由控制单元控制的转移单元，其用于将至少一部分具有CPA的HCDC从所述装置容积转移到一个或多个接收装置中以获得用于低温保存的HCDC制备物。

优选地，在将CPA添加到装置容积内的HCDC之前，进行至少一部分培养基从装置容积内部通过膜元件到装置容积外部的排放。然而，可选地，也可以至少部分地同时执行两个步骤和/或在排放培养基之后添加CPA。然而，后者不太可能，因为CPA也可能从装置容积中排放，这可能是不希望的。

所述系统允许CPA自动替代至少部分培养基，因为培养基通过膜元件并且通过排放口从装置容积的内部排放到外部，其中HCDC保留在装置容积的内部，同时或之后，将CPA添加到基本上在装置容积内部的HCDC中。

膜元件不仅可以用于通过CPA至少部分交换培养基，而且还可以用于将废物从装置容积的内部向外部排放，或者用于冲洗目的。

这些步骤可以例如基本上同时进行，使得装置容积内部活细胞的浓度在CPA交换至少一部分培养基的时间内基本上保持稳定。这可能是有利的，因为如果浓度变得太高，细胞可能潜在地变性。

所述系统可以提供用于高品质低温保存的HCDC制备物。优选地，所述系统的所有或至少大部分元件可以由控制单元控制和/或调节，使得它们的功能可以被自动地请求和/或启动。

此外，所述系统通过监测生理细胞状态，例如新陈代谢和细胞生长，帮助将细胞保持在有益状态，因此所述系统可以改进后续培养物的性能和再现性。因此，HCDC的生产可以更可靠，提供更高的再现性，更好的效率。换句话说，所述系统具有降低或甚至避免故障率，以及在种子培养处理中具有更高的成本效率的优点。因此可以降低或消除(高)可变性和性能波动的风险。

根据一个方面，转移单元被配置为将至少一部分具有CPA的HCDC从装置容积自动地转移到一个或多个接收装置中，以获得用于低温保存的HCDC制备物。换句话说，可以使用自动化过程来进行到接收装置的转移。

将具有CPA的HDCD自动地转移到装置容积中特别是指自主转移，即不需要调用或指示转移单元来执行转移步骤，而是独立地执行该步骤。可选地，转移步骤可以由控制单元启动。可选地或另外，至少一个开关控制物质从细胞扩增装置流向转移单元的至少一部分。开关可以手动和/或自动和/或通过控制单元的命令来控制。

根据一个方面，系统的多个元件与控制单元交换数据和/或由控制单元控制。特别地，以下中的至少两个与控制单元交换数据和/或由控制单元控制：细胞扩增装置，具有摇杆功能、平衡功能、加热功能和/或冷却功能的单元中的一个，转移单元，至少一个传感器，至少一个流量控制器，至少一个开关，至少一个端口和/或至少一个阀。

根据一个方面，特别表示为“选项B)”，所述系统还包括：

-离心单元，其用于离心具有培养基的HCDC，其中离心单元用于通过CPA至少部分交换培养基；

-由控制单元控制的至少一个转移单元，其用于将至少一部分具有培养基的HCDC转移到离心单元的至少一个离心容器中；以及

-其中控制单元被配置为基于是否满足标准来启动以下步骤：将至少一部分具有培养基的HCDC从装置容积转移到离心单元的至少一个离心容器中，用离心单元离心转移的具有培养基的HCDC，将离心的培养基与HCDC至少部分地分离，以及将CPA添加到HCDC中。

换句话说，系统用于低温保存的HCDC制备物的自动化生产，所述系统包括：

-细胞扩增装置，优选袋子，如一次性使用的袋子，其用于使分散在细胞扩增装置的装置容积内部的培养基中的HCDC生长；

-至少一个传感器(特别是电容探针)，其用于通过至少在时间上监测至少一个参数，特别是HCDC的电容来收集数据，其中所述参数指示HCDC的生理状态；

-离心单元(也称为离心机)，其用于离心具有培养基的HCDC，优选包括至少一个离心容器，优选几个离心管；

-由控制单元控制的第一转移单元(如管道系统)，其用于将至少一部分具有培养基的HCDC转移到离心单元的至少一个，优选几个离心容器中；以及

-控制单元，其用于处理收集的数据以确定监测的参数是否满足至少一个预定标准，其中所述控制单元被配置为基于是否满足所述标准来启动以下步骤：经由第一转移单元将至少一部分具有培养基的HCDC从装置容积转移到离心单元的至少一个离心容器中，用离心单元离心转移的具有培养基的HCDC；将离心的培养基与HCDC至少部分地分离或者从培养基中至少部分地分离HCDC；以及将低温保护剂CPA添加到HCDC中；以及任选地

-由控制单元控制的第二转移单元，其用于将至少一部分具有CPA的HCDC从离心单元转移到一个或多个接收装置中以获得用于低温保存的HCDC制备物。

本方面的优点在于通过在离心机中离心具有培养基的细胞将细胞与培养基分离。在物理分离之后，例如通过用优选由控制单元执行的针吸出至少一部分培养基，控制用于吸出培养基的针，将CPA添加到细胞中。该方面代表根据第一方面的分离的替代或补充方面，其经由膜元件执行。两个方面可以组合在一个单系统中。换句话说，离心机是任选的，如果在袋子中加入CPA，则不需要离心机，然而，它可能仍然存在于系统中，但不使用。然而，也不排除可能出现应用选项A)和B)产生HCDC制备物的情况。

所述系统包括至少一个转移单元，所述转移单元可以被配置为将具有培养基的HCDC转移到一个或多个离心容器(如离心管)中，该离心容器提供在离心机内。离心机内的离心管用于离心具有培养基的HCDC。可以至少部分地去除培养基，例如从离心容器中排放，并且将CPA添加到同一离心容器中，该离心容器随后也用于低温处理。如果几个离心容器也用于低温处理，则将含有培养基的HCDC转移到离心容器中的步骤可以等于将产生的和制备的HCDC的体积基本上等分的步骤，因为产生的HCDC的体积被分成较小的部分。

此外，所述系统可以包括由控制单元控制的第二转移单元，其用于将至少一部分具有CPA的HCDC从离心单元，特别是从至少一个离心容器转移到一个或多个接收装置中。CPA可以添加到离心容器内和/或接收装置内的HCDC中以获得用于低温保存的HCDC制备物。在这种情况下，离心容器与接收装置不相同。接收装置可以包括小瓶、容器和管中的至少一个。

在组合选项A)和B)的情况下，可能产生特定的优点。例如，可能的情况是一些细胞类型可能更适合一种系统类型，而其它细胞类型可能很好地适合另一种系统。例如，如果物质经由膜元件排放，而另一种物质被重新填充以替代排放的物质并控制细胞密度，则可以非常好地控制HCDC的浓度。一些细胞可能特别敏感，因此，在这种情况下，膜技术可能是优选的。对于其它类型的细胞，包括离心单元的系统可能更适合。为了提供高度的多功能性，因此有利的是组合这两个方面，使得系统可以被编程以选择更适合的技术，即膜或离心技术。根据一个方面，控制单元被配置为基于所收集的数据来决定哪种技术最适合HCDC。可选地，操作者可以满足该决定。

根据一个方面，传感器与细胞扩增装置形成整体单元，优选地，其中传感器被焊接到细胞扩增装置的至少一部分壁中，和/或其中传感器通过细胞扩增装置的端口插入到装置容积中。

优选地，传感器经由端口穿过细胞扩增装置的壁进入装置容积，其中传感器可以基本上物理接触物质。优选地，传感器是用于检测具有HCDC的肉汤的电容的电容探针。优选地，细胞扩增装置的壁至少部分地是袋子(特别是一次性使用的袋子)的外壳。

根据一个方面，膜元件与细胞扩增装置形成整体单元。

由于细胞扩增装置的特定目的或功能，将元件作为与细胞扩增装置的整体单元提供是有利的。细胞扩增装置可以是一次性使用的细胞扩增装置，其中与细胞扩增装置一体形成的元件也可以是一次性使用的元件，使得在使用之后可以设置整个细胞扩增装置和整体元件。与至少一个元件一体形成的细胞扩增装置可以被配置为用于消毒或杀菌。因此可以降低污染的风险。根据优选的方面，电容传感器与细胞扩增装置一体地形成，特别是布置在细胞扩增装置的外壳或内壳或壁上。根据优选的方面，细胞扩增装置包括基本上包括装置容积的袋子，特别是一次性使用的袋子。

可选地，可以将诸如传感器或膜的元件从细胞扩增装置中移除和/或添加到细胞扩增装置中。因此，可以重复使用未被配置为一次性使用的元件。此外，可能由于不同的材料要求，元件可以与细胞扩增装置分开消毒。

根据另一个方面，所述传感器包括以下中的至少一个：电容传感器、光学传感器、pH传感器、气体传感器、介电常数传感器、射频阻抗(RFI)传感器等，其中光学传感器可以被配置用于拉曼、红外和/或UV-vis光谱。根据一个方面，传感器使用基本上不影响或改变细胞扩增装置内的物理、化学和/或生物参数的基本上非侵入性方法。特别地，传感器被配置为监测至少一个参数，而不物理接触物质，特别是细胞扩增装置内的气体和/或液体。特别地，传感器被配置为监测来自细胞扩增装置外部的至少一个参数。

期望精确地监测HCDC的生理状态，因此，监测互补地指示HCDC的生理状态的几个参数是有利的。因此，可以避免对一个参数的误解，因为第二参数可以提供另外的信息来解释状态。

所述系统的优点在于传感器能够为过程链增加益处，因为可以在线监测过程。这允许在HCDC冷冻种子培养物产生领域中操作的多功能性和自由度。

根据一个方面，膜元件包括以下中的至少一种：膜过滤器、透析膜、亲水过滤器、疏水过滤器、微过滤器、纳米过滤器。膜元件可以被配置用于过滤、微滤、超滤或纳滤，其中过滤被认为是以约10μm或更大的孔径进行的，其中微滤被认为是以约0.1μm或更大的孔径进行的，其中超滤被认为是以约100nm至2nm的孔径进行的，并且其中纳滤被认为是以约2nm至0.5nm的孔径进行的。本文所述的膜元件优选地被配置为当物质从装置容积排放到外部时在装置容积内保留的所有存活的或不存活的细胞。因此，由于细胞可以具有约1至30μm的典型直径，因此膜元件优选地被配置为允许至少微滤或超滤。

优选地，膜元件对于HCDC是基本上不可渗透的，并且对于液体、对于培养基、对于进料培养基和CPA是基本上可渗透的。因此，当液体从装置容积中排放时，可以保留HCDC。

根据又一方面，控制单元被配置为基于监测的参数自动地控制至少一个第二参数，其中第二参数优选地被配置为控制和/或调节HCDC的生理状态。

特别地，至少一个第二参数是系统特定参数，其基本上不指示HCDC的生理状态，但是可以调节生理状态。优选地，至少一个第二参数包括以下中的至少一个：摇摆频率，搅拌频率，温度，进料培养基的浓度，例如培养基的盐浓度、氧浓度、质子浓度，压力，可以暴露HCDC的光等。例如，考虑到上述情况，可以例如通过控制单元来控制第二参数，其中控制摇摆和/或搅拌频率、温度和/或压力。特别地，可以优选通过控制单元来控制以下中的至少一种：流入装置容积的新鲜培养基、进料培养基、pH校正剂、气体如氧气、缓冲液、盐水溶液或可能适于控制HCDC的生理状态的其它物质。

根据另一个方面，细胞扩增装置，传感器，离心单元，包括袋子、管和/或小瓶的接收装置以及至少一部分转移单元中的至少一个是一个或多个一次性使用的元件和/或一次性使用的消耗品。系统的一部分也可以是单个元件，其可以用于重复使用，用于一次性使用，用于移除和/或交换。

一次性使用的离心机或构造成一次性使用元件的任何其它元件降低了污染装置容积内物质的风险。一次性使用的离心机和/或元件特别被配置为无菌的。

根据一个方面，方法是用于低温保存的高细胞密度种子培养物制备物，即HCDC制备物的自动化生产的方法，其包括以下步骤：

-使HCDC在细胞扩增装置的装置容积内的培养基中生长；

-通过至少在时间上监测至少一个参数来收集数据，其中所述参数指示HCDC的生理状态；

-将收集的数据发送至控制单元；

-由控制单元处理收集的数据至少包括确定监测的参数是否满足至少一个预定标准；以及

-基于监测的参数是否满足至少一个预定标准来控制低温保护剂CPA至少部分交换所述培养基。

如果在本文反映了相应的特征和方面，则可以应用所有先前提及的技术效果和优点。

根据一个方面，所述方法包括基于监测的参数是否满足至少一个标准：

-由控制单元启动包括以下的步骤：

选项A)

-经由用于将HCDC保留在装置容积内的膜元件以及经由排放口从所述装置容积排放至少一部分培养基，

-将低温保护剂CPA添加到所述装置容积中的HCDC，以及

-将CPA中的至少一部分HCDC从所述装置容积转移到一个或多个接收装置中以获得用于低温保存的HCDC制备物，和/或

选项B)

-将至少一部分具有培养基的HCDC从所述装置容积转移到离心单元的至少一个离心容器中，

-用离心单元离心转移的具有所述培养基的HCDC,

-将离心的培养基与HCDC至少部分地分离，

-将CPA添加到HCDC中以获得用于低温保存的HCDC制备物，优选地，其中

将至少一部分具有所述CPA(a)的HCDC(2)从所述离心容器转移到一个或多个接收装置(7a)中以获得用于低温保存的HCDC制备物，优选地，其中自动地进行将至少一部分具有所述培养基(b)的HCDC(2)从所述装置容积(V)转移到至少一个离心容器中和/或将至少一部分具有所述CPA(a)的HCDC(2)从所述离心容器转移到一个或多个接收装置(7a)中的步骤。

换句话说，根据一个方面，方法是用于低温保存的高细胞密度种子培养物制备物，即HCDC制备物的自动化生产的方法，其包括以下步骤：

-使HCDC在细胞扩增装置的装置容积内的培养基中生长；

-通过至少在时间上监测至少一个参数来收集数据，其中所述参数指示HCDC的生理状态；

-将收集的数据发送至控制单元；

-由控制单元处理收集的数据至少包括确定监测的参数是否满足至少一个预定标准；

基于监测的参数是否满足至少一个标准：

-由控制单元启动包括以下的步骤

选项A)，其包括：

-通过用于将HCDC保留在装置容积内的膜元件以及通过排放口从所述装置容积排放至少一部分培养基，

-将CPA添加到HCDC中，即向装置容积中的HCDC提供低温保护剂CPA，这可以将CPA填充到HCDC的装置容积中，以及

-将CPA中的至少一部分HCDC从所述装置容积转移到一个或多个接收装置中以获得用于低温保存的HCDC制备物，和/或

选项B)，其包括：

-将至少一部分具有培养基的HCDC从装置容积转移到离心单元的至少一个离心容器中，

-用离心单元离心转移的具有培养基的HCDC,

-将离心的培养基与HCDC至少部分地分离，以及

-将CPA添加到HCDC中，即向HCDC提供CPA，这可以是将CPA填充到HCDC的离心容器中和/或如果将HCDC转移到接收容器中，则将CPA填充到接收容器中，以获得用于低温保存的HCDC制备物。

参考选项B)，将CPA添加到HCDC中的步骤可以包括将CPA填充到HCDC的离心容器中，特别是当离心容器用于储存和/或低温处理时。可选地或另外，将离心的培养基与HCDC至少部分地分离的步骤可以包括将HCDC从至少一个离心容器至少部分地转移到至少一个接收装置中，任选地包括等分至少一部分HCDC。例如，当HCDC在至少一个离心容器内和/或在接收装置内时，在这种特定情况下，可以将CPA添加到HCDC中。

根据另一个方面，所述方法还包括基于监测的参数自动地控制至少一个第二参数，其中第二参数优选地被配置为控制和/或调节HCDC的生理状态。

根据另一个方面，所述方法还包括基于监测的参数，由控制单元自动控制至少一个第二参数，其中第二参数被配置为用于控制和/或调节HCDC的生理状态。

根据另一个方面，收集的数据的处理包括通过将函数和/或函数的模型建立拟合到至少一部分收集的数据以获得拟合结果来自动地分析收集的数据。

根据理论自动地拟合函数帮助容易地分析收集的数据。作为一个实例，理论可以例如包括在一段时间内细胞的指数生长。因此，例如，适时反映细胞生长的至少一部分收集的数据可以通过对它们拟合指数函数来分析。例如，基于拟合结果，可以进行生长的预测和/或评估。基于此，可以调用根据任一个方面的系统的元件的功能。例如，可以由控制单元启动进料培养基的流入。

根据另一个方面，基于对拟合结果的自动分析来确定监测的参数是否满足至少一个预定标准。

类似地，根据前述方面的系统中的一个，特别是这种系统的控制单元被配置为基于通过对至少一部分收集的数据拟合函数来自动分析收集的数据以获得拟合结果，并且优选地自动分析拟合结果，来确定监测的参数是否满足至少一个预定标准。

例如，分析拟合结果的步骤可以包括计算至少一个导数以及将该导数与预定值进行比较。如果导数超过预定值，则控制单元可引起诸如启动新鲜培养基和/或进料培养基和/或CPA流入装置容积和/或通过引起装置容积和HCDC的冷却而终止细胞生长的动作。

根据另一个方面，所述方法还包括低温保存HCDC制备物的步骤，即在一个或多个接收装置中用CPA基本上冷冻和/或冷却HCDC以获得低温保存的HCDC，如在管中低温保存的HCDC的等分试样。

类似地，所述系统可以包括用于低温保存HCDC制备物的低温保存单元。

因此，根据上述任一方面的方法或系统可以包括低温处理的步骤，特别是自动化步骤。如果该步骤是自动化的，则它具有满足精确预设条件的优点，该条件例如被发现是最佳的。获得高品质低温保存的HCDC的再现性特别高。例如，低温保存的HCDC的品质可以取决于精确的低温处理方案，其可以包括在生产或制备HCDC制备物与低温处理之间经过的时间，和/或逐步或立即或即时的低温处理过程。

根据另一个方面，所述方法还包括在至少一个迭代步骤中确定获得的HCDC制备物的品质以及

-改变要由监测的参数满足的预定标准和/或

-改变至少一个第二参数；以及

-重复根据任何方面的方法，特别是直到获得最佳品质。

获得的HCDC制备物的品质可以例如包括在解冻之后低温保存的HCDC制备物的活细胞密度。预定标准可以是例如刚好在低温处理之前活细胞密度所超过的阈值。阈值可能不一定与品质线性相关。因此，可以改变该阈值以确定在解冻之后可以获得最佳品质的阈值。

根据另一个方面，所述方法还包括在低温保存之前或之后确定获得的HCDC制备物的品质，以及改变至少一个第二参数中的至少一个，以及根据任何方面重复所述方法，特别是直到获得最佳品质的至少一个迭代步骤。

提供自动确定理想条件的系统和方法是有利的，在该理想条件下产生高品质的HCDC制备物。例如，操作者可以要求系统在低温处理之前或之后改变温度、添加的CPH的量或浓度、添加的进料培养基的量、添加的氧的量、盐和/或营养物浓度和/或可以影响HCDC制备物的生理状态和品质的任何其它相关参数。因此，根据本方面的方法和相关系统的精度高，并且帮助找到可以获得高品质HCDC的最佳条件。

上述方面特别适用于基于哺乳动物细胞培养的生物过程，所述生物过程使用在线传感器来确定用于启动用于低温保存的细胞处理的理想时间点。考虑到细胞密度与在线传感器信号(如电容)的良好相关性，可以考虑其它可能的应用领域，如微生物应用和/或干细胞应用。

在下文中，将详细描述一些示例性实施方案，其中不应将本发明理解为限于所描述的示例性实施方案。在特定实施方案中描述的单个特征可以任意组合，只要它们不互相排除。此外，在示例性实施方案中一起提供的不同特征不应被认为是对本发明的限制。

附图简述

图1是根据一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统的示意图；

图2是根据另一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统的示意图；

图3是根据另一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统的示意图；

图4是根据一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统的一部分的示意图；

图5是根据一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统的另一部分的示意图；

图6是根据另一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统的一部分的示意图；

图7是用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的方法的示意图；以及

图8是根据测量的电容绘制的活细胞浓度的示例性图。

示例性实施方案的详细描述

图1是根据包含选项A)的实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统10A的示意图，其中膜元件1a用于生产HCDC制备物。扩增装置1提供在单元4b上，优选是具有摇摆功能的摇杆，其可以与加热和/或冷却功能、平衡功能和/或磁力搅拌器功能组合。单元4b可以由控制单元5控制，并且可以向控制单元5发送数据和/或接收来自控制单元5的数据。

扩增装置1包括用作例如用于液体和/或气体物质的入口的端口1e,1k，用作无细胞物质的出口的端口11和用作含细胞物质的出口的端口1j,1k。端口1j与路径11₃，例如管道流体连接。端口1h,1i主要用作气态物质的入口和/或出口。另一个端口1i用于第二传感器3b。另外的端口可以布置在扩增装置1上，例如用于光学测量的端口也可以布置在扩增装置1上。所有端口可以由手动和/或自动地打开和/或关闭，由控制单元5控制。所有端口可以包括阀和/或过滤器、打开和/或关闭机构。

扩增装置1包括外壳1b或壁，其包括底部部分1d和顶部天花板部分1c。扩增装置1包括用于接收和储存HCDC2的装置容积V，并且其中HCDC2可以生长以达到优选的活细胞密度。HCDC细胞2(为了简单起见，仅称为HCDC2)可以分散在培养基b中。包含HCDC2和培养基b的物质可以被认为是所谓的肉汤。如果肉汤基本上完全填充装置容积V，则肉汤具有可以等于装置容积V的体积V_HCDC。然而，可能还有气体占据装置容积V中的空间。气体可位于肉汤上方并具有体积Vgas。气体可以通过入口和/或出口1g进入或离开。入口和/或出口可具有至少一个阀功能，以使气体仅沿一个方向向内或向外通过。可以通过将气体通过入口1g填充到装置容积V中来建立气压，并且可以通过出口1g释放压力或者通过出口1g吸出气体来降低气压。气体可以包括例如氧气和/或CO₂。入口和/或出口1g可以包括过滤元件1i,1h。过滤元件1i,1h可以例如保护装置容积V免受来自外部的污染。

装置容积V通过至少一个端口1e流体连接到物质a,b,c(新鲜的液体培养基b，为简单起见表示为培养基，基料和/或营养物进料培养基c和CPA)的储器。物质a,b,c的储器共享公共端口1e，其通过公共路径L₁连接到装置容积V中。物质a,b,c的储器可以可选地通过连接到细胞扩增装置1上的单独端口的单独分支与装置容积V流体连接。例如，当控制单元5在不同的时间和/或同时启动每个单独的物质a,b,c的流动时，物质a,b,c可以单独地并且根据需要流入装置容积V。物质a,b,c的储器布置在单元4a上，该单元4a可以具有以下功能中的至少一种：摇摆、加热、冷却、平衡和磁力搅拌。单元4a可以由控制单元5控制，并且可以向控制单元5发送数据和/或接收来自控制单元5的数据。例如，当参数满足预定标准时，结果是控制单元5可以使流量控制单元11₁具体地驱动CPA(物质a)从储器进入装置容积V。预定标准例如可以是活细胞浓度的预设或预定阈值。当参数(其可以是电容)指示活细胞浓度超过阈值时，CPA(物质a)流入装置容积V由控制单元启动。在该步骤之前，例如，控制单元5可以通过在该特定情况下具有加热功能的单元4a将CPA(物质a)加热到适合的温度。

可以通过提供在细胞扩增装置1的外壳1b上或外壳1b处的电极传感器3a至少在一段时间内监测HCDC2的生理状态。电极传感器是电容传感器3a并且被配置为记录指示HCDC2的生理状态的电容，因为电容在至少一个电容范围内与活细胞密度基本上线性相关。电容传感器3a包括数据传输单元3d，其用于将包括适时测量的电容的收集数据传输到控制单元5。数据传输单元3d可以是数据线或无线连接，例如蓝牙或因特网等。

此外，至少第二传感器3b用于监测至少一个另外的参数。在本图1中，第二传感器3b通过传感器端口1f从外壳1b的外部到达装置容积V的内部。第二传感器3b布置在顶部天花板部分1c上。在当前情况下，第二传感器3b可以是pH传感器，其被配置为监测肉汤内的pH。除了电容传感器3a之外，第二传感器还可以提供补充信息。该信息可以帮助更精确地评估HCDC2的生理状态和/或可以帮助预测由于第二参数如pH与HCDC2的生理状态之间的已知相关性而引起的变化。第二传感器3b还包括数据传输单元3c，其用于将包括适时测量的第二参数(如pH)的收集数据传输到控制单元5。数据传输单元3c也可以是数据线或无线连接，例如蓝牙或因特网等。

特别地，基于选项A)的系统10A包括膜元件1a，在本实例中，膜元件1a可以是基本上布置在装置容积V内的膜过滤器以将HCDC与作为无细胞收获端口的排放口11基本上分离。排放口布置在扩增装置1的底部上，以使装置容积与外部基本上流体连通。然而，当肉汤的物质，例如培养基b从装置容积V的内部向外排放时，膜元件1a将HCDC保留在装置容积V内。排放的物质通过路径L₂被引导到容器20a中，例如用于回收物质的箱或容器。物质的流动可以由第二流量控制器11₂控制。第二流量控制器11₂可以被配置为产生用于通过排放口11和膜元件1a吸出物质的负压。第二流量控制器11₂也可以由控制单元5控制。

当控制单元5启动细胞收获时，例如当达到或超过活细胞密度的阈值时，可以打开端口1j，并且可以沿着路径L_3a将优选包含HCDC2和CPA(物质a)的物质从装置容积V引导到分配单元8。第三流量控制单元11₃可以被配置成产生用于通过端口1j吸出物质的负压。第三流量控制器11₃优选地也由控制单元5控制。分配单元8等分物质，即将以等体积划分的含有HCDC2和CPA(物质a)的物质分配到用于储存和冷冻物质的管7a中。控制单元5可以控制物质被划分的量和比率。此外，由控制单元5控制的机构可以密封管7a，以防止物质从管7a泄漏出来。含有包含HCDC和CPA的物质的管可以被认为是HCDC制备物，特别是用于低温保存的HCDC-等分试样。然后通过使用低温单元9来冷冻含有物质的单个管来低温处理HCDC制备物，该冷冻单元9在目前情况下是冰柜。低温处理的HCDC等分试样可以被认为是低温保存的HCDC制备物7b。低温保存的HCDC制备物7b可以随后根据需要解冻以将细胞用于其它目的。

如图1所示的选项A)基于以下步骤：将无细胞物质(如培养基b)从装置容积V经由膜元件1a和排放口11排放到外部，而将CPA(物质a)，例如CPA溶液，如DMSO从储器填充到HCDC2的装置容积V中以至少部分地替代已经从装置容积V排放的物质的体积。该过程的产物可以基本上是HCDC和CPA的混合物，或者它可以基本上是CPA(物质a)、HCDC和培养基(物质b)的混合物和/或碱和/或营养物进料(物质c)的残余物。

图2是根据另一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统10B的示意图。系统10B依赖于选项B)，其基于使用离心机将至少一部分培养基b与添加了CPA(物质a)的HCDC2分离。然而，本示例性系统10B还包括膜元件1a，然而膜元件1a在纯选项B)中不用于将培养基b与HCDC2分离。因此，本系统10B不包括装置容积V与CPA(物质a)的储器之间的流体连接。仅物质b和c，培养基和基料和/或营养物进料，即进料培养基，可以被转移到装置容积V中。如果需要控制单元5来停止或减缓生长，则装置容积V内包括例如进料培养基c的物质可以经由排放口11和膜元件1a从装置容积V中无细胞地排放。或者，细胞扩增装置1也可以是没有膜元件1a的细胞扩增装置1。

在非常适于收获HCDC2的细胞的时刻，例如当达到高活细胞浓度时，控制单元5启动包含HCDC2和培养基b的物质从装置容积V经由路径L₃和L_3b流入离心机的至少一个或多个离心容器，其中离心容器优选布置在离心机内部。控制单元5可以控制第三流量控制器11₃以产生负压，从而使物质流动。离心容器可以例如包括离心管。

离心机6由控制单元5控制。控制单元5特别启动离心物质以使HCDC2的相和培养基b的相彼此分离的步骤。优选地，离心机6是一次性使用的离心机。培养基b至少部分地与HCDC2物理分离，即从离心容器被引导到离心机6外部的另一容器20b中。这特别是也由控制单元5控制。在将至少一部分培养基移入容器20b之后，将CPA(物质a)添加到HCDC2中。潜在地，还将新鲜培养基和/或缓冲溶液添加到HCDC2中。这可以例如通过添加到离心容器中来进行。在目前情况下，可以添加到离心的HCDC中的物质a,b布置在单元4c上，所述单元4c可以被配置为调节物质a,b。单元4a可以特别地用作摇杆和/或天平和/或磁力搅拌器和/或温度调节器。

在添加CPA(物质a)之后，控制单元5可以使由第四流量控制器11₄调节的包括HCDC2和CPA的物质流被引导到分配单元8。

可选地，小瓶，如离心管也用于HCDC制备物的低温处理。在该特定情况下，将CPA添加到离心管中以获得用于低温处理的HCDC制备物。

其它步骤，如低温处理可以基本上类似于系统10A)中已经描述的步骤。

图3是根据另一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统10C的示意图。系统10C包括在系统10A和10B中实现的所有方面，特别是分别反映在图1和图2中的选项A)和B)。控制单元可以在两个选项A)和B)之间切换，即使用膜元件1a或离心机6用于至少部分地分离培养基b与HCDC2的操作模式。甚至可以是这两种操作模式并行运行的情况，例如当两种不同的物质应当用作CPA时，其中使用选项A)添加一种CPA，并且使用选项B)添加第二种CPA。

图4是根据一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统30A的一部分(a part/a section)的示意图。所述系统的部分类似于上述系统10A-10C的前部。该方案可以特别指系统，因为其通常用于生产HCDC制备物。

在本文中，物质a,b,c，即用作CPA(物质a)的冷冻培养基，培养基(物质b)和基料和/或营养物进料(物质c)的储器各自与装置容积V流体连接。物质a和b共享进入装置容积V的公共端口，其中物质c由单独的端口引导进入装置容积V。

图4包括扩增装置1的俯视图。膜元件1a布置在排放口正下方扩增装置1底部的扩增装置1位置的中心，使得当诸如培养基b的物质从装置容积V排放时，排放口被覆盖，HCDC的细胞基本上保留在装置容积V中。换句话说，膜元件1a(其在此处是膜)被密封到细胞扩增装置1(在目前情况下，它是袋子)的内底部。容器20a的无细胞收获线路基本上直接附接在膜元件1a上。袋子1位于摇杆4b上，摇杆4b被配置为用于摇动袋子1并控制袋子1内的温度以及用于搅动(摇杆是加热线圈并提供传感器)。

袋子1通常提供四个或五个端口，其中路径或线路从装置容积V(即袋子容积)朝向外部流体连接。

此外，三个排气过滤器1h,1i布置在袋子1的两个端口处或两个端口上，用于过滤气体，该气体例如可以是空气，该空气被引入装置容积V或从装置容积V释放。电容探针3a布置在袋子1上。电容探针3a可以与肉汤物理接触，所述肉汤包括装置容积V内的培养基b和HCDC2；或者它可以被附接，使得不允许直接物理接触。电容探针3a可以将数据传输到控制单元5(也称为控制系统)。另外的传感器3b，例如气体传感器和/或pH探针到达装置容积V内以检测诸如气体浓度和/或pH的参数。这些记录的数据也被传输到控制单元5。

控制单元5被配置为控制包括装置容积V内pH、温度、氧浓度中的至少一个的参数，而且还控制摇杆4b所用的摇摆速度和角度。此外，控制单元5被配置为触发一个过程，其中该过程的步骤基于在线信号，即与在某个时间段上测量的参数相关的数据，并且该数据被基本上即时地传输到控制单元5。

端口1k可以引导含有HCDC2和培养基b和/或CPA(物质a)的肉汤经由路径朝向具有汲取管(dip tube)的管，其用于填充、用于接种和/或用于细胞转移以供进一步处理。

线路L₃是细胞样品线路，其可以基于选项A)或选项B)将肉汤引导朝向系统的其它区段和/或单元。细胞样品线路可以是用于取样的汲取管，即装置容积V内部的管。

图5是根据一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统30B的另一部分的示意图。部分30B可以与参照图4所述的部分30A直接连接。例如，作为细胞样品线路的线路L₃可以朝向部分30B引导。该部分基于上述选项A)，其中膜元件已经用于将至少一部分培养基与HCDC分离，以及通过将CPA填充到装置容积V中来替代至少一部分排放的培养基。换句话说，选项A)包括利用内置膜在袋子内进行培养基交换。

包括用于均匀液体分配8a的一次性使用的歧管的分配单元8用于等分或划分包含HCDC和CPA的物质，并将划分的物质填充到单个容器、管7a和/或器皿中。分布可以由布置在朝向管7a的每条线路上的快速密封特征8b支撑。部分8,8a,8b和线路可以被认为是转移单元。包括填充机构的分配或传输基于反馈信号，例如袋子重量。

图6是根据另一个实施方案的用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的系统30C的一部分的示意图。部分30C可以是除了与参照图4所述的部分30A直接连接的部分30B之外的或代替与参照图4所述的部分30A直接连接的部分30B。例如，作为细胞样品线路的线路L₃可以朝向部分30C引导。该部分基于上述选项B)，其中离心机用于将至少一部分培养基与HCDC分离，以及通过同时或之后将CPA添加到HCDC中来替代至少一部分分离的培养基。换句话说，选项B)包括使用离心进行培养基交换。

基本上，上面参照图5描述的部分30B包括在部分30C中。如果分别基于选项A)和选项B)的两个系统部分在一个系统中实现，则因此可以共享部分30C，使得开关可以在绕过离心机的旁路L_3a与离心机之间切换。线路L_3b将来自装置容积V的肉汤引导至一次性使用的离心机6，特别是位于离心机6内部的离心容器。具有物质a(即CPA)的低温培养基储器以及用于培养基b、缓冲液等的储器与离心容器流体连接。此外，离心容器与另一个容器(未示出)流体连接，所述另一个容器用于储存例如从离心容器中排放的与HCDC分离的培养基。离心机还通过线路L_3c与分配单元的一次性使用的歧管8a流体连接，该分配单元已经在上面参照图5进行了描述。可能的是在基于选项A)和选项B)的组合系统中，线路L_3a和L_3c基本上在一次性使用的歧管8a之前或在一次性使用的歧管8a之中相遇或流体连接。在一次性使用的歧管8a之后的部分可以与参照图5描述的相应部分相同。

小瓶或管7a包括用于冷冻的临时端口(temp-port)7c和第二线路7d。

图7是用于自动化生产(低温保存的)HCDC制备物的方法100的示意图。方法100允许生产和制备低温处理的，即低温保存的HCDC制备物，它们在这种特定情况下是HCDC等分试样。HCDC制备物可以包含一定量的基本上未划分的HCDC，而HCDC等分试样是指HCDC制备物的许多划分中的一个。等分试样优选包含约1μl至10ml，优选约5μl至1ml，更优选约20μl至0.5ml的体积。方法100基本上从包括细胞扩增101的步骤开始。起始细胞在装置容积细胞扩增装置中与培养基和/或进料培养基组合。

在非常适合的时刻，例如当活细胞密度理想时，进行将CPA添加到HCDC中的步骤(102)。该步骤可以包括去除，特别是通过排放口和膜排放培养基，同时将HCDC保留在装置容积内。CPA可以至少部分地替代排放的培养基的体积。优选地，排放的培养基的体积基本上由添加的CPA替代，因为在这种情况下，细胞浓度，特别是活细胞浓度可以保持稳定。可选地或另外，步骤102可以包括离心具有培养基的HCDC，例如通过排放和/或吸出培养基将HCDC与至少一部分培养基物理分离，以及将CPA添加到HCDC中。同样在这种情况下，排放或吸出的培养基的体积优选基本上被CPA的加入替代，因为在这种情况下，细胞浓度，特别是活细胞浓度可以保持稳定。

特别参考选项A)，在使用膜元件至少部分地排放培养基的情况下，CPA的添加(102)之后是将具有CPA的HCDC转移到小瓶和/或容器中以用于低温储存的步骤。在图7的目前方法中，转移步骤包括将具有CPA的HCDC等分成具有CPA的HCDC的生成体积的较小体积部分(103)。换句话说，已经生成和制备的体积被分成较小的体积并被转移，例如填充到小瓶、(储存)容器和/或管，如适于冷冻的聚合物管中。

可选地，可以在添加CPA之前已经进行了等分步骤，特别是参考选项B)。在这种情况下，将HCDC和培养基转移，特别是等分到用于离心和低温处理的离心容器中。可以在等分步骤之后将CPA添加到离心容器中。

然而，即使在选项B)的情况下，可以在添加CPA之后进行等分(103)或第二等分，特别是当具有CPA的HCDC从离心容器转移到接收容器中时。

在小瓶、器皿、容器和/或管中等分的具有CPA的HCDC可以被认为是HCDC制备物，特别是用于低温处理的HCDC等分试样。包括冷冻HCDC等分试样的步骤的低温处理步骤(104)是图7中描述的示例性方法的最后步骤。

图8是根据测量的电容绘制的活细胞浓度的示例性图。在本实例中，用于收集数据的至少一个传感器包括电极传感器，特别是电容探针或电容传感器。电容探针至少在时间上监测至少一个参数，即包括HCDC的装置容积内的物质的电容。该参数表示HCDC的生理状态，因为活细胞密度指示至少在所示电容范围(约5至400pF/cm)内与测量的电容的增加的线性相关性。线性相关由虚线表示。换句话说，测量的电容是活细胞密度(VDC)的直接线性指标，其中VDC被认为是也是描述HCDC的生理状态的维度。

在灌注过程中，活细胞密度与在线信号如电容之间存在非常好的相关性，因为与标准补料分批过程相比，细胞不会扩增太多。图8的图是指对于不同RM袋子大小的CHO细胞的活细胞密度(VCD)-电容相关性。

电容探针，如BioPAT ViaMass，非常适合在线监测活细胞密度，而不与袋子发生物理相互作用。该传感器平台允许自动确定用于进一步处理培养物的理想时间点，替代的传感器解决方案(以及其它)将是拉曼光谱测定法。除此之外，另外的和补充的传感器帮助在线确定底物或产物浓度。通过将营养物水平保持在理想条件下，可以防止诸如营养物损耗的抑制性工艺条件。此外，可以确定细胞比消耗或生产速率以及比生长速率(与活细胞密度读数相结合)并将其用作细胞状态的指标。例如，拉曼光谱法和基于酶的在线传感器(例如BioPAT Trace)将能够提供相关的底物和产物浓度。

给出了在本文中使用的以下定义和用于更好理解本发明的示例性的进一步描述：

术语“高细胞密度种子培养物”(HCDC)是指具有高密度细胞，特别是活细胞，即至少是活细胞的体积浓度的细胞培养物。优选地，HCDC包含至少约5Mio.细胞/mL(5x10⁶个细胞/mL)，优选至少约20Mio.细胞/mL(20×10⁶个细胞/mL)，更优选至少约100至120Mio.细胞/mL(20×10⁶个细胞/mL)，其中细胞优选是活的。然而，该术语也可以指HCDC的最开始生长，即，当例如每mL只有数百或数千个活细胞开始生长以培养上述意义上的HCDC。因此，本文所用的术语HCDC也可以指细胞培养物，其处于任何生长状态，目的是具有上述意义上的高密度的活细胞。

术语“细胞培养”优选是指细胞在受控条件下，通常在它们的天然环境之外，即非原位(ex situ)生长的过程。在从活组织中分离细胞之后，随后可以将它们保持在仔细控制的条件下。这种条件可以根据每种细胞类型而变化，但通常它们可取决于适合的器皿，例如细胞扩增装置，其具有提供必需营养物，特别是氨基酸、碳水化合物、维生素和/或矿物质的底物或培养基。此外，该条件可能与生长因子，激素和气体如CO₂和O₂，以及物理化学环境，特别是pH缓冲液，渗透压和/或温度有关。

一些细胞需要表面或人工基底(特别是贴壁或单层培养物)，而其它细胞可以在培养基中自由漂浮地生长(悬浮培养)。优选地，本文提及的细胞可以在培养基(culturemedium)中自由漂浮地生长，所述培养基被称为“培养基(medium)”。大多数类型的细胞的寿命是基因确定的，但是一些细胞培养细胞已经被“转化”成永生细胞，如果提供最佳条件，其将无限繁殖。因此，细胞的寿命和繁殖率可以变化。

本文所述的“HCDC制备物”被认为是基本上准备好用于低温处理，并且通过根据任何一个方面的系统和方法之一产生的产物。“HCDC制备物”优选在连续操作中产生。也可能的是HCDC制备物在分批操作或补料分批操作中产生。通常，可以在以下各项之间进行区分：

-分批操作：用细胞和物质填充反应器，在细胞扩增过程期间无添加或移除，基本上外部控制参数，污染是不太可能的；

-补料分批操作：与分批操作类似，然而，例如可以在细胞扩增过程期间添加选定的底物；

-连续操作：底物添加和产物去除细胞扩增过程，参数控制，不能排除污染。

基本上准备好用于低温处理的HCDC制备物优选是包含HCDC和CPA的物质。该物质还可以包括细胞在其中生长的培养基的剩余部分。物质体积的至少一部分储存在一个或多个接收装置中。优选地，在低温处理之前，物质体积被分成多个部分的被填充到管中的小体积。物质体积在低温处理之前基本上是液体，并且在低温处理之后可以基本上是固体。凝固点，即物质可变成基本上固体的温度可偏离水的凝固点，即在正常条件下约0℃。

“低温保存的HCDC制备物”被称为低温处理之后的HCDC制备物，即冷却至一定温度，特别是冷冻的HCDC制备物。

与“低温保存”基本相同的术语“低温处理”是指冷却，特别是冷冻包含HCDC和CPA的物质的过程。该过程可以是逐步冷冻物质。例如，可以将物质从室温冷却至约4℃(典型的冰箱温度)和/或冷却至约-6至-20℃(典型的冰柜温度)和/或冷却至约-78.5℃(干冰的升华点)和/或冷却至约-196℃(液氮的沸点)。低温处理也可以指将物质冷却至一定温度的突然步骤，例如从约室温冷却至约-196℃。在低温处理之前，可能需要或有利地制备用于低温处理的物质的任何其它步骤，如添加其它化合物。

包含HCDC和CPA以及可能的培养基和/或其它化合物的小部分体积的物质在本文中被称为等分试样或HCDC等分试样。

监测过程特别包括检测、记录和可能但不一定显示过程的至少一个参数，特别是指示过程状态的参数。监测还指至少在时间上收集一组数据。可以通过在一段时间内的连续数据收集或者通过离散数据收集(即，仅在离散时间点的数据收集)来进行监测。

术语“在线监测”特别是指检测至少一个参数，其基本上实时地指示生物过程的状态，特别是细胞培养物(在本文中为HCDC)的生理状态。换句话说，过程永久地改变了HCDC的状态。利用在线监测，检测至少一个参数，即测量至少一次，但优选地，在一段时间内或至少几个不同的时间内检测该参数。该测量基本上是瞬时的，即指示瞬时状态的测量结果可以基本上同时获得，即在状态基本上没有变化的时刻获得。

术语“活细胞密度”特别是指每体积基本上活的细胞的密度。

术语“传感器”特别是指被配置为感测、探测或检测至少一个参数或物理尺寸、数量、变量或值的探测器和/或探针。

术语“与排放口一起布置的膜元件”特别是指膜元件布置在装置容积内和排放口前面，例如覆盖排放口，使得当至少一部分培养基通过膜元件从装置容积排放时，保留了装置容积内的HCDC。然而，膜元件也可以布置在装置容积内，以将装置容积分成两个装置容积隔室，即第一隔室和第二隔室，其中排放口布置成使得当排放口打开，例如以通过排放口从第一隔室排放物质时，可以在两个隔室之一的外侧和内侧之间产生流体连接。在该特定情况下，如果物质例如来自第二隔室的液体可以通过膜元件扩散，则该物质也可以被排放。

低温保护剂(CPA)，通常也称为冷冻保护剂，优选包括以下中的至少任一种：二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、海藻糖、蔗糖、丙二醇和2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)。CPA在低温处理期间保护细胞免于变性，使得大量低温保存的细胞在解冻之后可以用作基本上活的细胞。

在本文中被认为是生长培养基的培养基优选包含碳源，如葡萄糖，水，各种盐，特别是缓冲培养基，氨基酸源和氮源。进料培养基可以例如包含类似的物质，其中营养物可以以较高的浓度存在。在本文中，培养基被认为是基本上液体的培养基。支持细胞生长或具有与HCDC的生理条件或状态相关的功能的所有物质可以包含在培养基和/或进料培养基中。可选地，也可以将基本上仅包含离子，即盐和水的缓冲液认为是培养基。培养基甚至可以被认为是没有任何化合物的水。

短语“监测参数满足至少一个预定标准”是指例如由操作者选择的设置。操作者优选地选择活细胞密度的阈值，在该阈值处启动处理步骤。例如，当HCDC达到约20×10⁶个活细胞/ml的活细胞密度阈值时，可以将新鲜的进料培养基引入装置容积。例如，当HCDC达到约80×10⁶个活细胞/ml的活细胞密度阈值时，可以将新鲜的培养基引入装置容积。例如，当HCDC达到约100×10⁶个活细胞/ml的活细胞密度阈值时，可以在诸如一部分培养基的物质从装置容积中排放的同时或之后将CPA引入装置容积中。可选地或另外，根据理论(例如，指数生长理论)的函数由控制单元自动地拟合成作为时间的函数的活细胞密度。作为阈值的替代或除了阈值之外，至少一个预定标准还可以包括拟合函数的导数的值。

接收单元优选为袋子、小瓶、管或容器。转移单元优选地包括用于夹持的单元，无菌适配器和/或密封单元。低温单元特别包括受控的无速率冷冻单元或非受控速率冷冻。转移单元优选地包括分配单元8以及引导物质离开装置容积L3a,L3b和/或朝向分配单元L3a,L3c的路径中的至少一个。

在低温处理之后，低温保存的HCDC制备物可以转移用于中期储存或长期储存，以供最终用户按需使用。

装置容积V和装置容积V内的物质体积优选为约0.5l至150l，优选约0.75l至50l，更优选约1l至25l。

流量控制装置优选地包括流量计、天平、校准泵中的至少一种。

液体转移装置优选地包括泵、气动、重力、天平、压力驱动单元中的至少一种。

分配单元优选地包括多通阀、歧管中的至少一种。

为了更好地理解本发明，以下描述了根据几个方面的方法和系统：

用于产生冷冻的HCDC种子培养物的基本示例性步骤可以是：

1.细胞扩增，其包括HCDC的生长以产生足够量的细胞/体积；

2.将低温保护剂CPA应用于细胞以制备或保存它们用于冷冻；

3.将限定的细胞体积等分到用于冷冻的器皿中，即划分产生的HCDC的体积；

4.细胞的冷冻。

用于产生HCDC冷冻种子培养物的系统可以包括：

-细胞扩增装置，其包括内置的基于膜的细胞截留装置

-处理液体

-传感器或其组合，其用于监测细胞的生理状态以及活细胞密度

-泵

-天平或其他体积控制装置

-控制单元，其用于控制培养、在工艺步骤之间的体积转移以及启动用于冷冻的细胞的制备

-液体转移装置

-流量控制装置

-流量分配装置

-用于冷冻细胞的接收装置

-进一步任选的设备可以是：

-回火装置，其用于冷却液体以允许细胞的安全处理

-内联混合装置，其用于细胞与低温保护剂的快速且充分混合

-细胞分离装置，如果在细胞扩增装置外部进行细胞分离的话。

用于产生高细胞密度低温培养物的系统可以特别地包括：

-至少一种细胞扩增装置，其包括内置的基于膜的细胞截留装置

-处理液体，如培养基、pH校正剂和/或CPA溶液

-传感器或其组合，其能够提供关于细胞的生理状态和活细胞密度的在线信息

-泵

-用于进料和收获的体积控制的天平或等效装置

-控制单元

·以控制培养

·基于传感器输入自动监测培养物状态并启动用于冷冻的培养物制备

·以控制不同处理步骤之间的体积转移

-任选的回火装置

-任选的内联混合装置

-液体转移装置

-流量控制装置

-流量分配装置

-以及多个接收装置。

用于产生高细胞密度低温培养物的系统还可以包括：

-至少一种细胞扩增装置，其包括内置的基于膜的细胞截留装置

-处理液体，如培养基、pH校正剂、CPA溶液

-传感器或其组合，其能够提供关于细胞的生理状态和活细胞密度的在线信息

-泵

-用于进料和收获的体积控制的天平或等效装置

-控制单元

·以控制培养

·基于传感器输入自动监测培养物状态并启动用于冷冻的培养物制备

·以控制不同处理步骤之间的体积转移

-细胞分离装置和中间储存

-液体转移装置

-流量控制装置

-流量分配装置

-以及多个接收装置。

用于产生高细胞密度低温培养物的方法还可以包括：

-在至少一个细胞扩增装置中培养悬浮细胞，

·具有0.1-25L的工作体积

·包括内置的基于膜的细胞截留装置

·活细胞密度为100E6个活细胞/mL及以上

·处理模式：灌注

-处理液体，如培养基、pH校正剂、CPA溶液

-使用能够提供关于细胞的生理状态和活细胞密度的信息的传感器或其组合

-泵

-用于进料和收获的体积控制的天平或等效装置

-控制单元

·以控制培养

·基于传感器输入自动监测培养物状态并启动用于冷冻的培养物制备

·以控制不同处理步骤之间的体积转移

-用含有CPA的培养基替代培养体积的一部分或全部的步骤

·例如，通过使用内置的膜装置去除无细胞上清液，并用CPA溶液补足

·例如，通过使用内置膜装置去除无细胞上清液，以及在转移到下一个处理步骤时使用传输线路中的混合装置与CPA溶液进行内联混合

-例如通过使用快速回火装置或预冷培养基来降低含有细胞的溶液的温度的步骤

-用于转移含CPA的细胞悬液的液体转移装置，如泵、气动、重力和/或压力驱动的

-流量控制装置

-流量分配装置

·基于多阀的或歧管的

-以及多个接收装置

·体积不超过100mL的小瓶、袋子和/或器皿

用于产生高细胞密度低温培养物的方法还可以包括：

-在至少一个细胞扩增装置中培养悬浮细胞，

·具有约0.1-25L的工作体积

·包括内置的基于膜的细胞截留装置

·活细胞密度为100E6个活细胞/mL及以上

·处理模式：灌注

-处理液体

-使用能够提供关于细胞的生理状态和活细胞密度的信息的传感器或其组合

-泵

-用于进料和收获的体积控制的天平或等效装置

-控制单元

·以控制培养

·基于传感器输入自动监测培养物状态并启动用于冷冻的培养物制备

·以控制不同处理步骤之间的体积转移

-用含有CPA的培养基替代培养体积的一部分或全部的步骤

·通过使用一次性使用的细胞分离装置用预先调和的含有CPA的溶液替代培养基，然后进行随后的中间储存

·优选的实施方案：一次性使用的离心机

-例如通过使用快速回火装置或预冷培养基来降低含有细胞的溶液的温度的步骤

-用于转移含CPA的细胞悬液的液体转移装置

-流量控制装置

-流量分配装置

·基于多阀的或歧管的

-以及多个接收装置

·体积不超过100mL或小于100mL的小瓶/袋子和/器皿

参考符号

1：细胞扩增装置

1a：膜元件

1b：细胞扩增装置的外壳

1c：细胞扩增装置的顶部天花板

1d：细胞扩增装置的底部

1e：用于物质供应的至少一个端口

1f：传感器端口

1g：用作入口和/或出口的端口

1h：过滤元件

1i：过滤元件

1j：用于细胞样品线路的端口

1k：端口

1l：无细胞收获的排放端口

2：高细胞密度种子培养物

3a：电极传感器，特别是电容传感器

3b：传感器

3c：传感器的数据传输单元

3d：电极传感器的数据传输单元

4a：具有摇杆和/或天平和/或磁力搅拌和/或温度调节功能的单元

4b：具有摇杆和/或天平和/或磁力搅拌和/或温度调节功能的单元

4c：具有摇杆和/或天平和/或磁力搅拌和/或温度调节功能的单元

5：控制单元

6：(一次性使用的)离心机

7a：管

7b：低温保存的HCDC制备物

7c：用于冷冻的临时端口

7d：第二线路

8：分配单元

8a：用于均匀液体分配的一次性使用的歧管

8b：快速密封特征

9：低温单元

10A：系统A

10B：系统B

10C：系统C:系统A和系统B的组合

11₁：第一流量控制单元

11₂：第二流量控制单元

11₃：第三流量控制单元

a：低温保护剂，CPA

b：液体培养基

c：基料或营养物进料/进料培养基

L₁、L₂、L₃、L_3a、L_3b、I_3C：路径

V：装置容积

V_HCDC：HCDC的体积

V_gas:气体体积

100：包括步骤101-104的方法

101：包括细胞扩增的步骤

102：包括添加CPA的步骤

103：包括等分试样的步骤

104：包括低温处理的步骤

Claims (15)

1.用于低温保存的高细胞密度种子培养物HCDC制备物的自动化生产的系统(10A；10B；10C)，其包括：

-细胞扩增装置(1)，其用于使HCDC(2)在所述细胞扩增装置(1)的装置容积(V)内的培养基(b)中生长；

-至少一个传感器(3a,3b)，其用于通过至少在时间上监测指示所述HCDC的生理状态的至少一个参数来收集数据；以及

-控制单元(5)，其用于处理所收集的数据以确定所述监测的参数是否满足至少一个预定标准，以基于所述监测的参数是否满足所述至少一个预定标准来控制低温保护剂CPA(a)至少部分交换所述培养基(b)。

2.根据权利要求1所述的系统(10A；10C)，其中所述细胞扩增装置(1)包括：

-至少一个排放口(11)，其用于将所述培养基(b)的至少一部分从所述装置容积(V)向所述装置容积(V)的外部排放；以及

-膜元件(1a)，其布置在所述排放口(11)处，使得当所述培养基(b)的至少一部分从所述装置容积(V)通过所述膜元件(1a)并通过所述排放口(11)排放到所述装置容积(V)的外部时，所述HCDC(2)被保留在所述装置容积(V)内；以及

其中所述控制单元(5)被配置为基于是否满足所述标准来启动以下步骤

-通过所述膜元件(1a)排放所述装置容积(V)内的至少一部分培养基(b)；以及

-将所述CPA(a)添加到所述装置容积(V)中的HCDC(2)，以及任选地，

其中所述系统包括由所述控制单元(5)控制的转移单元(8；L3a；L3b,L3c)，其用于将至少一部分具有CPA(a)的HCDC(2)从所述装置容积(V)转移到一个或多个接收装置(7a)中，以获得用于低温保存的HCDC制备物。

3.根据权利要求2所述的系统，其中所述转移单元(8；L3a；L3b,L3c)被配置为将至少一部分具有CPA(a)的HCDC(2)从所述装置容积(V)自动地转移到一个或多个接收装置(7a)中，以获得用于低温保存的HCDC制备物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的系统(10B；10C)，其还包括：

-离心单元(6)，其用于离心具有所述培养基(b)的HCDC(2)；

-由所述控制单元(5)控制的至少一个转移单元，其用于将至少一部分具有所述培养基(b)的HCDC(2)转移到所述离心单元(6)的至少一个离心容器中；以及

-其中所述控制单元(5)被配置为基于是否满足所述标准来启动以下步骤：将至少一部分具有所述培养基(b)的HCDC(2)从所述装置容积(V)转移到所述离心单元(6)的至少一个离心容器中，用所述离心单元(6)离心转移的具有所述培养基(b)的HCDC(2)，将所述离心的培养基(b)与所述HCDC(2)至少部分地分离，以及将低温保护剂CPA(a)添加到所述HCDC(2)中。

5.根据前述权利要求中任一项所述的系统(10A；10B；10C)，其中所述传感器(3a,3b)与所述细胞扩增装置(1)形成整体单元，优选地，其中，所述传感器(3a,3b)被焊接到所述细胞扩增装置(1)的至少一部分壁(1b)中和/或其中所述传感器(3a,3b)通过所述细胞扩增装置(1)的端口插入到所述装置容积(V)中。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的系统(10A；10C)，其中所述膜元件(1a)与所述细胞扩增装置(1)形成整体单元。

7.根据前述权利要求中任一项所述的系统(10A；10B；10C)，其中所述控制单元(5)被配置为基于所监测的参数自动地控制至少一个第二参数，其中所述第二参数优选地被配置为控制和/或调节所述HCDC的生理状态。

8.根据前述权利要求中任一项所述的系统(10A；10B；10C)，其中所述细胞扩增装置(1)，所述传感器(3a,3b)，所述离心单元(6)，包括袋子、管和/或小瓶的所述接收装置以及所述转移单元(8；L3a；L3b,L3c)的至少一部分中的至少一个是一次性使用的元件和/或一次性使用的消耗品。

9.用于低温保存的高细胞密度种子培养物制备物，即HCDC制备物的自动化生产的方法，其包括以下步骤：

-使HCDC(2)在细胞扩增装置(1)的装置容积(V)内的培养基(b)中生长；

-通过至少在时间上监测至少一个参数来收集数据，其中所述参数指示所述HCDC(2)的生理状态；

-将所述收集的数据发送至控制单元(5)；

-由所述控制单元(5)处理所述收集的数据至少包括确定所述监测的参数是否满足至少一个预定标准；以及

-基于所述监测的参数是否满足所述至少一个预定标准来控制低温保护剂CPA(a)至少部分交换所述培养基(b)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中基于所述监测的参数是否满足所述至少一个标准：

-由所述控制单元(5)启动包括以下的步骤

选项A)

经由用于将所述HCDC(2)保留在所述装置容积(V)内的膜元件(1a)以及经由排放口(11)从所述装置容积(V)排放至少一部分培养基(b)，

将低温保护剂CPA(a)添加到所述装置容积(V)中的HCDC(2)，以及

将所述CPA(a)中的至少一部分HCDC(2)从所述装置容积(V)转移到一个或多个接收装置(7a)中以获得用于低温保存的HCDC制备物，其中自动地进行转移步骤；和/或

选项B)

将至少一部分具有所述培养基(b)的HCDC(2)从所述装置容积(V)转移到所述离心单元(6)的至少一个离心容器中，

用所述离心单元(6)离心转移的具有所述培养基(b)的HCDC(2),

将所述离心的培养基(b)与所述HCDC(2)至少部分地分离，

将CPA(a)添加到HCDC(2)中以获得用于低温保存的HCDC制备物，其中将至少一部分具有所述CPA(a)的HCDC(2)从所述离心容器转移到一个或多个接收装置(7a)中以获得用于低温保存的HCDC制备物，优选地，其中自动地进行将至少一部分具有所述培养基(b)的HCDC(2)从所述装置容积(V)转移到至少一个离心容器中和/或将至少一部分具有所述CPA(a)的HCDC(2)从所述离心容器转移到一个或多个接收装置(7a)中的步骤。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其还包括基于所述监测的参数，由所述控制单元(5)自动地控制至少一个第二参数，其中所述第二参数被配置为用于控制和/或调节所述HCDC(2)的生理状态。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述收集的数据的处理包括通过将函数和/或模型建立拟合到至少一部分所述收集的数据以获得拟合结果来自动地分析所述收集的数据。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述确定所述监测的参数是否满足至少一个预定标准是基于对所述拟合结果的自动分析。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其还包括在所述一个或多个接收装置(7a)中自动低温保存所述HCDC制备物以获得低温保存的HCDC制备物(2)的步骤。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其还包括在至少一个迭代步骤中确定所述获得的HCDC制备物的品质以及

-改变要由所述监测的参数满足的预定标准；和/或

-改变至少一个第二参数；以及

-重复权利要求8至13中任一项所述的方法，特别是直到获得最佳品质。

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