CN114292304B - 一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法 - Google Patents

一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法，属于基因编码化合物库构建领域。所述方法是以式II所示化合物和式III所示化合物为原料，在碱、催化剂和配体的存在下于溶剂中反应，得到式I所示化合物。本发明在DNA上合成芳基炔烃类先导化合物的方法，对DNA损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高收率地制得On‑DNA芳基炔烃类化合物。本发明丰富了在DNA上合成编码化合物库的化学反应类型，为基因编码化合物库构建了新的芳基炔烃类骨架，在先导药物开发中具有非常好的应用前景。

Description

一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法
技术领域
本发明属于基因编码化合物库构建领域，具体涉及一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法。
背景技术
任何一种药物的开发都是一个漫长且耗资巨大的过程。据药物研发的统计资料报道，一种新药从开始研发到最终批准投放市场，平均需10年的时间，研究费用更是高达26亿美元。药物的研制历程之所以这样漫长且费用高昂，其中很重要的一个原因是先导化合物的发现与优化过程缓慢。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求更多有效的筛选方法，以便在许多化合物中通过对生物学靶标的结合亲和力和/或药理学效力以无差异性的筛选方式找到优异的活性化合物。
经过许多年的应用、发展与完善，高通量筛选已经建立起了高度自动化、完善的筛选流程、以及与之相伴的提升的化学分子库质量和增长的化合物数量，是国际上主流的药物研发公司获得目标蛋白的先导化合物的重要途经。但是，基于单个分子的传统高通量筛选存在化合物库数量有限、时间较长、成本高等缺点，越来越不能满足新药研发的需求。
Brenner和Lerner于1992年创造性地提出可以使用基因编码化合物库技术(DELT)来进行生物活性化合物的筛选方法(相关文献：S.Brenner；R.A.Lerner.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89,5381-5383.)。DELT的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物，用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列的化合物文库。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，通过洗去没有与蛋白质靶标结合的化合物而达到物理分离并找到具有高结合亲和力的化合物。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极其小的剂量规模(微克)，而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下进行多项筛选实验。与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库极大地增加了化合物的数量和多样性(相关文献：R.A.Jr.Goodnow；C.E.Dumelin；A.D.Keefe.DNA-encoded chemistry:enabling the deeper sampling of chemicalspace[J].Nat.Rev.Drug Discov.,2017,16,131–147.)。
基因编码化合物库技术目前最主要的工作之一是DNA上化学反应(简称On-DNA化学反应)的开发，目前已经有一些On-DNA化学反应被报道。例如上海药明康德新药开发有限公司(申请号为CN201910609569.0的中国专利申请)公开了一种通过Suzuki偶联反应得到On-DNA芳烃化合物的方法：以On-DNA芳基卤代物为底物，在钯催化剂、配体和碱的存在下，与有机三氟硼酸钾试剂反应制得On-DNA芳烃化合物。该方法增加了On-DNA芳基卤代物的DNA编码化合物库的多样性，反应产率高，底物普适性广，条件温和，操作方便，适合于多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。成都先导药物开发股份有限公司(申请号为CN201910590679.7的中国专利申请)公开了一种合成On-DNA芳基苄位取代类化合物的方法，该方法以On-DNA醛类化合物为原料，与吲哚在碱性条件下反应生成On-DNA吲哚醇类化合物；然后将On-DNA吲哚醇类化合物在酸性条件下被1,4-二氢-2,6-二甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯还原成吲哚烷基化类化合物。能够在基因编码化合物库上实现的化学反应的种类越多，条件越丰富，在进行基因编码化合物库的设计和合成时选择才越多，得到的化合物库的多样性也会越丰富。但是，目前公开报道的On-DNA化学反应种类有限，还无法满足开发先导化合物的需求。
芳基炔烃类化合物指含有直接相连的芳基和炔基结构的一类化合物，这类化合物是有机合成中的重要原料或中间体。同时，研究发现芳基炔烃类化合物具有多种生物活性。例如化合物TolaSure(BM-3103)，它是美国BioMendics公司正在开发的一种用于由穿孔活检造成的急性诱导伤口的伤口愈合药物(相关文献：Safety and Efficacy of TopicalTolaSure Targeting Aggregated Mutant Keratin in Severe Epidermolysis BullosaSimplex(NCT05062070)ClinicalTrials.gov Web Site 2021,October 04)；再如化合物X，它是印度药用芳香植物中央研究所发现的一种具有抗疟性能、抗癌活性的药物(相关文献：Kumari,P.；Misra,K.；Sisodia,B.S.；et al.Planta Med 2009,75(1),59)。
申请号为CN201910609568.6的中国专利申请公开了一种DNA编码化合物库构建中制备On-DNA芳基炔烃化合物的方法，路线如下。该方法将On-DNA芳基端炔化合物与小分子芳基溴代物在二异丙基胺和和四三苯基膦钯的存在下，于超纯水与二甲基乙酰胺的混合溶剂中，在65℃下反应3小时，得到了On-DNA芳基炔烃化合物。但是，该方法需要加热到65℃，而已有研究证明，钯催化剂本身也对DNA存在一定程度的损伤，在加热的条件下这种损伤程度会进一步加深(Malone,M.L.and Paegel,B.M.ACS Comb.Sci.2016,18,182-187.)，因此该方法增加了DNA链损坏的风险，DNA链一旦损坏，将无法完成后续的扩增工作，使得On-DNA芳基炔烃化合物也就失去了在构建基因编码化合物库中的应用价值。事实上，正是因为DNA化学与普通化学反应存在差别，许多普通的小分子化学反应条件苛刻，容易引起DNA变性、破坏DNA活性，从而一定程度上限制了DNA编码化合物库构建和发展。因此，开发出一种对DNA损伤小、高收率的合成On-DNA芳基炔烃类化合物的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种合成芳基炔烃类先导化合物的方法，以及该合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。
本发明提供了一种合成式I所示芳基炔烃类先导化合物的方法，所述方法是以式II所示化合物和式III所示化合物为原料，在碱、催化剂体系的存在下于溶剂中反应，得到式I所示化合物：
其中，DNA为单链或双链的核苷酸链；
A为连接单元；
B为未取代或被一个或多个R1取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、3～8元饱和环烷基、3～8元饱和杂环基、C1～6亚烷基、C2～6亚烯基、C2～6亚炔基；其中，R1为卤素、卤代或未卤代的C1～6烷基、卤代或未卤代的C1～6烷氧基基；
X为卤素；
Y为未取代或被一个或多个R2取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、稠环芳基、稠环杂芳基；其中，R2各自独立地选自卤素、-(CH2)m-CN、卤代或未卤代的C1～6烷基、卤代或未卤代的C1～6烷氧基、NR3R4、-COOR5、-OR6、3～8元饱和环烷基、3～8元饱和杂环基，或者两个R2连接成环；R3、R4、R5各自独立地选自C1～6烷基，R6为3～8元饱和环烷基，m为0～3的整数。
进一步地，式II所示化合物、式III所示化合物、碱、催化剂体系的摩尔当量比为1：(1～500)：(1～500)：(0.1～100)；
所述反应的温度为0～40℃，时间为1～24小时；
所述溶剂为水、有机溶剂或两者的混合物；
所述碱为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化铯、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、磷酸钾、磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氟化铯、叔丁醇钾、叔丁醇钠、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯、无机盐缓冲液、有机碱缓冲液中的一种或两种以上的混合；
所述催化剂体系为钯催化剂及膦配体，钯催化剂与膦配体的摩尔当量比为1:1；所述钯催化剂优选为醋酸钯、氯化钯、四三苯基膦钯、1,1-双(二苯基膦)二荗铁二氯化钯、双三苯基磷二氯化钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁二氯合钯、烷磺酸(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)、甲烷磺酸(2-二环己基膦)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)、氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯)]钯(II)、甲烷磺酸(2-二叔丁基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)中的一种或两种以上的混合；所述膦配体优选为三苯基砷、三正丁基膦、三正丁基膦、三苯基膦、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、三苯基膦三间磺酸钠盐、2-双环己基膦-2',6'-二甲氧基联苯、三环己基膦、2-二-叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯、2-(二环己基膦)-3,6-二甲氧基-2'-4'-6'-三-I-丙基-11'-联苯、正丁基二(1-金刚烷基)膦、四氟硼酸三叔丁基膦、三(邻甲基苯基)磷、2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯、1,3-双(二苯基膦)丙烷、2-(二叔丁基膦)-3,6-二甲氧基-2'-4'-6'三-1-丙基-1,1'-双苯基、2-(二叔丁基膦)联苯、1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁中的一种或两种以上的混合；
或，所述催化剂体系为铜催化剂；所述铜催化剂优选为三氟甲磺酸铜或其水合物、醋酸铜或其水合物、醋酸亚铜、溴化铜或其水合物、无水氯化铜或其水合物、硫酸铜或其水合物、六氟磷酸四乙腈铜或其水合物、氟化铜或其水合物、溴化亚铜或其水合物、氯化亚铜或其水合物、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物或其水合物、溴化亚铜二甲硫醚络合物或其水合物、碘化亚铜或其水合物中的一种或两种以上的混合。
更进一步地，上述催化剂体系为钯催化剂及膦配体，式II所示化合物、式III所示化合物、碱、钯催化剂和膦配体的摩尔当量比为1：100：10：1：1；
所述反应的温度为25℃，时间为12小时；
所述溶剂为水和甲醇的混合物；
所述碱为碳酸钾；
所述钯催化剂为氯化钯；
所述膦配体为三苯基膦三间磺酸钠盐；
或，所述催化剂体系为铜催化剂，式II所示化合物、式III所示化合物、碱、和催化剂的摩尔当量比为1：200：20：10；
所述反应的温度为25℃，时间为24小时；
所述溶剂为水、甲醇和乙腈的混合物；
所述碱为碳酸钾；
所述铜催化剂为碘化亚铜。
更进一步地，上述DNA为单链或双链的寡聚核苷酸链；
A为-NHCO-或-CONH-；
B为未取代或被一个或多个R1取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、5～6元饱和环烷基、5～6元饱和杂环基、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基；其中，R1为卤素、卤代或未卤代的C1～4烷基、卤代或未卤代的C1～4烷氧基；
X为卤素；
Y为未取代或被一个或多个R2取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、稠环芳基、稠环杂芳基；其中，R2各自独立地选自卤素、-(CH2)m-CN、卤代或未卤代的C1～4烷基、卤代或未卤代的C1～4烷氧基、NR3R4、-COOR5、-OR6、5～6元饱和环烷基、5～6元饱和杂环基，或者两个相邻的R2连接成环，所述环为5～6元饱和碳环、5～6元饱和杂环、5～6元芳环或5～6元杂芳环；R3、R4、R5各自独立地选自C1～4烷基，R6为3～5元饱和环烷基，m为0或1。
更进一步地，上述卤素为氟、氯、溴或碘。
更进一步地，上述A为-NHCO-或-CONH-，式II所示化合物是以式II-a和式II-b为原料进行缩合反应得到的：
其中，Ra为氨基，Rb为羧基；或Ra为羧基，Rb为氨基。
更进一步地，上述反应是在碱和缩合试剂的作用下于溶剂中进行的；
式II-a、式II-b、碱和缩合试剂的摩尔当量比为1：(1～160)：(1～400)：(1～100)；
所述反应的温度为0～40℃，时间为1～24小时；
所述反应的溶剂为水、有机溶剂或两者的混合物。
更进一步地，上述碱为N,N-二异丙基乙胺，缩合试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
式II-a、式II-b、碱和缩合试剂的摩尔当量比为1：80：200：50；
所述反应的温度为20～30℃，时间为1小时；
所述反应的溶剂为DMSO和水的混合物。
更进一步地，上述式I所示化合物为以下化合物之一：
本发明还提供了式I所示芳基炔烃类先导化合物：
其中，DNA为单链或双链的核苷酸链；
A为连接单元；
B为未取代或被一个或多个R1取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、3～8元饱和环烷基、3～8元饱和杂环基、C1～6亚烷基、C2～6亚烯基、C2～6亚炔基；其中，R1为卤素、卤代或未卤代的C1～6烷基、卤代或未卤代的C1～6烷氧基基；
Y为未取代或被一个或多个R2取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、稠环芳基、稠环杂芳基；其中，R2各自独立地选自卤素、-(CH2)m-CN、卤代或未卤代的C1～6烷基、卤代或未卤代的C1～6烷氧基、NR3R4、-COOR5、-OR6、3～8元饱和环烷基、3～8元饱和杂环基，或者两个R2连接成环；R3、R4、R5各自独立地选自C1～6烷基，R6为3～8元饱和环烷基，m为0～3的整数。
进一步地，上述DNA为单链或双链的寡聚核苷酸链；
A为-NHCO-或-CONH-；
B为未取代或被一个或多个R1取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、5～6元饱和环烷基、5～6元饱和杂环基、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基；其中，R1为卤素、卤代或未卤代的C1～4烷基、卤代或未卤代的C1～4烷氧基；
X为卤素；
Y为未取代或被一个或多个R2取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、稠环芳基、稠环杂芳基；其中，R2各自独立地选自卤素、-(CH2)m-CN、卤代或未卤代的C1～4烷基、卤代或未卤代的C1～4烷氧基、NR3R4、-COOR5、-OR6、5～6元饱和环烷基、5～6元饱和杂环基，或者两个相邻的R2连接成环，所述环为5～6元饱和碳环、5～6元饱和杂环、5～6元芳环或5～6元杂芳环；R3、R4、R5各自独立地选自C1～4烷基，R6为3～5元饱和环烷基，m为0或1。
更进一步地，上述卤素为氟、氯、溴或碘。
更进一步地，上述芳基炔烃类先导化合物为以下化合物之一：
本发明还提供了上述的合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀Ca～b烷基表示任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。例如，C1～6烷基是指包含1～6个碳原子的直链或支链的烷基。
“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于其它环状基团(包括饱和和不饱和环)，但不能含有杂原子如氮、氧、硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。芳基可以是取代的或未取代的。
“杂芳基”指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂原子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。
“稠环烷基”指多环的环烷基，且该多环的环烷基中有两个环共用两个相邻的碳原子。“稠环芳基”指多环中的至少一个环为芳基的稠环烷基。
“杂稠环基”指多环的杂环基，且该多环的杂环基中有两个环共用两个相邻的碳原子或杂原子。“稠环杂芳基”指多环中的至少一个环为杂芳基的杂稠环基。
“有机溶剂”包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环己醇、2-氟乙醇、2,2-二氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、六氟异丙醇、苯甲醇、乙二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、丙三醇、乙醚、环氧丙烷、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢吡喃、1,4-二氧六环、苯甲醚、二甲硫醚、二乙基硫醚、乙二醇二甲醚，乙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、丙酮、环己酮、二氯甲烷、氯仿、氯苯、1,2-二氯乙烷、乙酸乙酯、正己烷、环己烷、吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、4-甲氧基吡啶、甲苯、二甲苯。
本发明的有益效果：提供了一种在DNA上合成芳基炔烃类先导化合物的方法，该方法对DNA损伤小，普适性好，操作简单，条件温和，能高收率地制得On-DNA芳基炔烃类化合物。
具体的，本发明使用了炔烃卤代物与廉价易得的硼酸试剂在金属钯、或者是铜催化剂下完成炔烃的烷基化反应。本发明的反应条件比现有技术报道的更加温和，反应只需要在室温下进行，不需要加热就可以高收率地得到偶联产物。
本领域公知的，DNA必须在一定的条件下才能保持稳定；应用于DNA编码化合物库构建的反应需要具有较高的收率。在本发明的反应条件下，产物On-DNA芳基炔烃类化合物不仅收率高，而且产物On-DNA芳基炔烃类化合物中的DNA完整性好。本发明中得到的On-DNA芳基炔烃类的完整性不仅可以从液相色谱质谱得到确认，还可以通过进行下一步DNA酶催化偶联反应验证。本发明丰富了在DNA上合成编码化合物库的化学反应类型，为基因编码化合物库构建了新的芳基炔烃类骨架，在先导药物开发中具有非常好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：寡聚核酸-碘代炔烃S1-1～S1-6的结构式、分子量和纯度。
图2：原料HP的结构。
图3：寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1的液相色谱质谱图。
图4：寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-2的液相色谱质谱图。
图5：寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-3的液相色谱质谱图。
图6：寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-4的液相色谱质谱图。
图7：寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-5的液相色谱质谱图。
图8：寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-6的液相色谱质谱图。
图9：芳基硼酸S2-1～S2-24的结构式。
图10：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1～P17、P25～P29的结构式、分子量和产物收率。
图11：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P18～P24的结构式、分子量和产物收率。
图12：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1的液相色谱质谱图。
图13：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P2的液相色谱质谱图。
图14：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P3的液相色谱质谱图。
图15：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P4的液相色谱质谱图。
图16：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P5的液相色谱质谱图。
图17：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P6的液相色谱质谱图。
图18：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P7的液相色谱质谱图。
图19：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P8的液相色谱质谱图。
图20：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P9的液相色谱质谱图。
图21：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P10的液相色谱质谱图。
图22：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P11的液相色谱质谱图。
图23：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P12的液相色谱质谱图。
图24：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P13的液相色谱质谱图。
图25：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P14的液相色谱质谱图。
图26：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P15的液相色谱质谱图。
图27：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P16的液相色谱质谱图。
图28：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P17的液相色谱质谱图。
图29：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P18的液相色谱质谱图。
图30：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P19的液相色谱质谱图。
图31：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P20的液相色谱质谱图。
图32：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P21的液相色谱质谱图。
图33：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P22的液相色谱质谱图。
图34：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P23的液相色谱质谱图。
图35：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P24的液相色谱质谱图。
图36：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P25的液相色谱质谱图。
图37：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P26的液相色谱质谱图。
图38：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P27的液相色谱质谱图。
图39：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P28的液相色谱质谱图。
图40：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P29的液相色谱质谱图。
图41：方法1制备的寡聚核酸-芳基炔烃化合物P2链接TagA前后的液相色谱质谱图。
图42：方法2制备的寡聚核酸-芳基炔烃化合物P2链接TagA前后的液相色谱质谱图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。本发明说明书所述的所有“当量”均是指“摩尔当量”。
本发明实施例采用的寡聚核酸-碘代炔烃为S1-1～S1-6中的一种，S1-1～S1-6的结构如图1所示，合成方法如下：
(一)合成寡聚核酸-碘代炔烃S1-1
1、合成原料DNA-NH2
(1.1)合成DNA-NHFmoc
将100nmol HP(HP的结构如图2所示，为市售产品)溶于去离子水配制成1mmol/L的溶液(100μL，100nmol，1当量)。将40当量的起始头片段化合物SM1(市售产品)的DMSO溶液(浓度：200mmol/L)、250当量pH＝9.47的四硼酸钠(Na2B4O7)缓冲液(浓度：250mmol/L)、40当量的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMT-MM)水溶液(浓度：200mmol/L)混合，将该混合物用涡旋振荡器充分混匀。再将上述混合物加入到HP的溶液中，混合均匀后于4℃下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应液置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到DNA-NHFmoc的溶液。
(1.2)合成DNA-NH2
将100nmol DNA-NHFmoc溶于去离子水配制成1mmol/L的DNA-NHFmoc溶液(100μL，100nmol，1当量)，向其中加入36微升10％的哌啶(piperidine)水溶液，将两者混合均匀后于室温下反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液。然后，继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后得到寡聚核酸-NH2(简写为DNA-NH2)的溶液。
2、合成寡聚核酸-碘代炔烃S1-1
将100nmol(1当量)DNA-NH2溶于100μL去离子水配制成1mmol/L的溶液。取80当量酸-碘代炔烃化合物S3的DMSO溶液(浓度：200mmol/L)、200当量N,N-二异丙基乙胺(简称DIEA)的DMSO溶液(浓度：200mmol/L)和50当量2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称HATU)的DMSO溶液(浓度：200mmol/L)混合，将所得混合物用涡旋振荡器充分混匀。然后将上述混合物加入到寡聚核酸-NH2的溶液中，混合均匀后室温反应1小时。
反应结束后，先向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液，再继续加入总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将液体置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。然后在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀即寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1。
(二)合成寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-2～S1-6
参照上述相同的方法，区别仅在于将酸-碘代炔烃化合物S3替换为对应的原料，分别合成寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-2、S1-3、S1-4、S1-5、S1-6。
利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1～S1-6，谱图如图3～图8所示。
实施例1：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1的合成方法
方法1、以钯催化剂-膦配体作为催化体系
将1nmol寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1(1当量)溶于去离子水，配制成1mmol/L的溶液，然后加入100当量芳基硼酸底物S2-1的甲醇溶液(浓度：100mmol/L)、10当量碳酸钾的水溶液(浓度：10mmol/L)、1当量氯化钯的水溶液(浓度：1mmol/L)以及1当量三苯基膦三间磺酸钠盐的水溶液(浓度：1mmol/L)，混合均匀后，于氮气氛围中在25℃下反应12小时。
反应结束后，向反应液中加入5微升的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液(浓度：1mol/L)，80℃下反应10～30分钟。然后再上述反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液以及总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。然后在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀干燥后即得寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1(产率见表1)。
方法2、铜催化剂作为催化体系
将1nmol寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1(1当量)溶于去离子水，配制成1mmol/L浓度的溶液，向其中加入200当量芳基硼酸2-1(200mmol/L的甲醇溶液，200当量)、20当量碳酸钾(20mmol/L的水溶液，20当量)、10当量碘化亚铜(10mmol/L的乙腈溶液，10当量)，将该混合物混合均匀，25℃下氮气保护反应24小时。反应结束后，向反应液中加入2微升1mol/L的二乙基二硫代氨基甲酸钠水溶液，80℃下反应10～30分钟。再向上述反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠水溶液以及总体积3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后，在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1(产率见表2)。
实施例2：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P2～P24的合成方法
参照实施例1方法1相同的方法，区别仅在于将芳基硼酸底物S2-1替换为炔烃底物S2-2～S2-17(产率见表1)；按照实施例1方法2相同的方法，区别仅在与将芳基硼酸底物S2-1替换为炔烃底物S2-2～S2-24，分别合成寡聚核酸-芳基炔烃化合物P2～P24(产率见表2)。S2-2～S2-24的化学结构如图9所示。
实施例3：寡聚核酸-芳基炔烃化合物P25～P29的合成方法
参照实施例1方法1相同的方法，区别仅在于将寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1替换为寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-2～S1-6，分别合成寡聚核酸-芳基炔烃化合物P25～P29(产率见表1)。
参照实施例1方法2相同的方法，区别仅在于将寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-1替换为寡聚核酸-碘代炔烃化合物S1-2～S1-6，分别合成寡聚核酸-芳基炔烃化合物P25～P29(产率见表2)。
方法1和方法2制备的寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1～P27以及P25～P29的结构式、分子量如图10所示；方法2制备的寡聚核酸-芳基炔烃化合物P18～P24的结构式、分子量如图11所示。本发明利用液相色谱质谱联用仪能够准确检测目标产物的收率。
利用液相色谱质谱联用仪检测寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1～P29，谱图如图12～图40所示。
表1方法1合成寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1～P17、P25～P29的产物收率
化合物编号 产物收率
P1 72％
P2 77％
P3 52％
P4 60％
P5 77％
P6 60％
P7 73％
P8 56％
P9 64％
P10 71％
P11 89％
P12 61％
P13 72％
P14 68％
P15 45％
P16 78％
P17 24％
P25 70％
P26 80％
P27 78％
P28 80％
P29 35％
表2方法2合成寡聚核酸-芳基炔烃化合物P1～P29的产物收率
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：合成寡聚核酸-芳基炔烃化合物的条件筛选实验
以P2的合成为例，对方法1中钯催化剂、碱、配体的种类、比例和反应温度条件进行了筛选，结果如表3所示。
同样以P2的合成为例，对方法2中铜催化剂、碱的种类、比例、反应环境和温度等条件进行了筛选，结果如表4所示。
根据表中结果可知，只有在本发明特定的反应条件下，制备的寡聚核酸-芳基炔烃化合物才具有最高的产率。
表3方法1筛选优化条件a
a、S1-1、K2CO3、K3PO4、Cs2CO3、钯催化剂、TPPTS均溶于水，S2-2溶于甲醇，氮气氛围下反应24小时
b、反应18小时
表4方法2筛选优化条件a
a、S1-1、K2CO3、LiOH、Cs2CO3溶于水，S2-2溶于甲醇，其余试剂均用乙腈溶解，反应24小时
b、反应15小时
实验例2：本发明寡聚核酸-芳基炔烃化合物中寡聚核酸的完整性验证
寡聚核酸-芳基炔烃化合物与TagA(短链的寡聚核苷酸，两条链的分子量分别为4064、5884)链接
步骤：分别将1nmol按照实施例1中方法1、方法2制备的P2溶于去离子水配制成1mmol/L浓度的溶液(1μL，1nmol，1当量)，向其中加入1.2当量的TagA(1mmol/L水溶液，1.2μL，1.2当量)、1微升10xT4DNA链接缓冲溶液以及0.5微升T4 DNA链接酶。然后将上述溶液混合均匀，室温反应1小时。反应结束后，向反应液中加入总体积10％的5mol/L氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-80℃的冰箱中冷冻2小时。之后在4000rpm的转速下离心半小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解后通过液相色谱质谱检测确认产物分子量。方法1制备反应原料P2和产物P2-1的液相色谱质谱联用仪检测结果见图41；方法2制备的反应原料P2和产物P2-1的液相色谱质谱联用仪检测结果见图42。
结果发现，寡聚核酸-碘代炔烃与硼酸的偶联反应产物可以进行DNA酶催化偶联反应，说明方法1的合成没有对DNA部分的结构造成破坏；同时，同时LCMS分析表明该反应产物纯度高、质谱数据能够精确得到与计算值相吻合的实验数值进一步验证了DNA的良好完整性。

Claims (10)

1.一种合成式I所示芳基炔烃类先导化合物的方法，其特征在于：所述方法是以式II所示化合物和式III所示化合物为原料，在碱、催化剂体系的存在下于溶剂中反应，得到式I所示化合物：
其中，DNA为单链或双链的核苷酸链；
X为卤素；
所述反应的温度为0～40℃，时间为1～24小时；
所述碱为碳酸铯、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化铯、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、磷酸钾、磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氟化铯、叔丁醇钾、叔丁醇钠、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N,N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯、N,N,N',N'-四甲基乙二胺、1,1,3,3-四甲基胍、N,N-二环己基甲胺、二环己胺、四氢吡咯中的一种或两种以上的混合；
所述催化剂体系为钯催化剂及膦配体，钯催化剂与膦配体的摩尔当量比为1:1；所述钯催化剂为醋酸钯、氯化钯、四三苯基膦钯、1,1-双(二苯基膦)二荗铁二氯化钯、双三苯基磷二氯化钯、三(二亚苄基丙酮)二钯、1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁二氯合钯、烷磺酸(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)、甲烷磺酸(2-二环己基膦)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)、氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯)]钯(II)、甲烷磺酸(2-二叔丁基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)(2'-氨基-1,1'-联苯-2-基)钯(II)中的一种或两种以上的混合；所述膦配体为三苯基砷、三正丁基膦、三正丁基膦、三苯基膦、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽、1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦、1,1'-双(二苯基膦)二茂铁、三苯基膦三间磺酸钠盐、2-双环己基膦-2',6'-二甲氧基联苯、三环己基膦、2-二-叔丁膦基-2',4',6'-三异丙基联苯、2-(二环己基膦)-3,6-二甲氧基-2'-4'-6'-三-I-丙基-11'-联苯、正丁基二(1-金刚烷基)膦、四氟硼酸三叔丁基膦、三(邻甲基苯基)磷、2-二环己膦基-2'-(N,N-二甲胺)-联苯、1,3-双(二苯基膦)丙烷、2-(二叔丁基膦)-3,6-二甲氧基-2'-4'-6'三-1-丙基-1,1'-双苯基、2-(二叔丁基膦)联苯、1,1'-双(二叔丁基膦)二茂铁中的一种或两种以上的混合；
或，所述催化剂体系为铜催化剂；所述铜催化剂为三氟甲磺酸铜或其水合物、醋酸铜或其水合物、醋酸亚铜、溴化铜或其水合物、无水氯化铜或其水合物、硫酸铜或其水合物、六氟磷酸四乙腈铜或其水合物、氟化铜或其水合物、溴化亚铜或其水合物、氯化亚铜或其水合物、氯化亚铜-双(氯化锂)络合物或其水合物、溴化亚铜二甲硫醚络合物或其水合物、碘化亚铜或其水合物中的一种或两种以上的混合；
A为-NHCO-或-CONH-；
B为未取代或被一个或多个R1取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、5～6元饱和环烷基、5～6元饱和杂环基、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基；其中，R1为卤素、卤代或未卤代的C1～4烷基、卤代或未卤代的C1～4烷氧基；
Y为未取代或被一个或多个R2取代的以下基团：5～6元芳基、5～6元杂芳基、稠环芳基、稠环杂芳基；其中，R2各自独立地选自卤素、-(CH2)m-CN、卤代或未卤代的C1～4烷基、卤代或未卤代的C1～4烷氧基、NR3R4、-COOR5、-OR6、5～6元饱和环烷基、5～6元饱和杂环基，或者两个相邻的R2连接成环，所述环为5～6元饱和碳环、5～6元饱和杂环、5～6元芳环或5～6元杂芳环；R3、R4、R5各自独立地选自C1～4烷基，R6为3～5元饱和环烷基，m为0或1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：式II所示化合物、式III所示化合物、碱、催化剂体系的摩尔当量比为1：(1～500)：(1～500)：(0.1～100)；
所述溶剂为水、有机溶剂或两者的混合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述催化剂体系为钯催化剂及膦配体，式II所示化合物、式III所示化合物、碱、钯催化剂和膦配体的摩尔当量比为1：100：10：1：1；
所述反应的温度为25℃，时间为12小时；
所述溶剂为水和甲醇的混合物；
所述碱为碳酸钾；
所述钯催化剂为氯化钯；
所述膦配体为三苯基膦三间磺酸钠盐；
或，所述催化剂体系为铜催化剂，式II所示化合物、式III所示化合物、碱、和催化剂的摩尔当量比为1：200：20：10；
所述反应的温度为25℃，时间为24小时；
所述溶剂为水、甲醇和乙腈的混合物；
所述碱为碳酸钾；
所述铜催化剂为碘化亚铜。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：所述DNA为单链或双链的寡聚核苷酸链。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述卤素为氟、氯、溴或碘。
6.根据权利要求1～3或5任一项所述的方法，其特征在于：A为-NHCO-或-CONH-，式II所示化合物是以式II-a和式II-b为原料进行缩合反应得到的：
其中，Ra为氨基，Rb为羧基；或Ra为羧基，Rb为氨基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述反应是在碱和缩合试剂的作用下于溶剂中进行的；
式II-a、式II-b、碱和缩合试剂的摩尔当量比为1：(1～160)：(1～400)：(1～100)；
所述反应的温度为0～40℃，时间为1～24小时；
所述反应的溶剂为水、有机溶剂或两者的混合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述碱为N,N-二异丙基乙胺，缩合试剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
式II-a、式II-b、碱和缩合试剂的摩尔当量比为1：80：200：50；
所述反应的温度为20～30℃，时间为1小时；
所述反应的溶剂为DMSO和水的混合物。
9.根据权利要求1～3、5、7或8任一项所述的方法，其特征在于：式I所示化合物为以下化合物之一：
10.权利要求1～9任一项所述的合成方法在构建基因编码化合物库中的用途。
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